ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ YONCA, KORUNGA VE FİĞDE TOHUMLA TAŞINAN FUNGAL HASTALIK ETMENLERİNİN BELİRLENMESİ Ülkü ER BİTKİ KORUMA ANABİLİMDALI ANKARA 2008 Her Hakkı Saklıdır
ÖZET Yüksek Lisans Tezi YONCA, KORUNGA VE FİĞDE TOHUMLA TAŞINAN FUNGAL HASTALIK ETMENLERİNİN BELİRLENMESİ Ülkü ER Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Bitki Koruma Anabilimdalı Danışman: Prof. Dr. Y. Zekai KATIRCIOĞLU 2005-2006 yıllarında 4 adedi Tarım İşletmeleri, 1 adedi Doğu Anadolu Tarımsal Araştırma Enstitüsü nden ve 5 adedi özel sektör tohumculuk firmalarından alınan toplam 10 adet yonca, Tarım İşletmeleri nden alınan 4 adet fiğ ve 3 adet korunga tohumlarında nemli hücre ve agar yöntemi kullanılarak fungal flora saptanmıştır. Tohumlardan izole edilen funguslardan tohumla taşınma ihtimali olanlara patojenite testi uygulanmıştır. Nemli hücre yöntemiyle yonca tohumluklarında en yaygın fungus Rhizopus sp., korunga tohumluklarında en yaygın fungus Alternaria alternata, fiğ tohumluklarında ise en yaygın fungus türleri Penicillium spp. olarak tespit edilmiştir. Agar yönteminde ise yonca ve korunga tohumlarında Alternaria alternata, fiğ tohumlarında Penicillium spp. nin en yaygın funguslar olduğu ortaya konmuştur. En fazla fungus cins ve türü nemli hücre yöntemiyle elde dilmiştir. Alternaria alternata nın yonca, A. teunissima nın fiğ ve Fusarium solani nin korunga, F. equiseti nin fiğ bitkilerinde patojen olduğu tespit edilmiştir. Haziran 2008, 41 sayfa Anahtar Kelimeler: Yonca, korunga, adi fiğ, Medicaga sativa, Onobrychis sativa, Vicia sativa, tohumla taşınan hastalık i
ABSTRACT Master Thesis DETERMINATION OF SEED TRANSMITTED FUNGAL DISEASES OF ALFALFA, SAINFOIN AND COMMON VETCH PLANT Ülkü ER Ankara University Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Plant Protection Supervisor: Prof. Dr. Y. Zekai KATIRCIOĞLU Fungal flora of alfalfa, vetch and sainfoin seeds of 10, 4 and 3 samples collected from state farms, agricultural research institutes and private firms were determined by blotter and agar methods, in 2005 2006 years. Some fungi were tested for then pathogenicity. The most widespread fungi found on blotter test of alfalfa, sainfoin and vetch seed samples were Rhizopus spp., Alternaria alternata, and Penicillium spp. respectivly. In agar method the commonest fungi were Alternaria alternata on alfalfa and sainfoin seed samples while it was Penicillium spp. on vetch seed samples. The highest number of genera were determined on blotter method. Alternaria alternata was pathogenic on alfalfa, A. tenuissima on vetch Fusarium solani on sainfoin while F. equiseti on vetch. June 2008, 41 pages Key Words: Alfalfa, common vetch, sainfoin, seed transmitted diseases ii
TEŞEKKÜR Bu çalışmanın gerçekleşmesinde yardım ve desteğini esirgemeyen, çalışmanın her safhasında yakın ilgi ve önerileri ile beni yönlendiren danışman hocam, Sayın Prof. Dr. Y. Zekai KATIRCIOĞLU na ve bu çalışmanın yapılmasından gerçekleşmesine kadar görüş, düşünce, bilgi ve deneyimlerinden yararlandığım değerli hocam Prof. Dr. Salih MADEN e, maddi ve manevi olarak hiçbir desteğini esirgemeyen aileme, çalışmalarım boyunca bana destek veren Genel Müdürüm Ömer KELEŞ e ve tezin yazımında bana yarımcı olan arkadaşım Seval GÖKKURT a teşekkürlerimi sunarım. Ülkü ER Ankara, Haziran 2008 iii
İÇİNDEKİLER ÖZET...i ABSTRACT...ii TEŞEKKÜR....iii ŞEKİLLER DİZİNİ......v ÇİZELGELER DİZİNİ......vi 1. GİRİŞ........1 2. KAYNAK ÖZETLERİ....5 3. MATERYAL VE YÖNTEM........15 3.1 Materyal...15 3.2 Yöntem......16 3.2.1 Standart nemli hücre (Blotter) yöntemi.....16 3.2.2 Agar yöntemi.....16 3.2.3 Fungusların patojenitelerinin belirlenmesi....17 4. ARAŞTIRMA BULGULARI.......19 4.1 Nemli Hücre Yöntemi İle Tespit Edilen Funguslar..... 19 4.2 Agar Yöntemi İle Tespit Edilen Funguslar... 24 4.3 Fungusların Patojenitelerinin Tespiti............27 5. TARTIŞMA VE SONUÇ......31 KAYNAKLAR... 37 ÖZGEÇMİŞ.......41 iv
ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil 4.1 Alternaria alternata nın (a) yonca yapraklarındaki belirtisi (b) sporları (Konidileri).... 28 Şekil 4.2 Alternaria teunissima nın fiğ yapraklardaki belirtisi......29 Şekil 4.3 Korunga bitkisinin köklerinde oluşan Fusarium solani zararı.... 30 Şekil 4.4 Fiğ bitkisinin köklerinde oluşan Fusarium equiseti zararı...30 v
ÇİZELGELER DİZİNİ Çizelge 1.1 Türkiye de yıllar itibariyle yem bitkileri ekiliş alanları...3 Çizelge 3.1 Çalışmada kullanılan tohum örneklerinin alındığı yer, yıl ve alınan örneklerin sayısı...15 Çizelge 4.1 Tarım İşletmeleri, Doğu Anadolu Tarımsal Araştırma Enstitüsü ve Özel Tohumculuk Firmalarından 2005 ve 2006 yıllarında alınan yonca tohum örneklerinde nemli hücre yöntemi ile tespit edilen funguslar ve bulunma yüzdeleri 20 Çizelge 4.2 Tarım İşletmeleri nden elde edilen korunga tohumluk örneklerinde nemli hücre yöntemi ile saptanan funguslar ve bulunma yüzdeleri. 22 Çizelge 4.3 Tarım İşletmeleri nden elde edile fiğ tohumluk örneklerinde nemli hücre yöntemi ile saptanan funguslar ve bulunma yüzdeleri...23 Çizelge 4.4 Tarım İşletmeleri, Doğu Anadolu Tarımsal Araştırma Enstitüsü ve Özel Tohumculuk Firmalarından 2005 ve 2006 yıllarında alınan yonca tohum örneklerinde agar yöntemi ile tespit edilen funguslar ve bulunma yüzdeleri 25 Çizelge 4.5 Tarım İşletmeleri nden elde edilen korunga tohumluk örneklerinde agar yöntemi ile saptanan funguslar ve bulunma yüzdeleri...26 Çizelge 4.6 Tarım İşletmeleri nden elde edilen fiğ tohumluk örneklerinde agar yöntemi ile saptanan funguslar ve bulunma yüzdeleri......27 vi
