RIDASCREEN Clostridium difficile Toksin A/B Makale no.: C0801 R-Biopharm AG, An der neuen Bergstraße 17, D-64297 Darmstadt, Almanya Telefon: +49 (0) 61 51 81 02-0 / Fax: +49 (0) 61 51 81 02-20
1. Kullanım amacı İn vitro diagnostik kullanım içindir. RIDASCREEN Clostridium difficile Toksin A/B insan dışkı numunelerindeki ve dışkı numunelerinden önceden kültürlü toksin üreten Clostridium difficile soylarının kültürlerinden Clostridium difficile toksinleri A ve B nin kalitatif tespiti için enzim immunoassaydir. 2. Özet ve testin açıklaması İshal hastalıkları antibiyotik tedavilerinin nispeten sık görülen yan etkisidir. Özellikle 1970 lerin başında klindamisin tanıtımından beri massive pseudomembranous colitis (PMC) yol açabilecek işaretler ve belirtilerle daha şiddetli formlarda antibiyotik ilişkili kolit (AAC) daha sık karşılaşılan bir durum olmuştur. Patojen Clostridium difficile için pseudomembranous kolitin (PMC) sebebi olduğu ve AAC ve AAD nedenlerinden biri olduğu bulunmuştur. Clostridium difficile toksijenik soyları tarafından toksin A ve B üretimi hastalığın klinik belirtilerinin etyolojisinde önemli bir rol oynar. Molar kütlesi 200 kda dan büyük olan bu proteinlerin fonksiyonlarında ve immunolojisinde farklılıklar vardır. Toksin A enterotoksindir, toksin B sitotoksindir; ve her iki toksin in vivo etkilerinde sinerji gösterir. Considering that Clostridium difficile bazı soylarının toksinleri üretmediği ve sağlıklı yetişkinlerin yaklaşık 2 8% sinin ve 50% ye kadar iki yaşından daha küçük çocukların Clostridium difficile taşıyabileceği düşünüldüğünde bu toksinlerin belirlenmesi diagnostik uygulamada patojenik mikroorganizmayı belirlemekten daha önemli görünür. RIDASCREEN Clostridium difficile Toksin A/B ELISA monoklonal antikorların yardımıyla hasta dışkı numunelerindeki toksin A ve toksin B yi aynı anda spesifik olarak belirleyebilen enzim immunoassaydir. Güvenilir inceleme sonuçları iki saatten sonra zaten mevcuttur, erken bir aşamada etkili tedavi yöntemleri başlatmayı mümkün kılar. 3. Test prensibi RIDASCREEN Clostridium difficile Toksin A/B Testi sandviç-tip yönteminde monoklonal antikorları kullanır. Clostridium difficile toxksin A ve B karşı bu monoklonal antikorlar mikrokuyu plağın kuyu yüzeyine bağlanır. Bir pipet oda sıcaklığında (20 25 C) inkübasyon için biyotinli anti-toksin A/B antikorlarıyla (Konjugat 1) ile birlikte mikrokuyu plağın kuyusuna incelenecek kontrol numuneleri ve dışkı örneğinin bir süspansiyonunu yerleştirmek için kullanılır. Yıkama aşaması sonrası, streptavidin poly-peroksidaz konjugat (Konjugat 2) eklenir ve tekrar oda sıcaklığında (20 25 C) inkübe edilir. Numunedeki toksinlerin varlığıyla, hareketsiz antikorlar, toksinler ve konjuge antikorlar sandviç kompleksi oluşturur. Başka yıkama aşaması bağlanmamış streptavidin poly-peroksidaz konjugatı kaldırır. Substrat eklenmesinden sonra bağlanan enzim mikrokuyu plağın kuyularındaki önceden renksiz olan solüsyonun rengini eğer test pozitifse maviye dönüştürür. Durdurma reaktifinin eklenmesi rengi mavidne sarıya dönüştürür. Ekstinksiyon numunede bulunan toksin A ve B konsantrasyonuyla orantılıdır. RIDASCREEN Clostridium difficile Toksin A/B 13-09-05 2
