UYGULAMA NOTU Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografi L005 HPLC ile Balda Sülfo Grubu Antibiyotik Analizi HAZIRLAYAN Kim. Mahmut Arıkan Ant Teknik Cihazlar Ltd. Şti.
KONU: HPLC ile balda sülfo grubu antibiyotik analizi ÇALIŞMANIN AMACI: Arıcıların arı hastalıklarına karşı kullandıkları antibiyotikler bala bulaşabilmektedir. Bu çalışmada bal numunelerinde sulfo grubu antibiyotik kalıntısının kantitatif tayini amaçlanmaktadır. KAPSAM: Bal numunelerinde sulfamethazine, sulfamerazine ve sulfathiazole saptanabilmesi için kullanılan yöntemin kapsamını belirleyen temel basamaklar aşağıdaki gibidir: Numunenin Ekstraksiyonu Türevlendirme Kromatografik Tayin Hesaplama PRENSİP: Balda sulfamethazine, sulfamerazine ve sulfathiazole analizi yönteminin temel prensibi, örneğe uygulanan ön işlemlerin ardından kromotografik (HPLC) olarak kantitatif analizine dayanmaktadır. Sulfonamid grubu antibiyotikler: Antienfeksiyon ajanlar grubundan Para-amino Benzoik Asit türevi olan bu bileşikler bakteriostatik olarak etkilidir. Gram-pozitif ve gram-negatif mikroorganizmaların çoğuna karşı aktiftirler. Farmokinetik özellikleri kimyasal yapılarına bağlı olarak değişkenlik gösterir. Sulfamethazine krem renginde, kokusuz, hafif acı lezzette bir tozdur. Suda çok az çözünür, asidik ortamda emilimi kolaylıkla gerçekleşir. Bu nedenle seyreltik anorganik asitler ve alkali hidroksit çözeltilerinde çözünür. Kimyasal yapısını karasızlığı sebebiyle kapalı kaplarda ve karanlık ortamda saklanmalıdır. Sulfamethazine özellikle stafilokok, pastörella, pullorum, salmonella ve koksidiyoz etkenlerine karşı aktiftirler. Sindirim kanalından kolaylıkla emilir, vücutta sistemik etkilidir. Süt ve plasentaya geçer. Plazma proteinlerine yüksek düzeyde bağlanır(%70-85). Böylece vücutta uzun süre kalır. Sulfamethazine: C 12 H 14 N 4 O 2 S (sulfadimidin) Sulfamethazine Gram(+) ve Gram(-) bakterilerin çoğuna ve koksidiyoz etkenlerine karşı etkilidir. Organizmada sistemik etkilidir. Organizmaya oral ve paranteral yolla verilir. Sulfamerazine:C 11 H 12 N 4 O 2 S / Sulfathiazole:C 9 H 9 N 3 O 2 S 2
METOD ve MATERYALLER: Analitik Terazi Azot Kurutma Düzeneği Vortex phmetre Santrifüj Cihazı Dereceli Amberli Vial 5 ml, 8 ml Pastör Pipet, Dereceli Cam Pipetler 1 ml, 2 ml, 5 ml ve dereceli mezur KROMATOGRAFİK MATERYALLER HPLC; Pompa, Autosampler, RF dedektör Analitik Kolon: Restek 5µ Phenlyl (250-460 mm, 5µ) Mobil Faz ve Tampon: Acetonitrile (HPLC Grade), %2 Acetic Acid KİMYASAL MADDELER Referans Standartlar (Sulfamethazine-CAS-No:57-68-1, Sulfathiazole CAS-No:72-14-0) ÇÖZELTİ VE KARIŞIMLAR %37 NaOH- CAS-No:1310-73-2 NaCI- CAS-No:7647-14-5 Citric acid Monohydrate CAS-No:5949-29-1 Acetonitrile- CAS-No:75-05-8 Dicloromethane- CAS-No:75-09-2 Acetone- CAS-No:67-64-1 %100 Acetic Acid- CAS-No:64-19-7 Fluorescamine-SIGMA-Lot 092K4022 %37 Hydrocloric Acid- Methanol CAS-No:67-56-1 Ekstraksiyon Yöntemi: 5 gr (5000 mg) bal numunesi alınır; 5 ml, 2M HCI den katılır vortexle karıştırılır. Karışıma Internal Standart olarak Sulfathiazole (STZ) den 70ul 5 ppm lik Working solüsyon (WS) dan ilave edilir. 25-30 dakika oda sıcaklığında bekletilir. Karışım P H=4.5 olacak şekilde 10 M ve 5 M NaOH solüsyonu ile P H ayarlanır. 10 ml Acetonitril HPLC grade (ACN) ilave edilir ve karıştırılır. 2.5 mi Dichloromethane HPLC grade ilave edilir. Karışıma NaCI den 0.5 gr eklenir 10 dakika karıştırılır. Karışım 3250 devirde 10 dakika santrifüj edilir. Örnekte üste kalan organik fazdan 5 mi, 8 mi lik amberli viale alınır. N 2 (azot ) gazı altında 40 derece sıcaklıkta su banyosunda 1 ml olana kadar uçurulur. Kalan 1 ml ekstrakt dereceli amberli vialde su ile 2 ml e tamamlanır.