1. GİRİŞ Yem bitkileri tarımının tarihi kesin olarak bilinmemektedir. Ancak M.Ö. 1350 yıllarında Anadolu da yoncadan yararlanıldığı Hitit Yazıtlarından anlaşılmaktadır. Yem bitkilerinin tarihi bu kadar eskilere dayanmasına karşın planlı ve sistemli bir üretimin başlaması 17.yy dan sonra Avrupa da görülmektedir. Ülkemizde bilinçli bir yem bitkisi tarımı Cumhuriyet Dönemi başında görülmektedir (Soya vd. 1997). Baklagil yem bitkileri derinlere inen kökleri ile buralarda bulunan besin maddelerini toprağın üst katmanlarına taşırlar, kuvvetli kök sistemleri ile toprağı gevşeterek toprağın drenajını, havalanmasını ve fiziksel özelliklerini iyileştirir, toprağı erozyona karşı koruyarak toprak ve su kaybını önlerler. Toprağı organik madde yönünden zenginleştirerek, topraktaki mikroorganizma etkinliğini artırırlar. Köklerinde ortak yaşayan Rhizobium bakterileri yardımıyla atmosferdeki azotu bitkilere yarayışlı hale getirirler. Ekim nöbeti sistemleri içerisinde ana ürünlerin araziyi boş bıraktıkları devrelerde yetişme süreleri kısa olan fiğ türleri, yem bezelyesi, mürdümük gibi yem bitkileri önemli miktarda kaliteli kaba yem üretimini sağlar ve arazi daha verimli kullanılır. Yem bitkileri tarıma yeni açılacak alanlarda, kuru tarımdan sulu tarıma geçilecek yerlerde ve her hangi bir nedenle üst toprak tabakasız arazilerde öncü bitki olarak önem taşırlar (Anonim 2008a). Yonca (Medicago sativa) diğer bitkilerden protein, vitamin ve mineral maddece daha zengin olan bir yem bitkisidir. Bununla birlikte adaptasyon yeteneği yüksek, uzun ömürlü ve bir vejetasyon döneminde bir çok defa biçilebilen, verimi yüksek olan bir yem bitkisidir (Soya vd. 1997). Soya vd. (1997) e göre Korunga (Onobrychis sativa) kısa ömürlü, çok yıllık bir baklagil yem bitkisidir. Soğuğa ve kurağa çok dayanıklıdır. Diğer bitkilerin yetişemediği kıraç, kireçli topraklarda iyi gelişir. Yem kalitesi iyidir, yemi proteince zengindir. Korunga otunun besleme değeri yüksektir; kalsiyum, fosfor ve diğer mineral elementlerce zengindir. Yeşil ot olarak hayvanlara yedirildiğinde şişkinlik yapmaz. Kökleri 1
yardımıyla toprağa azot kazandırır. Çok iyi bir balözü bitkisidir. Otlatmaya dayanıklı olduğundan iyi bir mera bitkisi olarak da kullanılabilir. Özellikle kurak ve yarı kurak bölgelerde iyi bir ekim nöbeti bitkisidir (Yüksek vd. 2007). Fiğ (Vicia sativa), yeşil yem ve kuru ot olarak veya slaj yapılarak değerlendirilebilmesinin yanı sıra yeşil gübre olarak da değerlendirilebilir. Ayrıca erozyonun önlenmesinde önemli bir yere sahiptir, iyi bir ekim nöbeti bitkisidir (Soya vd. 1997). Tohumluk Tescil ve Sertifikasyon Merkezi Müdürlüğü verilerine göre; ülkemizde 25 çeşit (13 tescilli, 12 üretim izinli) yonca, 19 çeşit (18 tescilli, 1 üretim izinli) adi fiğ ve 3 çeşit (2 tescilli, 1 üretim izinli) korunga; araştırma enstitüleri, üniversiteler ve özel tohumculuk firmaları tarafından kayıt altına alınmıştır (Anonim 2008b). 2007 yılı TÜGEM verileri incelendiğinde 3,085 ton yonca tohumunun özel firmalarca ithal edildiği, 670 ton tohum üretiminin gerçekleştiği görülmektedir; yine bu veriler incelendiğinde 1,316 ton korunga ve 232 ton adi fiğ tohumunun ithal edildiği ve 1,680 ton korunga tohumunun, 460 ton adi fiğ tohumunun üretildiği görülmektedir. Bu kayıtlı çeşitler ile ülkemizde çok fazla miktarda üretim yapılmamaktadır. Özellikle korunga ve adi fiğ tohumluklarının büyük bir miktarının üretimleri TİGEM tarafından gerçekleştirilmektedir (Anonim 2008c). Özel tohumculuk firmaları çoğunlukla kayıt ettirdikleri çeşitleri ithal ederek iç pazara sunmaktadır. Türkiye de yem bitkilerinin üretiminin desteklenmesi yem bitkileri tohumluklarına olan ihtiyacı artırmaktadır. Özellikle de çiftçilerimiz desteklemeden yararlanmak amacıyla son yıllarda bilinçsizce bu yem bitkilerini üretmektedir. Bunun sonucunda yalnızca desteği almak amacı ile yem bitkileri üretimi yapan çiftçi sayısının artması yonca, korunga ve adi fiğ tohumluklarına olan talebi artırmıştır, yurt içi üretimler yeterli olmadığı için ithalat miktarında da artışlar olmuştur. Türkiye de toplam işlenen tarım alanı 23 milyon hektardır. Bu işlenen tarla alanının 17.6 milyon hektarında tarla bitkileri üretilmekte, 4.6 milyon hektar alan nadasa bırakılmaktadır (Anonim 2007). 2
Yonca, korunga ve fiğin Türkiye deki toplam ekim alanları 2006 yılı verilerine göre Çizelge 1.1 de verilmiştir. Bu verilere göre yem bitkileri üretim alanı geçmiş yıllara göre artış göstermektedir. Çizelge 1.1 Türkiye de yıllar itibariyle yem bitkileri ekiliş alanları (ha) (Anonim 2007) YILLAR Yonca Korunga Fiğ TOPLAM 2000 250.800 107.500-358.300 2001 249.000 105.500-354.500 2002 260.000 99.000-359.000 2003 290.000 108.000-398.000 2004 320.000 107.000 220.000 647.000 2005 375.000 110.000 250.000 735.000 2006 444.029 117.609 386.288 947.926 Yeşil ot üretiminde yonca 1,8 milyon ton ile birinci sırada yer alırken, 1milyon ton yeşil ot üretimiyle fiğ ikinci sırada yer almıştır. Korunganın ise 124 bin ton yeşil ot üretimi gerçekleşmiştir. Yine kuru ot üretiminde de 2,8 milyon ton üretim ile yonca birinci sırada yer alırken, bunu 1,2 milyon ton üretim ile fiğ ikinci sırada takip etmiş, korunga kuru ot üretimi ise 496 bin ton olarak gerçekleşmiştir (Anonim 2007). Çizelge 1.1 deki istatistiki veriler incelendiğinde yem bitkileri ekim alanı toplam ekili alan içinde oldukça az bir yere sahiptir. Ekiz (1995) tarafından hayvancılığın ileri olduğu bir çok ülkede tarla tarımının dörtte birinin yem bitkilerine ayrılmış olduğu ve evcil hayvanların besinlerini çayır meralar ve tarla tarımı içerisinde yetiştirilen bitkilerden karşılandığı ifade edilmiştir. Aşırı ve erken otlatmalar gibi bazı yanlış uygulamalar ile çayır ve meraların bozulduğu ve birim alan verimlerinin düştüğü bundan dolayı da hayvan varlığımızın beslenmesini tarla ziraatı içindeki yem bitkilerine kaydırmamız gerektiği belirtilmiştir. Anonim (2006) Hayvan varlığımızın kaliteli kaba yem ihtiyacı 50 milyon ton civarında iken bu ihtiyacın yaklaşık 25 milyonu karşılanabilmektedir. 3
Tarımın diğer bir kolu olan hayvancılığın gelişmesi ve hayvan yemi ihtiyacının karşılanması için yem bitkilerinin üretiminin artırılması gerekmektedir. Ülkemizde, son yıllarda hayvancılığın desteklenmesi kapsamında yem bitkileri yetiştiriciliğine uygulanan desteklemeler ile yem bitkisi üretimi artış göstermiştir. Bu desteklemeler ile sertifikalı tohumluk kullanımı teşvik edilmektedir. Yem bitkileri üretiminde önemli bir girdi olan tohum; sağlıklı bitki yetiştirebilmenin ilk aşamasını oluşturur. Sağlıklı bitkiler yetiştirmek için hastalıksız tohumlar kullanılmalı ve yem bitkilerinin gelişmesi için uygun koşullar sağlanmalıdır. Ülkemizde yonca başta olmak üzere korunga ve fiğ gibi baklagil yem bitkileri hastalıkları üzerine yapılan bazı çalışmalar bulunmaktadır. Tuncer (1984) Orta Anadolu Bölgesi nde yetiştirilen yoncalardaki hastalıkların tespiti ile ilgili çalışmış ve ayrıca bu çalışmasında tohumlardaki etmenlerin tespiti amacıyla da sörvey sırasında çiftçilerden aldığı tohumlarda nemli hücre yöntemini