T.C. ANADOLU ÜN VERS TES YAYINI NO: 2067 AÇIKÖ RET M FAKÜLTES YAYINI NO: 1101 TIBB LABORATUVAR UYGULAMALARI (UYGULAMA K TABI) Yazarlar Prof.Dr. Ahmet ÖZATA (Ünite 1) Arfl.Gör.Dr. Volkan KILIÇ (Ünite 1, 3) Arfl.Gör.Dr. Gözde Aydo an KILIÇ (Ünite 1, 3) Prof.Dr. K ymet GÜVEN (Ünite 2) Yrd.Doç.Dr. Mehmet Burçin MUTLU (Ünite 2) Arfl.Gör.Dr. Meral YILMAZ (Ünite 2) Prof.Dr. A.Yavuz KILIÇ (Ünite 4) Arfl.Gör. Hülya ALTUNTAfi (Ünite 4) Editör Yrd.Doç.Dr. Mehmet Burçin MUTLU ANADOLU ÜN VERS TES
Bu kitab n bas m, yay m ve sat fl haklar Anadolu Üniversitesine aittir. Uzaktan Ö retim tekni ine uygun olarak haz rlanan bu kitab n bütün haklar sakl d r. lgili kurulufltan izin almadan kitab n tümü ya da bölümleri mekanik, elektronik, fotokopi, manyetik kay t veya baflka flekillerde ço alt lamaz, bas lamaz ve da t lamaz. Copyright 2010 by Anadolu University All rights reserved No part of this book may be reproduced or stored in a retrieval system, or transmitted in any form or by any means mechanical, electronic, photocopy, magnetic, tape or otherwise, without permission in writing from the University. UZAKTAN Ö RET M TASARIM B R M Genel Koordinatör Prof.Dr. Levend K l ç Genel Koordinatör Yard mc s Doç.Dr. Müjgan Bozkaya Ö retim Tasar mc lar Yrd.Doç.Dr. Alper Tolga Kumtepe Arfl.Gör.Dr. Öznur Öztürk Grafik Tasar m Yönetmenleri Prof. Tevfik Fikret Uçar Ö r.gör. Cemalettin Y ld z Ö r.gör. Nilgün Salur Dil Yaz m Dan flman Okt. Ayd n F nd ko lu Grafiker Yasin Karakoç Kitap Koordinasyon Birimi Yrd.Doç.Dr. Feyyaz Bodur Uzm. Nermin Özgür Kapak Düzeni Prof. Tevfik Fikret Uçar Dizgi Aç kö retim Fakültesi Dizgi Ekibi T bbi Laboratuvar Uygulamalar (Uygulama Kitab ) ISBN 978-975-06-0750-9???. Bask Bu kitap ANADOLU ÜN VERS TES Web-Ofset Tesislerinde... adet bas lm flt r. ESK fieh R,... 2011
çindekiler iii çindekiler Önsöz... vii Genel Biyokimya Laboratuvar Uygulamalar...... 1 KARAC ER FONKS YON TESTLER... 3 LABORATUVAR ÇALIfiMASI 1: B L RUB N M KTAR TAY N... 4 LABORATUVAR ÇALIfiMASI 2: TOTAL KOLESTEROL M KTAR TAY N... 6 BÖBREK FONKS YON TESTLER... 7 LABORATUVAR ÇALIfiMASI 3: KREAT N N M KTAR TAY N... 8 LABORATUVAR ÇALIfiMASI 4: DRAR ANAL ZLER... 10 LABORATUVAR ÇALIfiMASI 5: KAN GRUBU TAY N... 13 ABO Kan Gruplar ve Kal t m... 13 Kaynaklar... 16 Genel Mikrobiyoloji Laboratuvar Uygulamalar... 18 Uygulama 1... 19 Deney Tüpü... 19 Santrifüj Tüpü... 19 Durham Tüpü... 20 Balon Joje (Volümetrik Balon, Dereceli Balon)... 20 Erlenmayerler... 20 Beherler... 20 fiifleler... 20 Petri Kutular... 21 Mezür (Dereceli Silindir)... 21 Pipetler... 21 Baget... 23 Cam huni... 23 Lam... 23 Rodajl Lam... 23 Lamel... 23 Büret... 23 Ay rma Hunisi... 23 Desikatör... 23 fiale... 23 Di er Malzemeler... 24 Sporlar... 24 Süzgeç Ka d... 24 Flask... 24 Cryotüp... 24 Puar... 24 Mavi ve Sar Tip... 24 Spatül... 25 Bal k (Manyetik Bar)... 25 Çelik Küvet... 25 Pens... 25 Bistüri... 25 Diseksiyon nesi... 25 1. ÜN TE 2. ÜN TE
iv çindekiler Otoklav Band... 25 Cam kalemi... 25 Laboratuvar Çalar Saati... 25 Pipetlik... 25 Piset... 25 Ekim Aletleri... 26 Öze... 26 Eküvyon... 26 Drigalski Spatülü... 26 Sterilizasyon Aletleri... 27 Otoklav... 27 Pasteur F r n... 27 Filtreler... 27 Su Banyosu (Ben Mari)... 27 UV Lambalar... 28 Di er Aletler... 28 Etüvler... 28 Santrifüjler... 28 Spektrofotometreler... 28 ph metreler... 29 Derin Dondurucu... 29 Teraziler... 30 Manyetik Kar flt r c ve Is t c lar... 30 Çalkalamal Tabla... 31 Vortex... 31 Steril Kabin... 31 LABORATUVAR ÇALIfiMASI 2: M KROORGAN ZMALARDA ÇO ALMANIN KONTROLÜ... 31 S cakl k le Sterilizasyon... 32 Kuru Is le Sterilizasyon... 32 Nemli Is le Sterilizasyon... 33 Dezenfeksiyon... 35 Tindalizasyon... 36 Pastörizasyon... 36 Kimyasal Maddeler le Sterilizasyon... 36 Fenol ve Fenol Türevleri... 36 Klor... 36 Kuaterner Amonyum Bileflikleri... 37 Hipokloritler... 37 Alkoller... 37 Formaldehit... 37 A r Metaller... 37 Peroksitler... 37 Boyalar... 37 Fiziksel Ajanlar le Dezenfeksiyon... 37 Antisepsis... 37 Filtrasyon le Sterilizasyon... 38 Radyasyon le Sterilizasyon... 39 yonize Olmayan Radyasyon... 39 yonize Radyasyon... 39
çindekiler v LABORATUVAR ÇALIfiMASI 3: CANLI BAKTER PREPARATLARININ NCELENMES VE M RRORGAN ZMALARIN M KROSKOB K ÖLÇÜMÜ... 40 Uygulama 1: As l Damla Yöntemi... 40 Uygulama 2: Yafl Preparasyon Yöntem... 41 Mikroorganizmalar n Mikroskobik Ölçümü... 42 Uygulama... 42 Mikroorganizmalar n Boyutlar n n Ölçülmesi... 42 LABORATUVAR ÇALIfiMASI 4: M KROORGAN ZMALARIN KÜLTÜR ED LMES... 43 Uygulama 1: Besiyeri Haz rlanmas... 43 Saf Kültür Eldesi ve Mikroorganizma nokülasyon (Ekim) Teknikleri... 45 Uygulama 1: S v Besi Yerine nokülasyon... 46 Uygulama 2: Çizgi Ekim le Saf Kültür Elde Eldesi... 48 Uygulama 3: Yayma Plak Ekim Yöntemi... 49 Uygulama 4: Dökme Plak Yöntemi... 49 LABORATUVAR ÇALIfiMASI 5: ANAEROB K BAKTER LER N KÜLTÜR ED LMES... 50 Uygulama: GasPak Sistemi le Anaerobik Kültür Gelifltirme... 52 LEBORATUVAR ÇALIfiMASI 6: BAKTER LER N BOYANMASI VE M KROSKOB K NCELEME... 52 Uygulama 1: Mikroskobik Preparat Haz rlama ve Basit Boyama... 53 Uygulama 2: Gram Boyama... 55 Uygulama 3: Spor Boyama... 57 LABORATUVAR ÇALIfiMASI 7: BAZI METALLER N VE K MYASAL MADDELER N ANT M KROB YAL ETK S LE ANT B YOT K DUYARLILIK TESTLER... 58 Uygulama 1: Oligodinamik Etki... 59 Uygulama 2: Baz Kimyasal Maddelerin Antimikrobiyal Etkisi... 60 Uygulama 3: Antibiyotik Duyarl l k Testleri (Kirby-Bauer Testi)... 61 LABORATUVAR ÇALIfiMASI 8: LAM AGLUT NASYON TEST... 63 Uygulama 1: Aglutinasyon reaksiyonu... 63 Amaç: Lam üzerinde aglutinasyon reaksiyonunu göstermek.... 63 LABORATUVAR ÇALIfiMASI 9: BAZI FUNGUSLARIN KÜLTÜR ED LMES VE MORFOLOJ K NCELENMES... 64 Uygulama 1: Küfler... 64 Uygulama 2: Mayalar... 66 LABORATUVAR ÇALIfiMASI 10: OTOMAT ZE B YOK MYASAL BAKTER YAL TANI TESTLER (API 20E, V TEK)... 66 API Kitleri ile Mikroorganizma dentifikasyonu... 66 Genel Bilgiler... 66 Uygulamalar :... 66 Uygulama 1: API CHL ile dentifikasyon... 69 Uygulama 2: Mikroorganizmalar n VITEK Sistem ile Tan s ve Karakterizasyonu... 73 Uygulama 3: PZR (Polimeraz Zincir Reaksiyonu: Polymerase Chain Reaction - PCR) ile Belirli Bir Gen Bölgesinin Ço alt lmas... 77 Yararlan lan ve Baflvurulabilecek Kaynaklar... 79
