attomol α1-antitrypsin quicktype İnsan α-1 antitripsin gen inde M-, Z- and S-alellerin tespitine yönelik kit Sadece in vitro diagnostik kullanım içindir! Z-mutasyonun tespiti için 10 sipariş numarası: 1033 S- mutasyonun tespiti için 10 1.Giriş Alfa-1-antitripsin (AAT) tripsin, kimotripsin, ve elastas içeren serin proteaz için özellikle bir proteaz inhibitörü(pi) olarak akut faz proteinleri ve fonksiyonları grubuna ait olan bir glikoproteinidir. Bir AAT eksikliği elastasin yetersiz inaktivatsyonudur, bağ dokusu yapılarının bozulma artışıyla sonuçlanır ve ayrıca akciğer ve karaciğer anfizemine sebep olur. Bu eksiklikler için moleküler bazın AAT geninde(pi geni) mutasyonlar olabilir. Kuzey Avrupalıların çoğunluğu 0,95(wild type) bir allel frekansı ile PiM allel taşır. Klinik olarak ilgili PiS (S-mutasyon) ve PiZ (Z-mutasyon) allelleri vardır. Kodon 264'te timin (T) tarafından bir adenin (A) değişimi ile PiM alleli, PiS alleline dönüştürülür. PiZ alleli ile ilgili olarak, bir guanin (G) kodon-342'de bir adenin (A) ile yer değiştirmiştir (Zuntar et al., 1998, Clin. Lab. 44:837-843). Baz değişimi her iki kodonda sırasıyla valin(val) veya lizin (Lys) ile glutamik asidin (Glu) yer değiştirmesine neden olur (Fig. 1). 90-180 mg/dl arasındaki AAT plazma konsantrasyon aralıkları PIM allel taşıyıcılarıdır. AAT yeterliliği görülen hastalarda normal AAT in tersine plazma konsantrasyonunun sadece 10-15% veya 65% e sahiptir (Eriksson and Elzouki, 1998, Baillière s Clinical Gastroenterology 12 [2]:257-273). AAT eksikliği olan hastalarda, aşırı elastas akciğer anfizemi riskini artırır(1997, Bulletin of the World Health Organization, 75 [5]:397-415). Ayrıca, yeni doğmuş bebekte yenidoğan hepatit sendromuna neden olabilir. Erişkinlerde, karaciğer hasarının çeşitli tipleri, karaciğer hücrelerinin endoplazmik retikulumun içinde mutasyona uğrayan AAT moleküllerinin etkisiz bir şekilde bozulması olarak açıklanmıştır (Perlmutter, 1998, Seminars in Liver Disease, 18 [3]:217-225). AAT'in PiZZi homozigot formu 2000 de 1 kişiyi etkiler. AAT eksikliği en sık görülen otozomal-resesif kalıtsal hastalıklardan biri olduğunu anlamına gelir(1997, Bulletin of the World Health Organization, 75 [5]:397-415; Perlmutter, 1998, Seminars in Liver Disease, 18 [3]:217-225). Avrupalı nüfusta farklı AAT genotiplerinin frekansı Tablo 1'da gösterilir.
2. Genel Açıklamalar Bu kit sadece in vitro diagnostik uygulamalar için kullanılmalı. Bu kiti son kullanma tarihinden sonra kullanmayınız. Test çalışması için iyi eğitimli personel ve uygun laboratuar ekipman hususuna dikkat ediniz. Test uygulamasının tüm adımlarında eldiven giyiniz. Hasta numuneleri, potansiyel enfeksiyonlu madde olarak dikkate alınmalı ve mevcut yasalara göre hareket edilmelidir. PCR* a yönelik reaktifleri, DNA numuneleri ile amplifikasyon ürünlerinden ayrı saklayın. 3. Dahil olan malzemeler Sipariş numarası Reaktif Hacim Saklama Isısı 38 deiyonize PCR-H 2 O 0.2 ml -20 C 83 PCR-buffer I 0.5 ml -20 C 108 Primer S-mutasyonu (mavi renkli tüp) Liyofilize primerler içeren 1 tüp, tüp başına 225 μl PCRbuffer I (#83) ile çözündürme -20 C
109 Primer Z-mutasyonu (sarı renkli tüp) Liyofilize primerler içeren 1 tüp, tüp başına 225 μl PCRbuffer I (#83) ile çözündürme -20 C Kitteki tüm reaktiflerin miyadı, kutunun dış yüzeyinde bulunan esas etikette bulunmaktadır. 