TEKRARLAYAN VF BAfiARISIZLIKLARINDA GENET K FAKTÖRLER N KL N K VE PROGNOST K ÖNEM

DERLEME (Review) TEKRARLAYAN VF BAfiARISIZLIKLARINDA GENET K FAKTÖRLER N KL N K VE PROGNOST K ÖNEM Zeynep OCAK 1, Tülay ÖZLÜ 2 1 Abant zzet Baysal Üniversitesi T p Fakültesi, T bbi Biyoloji ve Genetik Anabilim Dal, Bolu. 2 Abant zzet Baysal Üniversitesi T p Fakültesi, Kad n Hastal klar ve Do um Anabilim Dal, Bolu. ÖZET 1978 y l nda in-vitro fertilizasyon sonucu elde edilen bir gebelikten ilk bebe in do mas sonucunda infertilite tedavisinde yeni bir dönem bafllam flt r. Bunu takiben, in-vitro fertilizasyon gibi yard mc üreme teknikleri sayesinde çocuksuz çiftlerin önemli bir yüzdesi sa l kl gebelikler elde edebilmifllerdir. Yard mc üreme tekniklerindeki tüm geliflmelere ra men, gebelik h zlar beklendi i flekilde artmam fl ve ne yaz k ki transfer edilen emriyolarda implantasyon baflar s düflük yüzdelerde kalm flt r (%15). Etiyolojisi net olarak bilinmeyen ve muhtemelen multifaktoriel nedenlerden kaynaklanan rekürren gebelik kay plar na benzer flekilde, tekrarlayan implantasyon baflar s zl olan hastalar n da de erlendirilmesi zor ve komplekstir. Çiftlerde yada embriyoda genomik yeniden düzenlenmeler, sperm DNA hasar ve imprinting hatalar gibi genetik risk faktörleri tekrarlayan implantasyon baflar s zl nedenleri aras nda kabul edilmektedir. Genetik tarama, genetik bir hastal k tan s konulan hastalara ve ailelere iyi bir t bbi bak m verilebilmesi için gerekli bir uygulamad r. Prekonsepsiyonel genetik taraman n amac fertiliteyi de erlendirmek, infertilite tedavilerinin baflar lar n art rabilmek, ve fatal ve/veya çoklu konjenital anomaliler ile etkilenmifl çocuk do urabilecek sa l kl tafl y c lar tespit edebilmektir. Bu derlemede, tekrarlayan implantasyon baflar s zl ile iliflkili muhtemel genetik faktörler güncel literatür bilgileri fl nda tart fl lm flt r. Anahtar kelimeler: anöploidi, DNA metilasyonu, karfl laflt rmal genom hibridizasyonu, kromozom aberasyonlar, preimplantasyon tan, tüp bebek, Türk Jinekoloji ve Obstetrik Derne i Dergisi, (J Turk Soc Obstet Gynecol), 2013; Cilt: 10, Say : 3, Sayfa: 181-92 CLINICAL AND PROGNOSTIC SIGNIFICANCE OF GENETIC FACTORS IN RECURRENT IN-VITRO FERTILIZATION FAILURES SUMMARY In 1978, a new era has started in the treatment of infertility by the birth of the first baby from a pregnancy achieved by in-vitro fertilization. Following this, healthy pregnancies have been achieved by assisted reproductive techniques such as in-vitro fertilization by an important percentage of the childless couples. Despite all developments in assisted reproductive techniques, pregnancy rates haven't increased as expected, and unfortunately the rate of implantation success of transferred embryos remained at low levels (15%). Similar to recurrent pregnancy loss in which the etiology is not clear yet and the causes are probably multifactorial, evaluation of patients with recurrent implantation failure is difficult and complex. Genetic risk factors such as genomic rearrangements in the couples and the embryo, sperm DNA damage and imprinting defects have been considered among the causes of recurrent implantation failure. Genetic screening is an integral part of providing good medical care of patients and families receiving a diagnosis Yaz flma adresi: Yard. Doç. Dr. Zeynep Ocak. Abant zzet Baysal Üniversitesi T p Fakültesi, T bbi biyoloji ve Genetik Anabilim Dal, Bolu. Tel.: (0532) 343 81 28 e-posta: zeynep_ipek@yahoo.com Al nd tarih:28.06.2012, revizyon sonras al nma: 28.06.2012, kabul tarihi: 09.01.2013, online yay n tarihi: 10.01.2013 181 DOI ID:10.5505/tjod.2013.85866

Zeynep Ocak ve Tülay Özlü of a genetic disorder. The aim of preconceptional genetic screening is to asses the fertility, to be able to increase succes rate of infertility treatments and to detect the healthy carriers who may have a baby with the risk of fatal and/or multiple congenital anomalies. In this review, possible genetic factors associated with recurrent implantation failure are discussed in the light of the current literature. Key words: aneuploidy, chromosome aberrations, comparative genomic hybridization, DNA methylation, fertilization in vitro, preimplantation diagnosis Journal of Turkish Society of Obstetrics and Gynecology, (J Turk Soc Obstet Gynecol), 2013; Vol: 10, Issue: 3, Pages: 181-92 TANIM VE ÖNEM Tekrarlayan in-vitro fertilizasyon baflar s zl (RIF), ard fl k en az üç in-vitro fertilizasyon (IVF)/Intrasitoplazmik Sperm Enjeksiyonu (ICSI)- Embriyo Transferi (ET) uygulamas sonras iyi kalitede embriyo transfer edilmesine ra men gebelik elde edilememesi olarak tan mlanm flt r (1,2). Yard mc üreme tekniklerindeki tüm geliflmelere ra men ET sonras implantasyon baflar oran %15 gibi düflük seviyelerde kalm flt r (3,4). Bu durumun etiyolojisi tam olarak ayd nlat labilmifl de ildir ve muhtemelen altta yatan bir çok neden vard r. Bu nedenle RIF olan hastalar n de erlendirilmesi oldukça zor ve karmafl kt r. IVF uygulamalar nda genetik faktörlerin de incelenmesi hem ifllem baflar s na olan etkisi hem de çiftlere özgü izlenecek yolun belirlenebilmesi aç s ndan oldukça önemlidir. Bu hastalar için planlanan genetik taramalar prekonsepsiyonel dönemde ya da fertilite durumunun de erlendirilmesi sürecinde yap lmal d r. TEKRARLAYAN IVF BAfiARISIZLIKLARININ ET YOLOJ S RIF anne, baba ve embriyoya ait birçok faktörün rol oynad kompleks bir süreçtir. Anneye ait faktörler aras nda ileri yafltan kaynaklanan oosit ve embriyo kalitesizli i ile kromozomal anöploidi riskinde artma temel nedenler aras nda say lmaktad r. Artan yaflla birlikte IVF baflar oranlar n n ve canl do um oranlar n n azald önceki çal flmalarda gösterilmifltir (1) (Resim 1). Yine annede endometrial polipler ve submüköz fibroidler gibi anatomik de iflikliklerin, embriyoya karfl immun reaksiyon oluflmas na neden olabilen antitroid antikor ve antinükleer antikor varl n n da RIF ve tekrarlayan gebelik kay plar na (RPL) neden olabildi i gösterilmifltir. Çiftlerde kromozomal anomaliler, tek gen hastal klar, multifaktöriyel hastal klar ve sperm anöploidileri gibi genetik anomalilerin varl (5,6), suboptimal ovarian stimulasyon protokolleri, suboptimal kültür koflullar, uygun olmayan embriyo transfer teknikleri ve embriyoya ait intrensek nedenlerin de implantasyon baflar s n etkiledi i gösterilmifltir (7,8) (Resim 2). 45,00% 40,00% 35,00% 30,00% 25,00% 20,00% 15,00% 10,00% 41,10% 43% 35,10% 36% 25.40% 27% Canl do um oran VF baflar oran 14.50% 18% 5,90% 2,90% 5,00% 0,00% 0-35 35-37 38-40 41-42 43 44 Resim 1: Yafla ba l olarak IVF baflar s ve canl do um oran aras ndaki iliflki. Yafl Genetik anomaliler Suboptimal ovaryan uyar mmunulojik durumlar mmunulojik durumlar Suboptimal kültür fiartlar Embriyo say s ve kalitesi Oosit sperm Zigot Embriyo Transfer Yafl Genetik anomaliler Çevresel ve immunulojik durumlar Genetik anomaliler Düflük embriyo kalitesi Anöploidi ve çeflitleri Zay f embriyo geliflmi Suboptimal embriyo Transfer tekni i Resim 2: mplantasyon baflar s n etkileyen temel faktörler. 182