vi çindekiler 3. ÜN TE Histoloji ve Embriyoloji Laboratuvar Uygulamalar... 80 LABORATUVAR ÇALIfiMASI 1:... 81 M KROSKOP PARÇALARININ TANITIMI VE KULLANIMI... 81 Ifl k Mikroskobunun K s mlar... 81 Gövde K sm (Mekanik K s m)... 81 Optik K s mlar... 82 LABORATUVAR ÇALIfiMASI 2: PREPARAT HAZIRLAMA... 83 LABORATUVAR ÇALIfiMASI 3: EP TEL DOKU... 86 Örtü Epiteli... 87 LABORATUVAR ÇALIfiMASI 4: BA VE DESTEK DOKU... 89 Gevflek Ba Doku... 89 S k Ba Doku... 90 Ya Doku... 90 K k rdak Doku... 91 Kemik Doku... 91 LABORATUVAR ÇALIfiMASI 5: KAS DOKU... 92 Düz Kas... 93 Çizgili Kas ( skelet Kas )... 93 Kalp Kas... 93 Yararlan lan Kaynaklar... 95 4. ÜN TE T bbi Parazitoloji Laboratuvar Uygulamalar... 96 LAB. I. PARAZ TOLOJ LABORATUVARINDA DIfiKI ÖRNEKLER N N NCELENMES NDE KULLANILAN YÖNTEMLER... 97 LAB II. S ND R M S STEM NDE YERLEfiEN PROTOZOON PARAZ T ÖRNEKLER N N NCELENMES... 99 LAB.III. KAN DOKU VE ÜROGEN TAL S STEM NDE YERLEfiEN PROTOZOON PARAZ T ÖRNEKLER N NCELENMES... 105 LAB IV. TIBB ÖNEM OLAN HELM NT PARAZ TLER N NCELENMES.. 110 LAB V. TIBB ÖNEM OLAN PARAZ T K ARTHROPODLARIN NCELENMES... 117 Yararlan lan ve Baflvurulabilecek Kaynaklar... 119 Sözlük... 121
Önsöz vii Önsöz Sa l k kurum ve kurulufllar n n laboratuvarlar nda görev alacak nitelikli laboratuvar teknikerlerinin yetifltirilmesini amaçlayan T bbi Laboratuvar Teknikleri Önlisans Program kapsam ndaki T bbi Laboratuvar Uygulamalar dersi için haz rlanan bu kitap, laboratuvar çal flmas na kat lacak ö renciler için temel bir kaynak durumundad r. Kitap genel olarak Histoloji ve Embriyoloji, Biyokimya, Mikrobiyoloji ve Parazitoloji olmak üzere 4 farkl bölümden oluflmaktad r. Her bölüm içerisinde ö rencilerin bilmesi ve ö renmesi gereken temel uygulamalara yer verilmeye çal fl lm flt r. Kitap uygulama a rl kl olarak haz rlanm fl ve üniversitemiz laboratuvarlar ndaki imkanlar dahilinde yap labilecek deneyler olmas na özen gösterilmifltir. Uygulamalar n olabildi i kadar güncel olmas na ayr ca dikkat edilmifltir. Yazarlar n k sa sürede büyük çabalarla ortaya ç kard klar bu kitab n bas ma haz rlanmas nda eme i geçen herkese teflekkür eder, tüm ö rencilerimize baflar - lar dileriz. Editör Yrd.Doç.Dr. Mehmet Burçin MUTLU
1TIBB LABORATUVAR UYGULAMALARI (UYGULAMA K TABI) Amaçlar m z Bu üniteyi tamamlad ktan sonra; Karaci er fonksiyon bozukluklar n n hangi testlerle belirlenebilece ini aç klayabilecek, Böbrek fonksiyon bozukluklar n belirleyebilmek için temel basit testleri gerçeklefltirebilecek, drar n fiziksel, kimyasal ve mikroskobik özelliklerini incelemek için gerekli testleri uygulayabilecek, Kan grubu tayinini temelini kavrayarak kan grubu tespiti yapabileceksiniz. Anahtar Kavramlar Bilirubin Kolesterol Kreatin drar Karaci er Böbrek Kan çerik Haritas T bbi Laboratuvar Uygulamalar (Uygulama Kitab ) Genel Biyokimya Laboratuvar Uygulamalar KARAC ER FONKS YON TESTLER LABORATUVAR ÇALIfiMASI 1: B L RUB N M KTAR TAY N BÖBREK FONKS YON TESTLER LABORATUVAR ÇALIfiMASI 2: TOTAL KOLESTEROL M KTAR TAY N LABORATUVAR ÇALIfiMASI 3: KREAT N N M KTAR TAY N LABORATUVAR ÇALIfiMASI 4: DRAR ANAL ZLER KAN GRUBU TAY N
Genel Biyokimya Laboratuvar Uygulamalar KARAC ER FONKS YON TESTLER Karaci erin bafll ca görevleri: Safra ve safra tuzlar yla birlikte, sindirime yard mc olur. Besinlerden al nan ya larla birlikte, ya da eriyen vitaminlerin emilmesini kolaylaflt r r. Kan n p ht laflmas için gereken, protrombin, fibrinojen ve heparin gibi maddeleri üretir. Vücuttaki toksinlerle birlikte zararl maddeleri atar. Protein, lipit ve karbonhidrat sentezini yapar. Protein, ya, karbonhidrat, mineral ve vitaminleri gerekti inde kullan lmak üzere Kan flekerini ayarlar. Baz hormonlar n yap s nda yer alan kolesterolü üretir. Pek çok reaksiyonun gerçekleflmesinde görev alan enzimleri yapar. Suyla birlikte pek çok maddeyi tafl yan albumin i üretir. Karaci er yukar daki görevlerini yerine getiremezse, çeflitli hastal klar ortaya ç - kar. Bu hastal klar n en önemlileri; Karaci er yetmezli i (Hepatik koma) Siroz Safra kesesi iltihaplar ve tafllar Kanser Karaci er hastal klar, en iyi flekilde Karaci er Fonksiyon Testleri ile anlafl l r. Biyokimyasal testlerden olan Karaci er Fonksiyon Testlerinin bafll calar flunlard r: Karbonhidrat metabolizmas ile ilgili testler Glukojenez, glukojenoliz, glukoneojenez gibi olaylar ile glukoz d fl ndaki heksozlar n glukoza dönüfltürülmesi karaci erde gerçekleflir. Bu gruptaki testler, çeflitli flekerlere karfl tolerans üzerine dayan rlar. a. Glukoz tolerans testi: Diabet hastal n n teflhisi için uygulanmaktad r b. Galaktoz tolerans testi: Karaci er hücre hasar n n tesbiti için uygulanmaktad r. c. Epinefrine karfl tolerans testi: Karaci erin glikojeni depo etme kapasitesini ölçmek amac yla uygulanmaktad r Lipid metabolizmas ile ilgili testler Lipoproteinler ve fosfolipid, kolesterol, trigliserit gibi lipid elemanlar karaci erde sentezlenir. Kolesterol esterleflmesi ve kolesterol ün safra asitlerine y k m karaci- erde gerçekleflir. Toplam kolesterol, ester kolesterol, fosfolipid seviyeleri ölçülür.
