helena www.helena-biosciences.com BioSciences Europe Kullanım Talimatları SAS-1 URINE SDS Katalog No: 201400
KULLANIM AMACI SAS-1 İdrar SDS kiti, SDS agaroz jel elektroforezi ile idrar numuneleri kullanılarak böbrek hastalığının tespiti için tasarlanmıştır. Üriner proteinleri böbrek yoluyla filtre edilen plazma proteinlerinden türetilmiştir. İdrarda anormal plazma proteinlerinin varlığı renal fonksiyon değerlendirmesinde büyük değere sahiptir. Proteinüre in uygun çalışması boşaltılan proteinlerin miktarı ve türünün kantitatif ve kalitatif değerlendirmesini içermelidir 1-5. Glomerüler kapiller hücre yoluyla plazma filtrasyonu bir sıvı olan idrarı verir. Normal idrar, bazı fizyolojik albümin ve transferrin ve moleküler ağırlığı 50.000 Dalton dan daha az olan mikroproteinler içerir. Bu mikroproteinler böbrek kanalları tarafından katabolizma yapılarak tübüler hücreleri ile tekrar absorbe edilirler. İdrarda proteinin fizyolojik konsantrasyonu normal olarak yaklaşık 100mg/24 saattir ve albümin ve transferrin jel profili üzerinde ışık bantları olarak bulunur. Normal bir proteinüri konsantrasyon(<0.1g/24h) ile anormal bir bandın varlığı immunofiksasyon tarafından tespit edilebilmelidir(bence Jones veya diğerleri). Proteinüre nin yüksek bir düzeyi ile ilgili olan farklı bantların varlığı tamamlayıcı bir kimlik gerektirir. SDS jel elektroforezi idrarda anormal proteinlerin tespiti için mükemmel bir metodolojidir. SAS-1 İdrar SDS jeli bir anyonik deterjan ile Tris / HEPES bufferında agarozun yüksek bir konsantrasyonunu içerir (SDS - sodyum dodesil sülfat). SDS in varlığında proteinler bir SDS protein kompleks oluşturur. Bağlayıcı SDS de doğal yük önemsizleştirilir ve tüm proteinler aynı yüklü kütle oranına sahip olurlar. SDS-protein kompleksleri, bir eleme jel agarozunda molekül ağırlığını ayırabilirler. 20.000 ile 50.000 Dalton alanında bantların varlığı immunofiksasyon ve özel antiserumlar tarafından tespit edilmelidir. UYARILAR VE ÖNLEMLER Tüm kitler yalnızca in-vitro diyagnostikte kullanım içindir. Herhangi bir kit bileşenini ağzınızla pipetlemeyin, ağzınıza sürmeyin. Tüm kit bileşenlerinin işlemi sırasında eldiven giyin. Risk, güvenlik koşulları ve atım bilgisi için ürün güvenlik kağıdına başvurun. BİLEŞENLER 1. SAS-1 İdrar SDS Gel Anyonik bir deterjan SDS ve koruyucu olarak sodyum azid ile bir Tris/HEPES buffer içeren agaroz. Paket içindeki jel kullanım için hazırdır. 2. Konsantre İdrar Protein Boya Konsantre coomassie mavi boya içerir. 1 litre fiksative/boya arındırıcı solüsyonu şişe içeriği ile dilüe edin. Kullanım öncesi karıştırılır ve filtre edilir. İyi kapatılmış bir şişede saklanır. 3. SDS Dilüent Bromophenol mavi ile Tris/HEPES bufferda SDS içerir. Sodyum azid bir koruyucu olarak kullanılır. Dilüent paket halinde kullanıma hazırdır.