4. Sağlanan reaktifler Kit içindeki reaktifler 96 tespit için yeterlidir. Plak 96 test Mikrokuyu plak, strip tutucuda 12 mikrokuyu strip (bölünebilen); Clostridium difficile toksin A ve B sine karşı spesifik monoklonal antikorlarla kaplı Seyreltici 1 100 ml Örnek dilüsyon buffer, protein-buffered NaCl solüsyonu; kullanıma hazır;mavi renkli Yıkama 100 ml Yıkama buffer, fosfat buffered NaCl solüsyonu (konsantre 10-kat); 0.1% thimerosal içerir Kontrol + Kontrol - Konjugat 1 Konjugat 2 2 ml 2 ml 13 ml 13 ml Pozitif kontrol; inaktif toksin; kullanıma hazır Negatif kontrol (örnek dilüsyon buffer); kullanıma hazır Stabilize protein solüsyonunda Clostridium difficile toksin A ve B karşı biyotin-konjuge antikorlar;kullanıma hazır;mavi renkli Stabilize protein solüsyonunda streptavidin poly-peroksidaz konjugat; kullanıma hazır; turuncu renkli Substrat 13 ml Hidrojen peroksit/tmb; kullanıma hazır Durdurma 8 ml Durdurma reaktifi; 1 N sülfürik asit;kullanıma hazır 5. Reaktifler ve onların saklanması Tüm reaktifler 2 8 C de saklanmalıdır ve etikette basılı tarihe kadar kullanılabilir. 2 8 C de saklı seyreltilmiş yıkama buffer maksimum 4 hafta için kullanılabilir. Mikrobiyel kontaminasyon önlenmelidir. Son kullanma tarihinden sonra kalite garantisi artık geçerli değildir. Alüminyum çanta kilit parçalanmayacak şekilde makasla açılmalıdır. Gerekmeyen herhangi mikrokuyu strip hemen alüminyum çantaya konulmalı ve 2 8 C de saklanmalıdır. Renksiz substratın ayrışmasını veya oto-oksidasyon nedeniyle maviye dönmesini önlemek için direkt ışıktan korunmalıdır. Birkez substrat maviye dönmüşse kullanılmamalıdır. 6. Ek gerekli reaktifler ve gerekli ekipman RIDASCREEN Clostridium difficile Toksin A/B 13-09-05 3
6.1. Reaktifler - Distile veya deiyonize su 6.2. Ekipman - Test tüpleri - Tek kullanımlık pipetler (Makale no.: Z0001) - Vorteks karıştırıcı (isteğe bağlı, 9.3. bakın) - 50 100 µl ve 1 ml hacimleri için mikropipet - Ölçüm silindiri (1,000 ml) - Kronometre - Mikrokuyu plaklar veya çok kanallı pipetler için yıkama cihazı (300 µl) - Mikrokuyu plaklar için fotometre (450 nm ve referans filtre 620 650 nm) - Filtre kağıdı (laboratuvar havlusu) - 0.5% hipoklorit solüsyonu içeren atık kabı 7. Kullanıcılar için önlemler Sadece in vitro diagnostik kullanım içindir. Bu test sadece eğitimli laboratuvar personeli tarafından yapılmalıdır. Medikal laboratuvarlardaki çalışma kuralları takip edilmelidir. Her zaman bu test için kullanıcı talimatlarına sıkıca bağlı kalın. Numuneler veya reaktifler ağızla pipetlenmemeli ve yaralı cilt veya mukoz membranlarıyla temas önlenmelidir. Numuneleri kullanırken kişisel koruyucu donanım (Uygun eldivenler, laboratuvar ceketi, koruyucu gözlük) giyin ve test bittikten sonra ellerinizi yıkayın. Örneklerin işlendiği alanlarda sigara içmeyin veya birşey yiyip içmeyin. Daha fazla detay için www.r-biopharm.com. da Malzeme Güvenlik