4 T bbi Laboratuvar Uygulamalar (Uygulama Kitab ) Protein metabolizmas ile ilgili testler Protein sentez ve y k mlar nda karaci erin önemli rolü vard r. Karaci er hastal klar nda albümin seviyeleri azal r (hipoalbuminemi), kronik karaci er hastalar nda ise globülin düzeyi artar (hiperglobulinemi). Detoksifikasyon ile ilgili testler Endojen ve eksojen baz toksik maddeler ve boya maddeleri karaci erde faz I ve faz II reaksiyonlar ile biyotransformasyona u rat l r. Karaci er detoksifikasyon bozukluklar hippürik asit testi, bromosülfoftalein testi ve rose bengal testi gibi testlerle belirlenir. Bilirubin metabolizmas ile ilgili testler Karaci erin al n m, at l m ve konjugasyon reaksiyonlar ile ilgili testlerdir. Bilirubin kanda direkt ve indirekt olmak üzere iki flekilde bulunur. Hepatoselüler sar l klarda herikiside artar. T kanma sar l klar nda ise direkt bilirubin artar. Serumda bilirubin düzeyi tayini, idrarda bilirubin ve bilirubin y k l m ürünü olan ürobilinojen tayini bu testlerden baz lar d r. Serum enzimlerinin tayini ile ilgili testler Karaci er hastal klar nda meydana gelen doku harabiyetinin bir sonucu olarak aç - a ç kan baz enzimlerin aktivite tayinleri ile ilgili testlerdir. Alkalen fosfataz (ALP): T kanma ve hepatoselüler sar l klarda art fl gösterir.. Alanin amino transferaz (ALAT) ve Aspartat amino transferaz (ASAT): Enfeksiyöz hepatitlerde ve toksik hepatitlerde yükselir. Laktat Dehidrogenaz (LDH): Hepatit ve sirozda artar. Lösin amino peptidaz (LAP) ve 5 Nükleotidaz: Hepatik t kanmalarda art fl gösterir. Gama-glutamil transferaz (GGT): Viral hepatitin saptanmas nda ölçülür. Kronik alkoliklerde art fl gösterir. Kolinesteraz Hepatoselüler hastal klarda aktivitesi azal r. Not: Genel Biyokimya Laboratuvar Uygulamalar nda karaci er fonksiyon testlerinden Bilirubin Miktar Tayini ve Total Kolesterol Miktar Tayini testleri uygulanacakt r. LABORATUVAR ÇALIfiMASI 1: B L RUB N M KTAR TAY N Kan dolafl m nda bulunan k rm z kan hücreleri yaklafl k 120 günlük bir süre sonunda ömürlerini tamamlar ve ço unlu u dalakta olmak üzere parçalan rlar. Aç a ç - kan bilirubin karaci ere götürülür. Karaci er özel bir ifllemle bilirubini suda çözünebilen bir hale getirir ve safra yoluyla ba rsa a atar. Karaci erde bu iflleme maruz kalm fl bilirubine direk, henüz ifllem görmemifl bilirubine ise indirek bilirubin denilir. Bu sistemin herhangi bir noktas nda meydana gelebilecek bir aksama kan bilirubin düzeyinin yükselmesine neden olur. Bu aksamalar; k rm z kan hücrelerinde afl r y k m, karaci er hastal klar ve safra yolu t kan kl klar d r. Sonuçta kan bilirubin seviyesi yükselecek ve koyu sar ten rengiyle tipik sar l k ortaya ç kacakt r. UYGULAMA: Van Den Bergh Metodu Amaç: Karaci er fonksiyon bozukluklar n belirleyebilmek amac yla kan serumundaki bilirubin miktar n ölçmek Prensip: Serum veya plazma üzerine diazo reaktifi ilave edildi inde serum veya plazmada bulunan bilirubin diazo ile reaksiyona girer ve mor renkte azobilirubin denilen bir bileflik meydana gelir.
1. Ünite - Genel Biyokimya Laboratuvar Uygulamalar 5 D REKT TOTAL 1.Tüp 2. Tüp 3. Tüp 4. Tüp Distile su 4 ml 2 ml Metil Alkol 4 ml 2 ml %6 HCl 0.8 ml 0.8 ml Diazo reaktifi 0.4 ml 0.4 ml Serum Dilüsyonu 3.2 ml 1.6 ml 3.2 ml 1.6 ml Materyal: Cam deney tüpü, 1ml lik cam pipeti, puar, tüplük, metil alkol, %6 HCl, diazo reaktifi, kurutma ka d, spektrofotometre, spektrofotometre küvetleri Uygulanacak fllem: 1. 4 adet deney tüpü 1 den -4 e kadar numaraland r l r. 2. Daha sonra her bir tüpe afla daki tablodaki gibi kimyasal maddeler eklenir. 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 32.7 31.3 30.7 30.2 29.0 27.0 26.0 25.2 24.4 23.7 20 22.9 22.2 21.8 21.5 20.9 19.8 19.2 18.7 18.2 17.7 30 17.2 16.8 16.6 16.3 15.8 15.4 15.0 14.5 14.2 13.8 40 13.0 12.7 12.5 12.3 12.0 11.6 11.3 11.0 10.7 10.4 50 9.8 9.5 9.4 9.3 9.0 8.8 8.6 8.3 8.0 7.8 60 7.3 7.1 6.9 6.8 6.6 6.4 6.2 5.9 5.7 5.5 70 5.1 4.9 4.8 4.7 4.5 4.3 4.1 3.9 3.7 3.5 80 3.1 3.0 2.9 2.8 2.7 2.5 2.3 2.2 2.0 1.8 90 1.5 1.3 1.2 1.2 1.0 0.9 0.7 0.6 0.4 0.3 3. 1. tüp 2. tüp için kör, 3. tüp ise 4. tüp için kördür. 4. Tüm kimyasal maddeler eklendikten sonra her tüp kar flt r l r. 5. Tüpler kar flt r ld ktan 5. dakika sonra 2. tüp spektrofotometrede 560 nm de okutulur. 6. Tüpler kar flt r ld ktan 10 dakika sonra 4. tüp spektrofotometrede 560 nm okutulur. 7. Daha sonra afla daki bilirubin kalibrasyon grafi inden de erlendirilir. Total Bilirubin-Direkt Bilirubin = ndirekt Bilirubin Normal de erler Total Bilirubin : 0.1 mg/dl Direkt Bilirubin : 0-0.4 mg/dl ndirekt Bilirubin : 0.1-0.5 mg/dl Gözlem ve Sonuçlar Spektrofotometreden elde etti iniz verileri bilirubin kalibrasyon grafi inde de erlendirerek Total bilirubin, Direkt bilirubin ve ndirekt bilirubin miktarlar n hesaplay n z. Tart flma Elde etti iniz sonuçlar n normal de erler aras nda olup olmad n kontrol ediniz. Bilirubin de erlerinin normal de erlerde olmamas vücudumuzdaki hangi bölgelerin tahribat ndan kaynaklanmaktad r? Tart fl n z.
6 T bbi Laboratuvar Uygulamalar (Uygulama Kitab ) LABORATUVAR ÇALIfiMASI 2: TOTAL KOLESTEROL M KTAR TAY N Klinik bak mdan plazma veya serumda total kolesterol ve kolesterol esterlerinin miktar plazma veya serum total lipid miktar hakk nda yeterli bilgi vermektedir. Kanda kolesterol ve lipid miktarlar karaci er fonksiyonlar ve koroner hastal klar hakk nda bilgi vermektedir. Serumda kolesterol miktar %140-250 mg aras ndad r. Afl r ya l g dalar beslenen insanlarda, hamile bayanlarda, fleker hastal nda, karaci er t kanmalar nda karbonhidrat eksikli ine ba l açl kta ve nefrozda, kandaki lipid ve kolesterol miktar artmaktad r. Afl r derecedeki anemilerde, hipertriodizm, hepatit ve sirozda ise kolesterol ve buna ba l olarak lipid miktar azalmaktad r. Erkeklerdeki total kan kolesterol miktar kad nlardakinden daha yüksektir. Kolesterol miktar n n çok fazlas olmas, ileri yafllarda arteriosklererozise (damar sertli i) neden olmaktad r. UYGULAMA: Lefter Metodu Amaç: Kan serumunda bulunan toplam kolesterol düzeyini belirlemek. Prensip: zopropil alkolün serum veya plazma ile muamelesi sonucu çöktürülen kolesterolün ferrik klorit ve sülfirik asit ile mor renk vermesi esas na dayan r. Materyal: zopropil alkol, konsantre sülfirik asit, ferrik klorit, kolesterol çal flma standart, serum, deney tüpü, spektrofotometre küveti, spektrofotometre, santrifüj tüpü, santrifüj, mikropipet ve ucu. Uygulanacak fllem: 1. Kapakl santrifüj tüpüne 0.1 ml serum ve 4.9 ml izopropil alkol konur. Tüpün a z kapat larak iyice çalkalan r ve 10 dakika beklemeye b rak l r. 2. Bekletilen tüp 3000 devirde 5 dakika santrifüj edilir. 3. Test, standart ve kör tüpü olmak üzere 3 adet tüp haz rlan r. 4. Test tüpüne 1 ml santrifüj tüpündeki s v dan konur. Standart tüpüne 1 ml çal flma standart çözeltisinden konur. Kör tüpüne ise 1 ml izopropil alkol konur. 5. Daha sonra her üç tüpe de pipet yard m yla 2 ml ferrik klorit ilave edilerek kar flt r l r. 6. Bu tüplere yine pipet yard m yla 2 ml konsantre sülfirik asit tabaka oluflturacak flekilde ilave edilir. 7. Bu tüpler iyice kar flt r ld ktan sonra 10 dakika bekletilir. 8. Kör tüp ile spektrofotometre s f ra ayarlan r ve 450 nm de test tüpünün ve standart tüpünün optik dansiteleri okunur. Hesaplama: Total Kolesterol = Test Tüpünün Optik Dansitesi Standart Tüpünün Optik Dansitesi * 200 mg (% mg) Gözlem ve Sonuçlar: Elde etti iniz optik dansite sonuçlar n kullanarak total kolesterol miktar n hesaplay n z? Tart flma: Buldu unuz de eri normal insanlarda olmas gereken de erlerle karfl laflt r n z ve yorumlay n z? Serum kolesterol miktar ndaki art fl veya azalma vücuttaki hangi de iflikliklerin belirtisidir?