4. Diğer Kit Bileşenleri Her kit kullanım için talimatlar ve 10 jeli tamamlamak için yeterli miktarda C, SDS kurutma kağıtları ve kurutma tarağı içerir. SAKLAMA VE RAF ÖMRÜ 1. SAS-1 İdrar SDS Jel Jeller 15-30 derecede saklanmalıdır ve paket üzerinde belirtilen son kullanma tarihine kadar stabildir. DOLABA KOYMAYIN VEYA DONDURMAYIN. Jelin bozulması : 1) jelin dondurulması kristal görünümü belirtir, 2) jelin kuruması, çatlama ve kuruluğu veya 3) bakteriyal ya da fungal kaynaklı agarozun kontaminasyonunu belirtir. 2. İdrar Protein Boya Konsantre boya 15-30 derecede saklanmalıdır ve etiket üzerinde belirtilen son kullanma tarihine kadar stabildir. Dilüe boya solusyonu 15-30 derecede 6 ay stabildir. Boya kapasitesinin azalmasını önlemek için derhal kullanılan boyanın alınması tavsiye edilir. Zayıf boyama performansı, boya solüsyonunun bozulduğunu belirtebilir. 3. SDS Diluent SDS dilüent 15-30 derecede saklanmalıdır ve etiket üzerinde belirtilen son kullanma tarihine kadar stabildir. Bulanıklık dilüent solüsyonun bozukluğunu belirtebilir. SAĞLANMAYAN FAKAT GEREKSİNİLEN ÖĞELER i) SAS-1 Plus kullanıcıları: Katalog No.3100 REP Prep 50-60 derece hava üfleme kapasiteli kurutma fırını Sabitleme/Boya arındırıcı Solüsyon: 1300ml saf su ile 300ml metanolu karıştırın. 400ml buzlu asetik asit ekleyin. Saf su ii) SAS-3 kullanıcıları: Katalog No.3100 REP Prep Katalog No.311200 SAS-3 Electrode Adaptors for IEF 50-60 derece hava üfleme kapasiteli kurutma fırını Sabitleme/Boya arındırıcı Solüsyon: 1300ml saf su ile 300ml metanolu karıştırın. 400ml buzlu asetik asit ekleyin. Saf su iii) SAS-M1 kullanıcıları: Katalog No.3100 REP Prep Katalog No.211000 SAS-M1 Katalog No.1525 EPS600 Power Supply 50-60 derece hava üfleme kapasiteli kurutma fırını Sabitleme/Boya arındırıcı Solüsyon: 1300ml saf su ile 300ml metanolu karıştırın. 400ml buzlu asetik asit ekleyin. Saf su
NUMUNE TOPLANMASI VE HAZIRLANMASI Tercih edilen numune taze toplanan idrardır. Numuneler 2...6 C de 72 saate kadar ya da -20 C de 2 haftaya kadar buzdolabında saklanmalıdır. Total protein 1000mg/L ın üstünde olmazsa numuneler konsantrasyon veya dilüsyon olmadan başlangıçta kullanılmamalıdır. Eğer numune protein konsantrasyonu 100mg/L den daha azsa, aşağıdakiler gibi konsantre edilmelidir: Protein Konsantrasyonları <100mg/L <50mg/L <20mg/L Konsantrasyon 5 kez 10 kez 30 kez Engelleyici faktörler: 1) numunelerden elde edilen yanlış sonuçlar buharlaşmadan dolayı ortaya çıkabilir. SAS-M1 kullanıcıları için not: Soğutma bloğu kullanmadan önce 2... 6 C de gece boyunca ve çalışma arasında en az 30 dakika soğutmalıdır. ADIM-ADIM PROSEDÜR 1.80μl idrara 20μl SDS dilüent ekleyin. Yaklaşık 100 C de 3-5 dakika boyunca numuneyi ısıtın. 6000rpm de 3 dakika santrifüjleyin ve süpernatantı toplayın. 2. Ambalajdan jeli çıkarın ve kağıt havlu üzerine koyun. Kurutucu C ile jel yüzeyini kurutun ve kurutucuları alın. 3. Jelin köşesindeki oklarla numune uygulama kalıbını hizalayın. Kalıbın üstüne bir SDS kurutucuyu koyun ve iyi temastan emin olmak için çatlaklar arasına parmağınızı sürtün. Kurutucuları alın ve Adım 5 te kullanmak için saklayın. 4. Her yarık için 5 μl numune uygulayın ve 12 dakika boyunca absorbe etmesini sağlayın. 5. Numune absorpsiyonunun ardından, adım 3 de saklanan SDS kurutucular ile kalıpları kurutun ve hem kurutucu hem de kalıpları çıkarın. 6. i) SAS-1 Plus kullanıcıları: Soğutucu üzerine 400 μl REP Prep boşaltın. Soğutucu üzerine jeli, agarozu düzgün ve hava kabarcığı kalmayacak şekilde yerleştirin, uygun elektrot çubukları pozitif ve negatif kısımlara yerleştirin. ii) SAS-3 kullanıcıları: Pinlere ayarlama kılavuzunu yerleştirin ve 400μL REP prep kalıbın merkezine boşaltın. Jeli agarozun toplandığı kuyuya yerleştirin, kılavuzu kullanın, uygun elektrot uçları ile negatif ve pozitif uçları ayarlayın, jelin altında hava kabarcığından kalmamasına dikkat edin. iii) SAS-M1 kullanıcıları: Soğutma bloğunun içine 400μl Rep Prepi boşaltın. Jel altında hava kabarcıklarını önleyerek ve agarozu toplayarak jeli soğutma bloğunun merkezine koyun. 7. i) SAS-1 Plus kullanıcıları: Elektrot kollarının içine KARBON elektrotları eklenir böylece jel blokları ile temasa girerler. ii) SAS-3 kullanıcıları: Elektrot kollarının içine KARBON elektrotları eklenir böylece jel blokları ile temasa girerler.
