TESTOSTERON ENZİM İMMUNOASSAY TEST KİTİ Katalog Numarası: 4S00072

Yayın Tarihi: 30.10.2012 TESTOSTERON ENZİM İMMUNOASSAY TEST KİTİ Katalog Numarası: 4S00072 General Biologicals Corp. #6, INNOVATION FIRST ROAD, SCIENCE-BASED INDUSTRIAL PARK, HSIN CHU 30077, TAIWAN, R. O. C. İnsan Serumunda Testosteron Konsantrasyonu Kantitatif belirlemesini yapan Enzim Immunotest İN VITRO DIAGNOSTIK KULLANIM İÇIN 2-8 C de saklayınız. ÖZEL VE GENEL İSIMLER GBC Testosterone Enzim Immunotest KULLANIM AMACI GBC Testosteron Enzyme Immunoassay (EIA) testi insan serumunda testosteronun kantitaif olarak tespit edilmesi için üretilmiştir Testoteron ölçümü bazı seksüel ve hormınal hastalığın tanısı amacıyla kullanılmaktadır. GİRİŞ Testosterone, (17 -Hydroxy-4-androstene-3-one), C19 steroid, doğal olarak en çok salınan androjendir. Bu testislerdeki Leydig hücrelerinden, adrenalden ve yumurtalıklardan kana salınan en önemli androjendir. Erkeklerde testosteron, tetislerdeki Leydig hücrelerinden salınır; kadınlarda, dolaşımdaki testosteronun yaklaşık %50 si androstenedionenin periferal dönüşümünden, geri kalanı adrenal ve ovaryan bezden direk sekresyonla elde edilir. Erkelerde, testosteron seviyesi, plasental ve fetal hipofiz gondotropin stimulasyonuna göre fetal hayatın son trimesteri boyunca artar ve sonra azalır, doğum sonrası 30-60 gün içinde tekrar artar. Bundan sonra, testosteron konsantrasyonu çocuklukta düşük seviyelere iner. Erkek pubertesi başlangıcında, gonadotropin sekresyonu, testiküler testosteron üretimini artırır. Yetişkin erkekte, serum testosteron seviyesi sabahları pik yaparak sirkadiyen değişkenlik gösterir. Testosteron ikincil erkek seks karakteri gelişiminden sorumludur ve ölçülmesi hipogonadal durumun belirlenmesine yardımcı olur. Prepubertal erkeklerde, artmış testosteron seviyesi, gonadotropin-bağımlı ve bağımsız erken gelişmiş puberte (testotoxicosis, adrenal hyperplasia ya da adrenal tumor), androjen reseptör defektleri olduğunda görülür. Yetişkin erkeklerde, yüksek testosteron seviyesi, hipotalamik-hipofiz ünitesi hastalıkları, testikular tumorler, konjenital adrenal hyperplasia ve prostat kanseri ile ilişkilidir. Aynı şekilde, ergenlikte ve yetişkin erkeklerde, düşük testosterone seviyesi, primer hypogonadism (testicular dysgenesis, Klinefelter syndrome) içeren çeşitli patolojik durumlar ve gonadotropin eksikliği (hypopituitarism, Kallman syndrome) ile ilişkilidir. Kadınlarda, üçüncü trimesterde çok az bir serum testosteron seviyesi artışı olur, takiben çocuklukta düşük seviyede görülür ve ergenlikte küçük bir artış gösterir. Tüm yaşlardaki kadınlarda, artmış testosterone seviyesi, konjenital adrenal hyperplasia, adrenoblastoma, mixed-gonadal dysgenesis, polycystic ovarian hastalık ve adrenal tumorleri içeren çeşitli virilizan durumlar ile ilişkilidir. Testosteron ölçülmesi, kadınlarda androjen önleyen ilaçların düzeni ve dozajının izlenmesi için kullanılabilir. Serumdaki Testosteron konsantrasyonu, 19-nortestosterone, epitestosterone, ethisterone ve Danazol gibi belli ilaçlar ile artabilir. Benzer şekilde, genel oral kontraseptif ilaçlar, cyprotarone acetate (CPA) içeren ilaçlar ve gonadotropin-releasing hormon (GnRH) analogları, testosteron konsantrasyonu baskılanmasında oldukça etkilidir. Testosteron ölçülmesi postnatal periyotta belirsiz genitelya tanısının ayrımlanmasına yardımcı olur. Eksojen gonadotropin