Bilgi Formuna (MSDS) bakın. Kitteki pozitif kontrol sitotoksisite testinde inaktivasyon öncesi pozitif reaksiyon gösteren inaktif Clostridium difficile toksin içerir. Bu toksinler ve dışkı örnekleri olası bulaşıcı materyal gibi işlenmeli ve uluslararası güvenlik düzenlemeleri ile uyumlu kullanılmalıdır. Yıkama buffer koruyucu olarak 0.1 % thimerosal içerir. Bu maddenin cilt veya mukoz membranlarıyla teması önlenmelidir. Kullanımdan sonra tüm reaktiflerin ve materyallerin uygun ve sorumlu şekilde atımını sağlayın. Atım için lütfen ulusal düzenlemelere bağlı kalın. RIDASCREEN Clostridium difficile Toksin A/B 13-09-05 4
8. Numune toplama ve saklama Dışkı örnekleri ishalin ilk belirtileri ortaya çıktıktan sonra üç gün içinde mümkün olduğu kadar kısa zamanda alınmalıdır. Kullanılıncaya kadar test materyalini 2 8 C de saklayın. Eğer materyal üç gün içinde test için kullanılamıyorsa -20 C veya daha soğukta saklanmasını öneririz. Numunenin tekrar tekrar dondurulup çözdürülmesinden kaçının Örnek dilüsyon buffer içinde dışkı örneğini seyrelttikten sonra 1:11, üç gün içinde kullanım için 4 C de saklanabilir. Dışkı örnekleri, koruyucular, hayvan serumları, metal iyonlar, oksitleyici maddeler veya deterjanlar içeren taşıma ortamıyla taşıma kaplarında toplanmamalıdır, bunlar RIDASCREEN Clostridium difficile Toksin A/B Testine müdahale edebilir. Rektal lekeler kullanılacaksa dışkı materyali hacminin test için yeterli olduğundan emin olun (yaklaşık 100 mg). Kontakt izleme asemptomatik taşıyıcıları belirlemek amacıyla klinik semptomlar göstermeyen kontakt kişilerden alınan dışkı örneklerini içermelidir. 9. Test prosedürleri 9.1. Genel bilgi Tüm reaktifler ve mikrokuyu plak kullanımdan önce oda sıcaklığına (20 25 C) getirilmelidir. Bu mikrokuyu stripler oda sıcaklığına erişene kadar alüminyum çantadan çıkartılmamalıdır. Bu reaktifler kullanımdan hemen önce iyice karıştırılmalıdır. Kullandıktan sonra mikrokuyu stripler (kapalı çantalarda yerleşik) ve reaktifler tekrar 2 8 C de saklanmalıdır. Birkez kullanıldığında mikrokuyu stripler tekrar kullanılmamalıdır. Bu reaktifler ve mikrokuyu stripler paketleme zarar görmüşse veya şişelerden sızıntı varsa kullanılmamalıdır. Çapraz kontaminasyonu önlemek için örneklerin kit bileşenleriyle direkt teması önlenmelidir. Bu test direkt güneş ışığında yapılmamalıdır. Buharlaşma kayıplarını önlemek için mikrokuyu plağın kaplanmasını veya üstüne plastik wrap yerleştirilmesini öneririz. 9.2. Yıkama buffer hazırlama 9 kısım distile suyla 1 kısım yıkama buffer konsantreyi Yıkama karıştırın. Konsantre içinde bulunan herhangi kristali çözmek için önceden ısıtılmış olmalıdır (37 C de su banyosunda). 9.3. Örnekleri hazırlama 1 ml RIDASCREEN örnek dilüsyon buffer Seyreltici 1 ile etiketli bir test tüpünü doldurun. Sadece ikinci çıkıntının üstüne ince dışkı örneğini aspire etmek için (yaklaşık 100 µl) ve süspansiyon yapmak için test tüpünde buffera eklenmesi için tek kullanımlık bir pipet kullanın (makale no. Z0001). Katı dışkı örneğiyle süspansiyon yapmak için spatula veya tek kullanımlık aşılama döngüsü ile eşit miktarda (yaklaşık 50 100 mg) ekleyin. İçine aspirasyon ve tek kullanımlık pipetten ejeksiyon ile dışkı süspansiyonunu homojenize edin veya alternatif olarak Vorteks karıştırıcıda karıştırın. İri dışkı partiküllerinin çökelmesi için kısa süre (10 dakika) süspansiyonu beklemeye bırakın ve dışkı süspansiyonunun bu netleşmiş su- RIDASCREEN Clostridium difficile Toksin A/B 13-09-05 5
