SEYHAN BARAJ GÖLÜ NDEN İZOLE EDİLEN ENTEROBACTERIACEAE GRUBU BAKTERİLERDE ANTİBİYOTİK DİRENÇLİLİĞİ VE PLAZMİD PROFİLLERİNİN BELİRLENMESİ * Antibiotic Resistances Of Enterobacteriaceae İsolated From Seyhan Dam And Determination Of Plasmid Profile Yasemin KAYA Biyoloji Anabilim Dalı Prof. Dr. Sadık DİNÇER Biyoloji Anabilim Dalı ÖZET Bu çalışmada Seyhan Baraj Gölü den izole edilen Enterobacteriaceae grubu 88 bakteri suşunun çoklu antibiyotik dirençliliği (MAR) belirlenmiştir. İzolatların plazmidleri izole edilerek her bakteriye ait plazmid profili belirlenmiştir. İzolatlardan MAR indeksi 1 olan tek bir bakteri belirlenmiş ve bu suş Escherichia coli olarak tanımlanmıştır. İzolatlardan 14 tanesinin MAR indeksinin 0.142 olduğu belirlenmiştir. Plazmid izolasyonunda 40 izolatın (% 45.5) plazmid içerdiği belirlenmiştir. Antibiyotik sayılarının plazmid ile ilşkilerine bakıldığında 7 antibiyotiğe karşı dirençli olan Escherichia coli suşunda hiç plazmid DNA bandı gözlenmemiştir. Tek antibiyotiğe dirençli olan diğer bir Escherichia coli suşunda ise toplam 7 plazmid DNA bandı olduğu belirlenmiştir. Beş farklı antibiyotiğe dirençli olan yine bir diğer Escherichia coli suşunda ise 14 plazmid DNA bandı gözlenmiştir. Anahtar Kelimeler : Enterobacteriaceae, Seyhan Baraj Gölü, Antibiyotik Dirençliliği, Plazmid izolasyonu, Elektroforez ABSTRACT In this study, Multiple antibiotic resistance was determined 88 Enterobacteriaceae strains which were isolated from Seyhan Dam. Plasmids of these strains were isolated and each of these strains plasmide profile was determined. MAR index of one strain was determined to be 1 and this strain was identified as Escherichia coli. MAR index of 14 strains in total 88 isolates were determined to be 0.142. It was determined that 40 isolates contain plasmid in 88 total isolates. It were seen that relationship with antibiotic count and plasmid profile, Escherichia coli, which was resist to 7 antibiotic, has not any plasmid. But another strain of Escherichia coli, which was resist to 1 antibiotic, has contain total 7 plasmid bands. Moreover, the other Escherichia coli strain resist to 5 antbiotics. But it has 14 plasmid bands. Key Words : Enterobacteriaceae, Seyhan Dam, Antibiotic Resistance, Plasmid isolation, Electrophoresis * Yüksek Lisans Tezi-MSc. Thesis 22
Giriş Mikroorganizmalar değişen çevre koşullarına hızla uyum sağlayabilme yeteneklerine sahip yeryüzünün en eski canlılarıdır (Demirtürk ve Demirdal, 2004). Akuatik çevrelerde bakteriler ekosistemin doğal bir parçasıdır (Robinson ve Tuovinen, 1984). İnsanların günlük yaşam gereği harcadığı ve kullanım sularının oluşturduğu atık sular, çeşitli şekillerde yerleşim birimlerinden çevre sularına katılmaktadırlar. Bu nedenle sucul ortamlar, katılan suların içerdiği kirlilik etkenlerine bağlı olarak organik ve inorganik maddeler tarafından kirletilmektedir (Karayakar ve ark., 2004). Evsel atıklar, R-plazmidi taşıyan ve çoğunluğu insan barsak florasından kaynaklanan bakteriler içerir. Bu bakterilerde antibiyotiklere dirençlilik kazandıran R-plazmidleri yaygın olarak bulunduğundan, atık suların çevre sularına deşarjı, bu tip dirençli bakterilerin çevreye yayılmasına neden olmaktadır (Karayakar ve ark., 2004). Son yıllarda antibiyotiklere karşı giderek artan direnç sorunu tüm dünyayı tehdit eder hale gelmiştir (Akçam ve ark., 2004). Bugün