Tekrarlayan VF baflar s zl klar nda genetik faktörlerin klinik ve prognostik önemi 1) Tekrarlayan IVF Baflar s zl klar nda Etkili Genetik Faktörler a. Kromozomal anomaliler: Yap lan çal flmalarda gebelik kay plar n n %80'den fazlas n n birinci trimesterde olufltu u ve fetüs ya da aborta ait materyallerin analizinde yaklafl k %53 oran nda kromozomal anomali saptand bildirilmifltir (9). Benzer flekilde RIF olan çiftlerden elde edilen embriyolarda da preimplantasyon genetik tarama (PGS) ile oldukça yüksek oranda kromozomal bozukluk tespit edilmifltir. Bu kromozomal bozukluklardan en s k gözlenenler anöploidilerdir. Bunun yan nda 3 veya daha fazla kromozomu içeren say sal ve kompleks anomaliler de bildirilmifltir (9,10). RPL'l annelerin abort materyallerine kromozom analizi yap ld nda anöploidili fetus do urma riskinin ileri anne yafl nda normalden daha yüksek oldu u birçok çal flmada gösterilmifltir (5). RPL'l annelerin hem kan hem de bukkal smear örneklerinde X alfa satellit problar kullan larak yap lan FISH analizinde yafltan ba ms z olarak düflük oranda X monozomi mozaisizminin de RPL için önemli bir risk faktörü oldu u tespit edilmifltir (11). Bu nedenle IVF uygulanacak çiftlerde ileri anne yafl veya mozaik X kromozom monozomisi tespit edildi inde aileye PGS ve prenatal tan önerilmesi gerekti i düflünülmüfltür. Normal karyotip ve anormal spermiyogram saptanan infertil erkeklerde yap lan sperm FISH çal flmalar nda, kromozom say anomalisi ile diploid sperm oran nda art fl gözlenmifl olup bu bulgular n sperm say ve motilitesi ile iliflkili oldu u bildirilmifltir (12). Yap lan sperm anöploidi çal flmalar nda, cinsiyet kromozomlar ile 21 ve 22 nolu kromozomlara ait anomalilerinin s kl n n daha yüksek oranda bulundu u bildirilmifltir (13). Mozaik olmayan XXY-Klinefelter olgular nda yap lan bir çal flmada cinsiyet kromozom dizomisinin %7.69; mozaik (XY/XXY) olgularda %2.54 ve XYY olgular nda ise %3.97 oran nda oldu u gösterilmifltir (14-16). Bu nedenle erkek faktör nedeniyle IVF uygulanmas düflünüldü ünde sperm FISH çal flmalar ile sperm anöploidisinin olup olmad araflt r lmal gerekirse aileye PGS, prenatal tan önerilmelidir (Resim 3). Subtelomerik yeniden düzenlenme? Subtelomerik FISH veya a CGH (+) Normal karyotip Sperm FISH (diploid veya anöploid sperm?) Sperm donasyon Sperm DNA hasar (DFI oran?) IMSI FGD Sperm donasyon Karyotip Yap sal kromozom anomalileri nversiyon Rob. translokasyon Resp. Translokasyon Sperm FISH (Anomali sperm oran ) Prenstal tan Sperm donasyon Cinsiyet kromozom anomalileri (-) (+) Mosaiklik? Sperm Fish (disomyhiperhaploidi?) Erkek faktör Y kromozom mikrodelesyon (AZFc delesyon+) Sperm FISH (45,X) 46 XY mozaiklik? Konjenital bilateral vas deferans yoklu u, Kalman vs. tek gen hastal klar Mutasyon analizi+ Partner+mutasyon + - mprinting defekti? mmunolojik faktörler? HLA tiplendirme? Klas I ve klas II ag araflt r benzerlik var m? Resim 3: Erkek faktörü nedeniyle IVF uygulamas düflünüldü ünde genetik yaklafl m. 183

Zeynep Ocak ve Tülay Özlü RPL öyküsü olan çiftlerde, efllerden en az birinin yap sal kromozom anomali için tafl y c olma s kl n n %3-11 aras nda de iflti i bildirilmifltir (17). Bu yap sal anomaliler içinde en s k otozomal kromozom translokasyonlar yer almaktad r. RIF olan çiftlerde kromozomal translokasyonlar n görülme s kl oran %2.5, RPL olan çiftlerde %9.2, yenido anlarda ise %0.2 olarak tespit edilmifltir (9,11). Yap sal kromozomal anomali tafl y c s olan çiftlerde IVF ve gebelik baflar oran n n düflebilece i ve düflük için artm fl riskin bulunabilece i bildirilmifltir (10). Yine bu çiftlerin gebeliklerinde fetusun çoklu konjenital anomali, mental retardasyon ve k sa yaflam süresi ile sonuçlanacak bir kromozomal anomaliye sahip olabilece i bildirilmifltir (17). Robertsonian translokasyon tafl y c s erkeklerde anormal sperm oran n %3.4-40, resiprokal translokasyon tafl y c lar nda %47.5-81 aras nda de ifldi i gösterilmifltir (18). Translokasyon tafl y c s olgular anormal sperm üretimine ba l olarak beklenenden daha fazla oranda anormal embriyo üretebilmektedirler. nversiyonlar di er bir yap sal kromozomal de iflikliklerdendir (19-20). Tafl y c bireylerin dengesiz gamet oluflturma olas l nedeniyle önemlidir. RPL olan çiftlerde saptanan major kromozomal anomalilerin %5-10'unu perisentrik inversiyonlar oluflturmaktad r. nversiyon tafl y c s erkeklerde inversiyonun uzunlu u ve ilmek oluflturup oluflturmama durumuna göre anormal spermatosit frekans % 0-54.3 aras nda de iflmektedir (19,20). Telomerik bölgeyi etkileyen kromozomal yeniden düzenlenmelerin de dengesiz gamet oluflturma nedeniyle RIF ve RPL'lar na yol açabilece i bildirilmifltir. Tüm bu sebeplerden dolay efllerden en az birinde yap sal bir anomali tespit edildi inde bu çiftlere preimplantasyon genetik tan () yap lmas önerilmifltir (21) (Resim 3,4). Konvansiyonel sitogenetik tetkiklerle saptanamayan anormalliklerin subtelomerik FISH veya Array-Comparative Genomic Hibridization (a-cgh) gibi FISH'den daha hassas yöntemler ile çal fl lmas önerilmifltir (21). Son y llarda kromozomlardaki heterokromatin Normal karyotip Subtelomerik yeniden düzenlenme? Subtelomerik FISH veya a CGH (+) Karyotip Yap sal kromozom anomalileri? nversiyon Rob. translokasyon Resp. taranslokasyon Cinsiyet kromozomu anomalileri Turner stigma? Gonadal disgenezi? Mosaiklik? Tek gen hastal klar? Multifaktoriyel hastal k? Mutasyon analizi Kad n faktör Kal tsal veya kazan lm fl trombofili? Homosistein düzeyi? Subklinik enfeksiyonlar? kronik endometrit öyküsü? Üre-Ürethral Swab Klamidya trakomatis, Ureplazma, Mykoplazma DNA? Enfeksiyon kontrolü Otoimmun bozukluklar? mmunolojik faktörler? SLE? APS? HLA tiplendirme? Klas I ve klas II ag araflt r Mitokondriyal hastal k? mtdna mutasyon? mt DNA delesyon? (+) Heteroplazmi? Resim 4: Kad n faktörü nedeniyle IVF uygulamas düflünüldü ünde genetik yaklafl m. 184