pernatantı testte direkt olarak kullanılabilir. Eğer test prosedürü otomatik ELISA sisteminde yapılıyorsa supernatant partikülsüz olmalıdır. Bu durumda 5 dakika 2,500 G da örneğin santrifüj edilmesi önerilir. Not: Seyreltici 1 içinde seyreltilen dışkı örnekleri Seyreltici 1 kullanılması şartıyla tüm RIDASCREEN ELISA içinde kullanılabilir. 9.4. Clostridium difficile kültürlerinden toksinlerin test edilmesi Katı substratlarda kültür sonrası kolonileri incelemek için (CCFA veya Schaedler agar) agar plaktan onları uzaklaştırmak için aşılama döngüsü kullanın; 1 ml örnek dilüsyon buffer Seyreltici 1 içinde askıya alın ve iyice karıştırın. Bu durumda süspansiyonun santrifüj edilmesi önerilir (5 dakika 2,500 G). Netleşmiş supernatant testte direkt olarak kullanılabilir. Sıvı kültürleri incelemek için, 1 ml örnek dilüsyon buffer Seyreltici 1 içinde 100 µl örneği askıya alın ve iyice karıştırın. Bu durumda süspansiyonun santrifüj edilmesi önerilir (5 dakika 2500 G). Netleşmiş supernatant testte direkt olarak kullanılabilir. Not: Sporülasyon başladığında Clostridium hücrelerinin kültüründe toksinleri tespit etmek mümkündür. Sporülasyon ve toksinlerin ilişkili atılımı, tüm besin maddeleri tüketildiğinde sadece patojen büyümenin geç,durağan fazında oluşur. 9.5. İlk inkübasyon Strip tutucuda yeterli sayıda kuyunun dolumundan sonra 100 µl pozitif kontrol kontrol +, negatif kontrol - veya dışkı örneği süspansiyonunu (veya mevcutsa, koloni süspansiyonunun supernatantı) kuyulara ekleyin. Daha sonra 100 μl biyotin-konjugatlı antikor Konjugat 1 ekleyin ve karıştırın (plağın kenarına hafifçe vurarak); sonra oda sıcaklığında (20 25 C) 60 dk inkübe edin. 9.6. Yıkama Dikkatli yıkama doğru sonuçların elde edilmesi için önemlidir ve bu nedenle talimatlara göre ilerleyin. Kuyularda inkübe edilen madde yerel düzenlemelere uygun olarak atım için atık kabı içine boşaltılmalıdır. Daha sonra emici kağıt üzerine plağı ters çevirin ve kalan nemi uzaklaştırmak için vurun. Sonra her defasında 300 µl yıkama buffer kullanılarak 5 kez plağı yıkayın. Emici kağıdın hala kuru ve kullanılmamış olan kısmında her yıkama sonrası vurup çıkartarak tamamen kuyuların boşaldığından emin olun. Mikroplak yıkayıcı veya tam otomatik ELISA kullanıyorsanız makinenin doğru şekilde ayarlandığından emin olun; gerekirse üreticiden ayarları isteyin. R-Biopharm tarafından verilen aletler valide ayarlar ve iş protokolleri ile zaten programlanmıştır. Yıkama iğnelerinin tıkanmasını önlemek için partikülsüz dışkı süspansiyonları doldurulmalıdır (Kısım 9.3., Örnekleri hazırlama kısmına bakın). Her yıkama aşaması esnasında tüm sıvının emildiğinden emin olun. RIDASCREEN Clostridium difficile Toksin A/B 13-09-05 6