yönetiminden önce ve sonra ölçülmesi, cryptorchidism ve diğer yapısal anomalilerin belirlenmesine yardımcı olur. GBC Testosterone EIA insan serumunda total testosteron ölçümü için güvenli ve duyarlı bir testtir. Kit 0.1-18 ng/ml standart aralığa sahiptir ve belirlenebilen mininmum konsantrasyon 0.06 ng/ml. Test, mikrotiter plate formatında 2 saatte sonuç verir. TEST PRENSIBI Testosteron EIA, sabit miktarda rabbit anti-testosteron için, test örneği içindeki testosterone ile testosterone -horseradish peroxidase (HRP) konjugat arasındaki yarışmalı bağlama prensibine dayanmaktadır. Inkübasyonda; goat anti-rabbit IgG-kaplı kuyucuklar, testosterone standartlar, kontroller, hasta örnekleri, testosterone -HRP konjugat reaktifleri ve rabbit anti-testosterone reaktifleri ile 90 dakika süre ile inkübe edilir. Inkübasyon süresince, sabit miktarda HRP-işaretli testosterone, standart, örnek kalite kontrol serumu içindeki testosterone ile spesifik testosterone antikorları üzerindeki sınırlı sayıdaki bağlanma bölgeleri için yarışır. Bu nedenle, örnek içindeki testosterone konsantrasyonu arttığında kuyucuklara immunolojik olarak bağlanan testosterone-hrp azalır. Bağlanmamış testosterone-peroxidase konjugat uzaklaştırılması için kuycuklar yıkanır. TMB reaktif eklenmesinden sonra mavi renk oluşumu gözlenir. Renk oluşumu durur ve absorbans spektrofotometrik olarak 450 nm de ölçülür. Oluşan rengin şiddeti görülen enzim miktarı ile doğru, örnek içinde bağlanmamış olan testosterone miktarı ile ters orantılıdır. Standart konsantrasyonuna karşı absorbans olacak şekilde bir standart eğri çizilir. Standartlar ile birlikte çalışılan örneğin ve kontrollerin testosterone konsantrasyonu standart eğrisinden hesaplanabilir. KIT İÇERIĞI 1. Antikor-kaplı kuyucuklar (1 plate, 96 kuyucuk) goat anti-rabbit IgG kaplı mikrotiter kuyucuklar 2. Referans Standard Set (0.5 ml/vial) Koruyuculu insan serumunda 0, 0.1, 0.5, 2.0, 6.0 ve 18.0 ng/ml testosterone içerir; likid, kullanıma hazır 3. Rabbit Anti-Testosterone Reaktif (7 ml) Koruyuculu bovine serum albumin (BSA) bufferda rabbit antitestosteron 4. Testosteron-HRP Konjugat Reaktif (12 ml) HRP konjugatlı testosteron içerir

5. Testosteron Kontrol 1 ve 2 (0.5 ml/şişe) 1.0 ve 12 ng/ml testosteron içeren, insan serumunda. Likid, 0.5 ml herbir, kullanıma hazır 6. TMB Reaktif (11 ml) Buffer solusyonunda stabilize 3, 3, 5, 5 -TMB 7. Stop Solusyonu (11 ml) Seyreltilmiş hidroklorik asid içerir (1N HCl) KIT İÇERIĞINDE BULUNMAYAN GEREKLI MATERYALLER 1. Distile ya da deiyonize su 2. 10 µl, 50 µl, 100 µl ve 1.0 ml pipetler 3. Tek kullanımlık pipet uçları 4. 450 nm okuma kapasiteli mikroplate okuyucu. 5. Vorteks mikser 6. Kurutma kağıdı 7. Grafik kağıdı UYARILAR VE ÖNLEMLER 1. ÖNLEM: Bu kit insan materyalleri içermektedir. Kaynak materyaller; FDA onaylı yöntemler ile HBsAg, HIV ½ ve HCV negatifliği açısından test edilmiştir. Fakat, hiçbir metod bu ajanların tam olarak yokluğunu garanti edemez. Bu nedenle; serum da dahil olmak üzere tüm insan kan ürünleri potansiyel enfeksiyon ajanı olarak kabul edilmelidir. Uygulamalar uluslararası güvenlik kurallarına uygun olarak yapılmalıdır. 12 2. 1 N HCl ile temas etmekten kaçınınız. Cildi yakabilir ya da tahriş edebilir. Temas etmeniz halinde bol su ile yıkayın ve eğer bir rahatsızlık hissederseniz doktora başvurun. 