Tekrarlayan VF baflar s zl klar nda genetik faktörlerin klinik ve prognostik önemi bölge polimorfizmlerinin de üreme sa l üzerine olan etkisi araflt r lm flt r. Bu polimorfik de iflikliklerin bilinen genetik bir hastal a yol açmad halde reprodüktif baflar s zl k ve RPL'den sorumlu olabilecekleri düflünülmüfltür (17). Yine heterokromatin polimorfizmi bulunan erkek hastalarda sperm FISH ile anöploidi oranlar nda art fl tespit edilmifltir (17,22,23). Heterokromatin de iflikliklerinin sperm üretimindeki mekanizmalar nas l etkiledi i henüz bilinmemekle birlikte, normal varyant oldu u düflünülen de iflikliklerin detayland r lmalar ile sperm üretiminde rol oynayan genlerin nas l etkilefltikleri aç a kavuflturulacakt r. b. Y Kromozomu Mikrodelesyonu: Y kromozomu delesyonuna sahip olgularda fertilizasyon ve gebelik oranlar n n düflük oldu u bidirilmifltir. Y mikrodelesyonu vakalar ço unlukla de novo'dur (24). Delesyonlar n en s k görüldü ü bölge Y kromozomunun uzun kolu üzerinde lokalizedir (Yq11). Y kromozomu üzerinde delesyonun bulundu u yer spermatogenezi etkilemesi bak m ndan önemlidir. Y kromozomu mikrodelesyonu, azoospermi ya da fliddetli oligozoospermisi olan vakalarda %10-15 s kl nda görülmektedir (20,24). Azoospermisi olan vakalar n %16's nda ve a r oligozoospermili vakalar n %5'inde AZFc delesyonu saptanmaktad r. AZFc delesyonlar n n toplumdaki s kl n n 1/4000 oldu u düflünülmektedir (20). AZFb delesyonlar ise vakalar n %2'sinde görülmektedir (18,21). Fertil ancak nedeni aç klanamayan RPL olan çiftlerde de etiyolojide Y kromozomu delesyonunun etkili olabilece i düflünülmektedir. RPL ile proksimal AZFc delesyonu aras ndaki iliskiyi inceleyen bir çal flmada RPL olan 17 olgunun 14'ünde (%82) Y kromozomu proksimal AZFc bölgelerinde delesyon saptan rken canl do umu olan grupta delesyon görülmemifltir (20,23,24). Bununla birlikte AZFc delesyonlar saptanan erkeklerde Y kromozomunun kayb sonucunda baban n gonadlar nda 45,X/46,XY mozaisizmi bulunabilmektedir. Bu flekilde ICSI ile X aç s ndan monozomik embriyo oluflabilmekte veya embriyonun erken dönemlerinde erkek embriyoya aktar lan stabil olmayan Y kromozomu nedeniyle 45,X/46,XY mozaisizmi oluflabilmektedir. Oluflan mozaisism nedeniyle flüpheli eksternal genitalya veya mikst gonadal disgenezili erkek çocuk do abildi i bildirilmifltir (24). IVF aday olan çiftlere IVF/ICSI uygulamalar ndan önce endikasyona göre karyotip analizine ilave olarak Y kromozomu mikrodelesyon testleri yap lmas önerilmifltir. c. Sperm DNA Hasar : Erkek infertilitesini indirekt olarak de erlendiren sperm say, morfoloji ve motilitesini içeren testler fertilite kliniklerinde yayg n olarak kullan lmaktad r. Son y llarda anormal semen parametrelerine sahip hastalarda sperm DNA hasar n n yüksek oldu unun tespit edilmesi ile yeni yaklafl mlar gündeme gelmifltir (25). Sperm DNA hasar anormal kromatin paketlenmesi, reaktif oksijen türevleri (ROS), sperm apopitozisi gibi farkl mekanizmalar ile oluflabilmektedir (26). Sperm DNA bütünlü ünün erkek infertilitesi üzerindeki potansiyel etkisi bilinmektedir. Tamir edilemeyen hasarlanm fl spermlerin apoptozis sürecine girerek fertilite yetene ini kaybettikleri bildirilmifltir (27). Baba yafl ile artan erkek germ hücrelerindeki DNA hasar normal koflullarda DNA tamir mekanizmalar ile düzeltilerek üreme/fertilizasyon devam ettirilmektedir (28). Ancak normal semen paramatrelerine sahip hastalar n da %8'inde sperm DNA hasar bulundu undan IVF ve ICSI sonuçlar na olan etkisi halen tart flmal d r. Sperm Kromatin Yap s Tayini (SCSA) testi ile ölçülen ve DNA denatürasyonunu gösteren DNA fragmantasyon indeksi (DFI) %30'a kadar olan fertilizasyonlarda, oositin sperm DNA fragmantasyonlar n kompanse edebildi i bildirilmifltir (29). DFI<%30 olan infertil çiftlerde ICSI ve rutin IVF'a ba l gebe kalma ihtimalinin 2 kat daha fazla oldu u bildirilmektedir (30). Ancak, sperm DNA fragmantasyonu > % 30 olan olgularda, her ne kadar ilk üç günlük embriyo geliflimi pek de olumsuz etkilenmeyecekse de, daha sonra bunu sa l kl blastokiste gidifl ve gebelik oranlar n n takip etmeyece i gösterilmifltir (31,32). Bungum ve arkadafllar n n yapt klar 387 intrauterin inseminasyon (IUI) siklusunu içeren bugüne kadarki en genifl seride DFI >%30 olan hastalarda biyokimyasal gebelik, klinik gebelik ve do um oranlar anlaml oranda düflük bulunmufltur (28). Ancak bu konuyla ilgili çal flmalarda DFI ile sperm anöploidi aras nda saptanan korelasyonlar çeliflkilidir. DFI ve sperm anöploidi aras ndaki iliflkiyi inceleyen iki çal flmada pozitif korelasyon görülürken son y llarda yap lan farkl bir çal flmada bu korelasyon bulunamam flt r. Her üç çal flmada da embriyo anöploidileri de erlendirilmemifl- 185