4. İlave Reaktifler ve Dahil olmayan malzemeler Hastaların DNA numuneleri ( genomik DNA kullanın, konsantrasyonu yaklaşık 20 ng/μl, distile suyla veya TE-buffer çözündürme) Qiagen tarafından sağlanan HotStarTaq DNA Polimeraz Kontrol template(pis and PiZ allele heterozigot DNA) Eppendorf-tüpler (0.2 ml; 1.5 ml) Mikropipetler (hacim aralığı 0.5-1000 μl) ve steril filtre uçları Thermocycler Agoroz jel elektroforez ve sarf malzemeleri için ekipman (agoroz veya % 3 prekastlanmış agoroz jelleri, elektrot buffer, örnek buffer, DNA-boya, UV-transilluminator) 5. Test Prensibi Quicktype genotipleme işlemi sırasında belirli bir genin her iki allelleri özellikle amplifiye edilmiş olur. Amplifikasyon ürünlerinin denemesi agoroz jel elektroforezle yapılabilir. Her iki allel de Z-mutasyonu için Wild tip dizisi taşırsa (homozigot wild tip), agoroz jeli yalnızca 244 bp te specifik bir bant içerir. Eğer bir allel Wild tip dizisi ve diğeri mutasyon dizisi (heterozigot) taşırsa, sırasıyla 244 bp ve 283 bp te iki bant olacaktır. DNA numunesi homozigot olarak mutasyona uğramışsa jelde 283 bp te sadece tek bir bant gözükür. S- mutasyonunda inceleme uygun bir şekilde yapılmalıdır. Bantların boyutu sırasıyla 188 bp (wild tip) ve 227 bp (mutasyon) dır. Jeldeki bantların kalibrasyonunda sonuçları daha iyi doğrulamak için referans olarak bir heterozigot DNA numunesi kullanmalısınız (Fig. 2'i gör). Tab. 1 ve 2 e göre genotiplerin tespiti gerçekleştirilir. Tek başına bir diagnostik metodun sonuçlarından klinik tanıya gidilmemelidir. Doktor mevcut tüm laboratuar ve klinik sonuçları dikkate almalıdır. 6. Manuel
Hastaların numunelerine ek olarak PCR reaksiyonlarını kontrol etmek için aşağıdaki kontrolleri eklemeniz önerilir: 1. Negatif kontrol (PCR-blank) 2. Pozitif kontrol (bir heterozigot kontrol template kullanın [genotiplendirilmiş, genomik DNA]) Kontrol template ayrı olarak üreticisinden de sipariş edilebilir(s-mutasyonu için sipariş numarası 110 ve Z-mutasyonu için sipariş numarası 111). Doğru şekilde genotiplendirilmiş olan hasta numuneleri kullanıcı tarafından kontrol template olarak da kullanılabilir. Protokol: Standart prosedürlere göre hasta kanından DNA-hazırlama Tüp başına 225 μl PCR-buffer I kullanarak (sipariş numarası 83) primerleri çözündürün, PCR Premix içinde pipet kullanarak uygun şekilde karıştırın ve oda sıcaklığında 5 dk. İnkübe edin. Dikkat: 225 μl den daha az PCR premixe ihtiyacınız varsa geri kalanı -20 C de saklayabilirsiniz.. Sırasıyla S-mutasyonu ve Z-mutasyonu için PCR premix e hot start Taq DNA polimeraz ilavesiyle PCR mix hazırlama Bir reaksiyon için kullanılacak toplam PCR premixin miktarını hesaplamak için her bir numune ve kontrol sayıları ile premix miktarı (20 μl) çarpılmalıdır ve bir miktar fazla hacim eklenmelidir (8 reaksiyon için örnek: 8 x 20 μl + 10 μl fazladan hacim = 170 μl PCR premix). Daha sonra, hot start Taq DNA polimeraz (5 U / μl) premix içine son dilüsyon 1:100 olacak şekilde ilave edilmelidir. (örneğin: 170 μl PCR premix + 1,7 μl 5 U / μl polimeraz). Şimdi, PCR mix iyice karıştırılmalıdır PCR mixi sırasıyla S-mutasyonu ve Z-mutasyonu için 0.2 ml lik tüplerde eşit hacimlere ayırma: Negatif kontrol: Pozitif Kontrol: Hasta numuneleri: 20 μl PCR mix 20 μl PCR mix 20 μl PCR mix + 5 μl PCR-H2O + 5 μl kontrol template + 5 μl DNA (ca. 20 ng/μl) (ca. 20 ng/μl) PCR thermocyclerde aşağıda listelenen sıcaklık rejimi kullanılarak yapılmaktadır: İlk denatürasyon: 15 dak. 95 C 5 döngü: 1 dak. 94 C 1 dak. 63 C 1 dak.72 C
30 döngü: 30 s 94 C 30 s 63 C 30 s 72 C Final sentezi: 2 dak. 72 C Durdurma: 4 C zaman sınırı yok PCR ürünlerinin analizleri uygun laboratuvar şartlarında bir agoroz jel üzerine (2,5 % 3) 10 μl PCR ürünü ilavesi ve sonra elektroforez ile gerçekleştirilir Hasta numunelerinin genotiplemesi kontroller ile numunelerin bant modeli kıyaslanarak yapılır(fig. 2'i gör). Belirli aminoasitlere göre allel tiplemesi: Test uygulaması sırasında sorunlar ile ilgili olarak üretici veya distribütör firmayla bağlantı kurmakta tereddüt etmeyin.
EK 1 Kit etiketlerinde kullanılan sembollere genel bakış Sembollerin açıklaması Üretici Lot numarası Son kullanma tarihi 2 C ve 6 C arasında saklayın Max. -20 C de saklayın Katalog numarası In vitro diagnostik medikal ürünler <n> determinations için yeterli içerik Kullanım talimatına bakınız