3. Reaktifleri son kullanma tarihinden sonra kullanmayınız, birbirine karıştırmayınız ve farklı bir lot numarasına sahip kitin içindeki reaktifleri bu kit ile kullanmayınız. 4. Kullandıktan sonra reaktiflerin kapaklarını kapatınız. 5. Sodyum azide gibi katkı maddesi veya koruyucular içeren solusyonları enzim reaksiyonlarında kullanmayınız. 6. Ağızla pipetleme yapmayınız. 7. Bu kit sadece in vitro teşhis için kullanılır. SAKLAMA KOŞULLARI 1. Kiti kullanmadığınız zamanlarda 2-8 C de saklayınız. Son kullanım tarihi kitin üzerinde yazmaktadır. 2. Mikrotiter pleyti nemden korumak için kapalı poşetinde saklayınız. REAKTIF HAZIRLAMA 1. Kullanmadan önce tüm reaktifleri oda sıcaklığına (18-25 C) çıkarınız. 2. Tüm reaktifler kullanmadan önce vortekslenmelidir. Karıştırma esnasında köpürtmeyiniz. 3. Testosteron konsantrasyonu 18 ng/ml üzerinde beklenen örnekler GBC den verilen diluent ile seyreltilebilir. CIHAZ KULLANIMI Absorbans ölçümü için mikroplate okuyucusunun 10 nm ya da daha az band aralığına ve 450 nm dalgaboyunda 0 dan 3 OD ye kadar ya da daha fazla optik dansite aralığına sahip olması gereklidir. 2 ÖRNEK TOPLAMA VE HAZIRLAMA 1. Bu testte serum kullanılmalıdır. 2. Örnekler için özel bir hazırlık gerekmemektedir. 3. Örnekler 2-8 C de 24 saat saklanabilir ve daha uzun zaman için 20 C de dondurulmalıdır. Hemolitik, lipemik ve bulanık örneklerden kaçınınız. 4. Not: sodium azide içeren örnekler kullanılmamalıdır. PROSEDÜR NOTLARI 1. Manuel Pipetleme: Herbir test çalışması için 32 kuyucuktan fazla kullanmamanız ve çok kananllı pipet ile çalışmanız tavsiye edilir. 2. Otomatik Pipetleme: Her bir test çalışması için 96 kuyucuklu tam plate kullanılabilir. Ayrıca, tüm standartlar, örnekler ve kontrollerin pipetlemelerinin 3 dakika içinde bitirilmesi önerilir. 3. Tüm standartlar, örnekler ve kontroller aynı anda çalışılmalıdır. 4. Stop Solusyonu eklendikten sonra 15 dakika içinde kuyucukların spektrometrede okutulması önerilir. TEST PRENSIBI 1. Yeterli sayıda kuyucuk ayırınız. 2. Uygun kuyucuklara standartlar, örnekler ve kontrollerden 10 L ekleyiniz. 3. Herbir kuyucuğa 100 l of Testosterone-HRP Konjugat Reaktifi ekleyin. 4. Herbir kuyucuğa 50 l rabbit anti-testosteron reaktifi ekleyin. 30 saniye iyice karıştırınız. Bu aşamalarda tamamen karışmaları önemlidir. 5. Pleyti 37 C de 90 dakika inkübe edin. 6. Pleyti tersyüz ederek içeriğini atık kabına dökünüz. Distile ya da deiyonize su ile 5 kez yıkayarak suyu atık kabına boşaltınız. 7. Pleyti tersyüz ederek sert bir şekilde kurutma kağıdına vurunuz ve tüm kalan su damlacıklarını uzaklaştırınız. 8. Herbir kuyucuğa 100 L TMB Reaktifi ekleyiniz. 5 saniye dikkatlice karıştırınız. 9. Pleyti oda ısısında 20 dakika bekletiniz. 10. Herbir kuyucuğa reaksiyonu durdurmak için 100 L Stop Solusyonu ekleyiniz. 11. 30 saniye dikkatlice karıştırınız. Tüm mavi renkli olanların sarı renge dönüşmesini sağlayana kadar. 12. Absorbanslarını mikroplate okuyucu ile 15 dakika içinde 450nm de okuyunuz. KALİTE KONTROL 1. Kit içeriğindeki kullanım bilgileri tam olarak anlaşılıp uygulandığında güvenli ve üretken sonuçlar elde edilir 2. Kontrol olarak Bio-Rad Lyphochek Immunoassay Control Sera kullanılması tavsiye edilir. GBC Testosteron EIA kiti internal kontrol sağlamaktadır. 3. Sodyum azide içeren kontroller kullanılmamalıdır. SONUÇLARIN DEĞERLENDIRILMESI 1. Referans standartlar, kontroller ve örneklerin absorbans değerlerini (OD 450 ) ölçünüz.

