TÜBİTAK BİDEB LİSE ÖĞRETMENLERİ-FİZİK, KİMYA, BİYOLOJİ, MATEMATİK- PROJE DANIŞMANLIĞI EĞİTİMİ ÇALIŞTAYI (LİSE 4 [ÇALIŞTAY 2014]) BİYOLOJİ PROJE RAPORU GRUP MİKROKOZMOS PROJE ADI Kitosan-Limon Yağı ve Kitosan-Elma Sirkesi Kaplanmış Yumurta Kabuğunda S. aureus ve E. coli Penetrasyonunun Engellenebilirliğinin Araştırılması PROJE EKİBİ Öykü DULUN Murat KODAT PROJE DANIŞMANLARI Doç. Dr. Murat TOSUNOĞLU Prof. Doç. Dr. Güven Özdemir ÇANAKKALE 25 OCAK 02 ŞUBAT 2014 1
PROJE ADI: Kitosan-Limon Yağı ve Kitosan-Elma Sirkesi Kaplanmış Yumurta Kabuğunda S. aureus ve E. coli Penetrasyonunun Engellenebilirliğinin Araştırılması PROJENİN AMACI: Bu projenin amacı: 1. Kitosan-Limon Yağı ve Kitosan-Elma Sirkesi Kaplamalarının E. coli ve S. aureus Üzerine Antibakteriyal Özelliklerininin-vitro Çalışmayla Desteklenmesi, 2. Tüketicilerin S. aureus ve E. coli kaynaklı bir sağlık sorunu ile karşılaşmamaları adına üretici firmalara koruyucu kaplama önerisinde bulunmaktır. GİRİŞ Son yıllarda tavuk yumurtalarının S. aureus gibi bakterilerin insanlara bulaşmasında Avrupa da (Lee, 2000), Kanada da (Todd, 1996), Amerika da (Ching-Lee, Katz, Sasaki, & Minette, 1991; Schultze & Fawcette, 1996; Trepka, Archer, Altekruse, Proctor, & Davies, 1999) ve Kuwait gibi ülkelerde (Kamel ve ark., 1980), Kore de (Chang, 2000) ve Polonya da (Radkowski, 2001) etkili olduğu bilinmektedir. Theron ve ark. (2003) tarafından gelişmekte olan birçok ülkedeki işletmelerin uygun şartlar altında olmamakla birlikte Günay Afrika da ise hiç bir standart olmadan yumurta üretiminin olduğu rapor edilmiştir. Yumurtaların elde edilmesinden tüketiciye ulaşmasına kadar olan değişkenlere bağlı olarak dünyanın çeşitli bölgelerinde incelenen yumurtalarda Cowden (1990) 360 yumurtadan sadece 1 inde S. enteritidis, Var (1993) 448 yumurtadan 3 ünde S. paratyphi, Dorn ve ark. Bavyera da 112 işletmeye ait olan 23620 yumurtadan % 0,081 oranda S. aureus, Parales ve Audicana (1988) 998 örnekten 6 sının içinde ve 3 ünün de kabuğunda S. enteritidis, Humphrey ve ark. nın çalışmasında da (1989) 1119 örnekten 11 S. aureus bulunmuştur. Reu ve ark. (2006) ise S. enteritidis in % 43 oranla yumurta kabuğuna penetrasyonu olduğu çalışmalarda gözlemlenmiştir. Esansiyel yağlar doğal antioksidan ve antimikrobiyal maddeler olarak çeşitli meyve ve sebzelerden ekstraksiyon elde edilerek kullanılmaktadır. Limon esansiyel yağı Citrus 2
lemon dan çıkartılmış olup içeriğinde bulunan limonene, antimikrobiyal özelliğinden ötürü gıdalarda katkı maddesi ya da tatlandırıcı olarak kullanılmaktadır (Perdones ve ark., 2012). Kitosan günümüzde tıptan gıdaya, ziraatten kozmetiğe, eczacılıktan atık su arıtımına ve tekstil sektörüne kadar sayısız alanda kullanılabilmektedir. Ayrıca antimikrobiyal özelliğinden ötürü gıdaların raf ömrünü uzatmada da kullanılmaktadır (Demir & Seventekin, 2009). Kitosan,limon yağı ve sirke