Zeynep Ocak ve Tülay Özlü tir (33). Yine Balaban ve arkadafllar n n yapt prospektif randomize bir çal flmada morfolojik olarak seçilen sperm ile intrasitoplazmik enjeksiyon (IMSI) sonras implantasyon ve klinik gebelik oran ICSI sonuçlar ile karfl laflt r lm flt r. Çal flma sonucunda ICSI'de s ras yla %19.5 ve %54.0 olarak bulunan oranlar n IMSI ile % 28.9 ve %54.0'e artt gözlenmifltir (34). Bu nedenle befl veya üzerinde fliddetli RIF olan çiftlere rutin IMSI yap lmas önerilmifltir (34). Anöploidi oran yüksek embriyo oluflumu, erken dönem gebelik kay plar, epigenetik de iflimlere ba l olarak metabolik hastal k riski, çocukluk ça kanserleri gibi problemler halen araflt rma konusudur. ICSI için kullan lan sperm DNA's n n hasarl olmas ile do acak çocukta oluflturabilece i potansiyel etkiler aras ndaki iliflki net de ildir, ileri araflt rmalar gerektirmektedir. Sperm DNA hasar n n oluflum mekanizmalar n ve IVF baflar s üzerine olan etkilerini ortaya koyacak genifl serili çal flmalara ihtiyaç vard r. d. Tek Gen Hastal klar ve Multifaktöriyel Hastal klar: Tek gen hastal klar, özellikle aile öyküsü olan bireylerde RPL'lar na ve IVF baflar s zl klar na yol açabilmektedir. Tek gen hastal klar n n iki flekilde gebelik kay plar nda etkili olabilece i düflünülmektedir. Bunlardan ilki fetüste var olan hastal n hayatla ba daflmayan bir soruna yol açabilmesi di eri ise annede mevcut tek gen hastal n n gebeli i olumsuz etkileyebilme ihtimalidir. Akraba evliliklerinde görülme s kl klar artan orak hücre anemisi, alfa talasemi, zelweger hastal, glutarik asidüri gibi tek gen hastal klar n n gebelik kay plar na yol açabildi i gösterilmifltir (23). Avrupa Üreme ve Embriyoloji Derne i (ESHRE) Consortium'un 2012 y l ndaki verilerine göre son on y lda tek gen hastal klar için 4733 siklus yap lm flt r. Bu rapora göre günümüzde en yayg n olarak s ras yla kistik fibrozis, orak hücreli anemi ve spinal muskuler atrofi için yap lm flt r. Otozomal dominant hastal klar içinde ise en çok miyotonik distrofi için yap lmaktad r (36). X kromozomu üzerindeki resesif kal t lan defektler etkilenen erkek fetüs için intauterin dönemde letal seyredebilir. RPL olan kad nlarda X-linked letal genlerin araflt r ld bir çal flmada kontrol gurubuna göre yüksek oranda kaym fl X inaktivasyon paterni saptanm flt r (22,23). Hücrelerin %90'dan fazlas nda belli bir X kromozomunda inaktivasyon oldu u test edilmifltir. Lökositler, oral mukoza hücreleri, kas biyopsilerinde de ayn sonuçlar elde edilmifltir. Genetik defektin oldu u lokus Xq28 bölgesine haritalanm flt r (23). Günümüzde X'e ba l hastal klardan ençok Frajil X sendromu, Duchenne musküler distrofi (DMD) ve hemofili için yap lmaktad r (36). Direkt olarak fetal ölümlere yol açabilen bu gibi durumlar IVF uygulamas ndan önce araflt lmal d r. e. Polimorfik De ifliklikler: Çal flmalardan elde edilen verilere göre p53, HLA- G, VEGF ve IL-1RN gibi baz genlerde gösterilen mutasyon ve polimorfizmler IVF sonras meydana gelen RIF'e genetik yatk nl kta rol oynamaktad r. Sipak- Szmigiel ve arkadafllar n n yapt bir çal flmada, fetüsten orijin alan trofoblast hücrelerinde eksprese olan HLA-G antijeninin gen polimorfizmi ile RIF aras nda herhangi bir iliflki olup olmad araflt r lm flt r (37). Gebelik fizyolojisinde önemli bir rol oynayan bu antijen gebelik esnas nda maternal immün sistemin oluflumuna katk da bulunmaktad r. HLA-G antijeni ayr ca baz blastokislerde de saptanabildi inden implantasyonda da rol oynayabilmektedir. HLA-G gen polimorfizminin pre-eklampsi, RPL ve RIF'a neden olabildi i gösterilmifltir (37). Sipak-Szmigiel ve arkadafllar n n yapt çal flmada söz konusu HLA-G gen polimorfizmi ile artm fl RIF riski aras nda bir ba lant bulundu u tespit edilmifltir (37). Goodman ve arkadafllar n n yapt bir çal flma anjiyogenezin en iyi karakterize edilmifl regülatörü olan VEGF geninin - 1154A/A polimorfizminin RIF olas l n etkilemede yatk nl k faktörü olabilece ini göstermifltir (38). Goodman ve arkadafllar n n farkl bir çal flmas nda ise; fertiliteyle iliflkili oldu u ve üremeyi düzenledi i düflünülen p53 geninin Pro72, koagülasyonda rol oynayan proteinleri kodlayan PAI geninin 4G/4G ve VEGF geninin -1154A/A polimorfizmlerinin RIF ile iliflkili oldu u vurgulanm flt r (39). Tüm bu verilerden yola ç karak, RIF gelifliminde polimorfizmlerin rol oynayabilece i ve bu gen polimorfizmleri için çeflitli testlerden oluflacak bir panelin, IVF sonras RIF için risk tafl yan bayanlar n belirlenmesinde yararl olabilece i düflünülmektedir. f. Mitokondrial De ifliklikler: mtdna genomunda yeniden düzenlemeler, büyük parça delesyonlar ve nokta mutasyonlar sperm hareketlili i ve morfolojisinde önem tafl maktad r. 186

Tekrarlayan VF baflar s zl klar nda genetik faktörlerin klinik ve prognostik önemi Sperm mtdna's nda oluflan genetik degisikliklerin, sperm fonksiyonunu, dolay s yla da normal fertilizasyonu etkiledi i gösterilmifltir (40). nfertil erkeklerde, anormal sperm ile sperm mtdna's nda art fl görülmekte ve bu art fl ICSI s ras nda ciddi sorunlar oluflturmaktad r. Mitokondrial rrna veya trna'lar n tam kayb n n mitokondrial protein sentezini durdurarak erken embriyonik geliflimi etkiledi i veya fetal ölümle sonuçlanabildi i bildirilmifltir (55,56). Ayn zamanda kad nlarda yafl ilerledikçe yumurtal k disfonksiyonlar nda defektif mtdna art fl da literatürde tan mlanm flt r (40). g. Metilasyon-Imprinting Bozukluklar : Germ hücre genomunun metilasyonu, gerek spermatogenezin normal devam etmesinde gerekse fertilizasyonu takiben embriyo gelifliminde önemli role sahiptir. Hücre genomunun ifllevini görebilmesi için major epigenetik düzenleyicinin DNA'n n metilasyonu oldu u bildirilmifltir. Genom imprinting bozukluklar n n hipospermatogeneze yol açt ve oligozoospermik erkeklerin bu imprinting defektlerini çocuklar na da geçirdikleri gözlenmifltir (41). Sperm ve oosit fertilizasyon s ras nda metilasyona u ramalar nedeniyle transkripsiyon yapamazlar. Oysa diploid olduktan sonra embriyonun somatik geliflimini sürdürebilmesi için kromatin DNA's metilasyon durumunda de ifliklik yaparak yeniden flekillenir. Bunun için erken embriyo devresinde babadan gelen genom fertilizasyonun ilk birkaç saati içerisinde demetilasyon geçirirken, anneden gelen genom ikihücreli embriyo dönemini takiben sadece pasif bir demetilasyon süreci izler. Morula ve blastokist gelifltikten sonra ise art k her iki genom da eflit metil kayb na u ram fllard r ve daha sonra yeni metilasyonlar oluflur (42). Benchaib ve arkadafllar n n yapt bir çal flmada metilasyon bozukluklar n n anormal fetal geliflmeye, Angelman sendromu ve Beckwith- Wiedemann sendromu gibi hastal klara neden olabildi i, metilasyonun artt olgularda ise gebelik baflar s n n artt gösterilmifltir (42,43). h) mmünolojik faktörler ve trombofililer Günümüzde implantasyon baflar s nda maternal ve fetal yüzde meydana gelen lokal immun fonksiyonlardaki düzensizliklerin etkisi giderek artan bir ilgi alan olmufltur (44). Son y llarda immünoloji alan ndaki geliflmelerle birlikte yap lan araflt rmalar, nedeni bilinmeyen düflüklerin %80'inin