uygulamıştır. Eken (1999) Erzurum da yetiştirilen yoncalardaki hastalıkları ve Eken and Demirci (2003) yonca, korunga ve fiğ bitkisinin kökünden izole ettiği Rhizoctonia izolatları üzerinde, Eken and Demirci (2004) korunga köklerinden izole ettikleri Fusarium türleri üzerinde çalışmışlardır. Ayrıca Onar and Karakaya (2006) Ziraat Fakültesi yonca ekim alanlarındaki önemli hastalıkları tespit etmişlerdir. Ancak Türkiye de bu bitkilerin tohumlarının hastalıkları üzerine ayrıntılı çalışma bulunmazken, dünya da da yonca, korunga ve fiğ tohumlarındaki hastalıklarla ilgili fazla çalışmaya rastlanılmamıştır. Ayrıca nadas alanlarının azaltılması amacıyla ve ekim nöbetinde ya da ana üründen sonra ikinci üründe baklagil yem bitkilerinin ekilmesi ve son yıllarda hayvancılığın geliştirilmesi amacıyla yem bitkileri üretiminin desteklenmesi ile bu bitkilerin üretim alanlarının artması yonca, korunga ve fiğin önemini bir kat daha artırmıştır. Önemi artan bu bitkilerin tohumlarına talep her geçen gün artmaktadır. Kaliteli ve yüksek verimli bitkiler yetiştirmek isteyen çiftçilerimiz hastalıklardan ari sertifikalı tohumluklar ile üretim yapmalıdır. Hastalıklardan ari tohumluk yetiştirebilmek için ise öncelikle bu bitkilerin tohumlarındaki hastalık etmenlerinin belirlenmesi ve bu etmenlerin tohumla taşınma durumlarının ortaya konması gerekmektedir. Hastalık etmenlerinin büyük bir grubunu fungal etmenler oluşturmaktadır. Bundan dolayı yonca, korunga ve fiğ tohumlarındaki fungal etmenlerin belirlenmesi ve bunların tohumla taşınması durumunun ortaya çıkarılması, bu konuyla ilgili yapılacak detaylı çalışmalara başlangıç teşkil etmesi amacıyla bu çalışma yapılmıştır. 4
2. KAYNAK ÖZETLERİ Tohumlar canlı bir embriyo içeren, biyolojik olarak dormant ve çok karmaşık yapılardır. Parazitik ve saprofit özellikteki mikroorganizmalar tohumla birlikte bulunabilirler. Tohumda bulunan bu mikroorganizmaları ortaya çıkarmak için kullanılan yöntemler basit gözlemlerden, elektron mikroskobu ve seroloji gibi çok gelişmiş tekniklere kadar uzanır. Yıllık kültür bitkilerinin hastalıkları bir yıldan diğer yıla; toprağa düşmüş sporlar, tarlada kalmış hastalıklı bitki artıkları veya ekilen tohumlar üzerinde geçerler. Bu bakımdan ekilecek tohumun hastalıksız olması lazımdır. Tohumla geçerek bitkilerin muhtelif yerlerinde zarar yapan hastalıkların mücadelesini daha kolay ve daha ucuza yapabilmek için, hastalık sporlarının tohum üzerinde olup olmadıklarının önceden tespiti ve ona göre gerekli mücadelenin yapılması gerekir (Göbelez 1956). Anonymous (1979) a göre yoncada fungus, bakteri ve virüsler zarara sebep olmaktadır. En az 40 fungus cinsi yonca bitkisini istila eder ki bu en geniş organizma grubudur. Yoncalarda tespit edilen bakteriyel etmenler; Corynebacterium insidiosum, Xanthomonas alfalfae, Pseudomonas syringae, Agrobacterium tumefaciens dir. Viral etmenler ise yonca mozaik virüsü (AMV), yonca enasyon virüsü, yonca çizgi virüsü, yonca latent virüsü (ALV) dür. Pythium spp., Phoma medicaginis, Pseudopeziza medicaginis, Leptotrochila medicaginis, Leptosphaerulina briosiana, Stemphylium botryosum, Cercospora medicaginis, Stagonospora meliloti, Colletotrichum trifolii, Peronospora trifoliorum, Uromyces striatus, Phsoderma alfalfae, Phytophthora megasperma, Rhizoctonia solani, R. crocorum, Sclerotinia trifoliorum, Sclerotium rolfsii, Verticillium albo atrum, Fusarium oxysporum f. sp. medicaginis, F. solani, F. roseum, Phymatotrichum omnivorum, Mycoleptodiscus terrestris, Cylindrocarpon ehrenbergii, Plenodomus meliloti türlerinin yonca bitkisinin kök, gövde ve yapraklarında fungal hastalıklara neden olduğu ve Phoma medicaginis, Stemphylium botryosum, Verticillium albo atrum türlerinin tohumla taşındığı bildirilmiştir. 5
Tuncer (1984) Orta Anadolu Bölgesi yonca ekim alanlarında sürdürdüğü çalışmasında, yonca ekim alanlarının fazla olduğu 6 ildeki 180 örneği incelemesi sonucunda; Pseudopeziza medicaginis, Sporonema phacidioides, Phoma medicaginis, Leveillula taurica, Uromyces striatus, Stemphylium botryosum, Stagonospora sp., Alternaria sp., Botryodiplodia sp., Epicoccum sp., Curvularia inaequalis, Trichoderma sp., Rhizoctonia violaceae, Rhizoctonia solani, Colletotrichum gleosporioides, Fusarium acuminatum, F. avenaceum, F. oxysporum, F. equiseti, F. solani tespit etmiştir. Aynı araştırcı yaptığı sürvey çalışması sırasında üreticilerden aldığı tohumlar üzerindeki etmenleri saptamak amacıyla nemli hücre yöntemiyle her örnekten 100 er adet tohum incelemiş ve sonuç olarak tohumdan yaptığı izolasyonlarda Penicillium sp. ve Ulocladium sp. den başka fungus gelişmediğini, özellikle de Phoma medicaginis in tohum üzerinde tespit edilmediğini bildirmiştir. Eken (1999) Erzurum ilinde yonca bitkisinin kök, gövde ve yapraklarında hastalık oluşturan fungal etmenlerin tanılanması, yayılışları, hastalık oranları ve yörede yaygın olarak yetiştirilen yonca çeşitlerindeki patojenlerin saptanması amacıyla 1996-1998 yılları arasında yapmış olduğu çalışma sonucunda; Colletotrichum trifolii, C. truncatum, Fusarium acuminatum, F. avenaceum, F. equiseti, F. flocciferum, F. oxysporum, F. semitectum, F. solani, Leptotrochila medicaginis, Leveillula taurica, Macrophomina phaseolina, Peronospora trifoliorum, Phoma medicaginis, Pseudopeziza medicaginis, Pythium acanthophoron, Pythium HS (hyphal-swelling) grup, Rhizoctonia crocorum, R. solani, iki nükleuslu Rhizoctonia spp., Sclerotinia trifoliorum,, Stagonospora meliloti, Stemphylium botryosum, Trematosphaerina circinas, Uromyces striatus ve steril misel olmak üzere 26 fungus türü saptamıştır. Eken and Demirci (2003) Erzurum da yetiştirilen yonca, korunga ve adi fiğ bitkisinin kök ve taç kısmından 225 Rhizoctonia izolatını elde etmişlerdir. Yonca, korunga ve fiğde yapılan patojenite testlerinde AG-4 ve AG-5 izolatları en yüksek şiddette hastalığa sebep olmuşlardır. AG-1 ve AG-10 izolatları üç test bitkisinde de patojen bulunmaz iken AG-K yonca ve korungada, AG-2-1 ve AG-3 izolatları korungada kısmen virülent bulunmuştur. R. solani AG-3, AG-5, AG-10 ve çift çekirdekli Rhizoctonia AG-1 yonca 6