1. Ünite - Genel Biyokimya Laboratuvar Uygulamalar 7 BÖBREK FONKS YON TESTLER Böbrekler organizmada homeostaz n sa lanmas nda önemli rol oynar. Böbre in en küçük fonksiyonel ünitesi nefron dur. Nefronlar glomerüller ve tübülüslerden meydana gelir. Glomerüller, kapiller yuma ve Bowman kapsülünden oluflur. Böbre in önemli fonksiyonlar flunlard r. Zararl maddeleri vücuttan atmak Vücutta su hacmini ayarlamak yon dengesini düzenlemek Plazman n ozmotik dengesini düzenlemek Kan bas nc n düzenlemek Asit-baz dengesini düzenlemek Böbrek fonksiyon testlerini 3 grupta toplamak mümkündür Böbrekte kan ak m n ölçen testler Glomerül ve tübülüslerdeki dolafl m ölçmek için kullan lacak olan maddenin hem glomerülden süzülmesi, hemde tübülüslerden uzaklaflt r lmas gerekmektedir. Diodrast, para amino hippürik asit, fenolsülfonftalein böbrek kan ak m n ölçmek için kullan lan maddelerden baz lar d r. Glomerül filtrasyonunu ölçen testler Bu testler Klerens testleri ad alt nda toplanmaktad r. Bir maddenin klerensi, plazman n o maddeden ar nma h z d r. Bir maddenin glomerül filtrasyonunu ölçmek amac yla kullan labilmesi için, o maddenin idrara sadece glomerül filtrasyonu ile geçmesi, tübülüslerden at lmamas, reabsorbe edilmemesi, vücutta kullan lmamas ve plazma proteinlerine ba lanmamas gerekmektedir. Bu flartlar tafl yan üre, kreatinin, inülin gibi maddeler hemen hemen tamamen glomerüllerden süzülür ve çok az reabsorbe edilir. Tübülüs fonksiyonunu ölçen testler Böbreklerin idrar yo unlaflt rma veya suland rma kabiliyetlerini ölçmeye yarayan testlerdir. drarda bulunan maddelerin miktar ve bununla ilgili olarak idrar n de- iflen yo unlu u, böbrek tübülüslerinin reabsorbsiyon ve salg lama özelliklerine ba l d r. Bu nedenle su testleri genellikle tübüler fonksiyonu ölçmek amac ile uygulanan testlerdir. a. Yo unlaflt rma testleri: Hastay belirli bir süre susuz b rakarak, böbre in suyu ne derece absorbe etti i ölçülür.yani, bir sudan yoksun b rak l fl zaman ndan sonra idrar n özgül a rl n n tayini, böbrek fonksiyonunun önemli bir göstergesidir. b. Suland rma testleri: Bu testlerde hastaya su içirildikten sonra belli zaman aral klar ile idrar toplanarak hacmi ve özgül a rl ölçülür. c. Tübülüsün d fla at l fl testleri: Tübülüsün vücuda d flar dan al nan yabanc maddeleri salg lama gücünü ölçen testlerdir. Vücuda d flar dan verilen baz boyalar n d fla at l fl h z ölçülür. Not: Genel Biyokimya Laboratuvar Uygulamalar nda böbrek fonksiyon testlerinden Kreatinin Miktar Tayini testi uygulanacakt r.
8 T bbi Laboratuvar Uygulamalar (Uygulama Kitab ) LABORATUVAR ÇALIfiMASI 3: KREAT N N M KTAR TAY N Böbrekler retroperitoneal bölgede bulunan her biri yaklafl k 120-150 gram a rl nda olan organlard r. Her iki böbrekte yaklafl k 2.000.000 nefron vard r ve bir nefron temel olarak glomerül ve tübül olmak üzere iki k s mdan oluflur. Nefronda, glomerüler filtrasyon, tübüler reabsorpsiyon (geri emilim) ve tübüler sekresyon (salg lama) sonucu idrar oluflur. Böbre in idrar oluflumu d fl nda da birçok fonksiyonu vard r. Böbrek yetmezli inde, böbre in bu temel fonksiyonlar nda bozulmalar olur ve de iflik adaptif sistemler devreye girer. Böbrek yetmezli i akut veya kronik olabilir. Böbrek yetmezli inin derecesinin belirlenmesinde kullan lan en objektif parametre glomerüler filtrasyon de erinin (GFD) ölçülmesidir. Glomerül filtrasyon bozuklu unu belirlemek amac yla uygulanan testler Klerens testleri ad alt nda toplanm flt r. Klerens, temizleme ar nma anlam ndad r. Bir maddenin klerensinin ölçülmesi denincede plazman n o maddeden ar nma h z n n ölçülmesi anlafl l r. Bir maddenin glomerül filtrasyonunu ölçmesi için ideal flartlar o maddenin idrara sadece glomerül filtrasyonu ile geçmesi, tübülüslerden at lmamas veya reabsorbe edilmemesi, vücutta kullan lmamas, plazma proteinlerine ba lanmamas ve ekstraselüler s v da eflit da lmas d r. Bu flartlar karfl layabilen üre, kreatinin, inülin hemen hemen tamamen glomerüllerden süzülür ve çok az reabsorbe edilir. Kreatinin kas metabolizmas n n sonucunda kreatinden oluflur, ve yap m oran kas kitlesiyle yak ndan ilgilidir. Kanda normal kreatinin düzeylerinde bu metabolit glomerulusda süzülür. Fakat tübülüs taraf ndan ne salg lan r ne de reabsorbe edilir. Bu nedenle kreatinin klerensi özellikle glomerül filtrasyonunun durumu hakk nda bilgi verir. Kreatinin klerensi yani 1 dakikada kreatininden ar nan plazma miktar, 1 dakikada glomerülden süzülen süzüntü miktar na denktir. UYGULAMA: Jaffe Metodu Amaç: Glomerül filtrasyon düzeyini ve böbrek fonksiyon bozukluklar n belirleyebilmek için kan serumundaki kreatinin miktar n ölçmek. Prensip: Kreatinin in alkali ortamda pikrik asit ile turuncu k rm z renk vermesidir (Jaffe Reaksiyonu) Materyal: 10 ml distile su, 8 ml %2 lik pikrik asit solüsyonu, 3 ml 2.5 N NaOH, 4 adet uzun cam tüp,1 adet tüplük, 5 adet 2 ml lik cam pipet, 1 adet kurutma ka d. Uygulanacak fllem: 1. Bir deney tüpüne serum numune süzüntüsü haz rlan r. Bunun için 1 ml serum 3 ml %2 lik pikrik asit solüsyonu ile kar flt r l r. Serum 1 ml %2 lik Pikrik asit solüsyonu 3 ml 2. Haz rlanan serum numune tüpü 1000 rpm de 5 dakika santrifüj edilir. Serum numune süzüntüsü elde edilmifl olur. 3. Baflka bir tüpteyse idrar dilüsyonu haz rlan r. Bunun için 0.5 ml idrar, 4.5 ml distile su ile kar flt r l r. 4. Spektrofotometrede ölçülecek örnekler afla daki flekilde haz rlan r.