iii) SAS-M1 kullanıcıları: İlgili buffer blokları ile her iki elektrotun temasını sağlamak için iyice basın ve SAS-M1 üzerine kapağı yerleştirin. 8. İdrar SDS elektroforezi yapılır: i)sas-1 kullanıcıları: 80 volt, 30 dakika, 15 C. NB: Numune tepsini veya jel kapağı kullanmayın. ii)sas-3 kullanıcıları: Adım zamanı (mm:ss) Sıcaklık ( C) Voltaj Diğer Elektroforez 24:00 18 100 iii) SAS-M1 kullanıcıları: Elektroforez jel: 80 volt, 30 dakika. 9. Elektroforezin ardından, elektrotları alın ve temizleyin. BOYAMA PROTOKOL 10. Gel Block Remover kullanılarak her iki jel bloklarını çıkarın. 11. Sabitleştirici/boya arındırıcı solüsyonda 5 dakika jeli bırakın. 12. 50...60 C de jeli kurutun. NOT: Eğer jel 60 C altındaki sıcaklıkta kurutulursa, jelin bulanıklığına neden olan problemler gözlenebilir. 13. 10 dakika boyunca boya solüsyonu içinde kuru jeli bırakın. 14. Arka plan temizlenene kadar yada sabitleştirici/boya arındırıcı solüsyonun yıkayarak 2 x 5 dakika içinde jeli boyadan arındırın. 15. Saf su içinde jeli kısa süre yıkayın ve kurutun. SONUÇLARIN YORUMLANMASI Glomerüler proteinüri. Glomerüler proteinüri, yaklaşık 50kDa den daha büyük molekül ağırlığına sahip proteinler ile karakterizedir (albumin, transferrin, IgG gibi). Bu jel üzerinde, albümin glomerüler ve tübüler proteinler arasındaki bariyer yapar. Tübülar Proteinüri. Tübüler proteinüri yaklaşık 50kDa den daha küçük molekül ağırlığına sahip proteinler ile karakterizedir (α1-mikroproteinler, retinol bağlayıcı protein, β2-mikroglobulin gibi) Bence Jones Proteinuria. Bunlar microprotein alanında, jel sonunda albümin ve anodal arasında bulunmaktadır. Moleküler ağırlığın varyasyonundan dolayı, Bence Jones proteinleri jel üzerinde biraz değişken konumda olabilir. Şüpheli Bence Jones protein varlığı immunofiksasyon tarafından onaylanmalıdır. Proteinler moleküler ağırlığına göre ayrılırlar. Katottan anota, aşağıdaki proteinler görülebilir: α2-macro ve IgM ~800 kda Haptoglobins ~250-350 kda IgA ~160-170 kda IgG ~150-160 kda Transferrin ~80 kda
Albumin ~70 kda Dimers Kappa velambda ~50 kda α1-microproteins ~30-35 kda Bence Jones κ or λ ~18-25 kda Retinol Binding Protein ~20 kda Lysozyme ~15 kda β2-microglobulin ~12 kda Kalitatitif Değerlendirme. İdrar SDS jel sadece kantitatif değerlendirme içindir. Jeller ilgili belirli bantların varlığı veya yokluğu için görünür şekilde incelenebilir. Jel 595nm de taranabilir. Tamamlanan jel bir zaman süresiz olarak stabildir. SINIRLAMALAR Tüm elektroforez yöntemleri doğrusal olmadığı için, tekrarlanabilir sonuçlar ve opsiyonel kararlılıktan emin olmak için kullanım kılavuzunu takip etmek önemlidir. Kullanım talimatı izlenirken oluşabilecek hatalar elde edilen sonuçları etkileyebilir. PERFORMANS ÖZELLİKLERİ Tekrarlanabilirlik Aynı numune 3 farklı jel üzerinde test edildi ve her jel üzerindeki bantlar aynı modeli gösterir. Hassasiyet Yöntem, tamamlanmış jel üzerinde ayrık bir bant gibi proteinin en düşük konsantrasyonu olarak belirlendi ve bant başına 10mg/L lik hassasiyete sahiptir. BİBLİYOGRAFİ 1. Fauchier, P. and Catalan, F. Interpretive Guide to Clinical Electrophoresis Alfred Fournier Institute, Paris, France, 1988. 2. Killingsworth, L.M., Cooney, S.K. and Tyllia, M.M. Finding Clues to Disease in Urine Diagnostic Medicine, 1980 ; May/June : 69-75. 3. Umbreit, A. and Wiedemann, G. Determination of Urinary Protein Fractions. A Comparison With Different Electrophoretic Methods and Quantitatively Determined Protein Concentrations Clin. Chim. Acta., 2000; 297 : 163-172. 4. Wiedemann, G. and Umbreit, A. Determination of Urinary Protein Fractions by Different Electrophoretic Methods, Clin. Lab.; 1999, 45 : 257-262. 5. Wong, W.K., Wieringa, G.E., Stec, Z., Russell, J., Cooke, S., Keevil, B.G. and Lockhart, S. A Comparison of Three Procedures for the Detection of Bence-Jones Proteinuria Ann. Clin. Biochem., 1997, 34 : 371-374.