2. Dikey eksende absorbans ve yatay eksende konsantrasyon olacak şekilde, doğrusal grafik kağıdına, ng/ml olan konsantrasyonlara karşı herbir ortalama referans standartları gözönüne alınarak standart eğrisi (standard curve) çiziniz. 3. Herbir örneğin ortalama absorbans değerini kullanarak, standart eğrisinden ng/ml olarak testosteron konsantrasyonlarını belirleyin.tecrübelerinize ve/veya bilgisayar kapasitenize bağlı olarak, diğer yöntemlerle de verileri elde edebilirsiniz. 4. Herbir seyreltilmiş örnek, uygun dilusyon faktörleri ile çarpılmalıdır. STANDARD EĞRI ÖRNEĞI Aşağıda, Y-ekseninde tipik standart çalışması ile 450 nmde okunan optik dansiteler, X-ekseninde total testosteron konsantrasyonu (ng/ml) olacak şekilde bir örnek gösterilmiştir. NOT: aşağıdaki standart eğrisi sadece örnek olması için çizilmiştir ve çalışmakta olduğunuz bilinmeyen örneklerin hesaplanmasında kullanılmamalıdır. Herbir laboratuvar, herbir çalışma için kendi bilgilerini ve standart eğrisini hazırlamalıdır. Ayrıca; absorbans (450nm) değerleri farklı laboratuvarlarda farklı oda ısılarında inkübasyonlar ile değişkenlik göstermektedir. Testosterone Absorbans (450 nm) 0 2.432 0.1 1.750 0.5 1.161 2.0 0.832 6.0 0.537 18.0 0.208 4. Bu kit kullanılarak elde edilan sonuçlar sadece diğer diagnostik testlere ek olarak ve doktorlara bilgi sunmak amacı ile kullanılabilir. BEKLENEN DEĞERLER Herbir laboratuar hasta populasyonuna dayanarak kendi normal aralığını belirlemelidir. Testosteron EIA rastgele seçilen ayakta tedavi klinik laboratuar örnekleri ile çalışılmıştır. Belirlenen sonuçlar aşağıdadır: Erkekler: prepubertal (geç) 0.1 0.2 ng/ml Yetişkin 3.0 10.0 ng/ml Kadınlar: prepubertal (geç) 0.1 0.2 ng/ml follicular faz 0.2 0.8 ng/ml luteal faz 0.2 0.8 ng/ml menopoz sonrası 0.08 0.35 ng/ml PERFORMANS ÖZELLIKLERI 1. Doğruluk Istatistik bir çalışma ile 109 insan serum örneği ticari kitler ile karşılaştırılmıştır. GBC Testosteron EIA ve DRG Testosterone kit karşılaştırma sonuçları aşağıdaki gibidir: N = 102 Korelasyon katsayısı = 0.936 Eğim = 0.842 Kesişme =- 0.122 GBC ortalaması = 1.8 ng/ml DRG ortalaması = 1.4 ng/ml Absorbance (450 nm) 3 2.5 2 1.5 1 0.5 0 0 5 10 15 20 Testosterone Conc. SINIRLAMALAR 1. Kit içeriğindeki kullanım bilgileri tam olarak anlaşılıp uygulandığında güvenli ve üretken sonuçlar elde edilir. 2. Yıkama prosedürü kritiktir. Yetersiz yıkama kesinliği azaltmakta ve yanlış yükselmiş absorbans okumalarına neden olmaktadır. 3. Hemolitik, lipemik ve turbid örnekleri bu test ile kullanmaktan kaçınınız. 2. Duyarlılık Testosterone ELISA testi ile minimum belirlenebilen konsantrasyon 0.05 ng/ml. 3. Kesinlik a. Çalışma İçi Kesinlik Çalışma içi kesinlik, bir test içinde 4 farklı kontrol serumunun tekrarlanan kararlılığı ile tanımlanmıştır: Serum Örneği 1 2 3 4 Tekrar Sayısı 24 24 24 24 Ortalama Testosterone 0.44 3.7 5.1 12.7 S.D. 0.03 0.4 0.4 0.6 V.K. (%) 6.4 10.0 8.3 5.0 b. Çalışmalar Arası Kesinlik Çalışmalar arası kesinlik, tek tek kalibre edilmiş testlerde altı farklı serum ölçülerek tanımlanmıştır: 3 Serum Örneği 1 2 3 4