9.7. İkinci inkübasyon Kuyulara 100 µl streptavidin poly-peroksidaz konjugat Konjugat 2 doldurmak için bir pipet kullanın sonra oda sıcaklığında (20 25 C) 30 dk inkübe edin. 9.8. Yıkama Kısım 9.6 da belirtildiği gibi yıkayın. 9.9. Üçüncü inkübasyon Tüm kuyuları 100 µl substrat Substrat ile doldurun. Sonra oda sıcaklığında karanlıkta (20 25 C) 15 dk plağı inkübe edin. Daha sonra reaksiyonu durdurmak için 50 µl durdurma reaktifi Durdurma ile tüm kuyuları doldurun. Plağın kenarına hafifçe vurarak dikkatlice karıştırdıktan sonra 450 nm de ekstinksiyon (isteğe bağlı: 450/620 nm) ölçün. Havada yani mikrokuyu plak olmadan sıfır noktasını ayarlayın. Not: Yüksek-pozitif hasta örnekleri substratın siyah renkli çökeltilerine sebep olabilir. 9.9 Özetlenmiş test protokolü Kısım 9.5, 9.7 ve 9.9 da belirtilen inkübasyon süreleri önemli ölçüde kısaltılabilir, plak 37 C de inkübe ediliyorsa ve titreşim frekansı 20 25 Hz. (DSX, Fa. Dynex). İnkübasyon süreleri değişir: İnkübasyon 1: 30 dk İnkübasyon 2: 15 dk İnkübasyon 3: 15 dk Ayrıca Eppendorf tarafından Thermomixer (frekans ayarı: 850 rpm) veya LTF Labortechnik tarafından DTS-2 (frekans ayarı 800 rpm) gibi ayrı mikrokuyu plak çalkalayıcıları uygundur. 10. Kalite kontrol reaktif süresi bitiminin belirtileri Kalite kontrol amaçları için, testin doğru şekilde yapılmış olması ve reaktiflerin stabil olmasını sağlamak için pozitif ve negatif kontroller her test yapıldığında kullanılmalıdır. Negatif kontrol için ekstinksiyon oranı (OD) 450 nmde 0.2 den küçükse (450/620 nm de 0.160 dan küçük) ve pozitif kontrol için ölçülen değer 450 nm veya 450/620 nm de 0.8 den büyükse test doğru yapılmıştır. Negatif kontrol için 0.2 den (0.160) büyük değer yıkamanın yetersiz olmuş olabileceğini gösterir. Olması gereken değerlerden sapma, bir bulanıklık veya kuyulara doldurulmadan önce renksiz substratın mavi renklenmesi reaktiflerin süresinin bittiğini gösterebilir. Öngörülen değerler karşılanmazsa, aşağıdaki noktalar testi tekrarlamadan önce kontrol edilmelidir: - Kullanılan reaktiflerin son kullanma tarihi - Kullanılan ekipmanın işlevselliği (ör. kalibrasyon) RIDASCREEN Clostridium difficile Toksin A/B 13-09-05 7
- Doğru test prosedürü - Kontaminasyon veya sızıntılar için kit bileşenlerinin görsel kontrolü maviye dönen substrat solüsyonu kullanılmamalıdır. Testi tekrarladıktan sonra hala şartlar yerine getirilmediyse, lütfen üretici veya yerel R-Biopharm distribütörünüzle temasa geçin. 11. Değerlendirme ve yorumlama 11.1. Cut-off hesaplama Cut-off oluşturmak için 0.15 ekstinksiyon birimleri negatif kontrol için ölçülen ekstinksiyona eklenir. Cut-off = negatif kontrol için ekstinksiyon + 0.15 11.2. Test sonuçları Ekstinksiyon oranı hesaplanan cut-off değerinden %10 daha fazlaysa numunenin değerlendirilmesi pozitiftir. Ekstinksiyon oranı cut-off değerinden %10 az ve %10 fazlası aralığındaysa numunenin değerlendirilmesi marjinaldir. Tekrar taze dışkı örneğiyle yeniden inceleme giri bölge içine düşüyorsa örneğin değerlendirilmesi negatifdir. Hesaplanan cut-off altında %10 dan fazla ekstinksiyonlara sahip örnekler negatif düşünülmelidir. 