üzerinde ilk kayıttır. Buna ek olarak korunga ve adi fiğden R. solani ve çift çekirdekli Rhizoctonia grupları Türkiye de ilk kez bu ürünlerde izole edilmiştir. Eken (2003) Erzurum da 2000-2001 yazında korunga ekili belirli alanlarda önemli tipik yanıklık belirtileri olan bir hastalık gözlemlemiştir. Bu hastalığın ilk belirtileri yapraklarda kahverengi ortası daha açık renkli dairesel, gövdede ise içe gömülmüş, yapraklardan daha koyu renkli ve buralarda piknitlerin yayıldığı simptomlar olarak bildirmiştir. Bu fungusu, hastalıklı yaprak ve saplardaki belirtilerden, PDA ortamında izole etmiş ve Ascochyta fabae olarak tanılamıştır. Ascochyta fabae Türkiye de korungalarda ilk kez bu çalışma ile rapor edilmiştir. 1998-1999 yıllarında Erzurum da yetiştirilen korungaların kök ve üst kısımlarına zarar veren 111 Fusarium izolatı elde edilmiştir. Bunların % 55 i Fusarium acuminatum, % 17 si F. solani, % 14 ü F. oxysporum, % 8 i F. avenaceum % 4 ü F. equiseti, % 2 sinin F. proliferatum olduğu saptanmıştır. Bunlardan Fusarium acuminatum, F. avenaceum, F. oxysporum ve F. solani korungada patojendir. Bunlar Türkiye de korungada ilk kaydedilen funguslardır (Eken and Demirci 2004 ). Esmer (2004) tarafından yapılan çalışma ile arpa tohumlarındaki fungal flora tespit edilmiş ve bu amaçla blotter ve agar metotları kullanılmıştır. Onar and Karakaya (2006) tarafından yapılan çalışma ile Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi yerleşkesindeki yonca ekim alanlarındaki önemli hastalıklar belirlenmiştir. 2003 ve 2004 yıllarında belirtilen bölgelerden örnekler alınarak hastalık etmenlerinin teşhisi yapılmıştır. Teşhisi yapılan funguslar; Phoma medicaginis var. medicaginis, Leptotrochila medicaginis, Leveillula taurica, Pseudopeziza medicaginis, Peronospora trifoliorum, Stemphylium botryosum, Stagonospora meliloti, Colletotrichum trifolii, Leptosphaerulina briosiana ve Rhizoctonia solani dir. Bu funguslardan en yaygın olarak görüleni Phoma medicaginis var. medicaginis dir. Leptosphaerulina briosiana ise Türkiye için yeni tespit edilen bir fungustur. Yonca mozaik virüsü de tespit edilmiştir. 7
Horn (1952) Louisiana da (ABD) yetiştirilen fiğlerde antraknoza iki Colletotrichum türü C. villosum ve C. sativum un sebep olduğunu ve hiçbirinin tohum patojeni olarak görülmediğini, C. sativum un yapraklarda, gövde ve baklalarda yuvarlak-düz şekilsiz koyu kahve-gri sınırlı, kahve rengi-siyah kenarlı lekeler oluşturduğu, gövde üzerinde koyu kahveden siyaha dönmüş lekeler oluşturduğunu ve 55-125µ çapında aservuluslara sahip olduğu; konidileri renksiz ve genellikle düz olan, C. sativum un adi fiği ve diğer bazı fiğ türlerini enfekte ettiği zaman ciddi zararlara sebep olurken V. benghalensis, V. villosa ve V. ludoviciana nın dayanıklı olduğu, C. villosum un V. benghalensis, V. villosa, V. dasycarpa, V. ludoviciana ve V. articulata da diğer Vicia türlerine oranla daha az zarara sebep olduğu bildirilmiştir. Colletotrichum trifolii ve C. dematium f.sp. truncata nın Meksika yoncalarında ilk kayıt olduğu, etmenlerin solgun bitkiler üzerinde gri lekeler ve filizlerde nekrozlar oluşturduğu ve tohumla taşındıkları Maloy (1968) tarafından saptanmıştır. Nelson (1955) Stemphylium botryosum un yonca bitkisi artıkları üzerinde ve dormant konukçu dokusunda olgunlaşmamış peritesyum olarak kışı geçirdiği ve ilk enfeksiyonları askosporların gerçekleştirdiğini, sonra oluşan konidilerin yaprakçık, gövde, petioller, bakla ve tohumları enfekte ettiğini, tohum miktarında ve ağırlığında azalma olduğunu, tohumların buruşarak çimlenmesinin zayıfladığını ve 18-24 ºC sıcaklık ile en az 12 saat % 100 nemin fungus için optimum koşullar olduğunu bildirmiştir. Bezelye, yonca, dört çeşit üçgül ve iki çeşit fiğ olmak üzere 1300 tohum partisinde önceki tanımlama metotları kullanılarak tohumdan geçen funguslar test edilmiştir. Phoma herbarum var. medicaginis, Fusarium roseum ve Stemphylium botryosum, tüylü fiğde Ascochyta pisi nin en çok rastlanılan funguslar olduğu, adi fiğde istila düzeyinin düşük ve patojensiz olduğu, parazitlerin yanında yirmi dört saprofit fungus olduğu, çoğunun zararsız olduğu ve on tanesinin tüm sekiz konukçuda da yaygın bulunduğu bildirilmiştir (Leach 1960). 8
Kvikala and Moravcik (1964) korungalarda antraknoza sebep olan Ascochyta onobrychidis in Çekoslavakya da yeni bir hastalık olduğu ve buraya Avrupa dan gelen tohumlar üzerinde taşındığını bildirmişlerdir. Kabuklu yem bitkisi tohumlarının kabuksuzlardan daha düşük çimlenme kapasitesine sahip olduğu ve daha çok patojen istilasına uğradığı bildirilmiştir. Böyle kabuklu tohumlarda tespit edilen fungusların çoğunun saprofit olmasına rağmen bunların uygun koşullarda fide ölümlerine yol açabileceği vurgulanmıştır. Yapılan bir çalışmada 8 çeşitten 3 ünde patojen olan Botrytis cinarea nın izole edildiği ve ayrıca solgunluk ve çürüklüğe sebep olan Fusarium avenaceum un yalnızca bir çeşidin baklalarından izole edildiği bildirilmiştir (Czaplinsca 1966). Botrytis cinerea nın yonca tohumlarında bulunuşunun ilk kaydının 1963 yılında olduğu, Çekoslavakya da nemli ve soğuk geçen 1965 yılında patojenin yonca çiçeklerine zarar verdiği, enfekteli tohumların erken dönemde fide ölümlerine yol açtığı ve thiram ile tohum muamelesinin etkili olduğu bildirilmiştir (Zakopal and Sychrova 1966). Marasas and Bredell (1973) Güney Afrika da yonca tohumlarını 12, 24, 36 ay ticari koşullar altında depolamışlardır. Başlangıçta tespit ettikleri Fusarium acuminatum, Phoma medicaginis, Rhizoctonia solani ve Stemphylium botryosum un depolama süresine bağlı olarak örneklerde gittikçe azaldıklarını sadece birkaç örnekte bulunduklarını belirtmişlerdir. 24 ay ve 36 aylık depolamalarda tohumda çimlenme yüzdesi % 92 iken fungusla bulaşıklık yüzdesi ise % 10 ve daha altına düşmüştür. Terenteva (1973), yonca tohum enfeksiyonlarının % 0.5-19 unun funguslar tarafından oluşturulduğunun ve bunda en çok payın Fusarium türlerine ait olduğunu bildirmiştir. Türler arasında en fazla izole edilen tür F. sporotrichiella (% 21.3) dır ve bunu F. oxysporum (% 7.8), F. sambucinum (% 5.2), F. avenaceum (% 2.6) izlemiştir. Percival (1975), bulaşık yonca tohumlarındaki blotter yöntemini kullanarak Phoma medicaginis olup olmadığını araştırmıştır. 9
