HLA Tiplendirmesi PCR-SSP Türker Duman PhD
Büyük Doku Uygunluk Kompleksi (Major Histocompatibility Complex - MHC) İlk olarak farklı fare suşlarında deri naklinin reddiyle tanımlanan genetik bölgedir Alloreaktiviteden de sorumlu hücre yüzey glikoproteinlerini kodlayan bir gen kümesini içerir. MHC insanlarda human leukocyte antigens (HLA), olarak da bilinir ve yapısı dokulardaki dağılımı fonksiyonuna göre sınıflara ayrılır HLA A-B-C MHC Sınıf I HLA DR-DQ-DP MHC Sınıf II bölgesinden kodlanmaktadır.
HLA SINIF I Sınıf I molekülleri olan HLA-A HLA-B ve HLA-C benzer özelliklere sahiptirler ve yan yana 6. kr sıralanmıştırlar. Bu moleküller, bir ağır zincir ve bir hafif zincir (beta-2-mikroglobulin) oluşan bir heterodimerdir. Beta2 microglobulin başka bir kromozom tarafından kodlanır. 15q21- q22.2 Ağır zincir zar içinde sabitlenmiştir. Sınıf I molekülleri, endoplazmik retikulum lümeninde türetilen peptidleri sunarak bağışıklık sisteminde önemli bir rol oynamaktadır. Neredeyse bütün hücrelerde ifade edilir.
Ağır zincir, yaklaşık 45 kda Kodlayan gen 8 ekson içerir. Ekson 1 lider peptidi kodlayan, Ekson 2 ve 3 alfa1 ve alpha2 domainleri Ekson 4 alfa3 domaini Ekzon 5 transmembran bölge, Ekzon 6 ve 7 sitoplazmik kuyruğu kodlar. Ekzon 2 ve 3 sınıf I moleküllerinde peptid bağlama özgünlüğü sorumludur.
HLA-Sınıf II DRB1 DQB1 DPB1 Hücre dışı proteinlerden oluşan peptidleri sunarak immün sistemede önemli bir rol oynar Dentritik hücreler, makrofajlar, B lenfositler gibi antijen sunan hücreler Sınıf II molekülleri, Alfa (DRA) ve Beta (DRB) zincirlerinden oluşan memrana tutunmuş bir heterodimerdir DR Beta zinciri peptide bağlanma özgüllüğünü veren polimorfizmileri içerirr HLA-DRB1, HLA class II beta zincir genlerindendir.
Beta zinciri yaklaşık 26-28 kda. protein kodlar. 6 ekzonu vardır. Ekon 1 lider peptidi Ekon 2 ve 3, 2 hücre dışı domaini Ekon 4 transmembrane domain Exon 5 sitoplazmik kuyruğu kodlar Sınıf II allelerinde,pp zincirin birinci domaini kodlayan 2. ekzonlar alel farklılıklarının büyük kısmından sorumludur. Bu yüzden HLA klas II tiplendirmesi genellikle 2. ekzondaki farklılıklara odaklanmıştır
DRB1 kesinlikle bulunur. DRB1 alellik varyantları DRB3, DRB4 and DRB5 genlerinin biriyle bağlantılı olabilir DRB1, DRB3, DRB4 ve DRB5 ten 5 kat fazla eksprese olur
6. kromozomun kısa kolunda (6p21.31) yerleşmiş 3.600 kilobazlık bir bölgedir MHC genleri kodominanttır, genlerinin birbirine yakın olması beraber kalıtılmasına yol açar ve bir HLA haplotipi oluşturur. HLA sistemi bilinen en polimorfik bölgedir.
HLA Sınıf I Genleri ve Alel Sayıları
HLA Sınıf II Genleri ve Alel Sayıları
HLA TİPLENDİRMESİ HLA bölgesindeki polimorfizmleri belirlemek için çeşitli yöntemler kullanılmıştır. Terasaki ve Mc Clelland tarafından bulunan 1964 serolojik yöntemler yaklaşık 50 yıldır kullanılmaktadır
HLA alellerinin belirlenmesinde kullanılan yöntemler Serolojik Fazla kan gerekli Canlı lenfosit gereklidir Farklı toplumlardaki seyrek antijenler için kaliteli antiserum bulmak zor olabilmektedir Olağanüstü polimorfikliği belirlemede yetersiz kalması Moleküler yöntemler
Moleküler Yöntemler En yaygın kullanılan tekniklerdir. DNA temellidir Serolojik olarak ayırt edilemeyen fakat fonksiyonel olarak ayrı olan HLA alellerini tiplendirmek için geliştirilmiştir. 1987 yılında Southern Blot ve RFLP yöntemiyle başlamıştır 1990 ların başında PCR tekniğinin bulunmasından sonra giderek yaygınlaşmıştır.
Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) İn vitro klonlama yöntemi olan PCR, spesifik DNA bölgelerinin çoğaltılarak üzerinde çalışılmasına olanak vermektedir. PCR temelli tiplendirme yöntemleri Hızlı, Güvenilir Düşük ya da yüksek çözünürlükte tiplendirme yapabilir Kolay uygulanabilir ve tekrarlanabilir
PCR Basamaklar Denatürasyon Bağlanma Uzama Bileşenleri DNA Primer çifti dntp ler Taq Polimeraz Tampon (uygun ph ve iyon (Mg+2))
PCR sayesinde 35 döngü sonunda yaklaşık 68 milyar kopya oluşabilmektedir
PCR- SSP (Sequence Specific Primer) PCR-SSP incelenen lokusta, alele özgü primerler kullanılarak amplifikasyonun varlığını araştıran bir yöntemdir. Alele-özgü PCR veya amplification refractory mutation system (ARMS) olarakta bilinir HLA üzerindeki polimorfik DNA dizileri, amplifikasyon primerleri olarak kullanılır. Primer çiftinin bir tanesi genetik olarak korunmuş diziye uygunken, diğer primer hedeflenen alele özgü baz değişikliğini 3 ucunda taşıyacak şekilde sentezlenir. Burada primerin 3 ucu hedeflenen dizideki komplementer baza özgüdür. İpliğin polimeraz tarafından uzatması için primerin 3 ucunun kalıba sıkıca bağlanmış olması gerekmektedir. Bu durumda sadece hedef polimorfik diziyi taşıyan aleller çoğalır.
PCR-SSP İncelenen örnekte primere özgü dizi yoksa PCR gerçekleşmez. Her tüpte PCR ı kontrol etmek amacıyla her örnekte çoğalması gereken (insan büyüme hormonu geni) bir çift primer, internal kontrol olarak kullanılır. Kontrol primerlerinin konsantrasyonu spesifik primerlerden düşüktür
Bir çok allelin bulunduğu lokusları tiplendirmek için kitlerde ayrı reaksiyonlarda bir çok primer seti kulanılır. HLA Sınıf I için 2,3. ekzon HLA Sınıf II için 2. ekzon Bütün reaksiyonların aynı termalcycler cihazında gerçekleşmesi için primerlerin bağlanma derecelerinin optimizasyonu gerekir. SSP yöntemiyle kullanılan primer setlerine bağlı olarak düşük yada yüksek çözünürlükte tiplendirme yapılabilir.
Uygulanışı DNA İzolasyonu Çekirdekli hücrelerden (kan, dalak, lenf gibi) DNA elde edilir. DNA izolasyonu için fenol kloroform, tuzla çöktürme DNA izolasyon kitleri Tam otomatik DNA izolasyon cihazları kullanılarak da yapılabilir. PCR HLA alellerin belirlenmesi için ayrı tüplerde hedef alellere özgü primerler ve internal kontrol primerleriyle PCR yapılır. Primerler tüplerde liyofilize halde PCR komponentleri (MgCl2, nükleotidler, tampon) ayrı bir tüpte karışım halinde bulunur, Taq Polimeraz ilave edilerek primer ekilmiş tüplere dağıtılır. DNA PCR tüpleri sıcaklık döngülerini sağlayan termal cycler aletine konularak genomik DNA nın ilgili bölgesinin çoğaltılması sağlanır.
Elektroforez PCR sonrasında agaroz jel elektroforezi yapılır. Kuyucuklara yüklenen örnekler uygun voltajda TBE (Tris Borat EDTA) gibi iletkenliğini sağlayan bir tampon varlığında yürütülür. Agaroz jel ethidium bromide ile boyanır. Değerlendirme Her kuyucukta bir kontrol bandı ve eğer varsa çoğaltılan diziye özgü PCR ürünü kendi moleküler ağırlığına uygun yürümüş olarak görülür. Pozitif örneklerin kit ile beraber gelen çözümleme tablosuyla ya da bilgisayar programıyla değerlendirilmesiyle HLA tiplendirmesi yapılır
1 2 3 4 5 6 7 9 10 11 12 13 14 15 17 18 19 20 21 25 26 27 28 29 33 34 35 36 41 42 43 44 8 M 49 16 M 57 50 58 51 52 53 59 60 61 68 69 Olerup SSP HLA-A-B-DR M 54 55 56 62 63 64 70 71 72 22 23 24 30 31 32 M 73 74 75 76 77 78 79 80 37 38 39 40 M 81 82 83 84 85 86 87 88 45 46 47 M 89 90 91 48 65 66 67 92 %2 agaroz jel elektorforezi 93 94 95 96 140 V -15dk
1 2 3 4 5 6 7 9 10 11 12 13 14 17 18 19 20 21 26 27 28 29 25 8 M 49 15 16 M 57 22 23 24 M 65 30 31 32 M 73 50 51 52 53 58 59 60 61 66 67 68 69 74 75 76 77 54 55 56 62 63 64 70 71 72 78 79 80 1-24 HLA-A* 24, 33 33 34 35 36 37 38 39 40 M 81 82 83 84 85 86 87 88 25-72 HLA B* 08, 14 41 42 43 44 45 46 47 48 M 89 90 91 92 93 94 95 96 73-96 HLA DRB1* 01, 03 DRB3
Dikkat edilmesi gerekenler Negatif kontrol kullanılmalıdır Analiz sırasında çalışılan kitin lot numarası kontrol edilmelidir. Değerlendirme yapılırken internal kontrol bantlarının olması gerektiği unutulmamalıdır. Elektroforez esnasında bir DNA ağırlık markırının kullanılması önemlidir. PCR bantların zayıf veya şüpheli olduğu bazı durumlarda, bantların DNA ağırlık markırıyla karşılaştırılarak büyüklüğünün kontrol edilmesi yanlış pozitifliklere engel olacaktır.
PCR SSP Artılar Canlı hücre gerekmez Güvenilir Örnekler aynı gün lab gelmek zorunda değildir Diğer yöntemlerle oluşabilen belirsizliklerde kullanılabilir Düşük veya yüksek çözürlüklü Eksiler Kaliteli DNA Fazla miktarda primer kullanımı zahmetli olabilmektedir Alel dizilerinin bilinmesi gerekli- SBT