1. Ünite - Genel Biyokimya Laboratuvar Uygulamalar 9 Kör Tüpü Numune Tüpü (Serum) Numune Tüpü ( drar) Distile su 0.5 ml - - Serum numune süzüntüsü - 2 ml - drar Dilüsyonu - - 0.5 ml Pikrik asit olüsyonu 1.5 ml - 1.5 ml 2.5 N NaOH 0.2 ml 0.2 ml 0.2 ml 5. Haz rlanan örnekler kar flt r l r ve 20 dakika bekletilir. 6. Daha sonra spektrofotometrede 520 nm de kör tüpüne karfli di er tüpler okunur. 7. Elde edilen sonuçlar kalibrasyon grafi inden de erlendirilir. Hesaplama: Kreatinin klerens testinde kan ve (24 saatlik) idrarda kreatinin tayinleri yap larak klerens için afla daki formül uygulan r. CKr = Kreatinin klerens (ml/dak) P = Kandaki kreatinin miktar (mg/dl) U = drarda kreatinin miktar (mg/dl) V = Dakikadaki idrar hacmi CKr = U/P x V Kreatinin klerensinin normal de eri 95-105 ml / dk d r. Not: drar de eri idrar numunesinin kalibrasyon grafi inden elde edilen de erin 10 ile çarp lmas yla verilir. Kreatinin kalibrasyon grafi i: 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 7.4 7.2 7.0 6.9 6.8 6.7 6.6 6.5 6.4 6.3 20 6.2 6.1 6.0 5.8 5.6 5.5 5.3 5.2 4.9 4.8 30 4.6 4.5 4.4 4.3 4.1 4.0 3.9 3.8 3.7 3.6 40 3.5 3.4 3.3 3.3 3.2 3.1 3.0 2.9 2.8 2.7 50 2.6 2.5 2.4 2.3 2.1 2.0 1.9 1.8 1.7 1.6 60 1.5 1.4 1.3 1.2 1.1 1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 70 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0 Gözlem ve Sonuçlar: Spektrofotometrede yapt n z ölçümlerde elde etti iniz OD de erlerini transmittansa çeviriniz. Buldu unuz transmittans de erlerinin kalibrasyon grafi inden karfl l klar n bularak kreatinin klerensini hesaplay n z. Tart flma: Kreatinin klerensi ne amaçla hesaplan r? Elde edilen bulgular bize vücudumuzun hangi bölgesiyle ilgili bilgiler verir?
10 T bbi Laboratuvar Uygulamalar (Uygulama Kitab ) LABORATUVAR ÇALIfiMASI 4: DRAR ANAL ZLER drar böbrekler taraf ndan vücuttan seçilerek süzülen ve çok say da maddeyi içeren s v at k maddedir. drar genellikle iki amaçla incelenir. lki böbrek hastal klar hakk nda bilgi edinmek di eriyse böbrekten kaynaklanan kimyasal madde ve metabolitlerin incelenmesidir. drarda mevcut maddeler belirli s n rlar dahilinde bulunur. Bu s n rlar farkl g dalar n al nmas yla ve di er faktörlere ba l olarak de- ifliklik göstermektedir. drar incelerken onun fiziksel özelliklerine, kimyasal özelliklerine ve mikroskobik özelliklerine bak l r. Fiziksel özelliklerinde idrar n miktar na, kokusuna, rengine, yo unlu una ve ph reaksiyonuna bak l r. drar n kimyasal özelliklerinde fleker, protein, bilirubin, ürobilinojen, keton cisimleri, kan gibi maddelerin olup olmamas na bak l r. Ayr ca idrar mikroskobik olarak incelenir. Burada hastal kl idrarlarda organik ve organik olmayan maddelerin varl n n belirlenmesi klinik aç - dan önemlidir. Bir çok hastal n teflhisi idrar n mikroskobik olarak incelenmesiyle gerçekleflir. UYGULAMA 1: drar n Fiziksel Özelliklerinin Belirlenmesi Hacim (miktar): Analizi yap lacak idrar n hacmidir. drar miktar besinle al nan s v miktar na, metabolizma durumuna, ter ve solunum havas ile kaybedilen s v miktar na, dolafl m ve böbreklerin durumuna göre de ifliklik gösterir. drar miktar günlük 1200-1500 ml dir. drar miktar normalin üzerinde olursa Poliüri (2500 ml üstü)denir. drar miktar n n normalden az olmas na Oligoüri (750 ml alt ) denir.günlük idrar miktar n n 100 ml nin alt na düflmesineyse Anüri denir. Koku: Normal idrar n aromatik kokusu vard r. Bu kokuyu idrar n içindeki fenoller verir. Bozulan idrarda amonyok oluflmas nedeniyle amonyak kokusu oluflur. Görünüm: drar n berrak veya bulan kl n n belirlenmesidir. Renk: Normal idrar n rengi aç k sar ile koyu sar aras nda de iflmektedir. Bu rengi idrarda bulunan ürokrom pigmenti verir. drar n rengi hastal klarda de iflir. fieker hastal nda aç k sar,böbrek ve idrar yollar hastal klar nda kan bulaflmas nedeniyle k rm z, bilirubin bulundu unda sar, yeflil veya yeflilimsi kahverengi olmaktad r. drar renginin belirlenmesidir. ph Reaksiyonu: Normal olarak idrar n ph s 4.8-7.5 aras ndad r. drar n ph s n turnusol ka d veya ph test ka d ile belirlenebilir. Amaç: drar n fiziksel özelliklerini gözlemlemek ve elde edilen veriler sonucunda idrar n al nd kiflinin sa l kl olup olmad n belirlemek. Materyal: Mezür, beher, pastör pipeti, ph ka d. Uygulanacak fllem: 1. Al nan idrar örne inin mezür ile hacmi ölçülür. 2. drar n görünümüne, kokusuna ve rengine bak l r. 3. drar n ph ka d ile ph ölçülür. Gözlem ve Sonuçlar: Uygulamada kulland n z idrar n fiziksel özelliklerini not ediniz. Tart flma: Normal idrar özelliklerini tafl y p tafl mad n belirtiniz ve e er tafl m yorsa sa l k aç s ndan ne gibi bozukluklar olabilir tart fl n z.
1. Ünite - Genel Biyokimya Laboratuvar Uygulamalar 11 UYGULAMA 2: drar n Kimyasal Özelliklerinin Belirlenmesi Amaç: drarda fleker, albumin, ürobilinojen ve bilirubinin bulunup bulunmad n belirlemek. Materyal: Deney tüpleri, benedict ay rac, %20 lik TCA, Ehrlich ay rac, iyot ay rac, pastör pipeti, cam pipet. Uygulanacak fllem: 1. fieker Aranmas : Normal idrarda fleker bulunmaz. drarda fleker aranmas en çok fleker hastal nda uygulanmaktad r. 1. Bir deney tüpüne 5 ml Benedict ay rac ve 0.5 ml idrar koyunuz ve kar flt r n z. 2. Bunsen beki alevi üzerinde 1-2 dakika kaynat n z, so utunuz. Tüpte gözledikleriniz nelerdir? 2. Albumin (protein) Aranmas : Normal idrarda protein çok az miktarda bulunur. drarda protein bulunmas özellikle böbrek hastal klar için ön bilgi verir. 1. Bir deney tüpünün 2/3 ne kadar idrar koyunuz. 2. Üzerine birkaç damla %20 lik TCA damlat n z, bu s rada tüpü gözlemleyiniz. 3. Ürobilinojen Aranmas : Normal idrarda ürobilinojen bulunmaz. Karaci er hastal klar nda ve yetersizliklerinde, safra yolu t kan klar nda idrarda görülür. Bu olaya Ürobilinojenüri ad verilir. 1. Bir deney tüpüne 5 ml idrar koyunuz. 2. Üzerine 1 ml Ehrlich ay rac kat n z ve kar flt r n z. 3. 5 dakika sonra tüpte gözlemledikleriniz nelerdir? 4. Bilirubin Aranmas : Ölü ve yafll eritrositlerin hemoglobin yap lar bozulur ve hem halkas aç larak bilirubin oluflur. Normalde idrarda bulunmaz. Ancak öd yollar n n tafl veya ur nedeniyle t kanmas, karaci erin vital hepatitlerinde, zehirlenmelerde ve sirozda kanda bulunan bilirubin idrara geçer. drarda bilirubin bulunmas na Bilirubinüri denir. 1. Bir deney tüpünün 1/3 üne kadar idrar koyunuz. 2. Bir pipetle tüpün iç k sm na iyot ay rac katarak tabakaland r n z. 3. Tüpte gözledikleriniz nelerdir? Gözlem ve Sonuçlar: drar n kimyasal özelliklerini belirlerken tüplerde meydana gelen de iflimleri not ediniz. Tart flma: Normal bir insan n idrar nda fleker, albumin, ürobilinojen ve bilirubinin olmas gereken de erleri nelerdir? Elde etti iniz de erlerle karfl laflt r n z. Anormal de erler tesbit edilmiflse idrar sahibinin sa l k durumu hakk nda neler söyleyebilirsiniz? Tart fl n z.