immünolojik faktörlere ba l olabilece ini göstermifltir. Fetal veya plasental antijenlere karfl anormal maternal immun yan t oluflturan alloimmun bozukluklar maternal sitotoksik antikorlar, "natural killer" hücre fonksiyon ve da l mlar ndaki anormallikler IVF baflar s n etkileyebilen immünolojik faktörlerdendir (44). Bunlar n birço unun yeni tedavi yöntemleri ile önlenebilece i bildirilmifltir (7). E er çiftlere IVF uygulamas öncesinde yap lan tüm testler normalse implantasyonu etkileyebilecek immünolojik faktörlerinde göz önüne al nmas gerekti i önerilmifltir. Bu amaçla ilk yap lmas gereken fley çiftlerin lenfositlerinin cross-match testi yap larak immünolojik reaksiyonun gözlenmesidir. E er erke in antijenlerine karfl bayanda bir reaksiyon yoksa bunlarda insan lökosit antijen (HLA) benzerli i oldu u düflünülebilir. Literatürde bu benzerli in RPL ve RIF'a yol açabilece i bildirildi inden çiftin Klas I ve Klas II HLA'lar n n incelenmesi ve bu vakalar n yüksek doz iv immünglobulin ile tedavi edilmesi önerilmifltir (46). Herediter veya kazan lm fl trombofilinin, implantasyon yüzeyindeki maternal vasküler yap larda lokal mikrotrombüsler oluflturarak mikrosirkülasyonu bozup RIF ve erken gebelik kay plar na neden olabilece i bildirilmifltir (47). Kazan lm fl trombofili nedenlerinden olan antifosfolipid antikor sendromu (AFS), arteryel ve venöz tromboz nedeniyle fetal ölüm ve RPL'na yol açan otoimmun klinik bir patolojidir. Antifosfolipid antikorlar genel popülasyonun %14'ünde, sistemik lupus eritamatozis (SLE) hastalar n n ise %30-50'sinde görülürler. Ayr ca Sifiliz, Lyme hastal, s k görülen virüs ve mikoplazma enfeksiyonlar ile klorpromazin, klonidin, fenitoin, prokainamid gibi baz ilaçlar n kullan m nda geçici antifosfolipid antikorlar bulunabilir. Fakat bu gibi durumlarda tromboz oluflumunun görülmedi i bildirilmifltir (48). Yap lan çal flmalarda SLE'li kad nlarda görülen fetal ölümlerin hemen hepsinin AFS (lupus antikoagülan -LA ve antikardiolipin antikorlar -AKA) ile iliflkili oldu u gösterilmifltir (47,48). Bu antikorlar fetal distres ve ölümde en duyarl göstergelerdir. Klinik yan nda LA ve orta veya yüksek seviyelerdeki AKA (IgG veya IgM) seviyelerinin gösterilmesi önemli laboratuar tan kriteridir. AFS'nun RPL ile olan bu iliflkisine karfl n 2008 y l nda Amerika T bbi Üreme Derne i (ASRM) taraf ndan AFS'nun IVF baflar s n etkilemedi i bildirilmifltir (49). Bu raporda yaklafl k 16 derleme ile 2053 vaka hem bireysel hem de toplu olarak 187

Zeynep Ocak ve Tülay Özlü de erlendirilmifl ve AFS ile IVF baflar s aras nda istatistiksel olarak anlaml bir de ifliklik görülmedi i bildirilmifltir (49). Literatürde herediter trombofilik gen mutasyonlar n n RPL ve IVF baflar s üzerine olan etkisi ile igili en az 694 çal flma bulundu u bildirilmifltir (50). Bu çal flmalar içinde derlemeler, meta analizler, vaka sunumlar toplu olarak göz önüne al nd nda en az 6092 vakan n de erlendirilebildi i görülmüfltür. Vaka kontrol çal flmalar nda birden fazla AFS antikoru bulunma durumunda IVF baflar s zl n n normalden üç kat daha fazla oldu u gözlenmifltir (50). Kohort çal flmalar nda ise AFS nin canl do um ve gebelik oran ile iliflkili olmad saptanm flt r (50). Sekiz vaka kontrol çal flmas nda Faktör V leiden mutasyonu olan hastalarda IVF baflar s n n normalden üç kat azald gösterilmifltir (50). ki kohort çal flmas nda ise bu iliflki tespit edilememifltir. Metilen tetrahidrofolat redüktaz (MTHFR) geni homozigot mutasyonunun hiperhomosistinemi geliflimine zemin haz rlad koryon villus vaskülarizasyonunda bozulmaya neden olarak erken gebelik kayb riskini artt rd gösterilmifltir (51,52). Yine bu mutasyonun fetusde NTD riskini de 1.9 kata kadar artt rd bildirilmifltir (51). Folatmetabolizmas n etkileyebilecek MTHFR mutasyonun fetüsdeki tüm bu etkilerine ra men RIF ile olan iliflkisi kan tlanmam fl-t r. Yak n zamanda Laanpere ve arkadafllar n n yapt bir çal flmada folat metabolizmas nda görevli genlerin heterozigot de iflikli inde over stimülasyonu ve IVF baflar s n n kontrol gurubuna göre düfltü ü bildirilmifl-tir (50). Fetüste trombofili oldu u zaman gebelik kayb ihtimalinin artt n düflünenler olmakla birlikte bu konuda henüz kesin kan tlar elimizde bulunmamaktad r (53). Literatürde birkaç vaka ile s n rl gebelik kayb, erken do um, serebral palsi tan mlanm flt r (54). Multiple trombofilik gen mutasyonu, RPL olan kad nlarda %74 iken kontrol grubu kad nlarda %20 olarak bulunmufltur (52). Tüm bu verilerden yola ç karak, RIF olan hastalarda IVF/ICSI uygulamalar ndan önce trombofili taramas n n faydal olabilece i düflünülmektedir (Resim 4). 2) Subklinik Enfeksiyonlar: Klamidya trakomatis, Üreoplazma ve Mikoplazma, Toksoplazma gondii, Listeria Monositogenez, Herpes virüs ve Sitomegalovirüs enfeksiyonlar n n RPL'lar na yol açabilece i bildirilmifltir (55). Ancak erken gebelik kay plar n n nedeni olarak servikovaginal infeksiyonlar n olas l n bildiren veriler yetersiz ve çeliflkilidir (56). Kamiyama ve ark. subklinik üst genital sistem enfeksiyonlar ile IVF-ET baflar s zl aras nda iliflki olup olmad n de erlendirmifl, IVF-ET yap lan 38 hasta aras nda menstrüel kanda endotoksin konsantrasyonu belli bir düzeyin üzerinde olan hastalar n hiç birinde gebelik olmazken, endotoksin düzeyleri kabul edilen s n r de erin alt nda olanlar n 1/3'ünde gebelik oldu unu görmüfllerdir (57). Endometriumun gram negatif bakterilerle önceden kolonizasyonunun implantasyonu bozarak ya da erken spontan düflükleri indükleyerek IVF-ET baflar s zl na yol açabilece ini savunmufllard r. Bu bulgulardan yola ç kan Romero ve ark. IVF-ET baflar s zl nda genital kanal enfeksiyonlar n muhtemel rolünü yapt klar bir derlemede desteklemifllerdir (58). Bu bilgiler fl nda, günümüzde klinik enfeksiyon bulgular olmayan yada cinsel yolla bulaflan hastal klar aç s ndan risk faktörü olmayan bir hastada IVF öncesi için bahsedilen enfeksiyon ajanlar aç s ndan tarama yararl olabilir gibi görünse de, henüz bunun rutin olarak önerilmesine yetecek düzeyde genifl çapl çal flmalar mevcut de ildir. Bu konuda de erlendirme hastan n risk faktörlerine göre yönlendirilmelidir. Öte yandan, IVF uygulamas ndan önce her iki partnerin HIV, hepatit B, hepatit C enfeksiyonu aç s ndan rutin taramalar yap lmal d r. Bu tibbi ve laboratuvar ekibinin ve IVF sonucu elde edilecek fetüsün korunmas ve dondurulmufl embriyolar aras nda çapraz kontaminasyon olmamas aç s ndan önemlidir. IVF BAfiARISIZLIKLARINDA PRE MPLANTASYON GENET K TANI VE ARRAY-CGH UYGULAMALARI ESHRE Konsorsiyumu' nun yay nlad raporda, 39 farkl merkezden al nan verilere göre 27 000'den fazla siklusun %61'inin anöploidi için, %17'sinin tek gen hastal klar, %16's n n kromozomal anomaliler, %4'ünün X'e ba l hastal klar, son olarak %2'sinin sosyal endikasyon nedeni ile yap ld belirtilmifltir (36). PGS, embriyodaki anöploidilerin de erlendirilerek IVF sonucu elde edilen en iyi embriyoyu seçip aktarma amac yla kullan lan bir tekniktir. IVF merkezlerindeki implantasyon baflar s n n artt r lmas veya düflüklerin 188