12. Yöntem sınırlamaları RIDASCREEN Clostridium difficile Toksin A/B Testi dışkı örneklerindeki Clostridium difficile toksin A ve B varlığını gösterir. Klinik belirtilerin ortaya çıkması ya da şiddeti için ekstinksiyonun belirlenen seviyesiyle ilişkilendirmek mümkün değildir. Elde edilen sonuçlar her zaman klinik görüntü ile kombinasyon halinde yorumlanmalıdır. Pozitif sonuç başka bulaşıcı patojenlerin varlığını ekarte etmez. Negatif sonuç Clostridium difficile enfeksiyon olasılığını ekarte etmez. Bu sonuç yetersiz saklama koşulları nedeniyle numunedeki toksinlerin proteolitik yıkımından kaynaklanabilir. Hasta anamnezi Clostridium difficile enfeksiyon şüphesini destekliyorsa inceleme başka dışkı örneğiyle tekrarlanmalıdır. Marjinal sonuç dışkı örneğindeki toksinlerin homojen olmayan dağılımından kaynaklanabilir. Bu durumda inceleme aynı örnekten ikinci bir süspansiyonla veya incelenmesi gereken başka dışkı örneğiyle tekrarlanmalıdır. RIDASCREEN Clostridium difficile Toksin A/B 13-09-05 8
Bir dışkı örneğinden Clostridium difficile kültüründe toksinler için negatif test sonuçları Clostridium difficile toksijenik olmayan soylarının varlığını gösterebilir. Böyle bir sonucu açıklığa kavuşturmak için şüpheli kolonilerdeki toksinlerin olası oluşumu ELISA ile incelenmelidir. 13. Performans özellikleri 13.1. Test kalitesi Almanya'da büyük bir klinikte yapılan prospektif bir çalışmada CDAD (Clostridium difficile ilişkili ishal) şüphesi olan hastalardan 502 dışkı örneği RIDASCREEN ELISA ve başka ticari ELISAlar ile incelendi ve sonra altın standart olarak sitotoksisite testiyle kıyaslandı. Altın standartla en iyi denk gelenin RIDASCREEN ELISA olduğu kanıtlanmıştır. Bu çalışmanın sonuçları Tablo 1 de özetlenmektedir. Tablo 1: Altın standart ile RIDASCREEN Clostridium difficile Toksin A/B kıyaslaması (nötralizasyon ile sitotoksisite testi) RIDASCREEN Clostridium difficile Toksin A/B poz neg Altın standart pozitif 61 7 negatif 14 420 Duyarlılık: 89.7 % Özgüllük: 96.8 % Pozitif öngörülebilirlik: 81.3 % Negatif öngörülebilirlik: 98.4 % 13.2. Çapraz reaktivite Bağırsak kanalından patojenik mikroorganizmaların çeşitliliği RIDASCREEN Clostridium difficile Toksin A/B ELISA ile incelendi ve çapraz reaktivite göstermedi. Bu testler bakteriyel süspansiyonlar (106-109 cfu/ml), parazit kültürleri (107-109 organizma/ml) ve virüs ile enfekte olmuş hücrelerden hücre kültür supernatantları ile yapıldı. Çalışmanın sonuçları Tablo 2 de özetlenmektedir. Tablo 2: Bağırsak kanalından patojenik mikroorganizmalarla çapraz reaktivite Organizma Sonuç [OD 450] Adenovirus 0.060 Aeromonas hydrophila 0.057 Astrovirus 0.055 RIDASCREEN Clostridium difficile Toksin A/B 13-09-05 9