için ise klinik önemi bulunan bakterilerde antibiyotik dirençliliği ile ilgili 100 den fazla gen bulunduğu bilinmektedir. Bir diğer yönden dirençlilik yayılabilir bir özelliktir ve oluştuktan sonra, büyük bir hızla sadece aynı tür ve cinsler içinde değil, plazmid ve transpozonlar gibi aktarılabilir genetik materyallerle diğer bakterilere de geçebilmektedir (Doğancı, 2001). Antibiyotikler, bazı bakteri ve mantar türü mikroorganizmalar tarafından üreme ortamlarında oluşturulan ve başka mikroorganizmalar için mikrobiyostatik ya da mikrobisid etki gösteren ve sağaltımda kullanılan maddelerdir (Bilgehan, 1994). İlk defa İskoç bakteriyolog Alexander Fleming in 1929 da gözlediği ve 1940 yılında Chain ve Flarey in Penicillium notatum un salgılarından elde ettiği ve penisilin adını verdikleri ilacın birçok mikroba öldürücü etkide bulunmasının keşfedilmesi bir devrim olmuştur. İnfeksiyon hastalıklarının tedavisinde antibiyotikler son 50 yılda son derece faydalı olmuşlar ve eskiden öldürücü olduğu bilinen pek çok hastalığın tedavisi için vazgeçilmez unsurlar haline gelmişlerdir (Berzeg, 2005). Antibiyotik direnci; bir mikroorganizma türünün bazı suşlarının antibiyotikten etkilenmemesi ya da antibiyotiğe duyarlı bir suşun çeşitli direnç mekanizmalarından biri ile dirençli hale dönmesi olarak tanımlanır (Demirtürk ve Demirdal, 2004). Antimikrobik kemoterapötik maddeler günümüzde etki mekanizmalarına göre 5 gruba ayrılır; 1. Hücre duvarı sentezini inhibe edenler 2. Sitoplazmik membranın yapı ve fonksiyonunu inhibe edenler 3. Protein sentezini inhibe edenler 4. Kimyasal yapılarındaki benzerlik dolayısı ile bakteri metabolizmasını bozanlar 5. Nükleik asit sentezini inhibe edenler (Baştürk, 2005). 23
Kazanılmış antibiyotik direnci, ya mikroorganizma kromozomunda oluşan mutasyonlarla ya da dirençli bir mikroorganizmanın direnç genini duyarlı mikroorganizmalara aktarması ile ortaya çıkar. (Demirtürk ve Demirdal, 2004). Kromozom dışında, bakterilerin içinde bulunan, DNA yapısında içinde bulunduğu hücreye bazı önemli özellikler kazandıran ve bu özellikleri genetik kontrol altında tutan elementlere plazmid denilmektedir. Plazmidler çift iplikli DNA molekülünden yapılmış, sitoplazma içinde dairesel yapıda bir uçları ile bakteri sitoplazmasının bir noktasına bağlanmış şekilde, bakteri kromozomundan ayrı olarak replike olabilen bakteri kromozomundan daha küçük genetik elementlerdir (Bilgehan, 2002). Plazmidler antimikrobiklere ve ağır metallere direnç genleri yanında değişik virulans faktörlerini de taşıyabilirler. R-plazmidi denen direnç plazmidleri bir veya daha çok sayıda antibiyotiğe karşı direnç genlerini taşımaktadır. Direnç plazmidleri diğer duyarlı bakterilere transdüksiyon, transformasyon ve konjugasyon olaylarıyla geçerek direnç gen paketini aktarır ve böylece direncin yayılmasına neden olur (Gür, 1994). Bilinen başlıca plazmidler şunlardır: 1. F faktörleri (Fertilite=Cinsel=Seks faktörleri) 2. F faktörleri 3. Col plazmidleri (Kolisinojenik faktörleri) 4. R plazmidleri-rtf faktörleri 5. Stafilokok plazmidleri Bakterilerde antibiyotiklere ve kemoterapötik ilaçlara karşı ekstra kromozomal dirençliliğin bakteriden bakteriye aktarılmasını yöneten kromozom dışı elementlerin bulunduğu belirlenmiştir. Bu faktörlere kısaca RTF (rezistans transfer faktörü) adı verilir. Bakteri hücresi içinde çembersel ya da