kullanılarak yumurta kabuğunda S. aureus penetrasyonunun engellenebilirliğiyle ilgili çalışmalar son yıllarda uygulanmaktadır (Reu ve ark., 2006). Bu projede doğal yöntemlerle geliştirilmiş olan tavuklardan günlük olarak hiçbir işleme tabi tutulmadan elde edilen yumurtaların Kitosan-limon yağı ve Kitosan-elma sirkesi kullanılarak E. coli ve S. aureus un yumurtanın içine penetrasyonunun ne kadar engellendiği araştırılacaktır. MATERYAL VE YÖNTEM Bu çalışmada kullanılan E. coli ve S. aureus bakterileri ile Kitosanın eldesi Ege Üniverstesi Mikrobiyoloji Laboratuvarından sağlanarak, tüm basamaklar Çanakkale Onsekiz Mart Üniversitesi Temel ve Endüstriyel Mikrobiyoloji Laboratuvarında yapılmıştır. Çalışılması planlanan organizma Salmonella spp. elimize ulaşmadığı için B planı doğrultusunda S. aureus ve E. coli ile çalışılmıştır. Çalışmada kullanılan yumurtalarda laboratuvara gelmeden önce ve çalışmaya başlamadan önce herhangi bir kırık, çatlak olmamasına, taze olmasına ve ekstra gözle görülebilir ölçüde kirli olmamasına dikkat edilmiştir. Bu projede uygulanan Ch-V ve Ch-L solüsyonlarının, yumurta kabuğundan içine doğru çevreden bulaşma ihtimali olan bakterilerden S. aureus ve E. coli nin penetrasyonunu engellemede etkin bir rolünün olup olmadığının incellenebilmesi amaçlanmıştır. Materyal 1. Toz Kitosan (0,5 g) 2. Limon yağı (50 ml) 3. Çözücüler (25 ml asetik asit, gliserol) 3
4. 12 adet steril Petri kabı 5. Nutrient Agar (100 ml) 6. Baird Parker Agar (100 ml) 7. 8 steril test tüp 8. 1500 ml Steril distile su 9. 15 adet steril eküvyon çubuğu 10. İnkübatör (37 C) 11. Otoklav (121 C'de, 1 atm) 12. Bakteri (S. aureus) 13. Bakteri (E. coli) 14. Mikropipet (10 100ul) 15. 16 adet steril ve boş antibiyotik diski 16. 8 adet Ampisilin antibiyotik diski 17. 8 adet Oksitetrasiklin antibiyotik diski 18. Kumpas KİTOSAN IN HAZIRLANIŞI: 1. 0,1 g kitosan 25 ml %1 lik asetik asit ile karıştırılıp manyetik karıştırıcıda 50 C de homojen bir karışım elde edene kadar karıştırıldı. 2. Kitosan ın tamamen çözündüğünden emin olunduktan sonra gliserol eklenip 5000 rpm de 5 dk boyunca büyük parçalardan ayırabilmek adına sentrifüj edildi. 3. Sentrifüjden alınan homojen karışım, 12,5 ml elma sirkesi ve 12,5 ml Kitosan karıştırılarak 25 ml Ch-V solüsyonu eldesinde ve 12,5 ml limon yağı ve 12,5 ml Kitosan karıştırılarak 25 ml Ch-L solüsyonu eldesinde kullanıldı. 4. 0,5 gr. toz kitosan 25 ml %1 lik asetik asit içinde çözünüp gliserol ile elastisitesi sağlandı. Deneyin tüm basamakları aseptik tekniklere uygun olarak gerçekleştirilmiştir. SOLÜSYONLARIN UYGULANMASI: 1. Yumurtalar hazırlanan Ch-V ve Ch-L solüsyonlarına bulanarak 30 dk süreyle kurumaya bırakıldı. 4