12 T bbi Laboratuvar Uygulamalar (Uygulama Kitab ) fiekil 1.1 UYGULAMA 3: drar n Mikroskobik ncelenmesi Amaç: drarda norganik sedimentler (tirozin, lösin, sistin ve ürikasit kristali), Organik sedimentler (a. Silindirler, b. Hücreler, c. Mikroorganizmalar) ve Yabanc Cisimlerin (ya taneleri, saç, tüy ve yün lifleri) olup olmad n belirlemek. Materyal: Ependorf tüp, santrifüj, lam ve lamel, mikroskop Uygulanacak fllem: 1. Bir Ependorf tüpüne 2 ml idrar koyunuz ve tüpü 1500-2000 devirde 2-3 dakika santrifüj ediniz. 2. Oluflan peletten lam üzerinde preparat haz rlay n z. Mikroskop alt nda flekilleri inceleyiniz. Gözlem ve Sonuçlar: Mikroskopta gözlemledi iniz flekilleri çiziniz ve isimlendiriniz. Tart flma: drarda gözlemlenen flekillerin nedeni nedir? Her bir flekil için tart fl n z. Epitel hücreleri Hiyalen silindir Tiple fosfat/kalsiyum okzala Eritrositler Granül silindir Sistin kristali Lökositler Mum silindir Lözin/tirozin kristali Maya hücreleri/tricomonas Lökosit silindir Kolesterol kristali Eritrosit Silindir Ürik asit kristali
1. Ünite - Genel Biyokimya Laboratuvar Uygulamalar 13 LABORATUVAR ÇALIfiMASI 5: KAN GRUBU TAY N Kan grubu tayini antijen-antikor tepkimelerine ba l olarak gerçeklefltirilmektedir. Bu nedenle kan grubu tayininin temelini kavrayabilmek için antijen ve antikor tan mlar iyi bilinmelidir. Antijen (aglütinojen): Antijenler, vücuda girdiklerinde ba fl kl k sistemini uyararak kendisine karfl bir ba fl kl k yan t n oluflmas na neden olan yabanc madde ve mikroorganizmalard r. Genellikle protein ve polisakkarit yap s nda canl organizma k s mlar ya da büyük moleküllü proteinler ile bunlara ba lanm fl karbonhidratlar, nükleik ve lipidik yap lard r. Antikor (aglütinin): Çok hücreli hayvansal organizmalar n ba fl kl k sistemi taraf ndan, kendi organizmalar na ait olmayan organik yap lara karfl gelifltirilen glikoprotein yap l moleküllerdir (immunoglobulin). Kendilerinin oluflmas nda etkili olan antijenlerle özgül olarak birleflebilirler. Organizmaya d flar dan giren yabanc moleküllerin neden olabilece i zarar verici etkilere karfl erken bir savunma oluflturarak koruyuculuk sa larlar. IgG, IgM, IgA, IgD, IgE gibi çeflitleri vard r. ABO Kan Gruplar ve Kal t m Kan gruplar n n varl ilk kez 1901 y l nda Karl Landsteiner adl araflt rmac taraf ndan ortaya koyulmufltur. Farkl kan gruplar ndaki insanlar n kanlar biribirine kar flt r ld nda, baz lar nda kümelenme (çökelme, aglütinasyon) meydana gelirken, baz lar nda çökelme görülmemektedir. Bu kümelenmeye alyuvarlarda bulunan farkl proteinler (antijen, aglütinojen) ile kan plazmas nda bulunan çökelticiler (antikor, aglütinin) neden olmaktad r. Alyuvarlar nda A antijeni bulunduran kifliler A kan grubuna sahiptir. Alyuvarlar nda B antijeni bulunduran kifliler B kan grubuna sahiptir. Alyuvarlar nda hem A antijeni hemde B antijeni bulunduran kifliler AB kan grubuna sahiptir. Alyuvarlar nda antijen bulundurmayan kifliler O kan grubuna sahiptir Bu kan gruplar na sahip olan kiflilerin kan plazmas nda baflka bir kan n alyuvarlar n çökelten antikorlar bulunur. A kan grubuna sahip kifliler anti-b antikoru üretebilirler. B kan grubuna sahip kifliler anti-a antikoru üretebilirler AB kan grubuna sahip kifliler anti-a ve anti-b antikorlar ndan hiçbirini üretemezler. O kan grubuna sahip kifliler anti-a ve anti-b antikorlar n n herikisini birden üretebilirler. A ve B antijenleri alyuvarlar n hücre zarlar nda yer alan glikoprotein çeflitlerindendir. Anti-A ve anti-b antikorlar ise, kan serumunda do al olarak bulunan ve ilgili antijen vücuda girsin veya girmesin yaflam n çok erken evrelerinde akyuvarlar taraf ndan oluflturulan moleküllerdir. Yani ABO kan gruplar ile ilgili antikorlar n di er antikorlardan fark, antijenlerle temas etmese bile kanda az miktarda bulunmalar d r. Bir kifli hiçbir zaman mikrobik bir hastal a tutulmad kça ya da afl lanmad kça o hastal n antikoruna sahip olamaz. Ancak A kan gruplu bir kifliye B kan grubundan kan verilmese bile kan nda anti-b antikoruna sahiptir. Afla daki tabloyu (Tablo 1.1) inceleyiniz.
14 T bbi Laboratuvar Uygulamalar (Uygulama Kitab ) Tablo 1.1 Kan Gruplar ve Özellikleri Kan grubu Alyuvarlar ndaki antijen Plazmas ndaki antikor Kan verebildi i gruplar Kan alabildi i gruplar Anti-A antikoru ile çökelme durumu Anti-b antikoru ile çökelme durumu A A antijeni Anti-B antikoru A, AB A, O Çökelme var Çökelme yok B B antijeni Anti-A antikoru B, AB B, O Çökelme yok Çökelme var AB A ve B antijeni Antikor yok Yaln z kendi grubu O Antijen yok Hem anti-b hemde anti A antikoru var Bütün gruplar (Genelverici) Bütün gruplar (Genel al c ) Yaln z kendi grubu Çökelme var Çökelme yok Çökelme var Çökelme yok Gruplar aras kan al fl-verifli, d flar dan verilen kandaki antijenik yap ya karfl, al c n n kan nda anikor oluflturulmas esas na dayan r. Vericinin kan nda antijenik yap bulunuyorsa ve al c da da bu antijenik yap ya karfl antikor üretilebiliyorsa çökelme meydana gelecektir. Ancak vericinin kan nda, al c da antikor oluflumuna neden olacak bir antijenik yap bulunmuyorsa çökelme meydana gelmez. Bu durumda vericide al c n n kan nda bulunan antijenlerle çökelme oluflturabilecek bir antikor bulunsa dahi, bu çökelme k smi bir çökelme (yar çökelme) olacak ve tam çökelme gerçekleflmedi i için hayati bir risk oluflturmayacakt r. Örne in, A kan gruplu bir kiflide A antijeni bulunmaktad r. O kan gruplu bir kiflide ise antijenik yap bulunmaz. Ancak O kan gruplu kifli hem anti-a hem de anti-b antikorlar n bulundurmaktad r. O kan grubunda antijenik yap bulunmad ndan A kan grubundaki bir kifliye verildi inde herhangi bir antikor oluflumuna neden olmaz. O kan grubunda az miktarda anti-a antikoru do al olarak bulunmaktad r. Ancak bu antikor A kan grubunda bulunan A antijeni ile birleflse dahi, çok az bir çökelme (yar çökelme) meydana gelecek ve hayati bir risk oluflturmayacakt r. Bu nedenle, A kan gruplu kifli kendi grubunun yan s ra O kan grubundan da kan alabilir. Buna ra men, kan gruplar aras ndaki en uygun kan al fl-verifli, her bireyin kendi grubuyla yapt al fl-verifltir. Buna ideal kan al fl-verifli denir. deal olmayan gruplar aras ndaki kan nakillerinde yar çökelme veya tam çökelme olmaktad r. fiekil 1.2 Gruplar Aras Kan Al fl-verifli O Genel Verici O A A Genel Al c AB AB B B Yandaki flekilde (fiekil 1.2) gruplar aras kan al fl-verifli gösterilmektedir. Normal çizgi ile gösterilen oklarla yap lan nakillerde hiç çökelme meydana gelmez. Kesik çizgi ile gösterilen oklarla yap lan nakillerde ise yar çökelme meydana gelir.