Macaristan da tohumla taşınan Ascochyta onobrychidis ile enfeksiyonlu korungaların arttığı, sağlıklı tohum kullanmak, ekim nöbeti ve uygun kültürel önlemler ile hastalığın kontrol edilebileceği belirtilmiştir (Hooly and Walcz 1976). Poltava (Ukrayna) Bölge sinde; kışlık fiğlerde Ascochyta viciae, Peronospora viciae ve Bacterium sp. nin çok yaygın ve önemli derecede zarara yol açtığı belirtilmiş olup tohumların thiram ve phenthiuram ile ilaçlanmasının enfeksiyonu azalttığı kaydedilmiştir (Trukina and Temnokhud 1977). Nik and Parbery (1977) tarafından yapılan çalışmada, yirmi tropik ve üç ılıman iklim baklagil yem bitkisi çeşitlerinin tohumlarındaki funguslar araştırılmış ve kırk iki tür izole edilmiştir. En fazla tür blotter yöntemi kullanılarak elde edilmiştir. Bunlardan Fusarium acuminatum, F. avenaceum, F. equiseti, F. fusorioides, F. oxysoprum, F. poae, Diaporthe phaseolorum, Phoma sorgihana, Botrytis cinerae, Cladosporium cladosporioides, Myrothecium leucotricha ve tanımlanmamış bir Fusarium türü patojen bulunmuştur. Tüm Fusarium türlerinin genellikle çıkış ve kök gelişimini taç gelişiminden daha fazla engellerken F. oxysporum un taç gelişimini daha fazla etkilediği, F. equiseti nin ise en şiddetli zarar yapan ve tohumlarda en yaygın patojen olduğu ortaya konmuştur. Depo fungusu olan Aspergillus ruber in de tohum patojeni olduğu özellikle yumuşak tohumlarda çimlenmeyi engellediği ve çimlenenlerin anormal fide oluşturduğunu belirlemiş, son olarak da sert tohumların fungal etmenlerce temiz olduğu buna karşın yumuşak tohumların daha fazla enfekte edildiği ve böyle zarar görmüş tohumların fungusları taşımasının muhtemel olduğu bildirilmiştir. Christen (1982) Verticillium albo atrum un doğal ve yapay olarak enfekteli yonca bitkilerinde tohumla taşındığını gözlemiştir. Araştırıcı yonca tohumlarını yapay olarak etmenle bulaştırdığında tohumlarda fungusun kolonisinin geliştiğini ve doğal enfekteli tohumlarda ise elektron mikroskobu ile yaptığı incelemede etmenin tohum kabuğu arasına yerleştiğini belirtmiştir. 10
Heale (1985) yaptığı çalışmada Verticillium çürüklüğünün Avrupa dan gelen tohumlar ile Kuzey Amerika ya bulaştığını ve bu iki alandaki izolatların virülensleri arasında pek fazla farklılık görülmediğini bildirmiştir. Mebalds (1987) tarafından yapılan çalışmada, Phoma medicaginis var. pinodiella, Fusarium acuminatum (Gibberella acuminata) ve Stemphylium sp. nin Medicago truncatula tohumlarından bitkiye taşındığını ortaya koyarak, tohum kaynaklı P. medicaginis var. pinodiella ve Stemphylium sp. inokulumlarının gelişmekte olan yaprak ve gövdedeki lekelerinde önemli bir inokulum kaynağı olduğunu göstermiştir. Ekilen tohumdaki, çeşitli mikoflora kuru madde üretimini etkilememiş fakat G. acuminata ile bulaşık tohumların ekilmesi sonucu ürün yüzdesinde azalma meydana gelmiştir. Lampracht et al. (1989) Medicago truncatula bitkisinin kök, sap, tohum ve tohum kabuğuna Fusarium avenaceum (Gibberella avenacea) enfekte ederek ve doğal enfekteli bitkilerde Fusarium un etkilerini araştırmış, sonuç olarak Medicago spp. nin tohum, tohum kabuğu ve sapında; G. avenacea nın önemli inokulum kaynağı olduğunu bildirmiştir. Aynı araştırıcılar (Lampracht et al. 1990) Güney Afrika nın kışın yağışlı olan, yonca buğday ekim nöbeti yapılan, 2 lokasyonunda; topraktan, tek yıllık Medicago türlerinin tohum ve tohum kabuğundan ve buğday kalıntılarından Fusarium türlerini izole etmişlerdir. Toplam 16 Fusarium türü toplanmıştır, bunlardan 11 türü yonca tohum ve tohum kabuğundan alınmışlardır. Fusarium acuminatum (Gibberella acuminata) un yonca tohum ve tohum kabuğundan izole edilen baskın tür olduğu açıklanmıştır. Richardson (1990) tohum kökenli hastalıklar ile ilgili açıklayıcı notlar içeren bir liste oluşturmuştur. Verticillium albo atrum, Fusarium oxysporum ve Rhizoctonia solani Meksika da yonca kültürlerinde kök hastalıklarına sebep olan en önemli türler olarak tanımlanmıştır. 11
Tohumla da taşınan bu patojenlerin saptanmasında; Valenciana, Moapa, San Joaquin Puebla 76 ve Sintetico II yonca çeşitleri kullanılmıştır. Yalnızca Verticillium albo - atrum ve Fusarium oxysporum un tohumla taşındığı ortaya konmuştur. En fazla enfekteli tohum sayısı; Valenciana ve San Joaquin çeşitlerinde bulunmuştur. Moapa ve Sintetico II çeşitlerinde enfeksiyon gözlemlenmemiştir (Lomeli et al. 1991). Pessa et al. (1993) yaptıkları çalışma ile; tohum üzerinde sıkça bulunan fungusların patojeniteleri ve Colletotrichum izolatlarının hassas yonca çeşitlerinin gelişme dönemlerine göre etkilerini ortaya koymuşlardır. PDA da kültüre alınan 3 farklı Colletotrichum izolatı kullanılarak inokulasyon yapmışlardır. Jaboticabal çeşidi yoncalardan izole edilen izolatın patojenitesinin Presidente Prudente ve Bandeirantes çeşitlerinden izole edilen izolatların patojenitesinden daha yüksek olduğunu görmüşlerdir. 7, 14 ve 21 günlük yonca bitkilerini spor püskürtme yöntemiyle inokule etmişler ve sonuçta 21 günlük bitkinin daha fazla etkilendiğini tespit etmişlerdir. Blotter testi ile Fusarium spp. bulmuşlar, tohum örneklerinde Colletotrichum spp. bulamamışlardır. Mackinaite and Strukcinskas (1994) çalışmalarında 3 yabani yonca türünün (Medicago sativa, M. falcata ve M. lupulina) ve Medicago var. Martyn varyetesinin Augune II ve Zydruna çeşitlerinin tohumlarının yüzeyinden ve iç dokularından 26 cinse ait 34 fungus türü bulmuşlardır. Tohumlardaki bu fungus türleri enfekteli köklerde de ortaya çıkmıştır. Sonuç olarak enfekteli yonca tohumlarının, kök çürüklükleri hastalıklarında önemli kaynak olabileceğini bildirmişlerdir. Yonca tohumları yapay olarak Verticillium albo atrum ile inokule edilerek, patojenin labaratuvar ve tarla koşullarında hayatta kalma durumu değerlendirilmiştir. Verticillium la bulaşık tohumların depolama süresi ve depo koşulları, patojenin hayatta kalma süresini etkilemiştir (Huang et al. 1994). Yonca tohumları üzerine yapılan çalışmalar haricinde diğer baklagil yem bitkilerinin tohum hastalıkları üzerine yapılan çalışmalardan bazıları aşağıda sunulmaktadır: 12