Tekrar Sayısı 20 20 20 20 Ortalama Testosterone 0.45 3.4 5.0 13.3 S.D. 0.02 0.3 0.2 0.5 V.K. (%) 4.4 8.4 4.4 3.7 4. Düzeltme Çalışmaları Testosteron seviyeleri bilinen çeşitli hasta serumları iki kopya olarak çalışılmıştır. Ortalama düzeltme 95.3%. NO. Beklenen [Testosterone] Gözlenen [Testosterone] % Düzeltme 1 8.7 9.2 105.9 2 9.3 9.6 103.6 3 6.3 5.2 83.2 4 5.0 5.0 99.9 5 2.6 3.3 127.5 6 2.4 2.3 97.5 7 0.66 0.46 70.4 8 0.61 0.46 74.6 Erkeklerde: Erkeklerde, testosterone belirlemesi testis fonksiyonları için belirleyici olarak kullanılır: düşük hormon seviyesi Klinefelter sendromu, cryptorchism ve anorchiada görülür. Testosterone eksikliği olan erkeklerde libido azalması, kas gücü azalması jinekomasti ve infertilite gibi semptomlar görülür. Kadınlarda: 1. Virilizan Bozukluklar: Testosterone ölçülmesi virilizan bozuklukların araştırılmasında kullanılır. Testosteron konsantrasyonu >2.0 ng/ml olması ovaryan ya da adrenal neoplazmada androjen sekresyonunu gösterir. 2. Androgen Baskılayıcı İlaçların İzlenmesi: Testosterone ölçülmesi, kadınlarda androjen baskılayan ilaçların ayarlanması ve dozajının tespiti için kullanılabilir. 3. Hamilelik: Testosterone konsantrasyonu hamilelik sırasında rölatif olarak tutarlıdır. 5. Özgünlük Aşağıdaki materyaller çapraz reaksiyon için test edilmiştir. Testosteron ile karşılaştırıldığında %50 çapraz reaksiyon görülür. Aşağıdaki tabloda çeşitli endojenler ve farmasötik steroidler için çapraz reaksiyon bilgileri bulunmaktadır: Çapraz-reaksiyon (%) Gözlenen Testosterone Konsantrasyonu 100 Steroid Konsantrasyonu Steroid Çapraz-Reaksiyon Testosterone 100% Dihydrotestosterone 0.86% Androstenedione 0.89% Androsterone 1.0% 17 Estradiol 0.05% Progesterone <0.05% Epitestosterone 17-OH-Progesterone Estriol Cortisol DHEA-Sulphate <0.05% KLINIK UYGULAMA Bilgi referans # 7 REFERANSLAR 1. Chen, A., Bookstein, J.J., Meldrum, D.R., Diagnosis of a testosterone-secreting adrenal adenoma by selective venous catheterization. Fertil. Steril., 1991; 55: 1202-1203. 2. Granoff, A.B. and Abraham, G.E., Peripheral and adrenal venous levels of steroids in a patient with virilizing adrenal adenoma. Obstet. Gynecol., 1979; 53:111-115. 3. Bricaire, C., Raynaud, A., Benotmane, A., et al., Selective venous catheterization in the evaluation of hyperandrogenism. J. Endocrinol Invest., 1991; 14: 949-956. 4. Heinonen, P.K., Androgen production by epithelial ovarian tumours in post-menopausal women. Maturitas, 1991; 13: 117-117-122. 5. Tietz, N.W. ed., Clinical Guide to Laboratory Tests, 3 rd Edition, W.B. Saunders, Co., Philadelphia, 1995: 578-580. 6. USA Center for Disease Control/National Institute of Health Manual, Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories" 1984. 7. ICN Guide to Endocrine Testing. Diagnostic Division, ICN Biomedicals, Inc. pp. 2:33-35; 3:4-6. Sadece invitro kullanım içindir. Sembol İndeksi Üretici Yetkili Temsilci 4

EC REP GENERAL BIOLOGICALS CORPORATION No.6 INNOVATION FIRST ROAD, SCIENCE BASED INDUSTRIAL PARK, HSIN CHU, 30077, TAIWAN, R.O.C. Tel: +886-35779221 Fax: +886-35779227 Web Site: www.gbc.com.tw Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80, D-66386 St. Ingbert, Germany Tel: +49 (0) 6894-581020 Fax: +49 (0) 6894-581021 5