1. Ünite - Genel Biyokimya Laboratuvar Uygulamalar 15 Rhesus (Rh) Faktörü ABO kan gruplar n n oluflmas n sa layan antijenlere ek olarak baz kiflilerin alyuvarlar nda fazladan antijenlerin bulundu u gözlenmifltir. Bu antijenler ilk kez Rhesus macacus ad ndaki bir maymunun kan nda tespit edilmifl ve Rh antijeni olarak adland r lm flt r. Bir kiflinin alyuvarlar nda Rh antijeni varsa Rh(+) yoksa Rh- tir. Rh( ) kan grubuna sahip kiflilerin kan plazmas nda Rh antijenini çökelten anti-d antikorlar bulunmaz. Ancak Rh antijeni ile biraraya geldi inde anti-d antikoru oluflur. Bu nedenle Rh( ) kan grubuna sahip bir birey Rh(+) kan grubuna sahib bir bireyden kan alamazken bu kifliye kan verebilir. Kan Uyuflmazl Annenin kan grubu Rh( ), bebe in kan grubu Rh(+) uldu u durumlarda kan uyuflmazl ortaya ç kabilir. Hamilelik s ras nda plasentada meydana gelebilecek bir hasar sonucunda embriyonun kan annenin kan na geçer. Annenin kan na geçen Rh antijenlerine karfl anti-d antikoru oluflur. Bu antikorlar plasenta yolu ile bebe- e geçer ve bebe in alyuvarlar n n çökelmesine neden olur. Bebekte meydana gelen bu hastal a Eritroblastosis fetalis denir. Bu olay düflü e ya da ölü do umlara neden olabilir. Bu durumu engellemek için gebelere 28. haftada anti-d i nesi yap lmal d r. Do umdan sonra bebe in kan grubu pozitif ise ilk 72 saat içinde yeniden anti-d uygulanmal d r. UYGULAMA 1: Kan Grubu Tayini Amaç: Kan, grubu tayinini gerçeklefltirmek. Materyal: Lam lanset, pamuk, %70 lik etil alkol, kürdan, anti-a antibadi solüsyonu, anti-b antibadi solüsyonu ve anti-d antibadi solüsyonu. Uygulanacak fllem: 1. Bir adet temiz lam haz rlay n z. 2. Cam kalemi kullanarak lam 3 bölgeye ay racak flekilde çiziniz. Bu bölmeleri A, B ve C olarak iflaretleyiniz. 3. Lam n A yaz lan bölümüne bir damla anti-a serumu, B yaz lan bölümüne bir damla anti-b serumu C yazan bölümüne ise bir damla anti-d serumu damlat - n z. 4. Sol elinizin orta parma n uç k sm na do ru birkaç kez s vazlayarak kan n parmak ucunda toplanmas n sa lad ktan sonra %70 lik etil alkol damlat lm fl pamuk ile parma n z siliniz. 5. Parma n z n ucunu tek kullan ml k steril lanset ile h zl ca deliniz. 6. Parma n z deldikten sonra 1 er damla kan s rayla anti-a, anti-b ve anti-d serumlar n n üzerine damlat n z. 7. Her damla için ayr kürdan kullanrak anti-a, anti-b ve anti-d serumlar n kan damlalar ile kar flt r n z. Sonra lamlar hafifçe öne ve arkaya do ru hareket ettirerek sallay n z. 8. Birkaç saniye içinde aglütinasyon oluflup oluflmad na makroskopik ve mikroskopik olarak bak n z.
16 T bbi Laboratuvar Uygulamalar (Uygulama Kitab ) fiekil 1.3 Kan Gruplar na Göre Çökelme (Aglütinasyon) Durumlar Kan Grubu AB, Rh(+) A, Rh(+) B, Rh( ) O, Rh( ) Damlat lan Serum Anti-A Anti-B Anti-D E er sadece anti-a ile aglütinasyon varsa, kan grubu A d r. E er sadece anti-b ile aglütinasyon varsa, kan grubu B dir. E er hem anti-a hem anti-b ile aglütinasyon varsa, kan grubu AB dir. E er gerek anti-a gerek anti-b ile aglütinasyon yoksa, kan grubu 0 d r. E er anti-d ile aglütinasyon varsa kan grubu Rh(+) dir. (Bkz. fiekil 1.3) Kaynaklar Yöntem, M., Pratik Biyokimya, 2006, Bizim Büro Bas mevi, ISBN 975-8201-61-1, sayfa 335. Aktümsek, A., Nurullaho lu, Z.Ü., 1996, Pratik Biyokimya, Mimoza Yay nlar Sa l k Dizisi, ISBN 975-543-042-3, sayfa 171. Uslu, S. Biyokimya Dersi Laboratuvar Çal flmalar (Ders notlar ) Osmangazi Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi.
2TIBB LABORATUVAR UYGULAMALARI (UYGULAMA K TABI) Amaçlar m z Bu üniteyi tamamlad ktan sonra; Mikrobiyoloji laboratuvar nda kullan lan malzeme ve araçlar listeleyebilecek, Mikroorganizmalarda ço alman n kontrolü için kullan lan yöntemleri aç klayabilecek, Canl bakteri preparatlar n n incelenmesini gerçeklefltirebilecek ve mikroorganizmalar n mikroskobik ölçümünü hesaplayabilecek, Besiyeri ve dilüsyon haz rlama, ekim tekniklerini (kültür transfer, saf kültür, çizgi, yayma, damla ekimler) gerçeklefltirebilecek, Bakterilerin boyanmalar ve mikroskobik incelenmelerini uygulayabilecek, Maya ve miselli funguslar n kültür edilmesi ve mikroskobik incelenmelerini gerçeklefltirebilecek, Otomatize biyokimyasal bakteriyal tan testlerini (API 20e, VITEK, PZR) aç klayabileceksiniz. Anahtar Kavramlar Sterilizasyon Preparat haz rlama Mikroskobik ölçüm Besiyeri Dilüsyon haz rlama Besiyeri tipleri Ekim teknikleri Kültür etme dentifikasyon Tan testleri çerik Haritas T bbi Laboratuvar Uygulamalar (Uygulama Kitab ) Genel Mikrobiyoloji Laboratuvar Uygulamalar M KROB YOLOJ LABORATUVARINDA KULLANILAN MALZEME VE ARAÇLAR M KROORGAN ZMALARDA ÇO ALMANIN KONTROLÜ CANLI BAKTER PREPARATLARININ NCELENMES VE ORGAN ZMALARIN M KROSKOB K ÖLÇÜMÜ M KROORGAN ZMALARIN KÜLTÜR ED LMES ANAEROB K BAKTER LER N KÜLTÜR ED LMES BAKTER LER N BOYANMASI VE M KROSKOB K NCELEME BAZI METALLER N VE K MYASAL MADDELER N ANT M KROB YAL ETK S LE ANT B YOT K DUYARLILIK TESTLER LAM AGLUT NASYON TEST BAZI FUNGUSLARIN KÜLTÜR ED LMES VE MORFOLOJ K NCELENMES OTOMAT ZE B YOK MYASAL BAKTER YAL TANI TESTLER
Genel Mikrobiyoloji Laboratuvar Uygulamalar LABORATUVAR ÇALIfiMASI 1: M KROB YOLOJ LABORATUVARINDA KULLANILAN MALZEME VE ARAÇLAR Uygulama I Amaç: Laboratuvarlarda kullan lan araç ve gereçlerin tan t m ve kullan m. Deney Tüpü Çap 1,5 ile 1,8 cm; boyu 8-10 cm ya da 15-18 cm aras nda olan cam borudur. Titrasyon ifllemlerinde, biyokimyasal deneylerde ve besiyeri haz rlama gibi çeflitli ifllemlerde kullan labilir. A z vidal kapakl ya da kapaks z olabilir. Santrifüj Tüpü Santrifüjlere s acak boyda amaca göre uçlar sivri yada yuvarlak ve santrifüjün tipine göre de iflik hacimlerde sa lam camdan yada plastikten yap lm fl tüplerdir.