düz olarak bulunurlar (Bilgehan, 1994). Bakteri kromozomu ile de integre olabilirler (Arda, 1995). RTF faktörü bulunduran bakterilerden bu faktörü olmayanlara kemoterapötiklere karşı direnç genlerinin aktarılması, bu faktörlerin kontrolü altında yapılır (Bilgehan, 1994). Mikroorganizmalar arasında gerek in vitro ve gerekse in vivo koşullarda gen veya genetik madde aktarımı meydana gelmektedir. Mikroorganizmalar arasında genetik madde aktarımı beş farklı tipte meydana gelmektedir. Bunlar; 1- Transformasyon 2- Konjugasyon 3- Transdüksiyon 4- Elektroporasyon 5- Protoplast füzyon (Akan, 1992). 24
Materyal ve Metot Materyal Bakteri Suşları Balcı (2007), tarafından Seyhan Baraj Gölü nden 02.11.2005, 29.12.2005,22.03.2006 ve 20.06.2006 tarihlerinde, arazi üzerinde belirlenen 7 farklı istasyondan alınan su örnekleri laboratuara getirilip, bakteri izolasyon yöntemleri uygulanarak saf kültür halinde elde edilen, identifikasyonları ve antibiyogramları yapılan bakteri suşları çalışmamızda kullanılmıştır. Plazmid izolasyon Kiti Çalışmamızda kullandığımız bakteri suşlarının plazmidlerinin izolasyonunda hazır plazmid izolasyon kiti kullanılmıştır (Roche applied science high pure plazmid isolation kit. Cat no: 11 754 777 001). Metot Çizelge 1. Örnek Toplama İstasyonlarının Özellikleri (Balcı, 2007) İstasyonlar Birinci istasyon İkinci istasyon Üçüncü istasyon Dördüncü istasyon Beşinci istasyon Altıncı istasyon Yedinci istasyon Özellikleri Seyhan nehrinin ilk giriş noktasıdır. Seyhan nehrinin baraj suyuyla karıştığı nokta olup yeni yapılmış henüz kullanımda olmayan yerleşim yerlerinin bulunduğu istasyondur. Çakıt nehrinin baraja döküldüğü ilk noktadır. Çakıt nehrinin yerleşim yerlerine olan başlangıç noktasıdır. Çakıt ile Seyhan nehrinin baraj suyuyla birleştiği yerdir. İki su kaynağının gölün suyuyla karıştığı bölge, Adnan Menderes yarımadasının orta bölgesidir Suyun drenaj noktasına gittiği bölge, Kayıkhanenin karşısıdır. Çoklu Antibiyotik Direnci (MAR) İndeksi Çoklu antibiyotik dirençliliği (MAR) indeksi test organizmalarının dirençli olduğu antibiyotik sayısının toplam denenen antibiyotik sayısına oranı ile hesaplanmaktadır. Çoklu antibiyotik dirençliliği (MAR) indeksi verilen populasyonlarda bakteri direnç yayılımını göstermektedir. Hesaplanan MAR indeksi sonucu eğer 0.2 den daha büyükse birkaç antibiyotiğin kullanıldığı ortam kökenli bakteri suşlarının varlığını gösterir (Ehinmidu, 2003). Çalışmamızda kullandığımız 88 izolatın plazmid izolasyonu yapılmıştır ve agaroz jel elektroforez yöntemi uygulanmıştır. 25
Araştırma Bulguları Çalışmada izole edilen bakterilerin toplamı hesaba katıldığında 14 bakteri suşunun (% 15.90) MAR indeksi 0.142, 11 bakteri suşunun (% 12.5) MAR indeksi 0.285, 16 bakteri suşunun (% 18.2) MAR indeksi 0.428, 27 bakteri suşunun (% 30.68) 0.571, 17 bakteri suşunun (% 19.32) 0.714, 2 bakteri suşunun (% 2.27) 0.857 ve bir bakteri suşunun (% 1.14) 1,000 dir. Yüzey sularından izole edilen bakterilerin antibiyotik kullanımına bağlı olarak gösterdikleri çoklu antibiyotik dirençliliği artmaktadır. Benzer konularda yapılan çalışmalarda elde edilen bulgular sonuçları desteklemektedir. Go-Ni-Urriza ve arkadaşları (2000), nehrinden izole edilen Enterobacteriaceae spp. suşlarının %72 sinin, Aeromonas sp. suşlarının ise %20 sinin nalidiksik aside karşı dirençli olduğunu tespit etmişlerdir. Enterobacteriaceae