Tekrarlayan VF baflar s zl klar nda genetik faktörlerin klinik ve prognostik önemi azalt lmas PGS'nin kullan m ndaki temel uygulama amaçlar ndan biridir (36). PGS tekni i özellikle ileri anne yafl, RPL ve RIF olan çiftlerde düflünülmelidir. Yap lan çal flmalarda, PGS uygulamas ile oosit bafl na düflen hamilelik oran n n %29'dan %38'e yükseldi i gösterilmifl ve tafl y c ebeveynlerin do al hamileliklerinde görülen %92'lik abortus oran n n PGS uygulamas sonras %12.5 oran na geriledi i bildirilmifltir (59). Anöplodi ve translokasyonlar n tayini için ço unlukla FISH tekni i kullan lmaktad r. FISH yöntemiyle s n rl say da kromozomun incelenebilmesi, sonuçlar n yoruma aç k oluflu, uygun olmayan biyopsi ve fiksasyon tekniklerinin kullan lmas farkl sonuçlar elde edilmesine sebep olmaktad r (60). S n rl say da kromozomun incelendi i FISH yöntemine alternatif olarak acgh yöntemi embriyolarda tüm kromozomlar n incelenmesini mümkün k lmaktad r. Bu yöntem ileri anne yafl, RPL, RIF, fliddetli erkek faktörü, translokasyon ve inversiyon tafl y c l gibi endikasyonlara uygulanabilmektedir. Yap lan çal flmalar acgh yöntemiyle belirlenen kromozom bozukluklar n n %30-40' n n FISH yöntemiyle belirlenemeyece ini ortaya ç karm flt r (60,61). PGS'den farkl olarak translokasyon gibi yap sal kromozomal yeniden düzenlenmeler ile ailesel geciflli genetik hastal veya genetik hastal k tafl y c l olan çiftlerde embriyolar n seçilerek transfer edilmesi ifllemine dayanmaktad r. Bu flekilde çiftlerin sa l kl çocuk sahibi olma flans artt r lmakta ve t bbi endikasyonlarla gebeli in sonland r lmas riskinin azalt lmas amaçlanmaktad r. Ülkemizde akraba evliliklerinin s k olmas nedeniyle, beta-talasemi gibi otozomal resesif geçifl gösteren hastal klarda yap lmas büyük önem arzetmektedir. Myotonik distrofi, Huntington hastal ve Marfan sendromu gibi otozomal dominant hastal klar için de uygulamalar gelifltirilmeye bafllanm flt r. Otozomal dominant hastal klara uygulama s kl n n, otozomal resesif olanlara göre daha az oldu u bildirilmifltir (36). Ancak otozomal dominant hastal a sahip bireylerdeki problemin embriyolar na aktar lma riskinin, resesif bireylerdekinden fazla olmas nedeniyle yak n zaman içinde uygulamalar n n artaca düflünülmektedir (36). IVF uygulamalar için her ne kadar avantajl görünse de birçok tart flmal durumu da beraberinde getirmektedir. Özellikle ngiltere gibi prenatal tan n n devlet taraf ndan ödendi i, ancak 'nin ödenmedi i ülkelerde ifllem çok pahal d r. 'de fertil çiftler için en zor k s m çok pahal ve stresli olan IVF'e gitmek zorunda olmalar d r. Yine yalanc pozitif veya negatif sonuçlar n olabilmesi genetik dan flmanl kta da vurgulanmas gereken di er bir dezavantajd r. nin di er bir dezavantaj oluflturdu u etik kayg lard r. Penetrans %100 olmayan kal t msal kanserlerde, hungtinton hastal gibi geç bafllang çl genetik hastal klarda, yaflam tehdit etmeyen iflitme kayb gibi durumlarda da yap lmaya bafllanmas birçok etik kayg y beraberinde tafl maktad r (36,62). Say sal kromozom bozukluklar n yan nda mikrodelesyon, duplikasyon, uniparental dizomi ve marker kromozom gibi yap sal anomalilerin de embriyolarda tan mlanabilmesine olanak sa layan ve tek nükleotid polimorfizmi-tek nükleotid varyasyonu (SNP-CNV) çal flmalar da son dönemlerde popülarite kazanm flt r. Oligo acgh temeline dayanan bu yöntemde ayn anda yaklafl k 250.000 genomik veri analiz edilebilmektedir. Al nan 1 adet blastomerde yap lan tüm genom amplifikasyonunu takiben 250.000 SNP bölgesi analiz edilebilmektedir (61). Son veriler mikroarray testleri sonras nda implantasyon ve gebelik baflar oranlar n n artt n gösterse de elde edilen sonuçlar n sa l kl biçimde yorumlanabilmesi ciddi bir problemdir ve uzun vadeli genifl kapsaml biyoinformatik çal flmalar ile desteklenmelidir (61). Array-SNP uygulamalar, oluflan beklentiler ve soru iflaretleriyle insanlar hem heyecanland ran, hem de baz verilerin sa l kl biçimde yorumlanmas ndaki yetersizlikler ve etik kayg lar nedeniyle endiflelere sürükleyen bir niteli e sahiptir. Günümüzde preimplantasyon aflamas nda yap lan tüm bu çal flmalar h zl sonuçlar verse de hala zahmetli ve zor uygulamalard r. labaratuvarlar n ISO 15189 veya eflde eri bir flekilde akredite edilmesi ve çal flan labaraturlar n verilerini bilimsel toplant larda paylaflmas bu konudaki bilgi ve deneyimin gelifliminde önemli rol oynayacakt r. Sitogenetik ve moleküler genetik disiplinlerini do ru bir biçimde birlefltirebilmek için e itim programlar n n düzenlenmesinin de bu yöntemlerin gelifltirilmesine katk sa layaca bildirilmifltir (63). 189