Kovacikova and Kudela (1989) yaptıkları çalışmada Kuarta ve 3 kırmızı üçgül çeşidinde, Fusarium oxysporum ve F. solani nin tohumlardaki yoğunluğunu değerlendirmişlerdir. Tohum enfeksiyonlarının bitkinin dayanıklılığı ile ilişkisi olduğunu bildirmişler ve enfeksiyon yoğunluğunun hassas çeşitlerin tohumlarında maksimim olduğunu açıklamışlardır. Buenos Aires taşrasında 1991-92 yıllarında yetiştirilen 8 Lotus spp. (gazal boynuzu) tohum örneği blotter yöntemiyle test edilmiş ve Alternaria, Phoma, Cladosporium, Colletotrichum spp., Fusarium equiseti, Leptosphaerulina trifolii ve Stemphylium loti cins ve türleri rapor edilmiştir (Bello and Sisterna 1992). Sign and Sign (1993) üçgülde sap çürüklüğünün ilk enfeksiyon kaynağının, tohum üzerindeki Sclerotinia trifoliorum un sklerotileri olduğu üzerine bir çalışma yapmışlardır. Kuzey Hindistan koşullarında bu hastalığın skleroti ile bulaşık tohumlarla yayıldığını bildirmişlerdir. Barbetti (1989) tarafından yapılan çalışmada 1m lik sıralara ekilen ve 2 mevsim geçiren, P. medicaginis e dayanıklı tek yıllık toplam 57 yonca çeşidi ve hattı seçilmiştir. Üç M. rugosa kültürü oldukça dayanıklı ve çoğu çeşit ve hatlar biraz dayanıklı görülmüştür. Tarla denemelerinde benomyl, carbendazim, flutriafol, propiconazole, thiabendazole ve triadimefon Phoma ya karşı test edilmiştir. Thiabendazol hariç tüm fungisitlerin hastalık şiddetini azalttığı görülmüştür. Aynı zamanda tohumdan bulaşan Phoma medicaginis in sebep olduğu siyah sap hastalığı tarlada kontrol edilmiştir. Tohumdan bulaşan P. medicaginis enfekteli tohumun ekiminden sonra siyah sap hastalığının gelişmesine sebep olduğu açıklanmıştır. Hastalık, M. turuncatula cv. cyprus da M. polymorpha cv. serena dan daha erken görüldüğü, hızlı geliştiği ve daha şiddetli olduğu bildirilmiştir. Tohumlara benomyl uygulaması siyah sap simptomlarının başlangıcının 4-5 hafta daha gecikmesine sebep olduğunu belirtilmiştir. Nan (1995) korunga tohumlarına uygulanan thiophanate - methyl in, tohum ve toprak patojeni olan bazı fungusların kontrolünde etkili olduğunu bildirmiştir. 13
Görüldüğü üzere ülkemizde yem bitkileri hastalıkları ile ilgili çalışmalar oldukça az sayıdadır. Dünyada ise yonca tohumlarında tohumla taşınan etmenler üzerinde çalışılmıştır, ancak korunga özellikle de fiğ tohumlarıyla ilgili çok fazla sayıda çalışmaya rastlanılmamıştır. Kaldı ki yonca korunga ve fiğ tohum hastalıkları üzerine ülkemizde hemen hemen hiç çalışma bulunmamaktadır. 14
3. MATERYAL VE YÖNTEM 3.1 Materyal Çalışmada materyal olarak 2005 ve 2006 yıllarında; Tarım İşletmeleri nden, Doğu Anadolu Tarımsal Araştırma Enstitüsü nden ve özel şirketlerden temin edilen on değişik yonca tohumu ile Tarım İşletmeleri nde üretilen üç değişik korunga tohumu ve dört değişik fiğ tohumu olmak üzere toplam on yedi tohum örneği kullanılmıştır. Çalışmada kullanılan tohum örneklerinin alındığı yerler ve yılları Çizelge 3.1 de verilmiştir. Çizelge 3.1 Çalışmada kullanılan tohum örneklerinin alındığı yer, yıl ve alınan örneklerin sayısı Örnek numarası Örnek Alınan Bitki Örnek alınan bölgeler Örneğin alındığı yıl 1 Yonca Elçi Tohumculuk/ K.Maraş 2005 1 2 Yonca May Tohum / Konya 2005 1 3 Yonca Anadolu TİM / Eskişehir 2005 1 4 Yonca Karacabey TİM / Bursa 2005 1 5 Yonca DATAEM / Erzurum 2005 1 6 Yonca Tivak A.Ş. / Konya 2005 1 7 Fiğ Karacabey TİM / Bursa 2005 1 8 Fiğ Anadolu TİM / Eskişehir 2005 1 9 Korunga Anadolu TİM / Eskişehir 2005 1 10 Korunga Karacabey TİM / Bursa 2005 1 11-12 Yonca Neobi Tohumculuk / Denizli 2006 2 13 Korunga Polatlı TİM / Ankara 2006 1 14 Yonca Gökhöyük TİM / Amasya 2006 1 15 Fiğ Gökhöyük TİM / Amasya 2006 1 16 Yonca Konuklar TİM / Konya 2006 1 17 Fiğ Konuklar TİM / Konya 2006 1 Örnek sayısı 15
3.2 Yöntem Yonca, korunga ve fiğ tohumları ile taşınan fungal hastalıkların belirlenmesinde tohumlukların üzerinde ve içerisinde gelişen fungusları izole etmek amacıyla iki yöntem kullanılmıştır. 3.2.1 Standart nemli hücre (Blotter) yöntemi Dokuz cm çapında yuvarlak olarak kesilen; yonca tohumu için 3 kat, korunga ve fiğ tohumları için 5 6 kat steril kaba filtre kağıtları steril su yardımıyla ıslatılarak ve fazla suları akıtılarak steril petri kapları içerisine yerleştirilmiştir. Bu şekilde nemlendirilen kurutma kağıtları üzerine, her petri kabına 50 şer adet yonca, 20 şer adet korunga ve 25 er adet fiğ olmak üzere tohumlar eşit aralıklarla yerleştirilmiştir. Bu yöntemle; yoncada her bir örnek için 8 petri, korungada 20 petri, fiğde 16 petri kullanılmış ve her bir örnekten toplam 400 adet tohum incelenmiştir (ISTA kurallarına göre). Ekimi yapılan petri kapları bir hafta süre ile 20 ± 2 ºC de 12 saat karanlık ve 12 saat aydınlık dönüşümüne sahip 20 cm aralıklarla 40 watt lık 2 adet yakın ultraviyole ışık tüplerinin 41 cm yükseklikten aydınlattığı 60 x 140 cm boyutlarındaki rafları içeren inkübasyon odasında tutulmuştur. Bir haftalık inkübasyon süresi sonrasında tohum üzerindeki gelişmeler stereomikroskop ve mikroskop altında incelenmiştir. 3.2.2 Agar yöntemi Tohumda derin enfeksiyon yapan fungusları belirlemek amacıyla bu yöntem kullanılmıştır. Her örnekten rastgele seçilen 200 adet tohum % 2 lik NaOCl ile yonca tohumları 2 dakika, korunga ve fiğ tohumları 3 dakika yüzey dezenfeksiyonu yapıldıktan sonra 3 kez steril destile su ile yıkanarak steril kurutma kağıtları arasında kurutulmuştur. Daha sonra tohumlar PDA ortamına her petriye yonca için 20 şer adet, korunga için 10 ar adet, fiğ için 15 er adet olmak üzere eşit aralıklarla yerleştirilmiş Blotter metodunda kullanılmış olan koşullar altında bir hafta süreyle inkübe edilmiştir. Bir hafta inkübasyon süresi sonrasında tohumlar üzerinde gelişen funguslar 16
stereomikroskop ve mikroskopta incelenerek cins ve tür düzeyinde teşhis edilmiştir. Funguslar PDA içeren eğik agarda +4 ºC de saklanmışlardır. Fungusların tanısında mikolojik yayınlardan yararlanılmıştır (Barnett 1965, Booth 1971, 1977, Ellis 1971, 1976, Domsch et. al. 1980, Sutton 1980). 3.2.3 Fungusların patojenitelerinin belirlenmesi Tohumlardan izole edilen funguslarla enfekteli yeterli tohum elde edilemediğinden bu fungusların tohumla taşınma durumları belirlenememiş. Bunun yerine bu fungusların patojeniteleri yapılmıştır. Yonca, korunga ve fiğ tohumlarında tespit edilen funguslardan literatür bildirilişlerine göre tohumla taşınma ihtimali olabilecek fungusların patotenitelerine bakılmıştır. Bunun için yeşil aksamda hastalık oluşturan fungusların (Alternaria, Stemphylium gibi) patojeniteleri için spor püskürtme yöntemi, bitkilerin kök ve kök boğazında hastalık oluşturan fungusların ise yani toprak patojeni karakterinde olanların ise toprak inokulasyonu yöntemiyle patojenite testleri yapılmıştır. Alternaria türleri için yapraklara spor püskürtülerek patojenite testi uygulanmıştır. Bunun için, fungus türleri bir hafta PDA da geliştirildikten sonra, 1x10 4 spor/ml yoğunlukta spor süspansiyonu hazırlanarak 30 günlük yonca ve fiğ yapraklarına püskürtülmüştür. Kontrol bitkilerine ise steril saf su püskürtülmüştür. Bitkiler 7 gün 22 ºC de yetiştirme odasında bırakılmış ve hastalık simptomu gösteren yapraklardan PDA ortamında reizolasyon yapılmıştır. Stemphylium türleri için yapraklara spor püskürtülerek patojenite testi uygulanmıştır. Bunun için, fungus bir hafta PDA da geliştirildikten sonra 1x10 4 spor yoğunlukta hazırlanan spor süspansiyonu 37 günlük yonca yapraklarına püskürtülmüştür. Kontrol bitkilerine ise yine saf su püskürtülmüştür. Bitkiler 7 gün 22 0 C de yetiştirme odasında bırakılmış ve gözlemler alınmıştır. Simptom gösterenlerden reizolasyon yapılmıştır. Fusarium türleri için kum+toprak+çiftlik gübresi (1:1:1) karışımı bulunan steril edilmiş topraklara fungus bulaştırılarak patojenite testi yapılmıştır. Bu amaçla cam şişelerin 17