sp izolatlarının tetrasikline %24.3, beta-laktamlara %20.5 dirençli olduklarını, Aeromonas sp izolatlarının ise tetrasikline %27.5, co-trimoksazole %26.6 dirençli olduklarını bulmuşlardır. Bakterilerde çoklu antibiyotik dirençliliğinin gelişmesinde çeşitli faktörler rol oynamaktadır. Colamiris ve ark., (1984), zararsız olarak tanımlanan bazı bakterilerde R-faktörlerine bağlı MAR dirençliliği olduğunu tespit etmişlerdir. Antibiyotiklere karşı geliştirilen direnç kromozomal olabileceği gibi ekstrakromozomal kökenli de olabilmektedir. Çalışmada izole edilen 88 Enterobacteriaceae grubu bakterilerin tamamı kullanılarak plazmid izolasyonları gerçekleştirilmiştir. Seçilen bakteri suşlarından izole edilen plazmidlerin büyüklükleri agaroz jelde yürütülen marker DNA sına göre belirlenmiştir. Çalışmada izole edilen 88 bakteriden gerçekleştirilen plazmid izolasyonunda 40 bakteride (% 45.5) plazmid saptanmıştır. Plazmid izole edilen bakterilerde, 5 farklı antibiyotiğe dirençli olan 1 bakterinin (% 1.14) izole edilen 14 plazmid bandı olduğu, 1 bakterinin (% 1.14) 13 plazmid bandı olduğu ve bir bakterinin de (% 1.14) 12 plazmid bandı olduğu belirlenmiştir. 6 farklı antibiyotiğe direnç gösteren 2 bakteride (% 2.27) ise 2 plazmid bandı olduğu belirlenmiştir. 2 farklı antibiyotiğe dirençli olan 2 bakteride (% 2.27) ise 7 plazmid bandı olduğu belirlenmiştir. Tek antibiyotiğe dirençli olan 1 bakteride (% 1.14) ise 7 plazmid bandı olduğu belirlenmiştir. 5 farklı antibiyotiğe dirençli olan 1 bakteride (%1.14) ise tek plazmid bandı olduğu belirlenmiştir. 7 farklı antibiyotiğe direnç olan 1 bakteride (% 1.14) ise plazmid bandı gözlenmemiştir. Yine 4 farklı antibiyotiğe dirençli olan 21 bakteride de (% 23.86) plazmid bandı gözlenmemiştir. Shah ve Stille (1983), yaptıkları çalışmalar sonucunda Almanya da betalaktam antibiyotiklere karşı Klebsiella pneumoniae ve Escherichia. coli suşlarının dirençlilik kazandıklarını tespit etmişlerdir. Saunders (1984), farklı konaklardan izole edilen suşlar arasında antibiyotik dirençliliğinin plazmidlerle aktarıldığını bildirmiştir. 26
Tartışma ve Sonuçlar Bu çalışmada Seyhan Baraj Gölünden 7 farklı istasyon belirlenerek 4 farklı zaman aralığında yüzey suyu ve dip suyu örnekleri toplanarak bu örneklerden izole edilen Enterobacteriaceae grubu bakterilerin antibiyotik dirençlilik düzeyleri tespit edilmiş ve bu dirençliliğin plasmid kökenli olup olmadıkları, izole edilen plasmidlerin büyüklükleri elektroforez yapılarak tespit edilmiştir. 2. 4. ve 6. istasyonlar insan aktivitelerinin en fazla olabileceği bölgeler olup bu bölgelerden izole edilen Enterobacteriaceae grubu bakterlerde antibiyotik dirençlilik düzeyinin yüksek olduğu belirlenmiştir. İzolatların 14 ü bir antibiyotiğe dirençli iken 5. istasyondan izole edilen ve Escherichia coli olarak tanımlanan 88 izolatın 1 tanesinin çalışmada kullanılan 7 antibiyotiğe karşı dirençli olduğu tespit edilmiştir. Diğer izolatların ise en az 2 antibiyotiğe dirençli olduğu belirlenmiştir. Yoğun antibiyotik kullanımı genellikle plazmide bağlı dirençliliğinin ortaya çıkmasında önemli rol oynamaktadır. Seyhan Nehri nin mikrobiyal kontaminasyona maruz kalması, izole edilen bakteriler arasında 7 antibiyotiğe dirençli organizma izole edilmiş olması bu durumların halk sağlığı açısından ciddi problemler teşkil edebileceğini düşündürebilir. Sulak