20 T bbi Laboratuvar Uygulamalar (Uygulama Kitab ) Durham Tüpü Deney tüplerinin içerisine ters olarak yerlefltirilen 7x25 mm boyutlar nda küçük tüplerdir. Genellikle s v besiyerlerinde bakterilerin karbonhidrat kullanarak gaz oluflturup oluflturmad n belirlemek için kullan l r. Balon Joje (Volümetrik Balon, Dereceli Balon) Vücudu küre fleklindeki alt düz olan, dar silindir fleklinde boynu olan cam kaplard r. 25 ml, 50 ml, 100 ml, 250 ml, 500 ml, 1000 ml gibi de iflik hacimlerde olabilir. Besiyeri ve çözeltilerin saklanmas nda kullan l r. Balon jojelerin boyun k sm nda bir çizgi bulunur, bu çizgi seviyeyle ilgili hacmi belirtmektedir. Ölçü çizgisine kadar dolduruldu unda üzerinde belirtilen hacim kadar s v al r. Erlenmayerler Dip k sm genifl, a z k sm dar bir bo azla sona eren konik flekilli bir cam malzemedir.a z t rafll ya da t rafls z olabilir. Bunun yan s ra kapakl ve kapaks z olanlar vard r. 25 ml, 50 ml, 100 ml, 250 ml, 500 ml, 1000 ml gibi de iflik hacimlerde ve materyal olarak da cam ya da plastikten üretilmifl olabilirler. Beherler Çözelti ve s v lar n haz rlanmas nda ve titrasyon için kullan l r. Beherlerde erlenler gibi de iflik hacimlerde üretilebilmektedir. Yine cam ya da plastikten üretilmifl olabilirler. fiifleler Balon joje ve erlenlerde oldu u gibi de iflik hacimlerde ve de iflik materyalden üretilebilmektedirler. Koyu renkli olanlar genellikle boya ve ayraçlar n konulmas
2. Ünite - Genel Mikrobiyoloji Laboratuvar Uygulamalar 21 amaçl d r. Vidal kapakl olanlarsa besiyerlerinin ve baz çözeltilerin saklanmas amaçl d r. Petri Kutular 1-2 cm yükseklikte, 5-8 cm çap nda camdan yada plastikten yap lm fl kapak ve kutudan ibarettir. Özellikle kat besiyerlerinin haz rlanmas nda kullan l r. Plastikten üretilmifl olanlar steril haldedir ve kullan ma haz rd r. 1887 y l nda ilk kez PETR taraf ndan tan mland için bu ad kullan l r. Mezür (Dereceli Silindir) Silindir fleklinde dereceli cam malzemedir. S v lar n ölçülmesinde kullan l r. De iflik hacimlerde cam yada plastikten üretilmifltir. Pipetler Dereceli pipet: stenilen miktarda s v y bir yerden bir yere tafl mada kullan l r. Genellikle s ya dayan kl camdan üretilmifllerdir. De iflik hacimlerde üretilmektedir. Pipetin üst k sm nda çal flma hacminin aral klar belirtilmifltir.
22 T bbi Laboratuvar Uygulamalar (Uygulama Kitab ) Pipetin kullan lmas 1. Pipet, sa elle yere dik bir flekilde bafl ve orta parmak aras nda tutulur. 2. Pipetin ucu, kab n cidar yla taban aras ndaki aç içinde duracak flekilde s v içine dald r l r ve s v dan d flar ç kmamas na dikkat edilir. Aksi halde hava da beraber emilece inden s v a za gelir. 3. Pipetin di er ucundan a zla düzgün bir emme yap larak volüm çizgisinin biraz üstüne kadar pipet doldurulur. 4. Sonra süratle iflaret parma yla pipetin üst deli i t kan r. Nemli yada slak parmakla s v seviyesini ayarlamak güç oldu undan iflaret parma kuru olmal d r. 5. S v yla dolu pipet biraz e ik tutulur. flaret parma na hafif ve yumuflak gevfleme hareketleri yapt r l r. Bu flekilde fazla s v at l r. 6. S v tamamen boflalt lacaksa pipet dikey tutulur ve iflaret parma kald r l r, son k sm üflenir. Pasteur pipeti: Üzerinde derecesi bulunmayan çok az s v maddeyi bir baflka yere aktarmaya yarayan pipetlerdir. Plastik ve camdan üretilebilmektedir. Camdan üretilmifl olanlar pasteur f r n nda steril edilebilir ve ucu amaca göre s yla flekillendirilebilir. Otomatik Pipetler: Küçük miktardaki (mikrolitre (µl)) s v lar n çekilmesinde kullan lan ayarlanabilir pipetlerdir. Otomatik pipet kullan m nda dikkat edilecek noktalar 1. Pipetin hacim aral n pipetin basma yerinden ya da yan yüzden bakarak kontrol ediniz. Pipetin üzerinde belirtilen hacimler d fl nda kullan lamaz, kullan ld taktirde pipet bozulur.
2. Ünite - Genel Mikrobiyoloji Laboratuvar Uygulamalar 23 2. stenilen hacme uygun pipet seçilir ve bu pipete uygun tip seçilir. Genellikle pipetin üzerindeki renkler hangi tipin (ucun) kullan laca n belirler. 3. Otomatik pipetlerde, pipete bast r ld nda iki kademe vard r. 4. lk kademe, pipete hafifçe bas ld nda ulafl lan kademedir ve s v al m nda istenen hacimdeki s v n n al m n sa lar. 5. kinci kademe, pipete daha kuvvetli bir biçimde bast r ld nda ve en sona ulaflan kademedir. S v n n at m nda kullan l r. 6. S v al m nda ikinci kademede s v y al rsan z, istedi iniz miktardan fazlas n alm fl olursunuz. Bu da yanl fll a neden olur ve s v, pipetin çeperine dolar, sonraki pipetlemede kontaminasyona neden olur. Böylece sonraki aktar mda pipet bozulur. Baget Ezme ve kar flt rma iflleminde kullan lan cam çubuktur. Cam huni S v lar a z dar kaplara boflalt rken ve süzme ifllemi bafllad zaman kullan l r. çlerine yerlefltirilen süzgeç ka tlar huniden taflmayacak flekilde kesilmelidir. Lam Genellikle 76x26 mm boyutlar nda dikdörtgen fleklinde cam malzemedir. Preparat haz rlamada kullan l r. Thoma lam, Howard lam, çukur lam gibi özel tipte lamlar da bulunmaktad r. Rodajl Lam Lam n üçte birlik k sm buzlu camdan üretilmifltir. Bu k sma kurflun kalemle etiketlendirme yap labilir. Lamel Genellikle 20x20 yada 22x22 mm boyutlar nda yap lm fl malzemedir. Lam üzerine haz rlanan preparatlar n kapat lmas için kullan l r. Kare ya da dikdörtgen fleklindeki malzemedir. Yuvarlak olan tipleri de bulunmaktad r. Büret Titrasyon ifllemlerinde titre edilecek s v ya, di er s v y damlatmakta kullan l r. Ay rma Hunisi ki farkl faz birbirinden ay rmada kullan l r. Desikatör Kat bilefliklerin kurutulmas için vakum desikatörleri kullan labilir. Kurutma için desikatörün dibine önce deriflik H 2 SO 4, susuz CaCl 2, fosfor pentoksit, NaOH yada silikajel yerlefltirilir. Sonra kurutulacak bileflik, bir kap içerisine konarak desikatörün raf na yerlefltirilir ve desikatörün havas bir tromp yada vakum pompas yard - m yla al n r. fiale Dörtgen prizma fleklinde, camdan yap lm fl kapakl kaplard r. çlerinde 4-7 lam n uzun ya da k sa kenar üzerinde dik durmas n sa layacak yivler aç lm flt r. Preparatlar n boya, tampon, çözelti ve benzeri s v lar içerisinde muamele edilmesi için gerçeklefltirilmifltir.
24 T bbi Laboratuvar Uygulamalar (Uygulama Kitab ) Di er Malzemeler Sporlar Metal ya da tahtadan yap lm fl tüplerin dik olarak içine yerlefltirilip tafl nmas n ve saklanmas n sa layan tafl y c d r. Sterilizasyonda kullan lacaksa metal tipleri tercih edilmelidir. Süzgeç Ka d Süzme iflleminde kullan l r. Düz katlanm fl süzgeç ka d : Özellikle çökeltiye gereksinim oldu unda, süzgeç ka d huninin büyüklü üne göre düzgün bir flekilde kesilir ve dörde katlan p haz rlan r. Pilili süzgeç ka d : Süzme yüzeyini artt rd için süzme ifllemi çabuklafl r. Ancak buradan çökeltinin toplanmas ifllemi güçleflir. Süzgeç ka tlar bir defa kullan l r ve ifllem bittikten sonra at l r. Süzme iflleminin çabuklaflt r lmas için sisteme vakum yada bas nç uygulanabilir. Flask Kültür hücrelerinin yetifltirilmesi amac yla kullan lan zemini özel kaplama maddeleriyle kaplanm fl plastik materyaldir. Cryotüp -196 C ye dayan kl içinde hücre saklanan plastik tüptür. Puar Armut biçiminde, pipet takmak için bir aç kl bulunan, kal n plastik balonlard r. Pipetin ucuna tak ld ktan sonra avuçta s k l p gevfletilerek vakum oluflmas sa lan r. Böylece, pipetle s v çekme, boflaltma ya da püskürtme gibi ifllerde kolayl k sa lar. Mavi ve Sar Tip Otomatik pipetlerle birlikte kullan l r. S v al m ve boflalt lmas gerçeklefltirilir.