Türevlendirme: Ekstraktan 0,5 ml alınır (8 ml lik amberli viyale). 0,5 ml distile su ilave edilir. 1,6 ml (P H =3) Sodium citrate buffer katılır. 0,2 ml 0,1 M lık HCI katılır. 0,6 ml Fluorescamine solüsyonu katılır. Oda sıcaklığında 30 dakika bekletilir. Hesaplama: Numune değerlendirmesi ilk olarak kalitatif olarak ve ardından dış standart - kalibrasyon eğrisi metoduyla kantitatif olarak tayini gerçekleşmiştir. ANALİTİK KOŞULLAR: Cihaz : HPLC Kolonlar : Restek Phenyl (250 mm x 4.6mm x 5 um) Kolon Fırın Sıcaklığı : 40 C Enjeksiyon Hacmi : 30 ul Akış Hızı : 1,2 ml/dk Ex/Em : 405/495 Süre : 33 dk Mobil Faz A : Asetonitril Mobil Faz B : %2 Asetik Asit GRADİENT PROGRAM: 0.00 Pumps B.Conc 30 20.00 Pumps B.Conc 40 21.00 Pumps B.Conc 40 25.00 Pumps B.Conc 60 26.00 Pumps B.Conc 30 33.00 Controller Stop 33 HESAPLAMA Analiz sonucunda bulunan sulfamethazine miktarı ng/mg olarak ifade edilir. Hesaplamada kullanılan eşitlik aşağıdaki gibidir: Konsantrasyonu bilinen standart çözeltinin alanı okunan numunenin alanı ile orantılanarak seyreltme faktörü de dikkate alınarak sonuç ng/mg olarak hesaplanır.(standardın ve numunenin toplam türevlendirme hacmi aynı olduğu için dikkate alınmamıştır.) Sc: Standardın konsantrasyonu (ppb)(1 ml) An: Numunenin alanı As: Standardın alanı Formül: 10x Sc x An (ng) As = 0,002 x Sc x An = ppm (ng/mg) 5000 (mg) As
SONUÇLAR ve GÖRÜŞLER 6.25 ppb Standart mv 6 Detector A:Ex:405nm,Em:495nm 5 4 3 S U L F A D IA Z IN E S U L F A T H IA Z O L E S U L F A M E R A Z IN E S U L F A M E T H A Z IN E 2 1 D A D S O N 0 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 min Kalibrasyon Eğrisi 2.50 Conc. Ratio 2.25 2.00 1.75 1.50 1.25 1.00 0.75 0.50 0.25 0.00 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 Area Ratio Çalışmalarımız Binboğa Bal firmasında gerçekleştirilmiştir. Desteklerinden dolayı Sn. Mehmet Çürük e teşekkürlerimizi sunarız. Bu Aplikasyon Notu uygulamanın gerçekleştirildiği tarihe ait bilgiler ışığında oluşturulmuştur. Bu yayında yer alan bilgilerin referans gösterilerek başka bir yerde kullanılması Ant Teknik in iznine tabidir. Aplikasyon Notu Ant Teknik tarafından önceden bildirilmeksizin değiştirilebilir.