Bacillus cereus 0.053 Bacteroides fragilis 0.058 Campylobacter coli 0.061 Campylobacter jejuni 0.059 Candida albicans 0.066 Citrobacter freundii 0.055 Cryptosporidium muris 0.061 Cryptosporidium parvum 0.054 E. coli (EPEC) 0.060 E. coli (ETEC) 0.054 E. coli (STEC) 0.053 Enterobacter cloacae 0.059 Enterococcus faecalis 0.054 Giardia lamblia 0.056 Klebsiella oxytoca 0.054 Proteus vulgaris 0.055 Pseudomonas aeruginosa 0.055 Rotavirus 0.056 Salmonella enteritidis 0.063 Salmonella typhimurium 0.062 Serratia liquefaciens 0.053 Shigella flexneri 0.067 Staphylococcus aureus 0.065 Staphylococcus epidermidis 0.055 Vibrio parahaemolyticus 0.054 Yersinia enterocolitica 0.053 3.2.1. Soy özgüllüğü: Aşağıdaki Clostridium soyları RIDASCREEN Clostridium difficile Toksin A/B ELISA içinde negatif test edildi: C. bifermentans, C. butyricum, non-toxigenic C. difficile (3 soy), C. perfringens, C. sordellii, C. sporogenes, C. tetani. 13.3. Kesinlik RIDASCREEN Clostridium difficile Toksin A/B ELISA tekrarlanabilirliği negatif-yüksek pozitif aralığında tam ölçümü gösteren altı referans ile test edildi. İntra-test tekrarlanabilirliğini bellirlemek için bu referansların 40 tekrarı test edildi. Ortalama değerler ve varyasyon katsayıları (VC) kitlerin üç lotu için belirlendi. İnter- test tekrarlanabilirliği için 10 ardışık çalışma gününden RIDASCREEN Clostridium difficile Toksin A/B 13-09-05 10
elde edilen referanslar gün başına iki çalışmayla iki kez test edildi. Ölçümler kitlerin üç lotu için üç teknisyen tarafından belirlendi. İnter-lot tekrarlanabilirliği kitlerin tüm üç lotu için belirlendi. Referans Ortalama değer / VC 1 2 3 4 5 6 Intra-test Inter-test Inter-lot Kit lot 1 Kit lot 2 Kit lot 3 Kit lot 1 Kit lot 2 Kit lot 3 Kit lotları 1 3 1,181 / 5,09% 0,867 / 6,25% 0,659/ 6,01% 0,428 / 9,64% 0,320 / 8,42% 0,046 / 5,60% 1,307 / 6,13% 0,895 / 4,59% 0,665 / 5,16% 0,461 / 4,74% 0,337 / 5,69% 0,049 / 6,91% 1,175 / 4,28% 0,879 / 4,81% 0,616 / 7,61% 0,462 / 3,30% 0,300 / 4,71% 0,053 / 15,40% 1,256 / 13,93% 0,947 / 15,51% 0,620 / 17,87% 0,471 / 20,13% 0,319 / 24,51% 0,058 / 24,16% 1,218 / 12,86% 0,900 / 14,41% 0,596 / 16,85% 0,445 / 18,24% 0,293 / 19,98% 0,058 / 20,54% 1,211 / 11,33% 0,897 / 12,47% 0,601 / 12,45% 0,482 / 18,32% 0,319 / 14,19% 0,059 / 15,37% 1,228 / 12,78% 0,915 / 14,24% 0,605 / 15,94% 0,466 / 18,98% 0,310 / 20,14% 0,058 / 20,33% 13.4 Analitik duyarlılık Clostridium difficile toksin A ve toksin B nin analitik tespit sınırları ayrı ayrı belirlendi. Blank sınırı (LoB) negatif örneklerin 270 testiyle belirlendi ve toksin A ve B için tespit sınırları (LoD) her biri 90 testte analiz edilerek belirlendi. Çalışmanın sonuçları Tablo 1 de özetlenmektedir. Tablo 1: LoB ve LoD OD (450 nm) Örnekteki analitik konsantrasyon (ng/ml) Örnek süspansiyonundaki analitik konsantrasyon (seyrelticide 1+10) (ng/ml) LoB 0.073 - - LoD (toksin A) 0.132 1.56 0.156 LoD (toksin B) 0.117 1.56 0.156 14. Müdahale edici maddeler Aşağıdaki maddelerin belirlenen konsantrasyonlarda C. difficile toksin A/B pozitif ve C. difficile toksin A/B negatif dışkı örneklerine karıştırıldığında test sonuçlarına etkisi görülmedi: baryum sülfat (5 % w/w), loperamid (antidiarrheal ilaç; 5 % w/w), Pepto-Bismol (antidiarrheal ilaç, 5 % v/w), mukinler (5 % w/w), sodyum siklamat (yapay tatlandırıcı, 5 % v/w), insan kanı (5 % v/w), stearik asit / palmitinik asit (karışım 1:1, 40 % w/w), metronidazol (0.5) (antibiyotik 5 % v/w), diklofenak (0.00263 % v/w). RIDASCREEN Clostridium difficile Toksin A/B 13-09-05 11