mısır unu kum karışımı 24 saat arayla 2 kez otoklavda 121ºC de 20 dakika sterilize edilmiştir. PDA ortamında bir hafta geliştirilen fungus türlerinden 1cm 2 lik fungus diskleri alınıp, mısır unu kum karışımının içine 5 er adet bırakılmıştır. 30 gün süre ile inkübasyon odasında geliştirilmiştir. Geliştirilen bu funguslar; içerisinde sterilize edilmiş kum+toprak+çiftlik gübresi karışımı bulunan 12 cm çapındaki plastik saksılardaki toprağa % 10 oranında karıştırılmıştır. Kontrol saksılarına yalnızca sterilize edilmiş kum+toprak+çiftlik gübresi karışımı konulmuştur. Yonca tohumları % 2 lik NaOCl ile 2 dakika, korunga ve fiğ tohumları 3 dakika yüzey dezenfeksiyonu yapıldıktan sonra 3 kez steril destile su ile yıkanarak steril kurutma kağıtları arasında kurutulmuştur. Yonca tohumları her saksıya 15 adet, korunga ve fiğ tohumları her saksıya 5 er adet ekilmiştir. Bitkiler 20-25ºC de 12 saat aydınlık 12 saat karanlık periyotta geliştirilmiştir. Gelişen bitkilerdeki simptomlar gözlenerek simptom gözlenenlerden reizolasyonlar yapılmıştır. 18
4. ARAŞTIRMA BULGULARI 4.1 Nemli Hücre (Blotter) Yöntemiyle Tespit Edilen Funguslar Nemli hücre (blotter) yöntemi kullanılarak; Tarım İşletmeleri, Doğu Anadolu Tarımsal Araştırma Enstitüsü ve özel sektör tohumculuk firmalarından 2005 yılına ait 6 adet yonca ve 2006 yılına ait 4 adet yonca olmak üzere toplam 10 adet tohum örneğinde tespit edilen funguslar ve bulunma yüzdeleri çizelge 4.1 de verilmiştir. 19
Çizelge 4.1 Tarım İşletmeleri, Doğu Anadolu Tarımsal Araştırma Enstitüsü ve Özel Tohumculuk Firmalarından 2005 ve 2006 yıllarında alınan yonca tohum örneklerinde nemli hücre yöntemi ile tespit edilen funguslar ve bulunma yüzdeleri Çeşit /Tohumluğun Alındığı Yer Alternaria alternata Aspergillus spp. Botrytis sp. Saptanan Funguslar(%) Cladosporium spp. Curvularia inaequalis Fusarium solani Penicillium spp. Rhizopus sp. Stemphylium botryosum Toplam Fungus Türü Elçi (Kahramanmaraş) 22.50 - - 0.25-0.25 9.50 - - 4 MA 414 (Konya) 1.00 0.50 - - - - 2.75 0.25-4 Populasyon (Eskişehir) 0.75 0.50 2.50 0.50 - - 0.50 1.00-6 Populasyon (Bursa) 1.00-1.75 0.50 - - 0.25 9.25-5 Savaş (Erzurum) 5.50 0.50 2.75 - - - 1.75 40.25-5 Populasyon (Konya) 12.25-6.00 - - - 1.50 1.75 0.25 5 Elçi (Denizli) 14.50 0.25 2.00 13.00-0.25 1.00 0.50-7 Kalender (Denizli) 16.00-2.00 6.00 - - 0.50 - - 4 Bilensoy (Amasya) 3.75 5.25 1.75 3.00 0.25-7.00 13.75-7 Populasyon (Konuklar) - 0.75-0.25 - - 5.25 17.50 0.50 5 Toplam 77.25 7.75 18.75 23.50 0.25 0.50 30.00 84.25 0.75 Ortalama bulunma yüzdesi 77.25:10 7.73 0.78 1.88 2.35 0.03 0.05 3.00 8.43 0.08 20
Çizelge 4.1 de görüleceği üzere; alınan yonca tohum örneklerinde nemli hücre yöntemiyle belirlenen fungus cins veya türü 9 adettir. Bunlardan en çok bulunma sırasına göre; Rhizopus sp. (% 8.43), Alternaria alternata (% 7.73), Penicillium spp. (% 3.00), Cladosporium spp. (% 2.35), Botrytis sp. (% 1.88), Aspergillus spp. (% 0.78), Stemphylium botryosum (% 0.08), Fusarium solani (% 0.05), Curvularia inaequalis (% 0.03) funguslarıdır. En çok fungus saptanan örnekler; Doğu Anadolu Tarımsal Araştırma Enstitüsü (Erzurum), Gökhöyük Tarım İşletmesi (Amasya) ve Elçi Tohumculuk (Kahramanmaraş) dan temin edilen örneklerdir. Tarım İşletmeleri nden 2005 yılına ait 2 adet, 2006 yılına ait 1 adet olmak üzere toplam 3 adet korunga örneğindeki tespit edilen funguslar ve bulunma yüzdeleri çizelge 4.2 de; Tarım İşletmeleri nden 2005 yılına ait 2 adet, 2006 yılına ait 2 adet, olmak üzere toplam 4 adet adi fiğ tohum örneğinde tespit edilen funguslar ve bulunma yüzdeleri çizelge 4.3 de verilmiştir. 21
Çizelge 4.2 Tarım İşletmeleri nden elde edilen korunga tohumluk örneklerinde nemli hücre yöntemi ile saptanan funguslar ve bulunma yüzdeleri Saptanan Funguslar (%) Örneğin alındığı yerler Alternaria alternata Penicillium spp, Cladosporium spp. Aspergillus spp. Rhizopus sp. Botrytis sp. Stemphylium sp. Curvularia inaequalis Ulocladium spp. Acremonium spp. Epicoccum sp. Toplam Fungus Türü Eskişehir 75.00 12.25-41.00 13.50 4.75 0.25 - - - - 6 Bursa 33.00 40.25 5.75 37.75 19.75 - - - 7.50 - - 6 Ankara 96.25 0.75 64.25 22.25 3.50 15.50-1.00 3.50 4.00 2.50 10 Toplam 204.25 53.25 70.00 101.00 36.75 20.25 0.25 1.00 11.00 4.00 2.50 Ortalama bulunma yüzdesi 68.08 17.75 23.33 33.67 12.25 6.75 0.08 0.33 3.67 1.33 0.83 22
Çizelge 4.2 de görüldüğü gibi korunga tohum örneklerinde nemli hücre yöntemiyle 11 adet fungus cins ve tür tespit edilmiştir. Bunlardan en çok bulunma sırasına göre; Alternaria alternata (% 68.08), Aspergillus spp. (% 33.67), Cladosporium spp. (% 23.33), Penicillium spp. (% 17.75), Rhizopus sp. (% 12.25), Botrytis sp. (% 6.75), Ulocladium sp. (% 3.67), Acremonium sp. (% 1.33), Epicoccum sp. (% 0.83), Curvularia inaequalis (% 0.33), Stemphylium sp. (% 0.08), funguslarıdır. Çizelge 4.3 Tarım İşletmeleri nden elde edilen fiğ tohumluk örneklerinde nemli hücre yöntemi ile saptanan funguslar ve bulunma yüzdeleri Saptanan Funguslar (%) Örneğin alındığı yerlerin Alternaria tenuuissima Penicillium spp. Cladosporium spp. Aspergillus spp. Rhizopus sp Botrytis sp Toplam Fungus Türü Bursa 2.25 10.50 0.75 0.50 1.00-5 Eskişehir - 3.25-1.75 2.25-3 Amasya - 5.25 0.75 6.50 0.75-4 Konya - 16.75 3.00 5.00 1.00 0.50 5 Toplam 2.25 35.75 4.50 13.75 5.00 0.50 Ortalama bulunma yüzdesi 0.56 8.94 1.13 3.44 1.25 0.13 Çizelge 4.3 de görüldüğü gibi fiğ tohum örneklerinde nemli hücre yöntemiyle belirlenen fungus cins veya türü 6 adettir. Bunlardan en çok bulunma sırasına göre; Penicillium spp. (% 8.94), Aspergillus spp. (% 3.44), Rhizopus sp. (% 1.25), Cladosporium spp. (% 1.13), Alternaria teniussima (% 0.56), Botrytis sp. (% 0.13) funguslarıdır. 23