alanların mikrobiyal kirlilikten kurtarılması ve daha fazla kirlenmesini engellemek için göle giren fekal kökenli kirlilik kaynaklarının ve atık su deşarjlarının önlenmesi büyük öneme sahip olacaktır. Bu sulak alanlara yakın bölgelerde imara açılacak olan sitelerin özellikle atık suların sulak alanlara verilmemesi ve kaçaklardan kaynaklanacak kirlenmenin önüne geçilmesi öneriler arasında sunulabilir. Kaynaklar AKÇAM, F. Z., GÖNEN, İ., KAYA, O., ve YAYLI, G., 2004. Hastane İnfeksiyonu Etkeni Enterobakterilerde Beta-laktam Antibiyotiklere Duyarlılık ve ESBL Sıklığının Araştırılması. Süleyman Demirel Üniversitesi Tıp Fak. Dergisi, 11(1):6-9 BAŞTÜRK, S., 2005. Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa ve Acinetobacter baumannii Suşlarında Çeşitli Kinolon Grubu Antibiyotiklerin Duyarlılıklarının Araştırılması. Haseki Eğitim ve Araştırma Hastanesi İnfeksiyon Hastalıkları ve Klinik Mikrobiyoloji Kliniği Uzmanlık Tezi, 61:7 BALCI, R. S., 2007. Seyhan Baraj Gölünün Bakteriyolojik Kirlilik Düzeyinin Belirlenmesi ve Enterobacteriaceae Üyelerinde Antibiyotik Dirençliliği. Çukurova Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Yüksek Lisans Tezi. BERZEG, D., 2005. Çeşitli Klinik Materyallerden İzole Edilen Enterokok Suşlarında Antibiyotik Direnci, Yüksek Düzey Aminoglikozid Direnci ve E Test ile Vankomisin MİK Değerlerinin Değerlendirilmesi. Haseki Eğitim ve Araştırma Hastanesi İnfeksiyon Hastalıkları ve Klinik Mikrobiyoloji Kliniği Uzmanlık Tezi, 95:5-6 27
BİLGEHAN, H., 1994. Temel Mikrobiyoloji ve Bağışıklık Bilimi. Fakülteler Kitap Evi Barış Yayınları, 589:145-178. BİLGEHAN, H., 2002. Klinik Mikrobiyolojik Tanı, Fakülteler Kitap Evi Barış Yayınları, 777s. COLAMIRIS, J. J., ARMSTRONG, J. L., SEIDLER, R. J., 1984. Association of Metal Tolerance with Multiple-Antibiotic Resistance of Bacteria Isolated from Drinking Water, Apply. Environ. Microbiol. 47:1238 1242. DEMİRTÜRK, N., ve DEMİRDAL, T., 2004. Antibiyotiklerde Direnç Sorunu. Kocatepe Tıp Dergisi 5 sf:17-21 DOĞANCI, L., 2001. Antibiyotik Direncinin Sıklığı Üzerine Antibiyotik Kullanımının Etkisi. Klinik Dergisi Cilt 14(2) sf:57-61 EHINMIDU, J. O., 2003. Antibiotics Susceptibility Patterns of Urine Bacterial Isolates in Zaria, Nigeria. Tropical Journal of Pharmaceutical Research, 2(2):223-228 GÜR, D., 1994. Antibiyotiklere Direnç Gelişmesi. Klinik Uygulamalarda Antibiyotikler ve Diğer Antimikrobiyal İlaçlar. Güneş Kitabevi Limitet Şirketi. Ankara, s.19 37 HALKMAN, K., A., 2005. Gıda Mikrobiyolojisi Uygulamaları (Editör, Halkman). Merc Gıda Mikrobiyolojisi Uygulamarı. s. 261-281. KARAYAKAR, F., AY, Ö., CİCİK, B., 2004. Mersin Kıyı Şeridinden Alınan Su Örneklerinden İzole Edilen Escherichia coli Suşlarının Bazı Antibiyotiklere Karşı Plasmid Kökenli Dirençliliğin Saptanması. Eko. Çev. Kor. 13,52: 28 32. ROBINSON, J. B., TUOVINEN, O. H., 1984. Mechanism of microbial resistance and detoxification of mercury and organomercury compounds: Physiological, Biochemical, and Genetic Analyses. Microbiological Reviews 48(2), 95-124. SAUNDERS, J.R., 1984. Genetics and Evolution of antibiotic Resistance, British Medical Bulletin, 40:54-60. SHAH, P. M., STILLE, W., 1983. Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae Strains More Suspectible to Cefoxitin than to III-Generation Cephalsporins. J. Antimicrob cchemother., 11: 597-598. 28