Zeynep Ocak ve Tülay Özlü GENET K DE ERLEND RME Sonuç olarak; yard mc üreme teknikleri uygulanmas öncesinde, s ras nda veya sonras nda genetik tan testlerine baflvurulmas iyi klinik uygulamalar n bir parças d r. Bu testler do ru tan konulmas n sa lad gibi uygun genetik dan flmanl n verilmesini de mümkün k lmaktad r. Uygulanacak testlere karar verilmesi s ras nda klinik bulgulara ek olarak aile öyküsünün genetik dan flmanl k s ras nda de erlendirilmesi hastalar n daha fazla yarar görmesini sa lamaktad r. Üreme sa l na yönelik olarak yap lan genetik taramalarda ölümcül ve/veya ciddi derecede anomalilerle seyreden bir hastal kla etkilenmifl bir bebek dünyaya getirme riski yüksek olan, sa l kl tafl y c lar ortaya ç karabilmek temel amaç olmal d r. RIF olan çiftlerde hangi testin yap laca na karar verilirken uygulanacak genetik testin maliyeti, etkinli i ve testin etiyolojik nedeni ortaya koyabilme etkinli i göz önünde bulundurulmal d r. Genetik tarama amac ile yap lan testler hasta bireylere veya çiftlere üreme sa l klar ile ilgili do ru bilgiler sunarak karar verme süreçlerini kolaylaflt rmal d r. KAYNAKLAR 1. Ly KD, Aziz N, Safi J and Agarwal A. Evidence-Based Management of Infertile Couples with Repeated Implantation Failure Following IVF. Current Women's Health Reviews 2010; 6: 200-18. 2. Macklin VM. Ovarian Stimulation and ovulation induction. Fertil Steril 2001; 75: 88-91. 3. ASRM/SART Registry. Assisted reproductive technology in the United States: Results generated from the American Society for Reproductive Medicine/Society for Assisted Reproductive Technology Registry. Fertil Steril 2000; 72: 641. 4. European Society of Human Reproduction and Embryology (ESHRE). The European VF-monitoring programme (EIM), for ESHRE. Assisted reproductive technology in Europe, 1998. Results generated from European Registers by ESHRE. Hum Reprod 2001; 16: 2459. 5. Dewald GW, Michels VV. Recurrent Miscarriages: Cytogenetic Causes and Genetic Counseling of Affected Families. Clinical Obstetrics and Gynecology 1986; 29: 865-83. 6. Chandley AC. Chromosome anomalies and Y chromosome microdeletions as causal factors in male infertility. Hum Reprod 1998; 13: 45-50. 7. Centers for Disease Control and Prevention, American Society for Reproductive Medicine. 2001 assisted reproductive technology success rates, U.S. Department of Health and Human Services, Public Health Service, Atlanta, GA, 2003. 2000; 72: 641. 8. Bolarinde O, Tin-Chiu L. n-vitro fertilizasyonu takiben implantasyon baflar s zl. Current Opinion in Obstetrics and Gynecology (Türkçe Bask ) 2006; 18: 440-5. 9. Hassold T, Chiu D. Maternal age-spesific rates of numerical chromosome abnormalities with special reference to trisomy. Hum Genet 1985; 70: 11-7. 10. Delhanty J, Griffin D, Handyside A. Detection of aneuploidy and chromosomal mosaicism in human embryos during preimplantation sex determination by fluorescent in situ hybridisation, (FISH). Hum Mol Genet 2 1993; 1183-5. 11. Ishikawa M, Hidaka E, Wakui K, Nakayama K, Takagi Y, Fukushima Y, Katsuyama T. Habitual abortion and high frequency of low frequent X chromosome monosomy mosaicism: detection by interphase FISH analysis of buccal mucosa cells and lymphocytes Rinsho Byori 2000; 48(10): 955-9. 12. Bronet F, Mart nez E, Gaytan M, Linan A, Cernuda D, Ariza M. et al. Sperm DNA fragmentation index does not correlate with the sperm or embryo aneuploidy rate in recurrent miscarriage or implantation failure patients. Human Reproduction. 2012; 1-8. 13. Vidal F, Blanco J, Egozcue J. Chromosomal abnormalities in sperm. Mol Cell Endocrinol 2001; 22; 183: 51-4. 14. Egozcue S, Blanco J, Vidal F, Egozcue J. Diploid sperm and the origin of triploidy. Hum Reprod 2002; 17: 5-7. 15. Jaarola M, Martin, RH, Ashley, T. Direct evidence for suppression of recombination within two pericentric inversions in humans: a new sperm-fish technique. Am J Hum Genet 1998; 63: 218-24. 16. Ishikawa M, Hidaka E, Wakui K, Nakayama K, Takagi Y, Fukushima Y, KatsuyamaT. Habitual abortion and high frequency of low frequent X chromosome monosomy mosaicism: detection by interphase FISH analysis of buccal mucosa cells and lymphocytes Rinsho Byori 2000 Oct; 48(10): 955-9. 17. Durak B, Yesil M, et al. Is recurrent abortion an indication for subtelomeric region analysis? Turkiye Klinikleri J Med Sci 2010; 30: 1465-8. 18. Jaarola M, Martin RH, Ashley T. Direct evidence for suppression of recombination within two pericentric inversions in humans: a new sperm-fish technique. Am J Hum Genet 1998; 63: 218-24. 190

Tekrarlayan VF baflar s zl klar nda genetik faktörlerin klinik ve prognostik önemi 19. Dohle GR, Diemer T, Giwercman A et al. Guidelines on Male Infertility. European Association of Urology 2010; 4: 14-6. 20. Pang MG, Kim YJ, Lee SH, Kim CK. The high incidence of meiotic errors increases with decreased sperm count in severe male factor infertilities. Human Reproduction 2005; 20: 1688-94. 21. Harper JC, Sengupta SB. Preimplantation genetic diagnosis: state of the ART 2011. Hum Genet 2012; 131: 175-86. 22. Mercy YL, Robin L, Bennett, Devki SS, et al. Genetic Evaluation and Counseling of Couples with Recurrent Miscarriage: Recommendations of the National Society of Genetic Counselors. Journal of Genetic Counseling 2005; 14: 3. 23. Hoffman, Eric P. Screening test for the lethal genetic trait of recurrent spontaneous pregnancy loss. 24. Siffroi JP, Bourhis CL, Krausz C, Barbaux S, Quintana-Murci L, Kanafani S, et al. Sex chromosome mosaicism in males carrying Y chromosome long arm deletions. Hum Reprod 2000; 15: 2559-62. 25. Zini A, Bielecki R, Phang D, Zenzes MT. Correlations between two markers of sperm DNA integrity, DNA denaturation and DNA fragmentation, in fertile and infertile men. Fertil Steril 2001; 75: 674-7. 26. Gorczyca W, Traganos F, Jesionowska H, Darzynkiewicz Z. Presence of DNA strand breaks and increased sensitivity of DNA in situ to denaturation in abnormal human sperm cells: analogy to apoptosis of somatic cells. Exp Cell Res 1993; 207: 202-5. 27. Alvarez JG. The predictive value of sperm chromatin structure assay. Hum Reprod 2005; 28: 2365-7. 28. Bungum M, Humaidan P, Axmon A, Spano M, Bungum L, Erenpreiss J. Sperm DNA integrity assessment in prediction of assisted reproduction technology outcome. Hum Reprod 2007; 22: 174-9. 29. Regan L, Rai R. Thrombophilia and pregnancy loss. J Reprod Immunol 2002; 55: 163. 30. Duran EH, Morshedi M, Taylor S, Oehninger S. Sperm DNA quality predicts intrauterine insemination outcome: a prospective cohort study. Hum Reprod 2002; 17: 3122-8. 31. Liu CH, Tsao HM, Cheng TC, Wu HM, Huang CC, Chen CI, Lin DP, Lee MS. DNA fragmentation, mitochondrial dysfunction and chromosomal aneuploidy in the spermatozoa of oligoasthenoteratozoospermic males. J Assist Reprod Genet 2004; 21: 119-26. 