Ek Teste özgü semboller: Plak Seyreltici 1 Yıkama Kontrol + Kontrol - Mikrokuyu plak Örnek dilüsyon buffer Yıkama buffer Pozitif kontrol Negatif kontrol Konjugat 1 Konjugat 1 Konjugat 2 Konjugat 2 Substrat Durdurma Substrat Durdurma reaktifi RIDASCREEN Clostridium difficile Toksin A/B 13-09-05 12
Bibliyografi 1. Lyerly, D.M. et al.: Clostridium difficile: Its disease and toxins. Clin. Microbiol. Rev. (1988); 1: 1-18. 2. Knoop, F.C. et al.: Clostridium difficile: Clinical disease and diagnosis. Clin. Microb. Rev. (1993); 6: 251-265. 3. Kelly, C.P. et al.: Clostridium difficile Colitis. New Engl. J. Med. (1994); 330: 257-262. 4. Sullivan, N.M. et al.: Purification and characterization of toxins A and B of Clostridium difficile. Infect. Immun. (1982); 35: 1032-1040. 5. Thomas, D.R. et al.: Postantibiotic colonization with Clostridium difficile in nursing home patients. J. Am Geriatr. Soc. 38, 415-420 (1990). 6. Bartlett, J.G.: Clostridium difficile: Clinical considerations. Rev. Infect. Dis. (1990); 12: 243-251. 7. Loeschke,K., Ruckdeschel, G.: Antibiotikaassoziierte Kolitis - aktualisiert. Internist (1989); 30: 345-353. 8. Enzensberger, R. et al.: Clostridium difficile-induzierte Enterokolitis. DMW(1986); 111: 56-59. 9. Cefai, C. et al.: Gastrointestinal carriage rate of Clostridium difficile in elderly, chronic care hospital patients. J. Hosp. Infect. (1988); 11: 335-339. 10. Samore, M.H. et al.: Wide diversity of Clostridium difficile types at a tertiary referral hospital. J. Infect. Dis. (1994); 170: 615-621. 11. Lipsett, P.A. et al.: Pseudomembranous colitis: A surgical disease? Surgery (1994); 116: 491-496. 12. Asha, N.J. et al.: Comparative analysis of prevalence, risk factors and molecular epidemiology of Antibiotic associated diarrhea due to Clostridium difficile, Clostridium perfringens, and Staphylococcus aureus. J.Clin. Microbiol. (2006); 44: 2785-2791. 13. Voth, D.E., Ballard, J.: Clostridium difficile toxins: Mechanism of action and role in disease. J.Clin. Microbiol. (2005); 18: 247-263. 14. Borgmann, S. et al.: Increased number of Clostridium difficile infections and prevalence of Clostridium difficile PCR ribotype 001 in southern Germany. Eurosurveillance (2008); Vol 13: No.49. 15. Mc.Donald, L.C. et al.: An epidemic, toksin gene-variant strain of Clostridium difficile. N.Engl.J.Med. (2005); 353: 23. 16. Loo,V.G. et al.: A predominantly clonal multi-institutional outbreak of Clostridium difficileassociated diarrhea with high morbidity and mortality. N.Engl.J.Med. (2005); 353.23 17. Bartlett,J.G., Gerding,D.N.: Clinical recognition and diagnosis of Clostridium difficile infection. CID (2008); 46 (Suppl.1): 12-18. RIDASCREEN Clostridium difficile Toksin A/B 13-09-05 13