4.2 Agar Yöntemiyle Tespit Edilen Funguslar Agar yönteminde nemli hücre yönteminde kullanılanla aynı sayıda örnek kullanılmıştır. Buna göre Tarım İşletmeleri, Doğu Anadolu Tarımsal Araştırma Enstitüsü ve özel sektör tohumculuk firmalarından alınan toplam 10 adet yonca örneğindeki tespit edilen funguslar ve bulunma yüzdeleri çizelge 4.4 de verilmiştir. 24
Çizelge 4.4 Tarım İşletmeleri, Doğu Anadolu Tarımsal Araştırma Enstitüsü ve Özel Tohumculuk Firmalarından 2005 ve 2006 yıllarında alınan yonca tohum örneklerinde agar yöntemi ile tespit edilen funguslar ve bulunma yüzdeleri Saptanan Funguslar (%) Çeşit /Tohumluğun Alındığı Yer Alternaria alternata Aspergillus spp. Aureobasidium sp. Chaetomium sp. Cladosporium spp. Fusarium solani Penicillium spp. Stemphylium botryosum Ulocladium sp. Toplam Fungus Sayısı Elçi (Kahramanmaraş) 27.00-1.00 0.50 1.00-1.50 - - 5 MA 414 (Konya) 1.50 - - - 0.50-1.50 - - 3 Populasyon (Eskişehir) 2.50 1.00 - - - - - - - 2 Populasyon (Bursa) - - - - 1.00 - - - - 1 Savaş (Erzurum) - - - - - - - - - - Populasyon (Konya) - 3.00 - - - 3.00 2.00 - - 3 Elçi (Denizli) 4.00 - - - 1.00 0.50 4.50-0.50 5 Kalender (Denizli) 8.00 - - - - - 2.00-0.50 3 Bilensoy (Amasya) 8.00 - - - 0.50 0.50 1.00 4.00 2.00 6 Populasyon (Konuklar) - - - - - 0.50 0.50 - - 2 Toplam 51.00 4.00 1.00 0.50 4.00 4.50 13.00 4.00 3.00 Ortalama bulunma yüzdesi 5.10 0.40 0.10 0.05 0.40 0.45 1.30 0.40 0.30 25
Çizelge 4.4 te görüleceği üzere Tarım İşletmeleri, Doğu Anadolu Tarımsal Araştırma Enstitüsü ve özel sektör tohumculuk firmalarından alınan yonca tohum örneklerinde agar yöntemi ile belirlenen fungus cins veya türü 9 adettir. Bunlardan en çok bulunma sırasına göre; Alternaria alternata (% 5.10), Penicillium spp (% 1.30), Fusarium solani (% 0.45), Stemphylium botryosum (% 0.40), Cladosporium spp. (% 0.40), Aspergillus spp. (% 0.40), Ulocladium sp. (% 0.30), Aureobasidium sp. (% 0.10) ve Chaetomium sp. (% 0.05) funguslarıdır. Bu yöntemde en fazla fungus saptanan tohum örnekleri Kahramanmaraş dan alınan Elçi çeşidi örneklerde olmuştur. Bunu Amasya dan alınan Bilensoy çeşidi örnekler takip etmiştir. Çizelge 4.5 Tarım İşletmeleri nden elde edilen korunga tohumluk örneklerinde agar yöntemi ile saptanan funguslar ve bulunma yüzdeleri Saptanan funguslar (%) Örneğin alındığı yerler Alternaria alternata Penicillium spp Cladosporium spp Aspergillus spp Rhizopus sp Fusarium solani Ulocladium sp. Toplam Fungus Sayısı Eskişehir 0.50 12.00 0.50 4.00 - - - 4 Bursa - 12.50-3.00 - - - 2 Ankara 49.50 11.00 16.50 0.50 26.00 0.50 2.00 7 Toplam 50.00 35.50 17.00 7.50 26.00 0.50 2.00 Ortalama bulunma yüzdesi 16.67 11.83 5.67 2.50 8.67 0.17 0.67 Çizelge 4.5 de görüldüğü gibi korunga tohum örneklerinde agar yöntemi ile belirlenen fungus cins veya türü 7 adettir. Bunlardan en çok bulunma sırasına göre; Alternaria alternata (% 16.67), Penicillium spp. (% 11.83), Rhizopus sp. (% 8.67), Cladosporium 26
spp. (% 5.67), Aspergillus spp. (% 2.50), Ulocladium sp. (% 0.67) ve Fusarium solani (% 0.17) funguslarıdır. Çizelge 4.6 Tarım İşletmeleri nden elde edilen fiğ tohumluk örneklerinde agar yöntemi ile saptanan funguslar ve bulunma yüzdeleri Saptanan funguslar (%) Örneğin yerler alındığı Alternaria tenuissima Penicillium spp Aspergillus spp Fusarium equiseti Chaetomium sp. Toplam Fungus Sayısı Bursa 0.50 12.50 1.50-1.50 4 Eskişehir - - 0.50 - - 1 Amasya - 53.50-1.00-2 Konya 0.50 10.50 0.50 0.50-4 Toplam 1.00 76.50 2.50 1.50 1.50 Ortalama bulunma yüzdesi 0.25 19.13 0.63 0.38 0.38 Çizelge 4.6 da görüldüğü gibi fiğ tohum örneklerinde agar yöntemi ile belirlenen fungus cins veya türü 5 adettir. Bunlardan en çok bulunma sırasına göre; Penicillium spp. (% 19.13), Aspergillus spp. (% 0.63), Fusarium equiseti (% 0.38), Chaetamium sp. (% 0.38) ve Alternaria tenuissima (% 0.25) funguslarıdır. 4.3 Fungusların Patojenitelerinin Tespiti Nemli hücre ve agar yöntemi ile tespit edilen bazı funguslardan tohumla taşınma ihtimali olanların patojenitelerinin tespiti amacıyla spor püskürtme yöntemi ve toprak inokulasyonu yöntemi uygulanmıştır. 27
Buna göre yonca yapraklarına Alternaria alternata nın spor süspansiyonu püskürtülerek yapraklarda leke oluşup oluşmadığı incelenmiştir. Sonuç olarak yonca yapraklarında Alternaria alternata leke oluşturmuştur. Alternaria alternata nın yonca yapraklarında oluşturduğu belirti Şekil 4.1 de verilmiştir. Bu lekelerden yapılan reizolasyonlarda bu fungus elde edilmiştir. a b Şekil 4.1 Alternaria alternata nın a. yonca yapraklarındaki belirtisi, b. Sporları (Konidileri) Fiğ bitkisinde Alternaria tenuissima nın spor süspansiyonu yapraklara püskürtüldükten sonra, yapraklarda belirtiler gözlemlenmiştir (Şekil 4.2). Bu bitkilerden yapılan reizolasyonlardan söz konusu fungus elde edilmiştir. 28
Şekil 4.2 Alternaria tenuissima nın fiğ yapraklarındaki belirtisi Yine aynı şekilde Stemphylium botryosum un patojenitesini belirlemek amacıyla yonca yapraklarına spor süspansiyonu püskürtülmüştür. Bunun sonucunda bitkinin yapraklarında herhangi bir belirtiye rastlanmamıştır ve kontrol bitkileri ile herhangi bir farklılık gözlemlenmemiştir. Toprak patojeni olan Fusarium türleri için ise toprak inokulasyonu yapılarak sonuçlar gözlemlenmiştir. Yonca ve korunga bitkileri için toprak Fusarium solani., fiğ bitkisi için toprak Fusarium equiseti ile bulaştırılarak patojenitelerine bakılmıştır.yonca bitkilerinin toprak üstü ve kök bölgelerinde herhangi bir belirtiye rastlanmamış ve kontrol bitkilerinden bir farklılık gözlemlenmemiştir. Ayrıca yapılan reizolasyonlarda Fusarium solani tespit edilmemiştir. Korunga bitkisinin kök bölgesinden yapılan izolasyonda Fusarium solani tespit edilmiştir, Fusarium solani nin korunga bitkisinin köklerinde oluşturduğu zarar Şekil 4.3 de verilmiştir. Fiğ bitkisinin toprak üstü kısımlarında çok hafif solgunluklar gözlemlenmiştir. Kök bölgesinden yapılan reizolasyon sonucunda Fusarium equiseti tespit edilmiştir, Fusarium equiseti nin fiğ bitkisi köklerinde oluşturduğu zarar Şekil 4.4 te verilmiştir. 29