32. Muriel L, Goyanes V, Segrelles E, Gosa lvez J, Alvarez JG, Ferna ndez JL.Increased Aneuploidy rate in sperm with fragmented DNA as determined by the sperm chromatin dispersion (SCD) test and fish analysis. J Androl 2007; 28: 38-49. 33. Balasuriya A, Speyer B, Serhal P, Doshi A, Harper JC. Sperm chromatin dispersion test in the assessment of DNA fragmentation and aneuploidy in human spermatozoa. Reprod Biomed Online 2011; 22: 428-36. 34. Bronet F, Mart nez E, Gaytan M, Linan A, Cernuda D, Ariza, Nogales M. at al. Sperm DNA fragmentation index does not correlate with the sperm or embryo aneuploidy rate in recurrent miscarriage or implantation failure patients Human Reproduction 2012; Vol.00, No.0 pp. 1-8. 35. Balaban B, Yakin K, Alatas C, Oktem O, Isiklar A, Urman B. Clinical outcome of intracytoplasmic injection of spermatozoa morphologically selected under high magnification: a prospective randomized study. Reprod Biomed Online 2011; 22: 472-6. 36. Duran EH, Morshedi M, Taylor S, Oehninger S. Sperm DNA quality predicts intrauterine insemination outcome: a prospective cohort study. Hum Reprod 2002; 17: 3122-8. 37. Harper JC, Wilton L, Traeger-Synodinos J, Goossens V, Moutou C, Sengupta SB, Pehlivan Budak T, Renwick P, De Rycke M, Geraedts JP, Harton G.The ESHRE Consortium: 10 years of data collection. Hum Reprod Update 2012; 18(3): 234-47. 38. Sipak-Szmigiel O, Cybulski C. HLA-G polymorphism and in vitro fertilization failure in a Polish population. Tissue Antigens 2009; 73: 348-52. 39. Goodman C, Jeyendran RS. Vascular endothelial growth factor gene polymorphism and implantation failure. Reprod Biomed Online 2008; 16: 720-3. 40. Goodman C, Jeyendran RS. P53 tumor suppressor factor, plasminogen activator inhibitor, and vascular endothelial growth factor gene polymorphisms and recurrent implantation failure. Fertil Steril 2009; 92: 494-8. 41. Sanchez CD, Ruiz-Pesini E, Lapen a, AC, Montoya J, Pe rez- MartosA, Enr_ quez, JA, Lo pez-pe rez MJ. Mitochondrial DNA Content of Human Spermatozoa. Biology of Reproduction 2003; 68: 180. 42. Marques CJ, Carvalho F, Sousa M, Barros A. Genomic imprinting in disruptive spermatogenesis. Lancet 2004; 22: 1700-2. 43. Reik W, Dean W, Walter J. Epigenetic reprogramming in mammalian development. Science 2001; 293: 1089-93. 44. Benchaib M, Ajina M, Lornage J, Niveleau A, Durand P, Guerin JF. Quantitation by image analysis of global DNA methylation in human spermatozoa and its prognostic value in in vitro fertilization: a preliminary study. Fertil Steril 2003; 80: 947-53. 45. Ogasawara M, Aoki K, Hayashi Y. A prospective study on 191

Zeynep Ocak ve Tülay Özlü pregnancy risk of antiphospholipid antibodies in association with systemic lupus erythematosus. J Reprod Immunol 1995; 28: 159. 46. Lachapelle MH, Miron P, Hemmings R, Roy DC. Endometrial T, B, and NK cells in patients with recurrent spontaneous abortion. Altered profile and pregnancy outcome. J Immunol 1996; 156: 4027. 47. Simon A, Laufe N. Repeated implantation failure: clinical approach Fertility and Sterility 2012; 97, 15-0282. 48. Ogasawara M, Aoki K, Hayashi Y. A prospective study on pregnancy risk of antiphospholipid antibodies in association with systemic lupus erythematosus. J Reprod Immunol 1995; 28: 159. 49. Sauer R, Roussev R, Jeyendran RS, Coulam CB. Prevalence of antiphospholipid antibodies among women experiencing unexplained infertility and recurrent implantation failure. Fertil Steril 2010; 1; 93: 2441-3. 50. Practice Committee of the ASRM. Anti-phospholipid antibodies do not affect IVF success. Practice Committee of the ASRM. Fertil Steril 2008; 90: S172-3. 51. Laanpere M, Altmäe S, Kaart T, Stavreus-Evers A, Nilsson TK, Salumets A. Folate-metabolizing gene variants and pregnancy outcome of IVF. Reprod Biomed Online. 2011; 22(6): 603-14. 52. Rey E, Kahn SR, David M and Shrier I. Thrombophilic disorders and fetal loss: a meta-analysis. Lancet 2003; 361: 901-08. 53. Coulam CB, Jeyendran RS. Multiple thrombophilic gene mutations rather than specific gene mutations are risk factors for recurrent miscarriage. American Journal of Reproductive Immunology 2006; 12: 322-7. 54. Tranquilli AL, Saccucci F, Giannubilo SR, Cecati M, Nocchi L, Lorenzi S, Emanuelli M. Unexplained fetal loss: the fetal side of thrombophilia. Fertil Steril. 2009. 55. von Kries R, Junker R, Oberle D, Kosch A, Nowak-Göttl U.Foetal growth restriction in children with prothrombotic risk factors. Thromb Haemost. 2001; 86(4): 1012-6. 56. Witkin SS, Kligman I, Grifo JA, Rosenwaks Z. Ureaplasma urealyticum and Mycoplasma hominis detected by the Polymerase Chain Reaction in the cervices of women undergoing in vitro fertilization: Prevalence and Consequences. Journal of Assisted Reproduction and Genetics 1995; 12(9): 610-4. 57. Sermon K, Steirteghem AV, Liebaers I. Preimplantation genetic diagnosis. Lancet 2004; 363: 1633-41. 58. Kamiyama S, Teruya Y, Nohara M, Kanazawa K. Impact of detection of bacterial endotoxin in menstrual effluent on the pregnancy rate in in vitro fertilization and embryo transfer. Fertil Steril 2004; 82: 788-92. 59. Romero R, Espinoza J, Mazor M.Can endometrial infection/ inflammation explain implantation failure, spontaneous abortion, and preterm birth after in vitro fertilization? Fertil Steril. 2004; 82(4): 799-804. 60. Abdelhadi I, Colls P, Sandalinas M, Escudero T, Munn. S. Preimplantation genetic diagnosis of numerical abnormalities for 13 chromosomes. Reprod Biomed Online 2003; 6: 226-31. 61. Trussler JL, Pickering S, Ogilvie CM. Investigation of chromosomal imbalance in human embryos using Comparative Genomic Hybridization. Reprod Biomed Online 2004; 80: 860-8. 62. Bisignano A, Wells D, Harton G, Munné S. Reply: and aneuploidy screening for 24 chromosomes by genome-wide SNP analysis: a responsible path towards greater utility. Reproductive BioMedicine Online 2012; 24: 4-5. 63. European Society of Human Reproduction and Embryology (ESHRE). The European VF-monitoring programme (EIM), for ESHRE. Assisted reproductive technology in Europe, 1998. Results generated from European Registers by ESHRE. Hum Reprod 2001; 16: 2459. 64. Harper JC, Harton G (2010) The use of arrays in preimplantation genetic diagnosis and screening. Fertil Steril 94(4): 1173-7. 192