2. Her yumurta bakteri solüsyonunda 60 dk bekletildikten sonra sterilizasyon işlemi uygulanıp steril ortamda şırınganın içeri girebileceği ölçüde çatlatılarak 4 kere steril şırıngayla farklı bölgelerinden örnekler alındı. 3. Kontrol grubu olan yumurtalara herhangi bir solüsyon uygulaması yapılmadan bakteri solüsyonu içerisinde 60 dk süreyle bekletildikten sonra yumurtaların içinden örnek alınmadan önce her yumurta kabuk sterilizasyonundan geçirilmek adına steril eküvyon çubuğu yardımıyla steril su ile nemlendirilip etanollü pamuk ile silinerek hızlıca ve çok kısa sürede bek alevinden geçirilmiştir. Bu prosedür yumurta kabuğunun S. aureus ve E. coli dışında diğer istenmeyen mikroorganizmalarla kontaminasyonunu engellemek için yapılmıştır (Papadopoulou, 1997). 4. Kontrol gruplarına herhangi bir işlem uygulanmamış olup köyden elde edilen yumurtalar S. aureus ve E. coli bakteri solüsyonları içerisinde aynı sürede bekletilip içerisine bakteri penetrasyonunun gerçekleşip gerçekleşmediği kontrol edilmiştir. 5. Yumurtalardan alınan 200 ml lik örnekler besiyerlerine ekilerek 18 saat süreyle 37 o C de etüvde bekletilmiştir. DENEYİN YAPILIŞI 1. 4 adet petri kabına E. coli için Nutrient agar ve 4 adet petri kabına da S. aureus için Baird Parker agar hazırlanmıştır. 2. 25 ml Kitosan solüsyonu hazırlanmıştır. 3. 12,5 ml Kitosan solüsyonu ile 12,5 ml limon yağının homojen karışımı elde edilmiştir. 4. 12,5 ml Kitosan solüsyonu ile 12,5 ml elma sirkesinin homojen karışımı elde edilmiştir. 5. 0,5 McFarland standardına göre S. aureus ve E. coli bakteri solüsyonları ayarlanmıştır. 6. Besiyerleri petrilere dökülmeden önce 100 ml 0,5 McFarland standardında S. aureus, 50 ml 0,5 McFarland standardında E. coli petrilere eklenmiştir. 7. Antimikrobiyal özelliği test edilecek olan Ch-V ve Ch-L solüsyonları boş disklere emdirilip petrideki besiyerlerine yerleştirilerek besiyerleri 18 saat süreyle 37 C'de inkübe edilmiş ve oluşan inhibisyon zonları kumpas (0,1mm) ile ölçülmüştür. 5
8. Antibakteriyel özelliklerine bağlı olarak, engelleyici olarak düşünülen Ch-V ve Ch-L solüsyonları ile kontrol grupları dışındaki yumurtalar 30 dk süreyle kaplanmışlardır. 60 dk süreyle bakteri solüsyonlarına maruz bırakılan yumurtaların kabuğundan yumurta içine bakteri penetrasyonunu sağlanmıştır. 9. Yumurtaların içine bakterilerin penetre edip etmedikleri yani solüsyonların öne sürülen hipotez doğrultusunda etkili olup olamadığını test edilebilmek adına yumurtalardan steril şırıngalar ile örnekler alınmıştır. 10. Her bir yumurtadan alınan tüm örnekler steril boş petri kabında toplanarak yumurtaların maruz bırakıldıkları bakteri penetrasyonunun yumurtanın her köşesine eşit olarak dağılmama riski azaltılmıştır. 11. SPSS 13 programında ANOVA testi yapılarak 4 er tekrarlı olan uygulama grupları neticesinde oluşan inhibisyon zon ortalamalarının gruplar arasında istatistiki olarak anlamlı bir farka sahip olup olmadığı değerlendirilmiştir. 3. BULGULAR Hangi uygulama grupları arasında istatistiki olarak anlamlı fark bulunduğunu anlayabilmek adına tablo 1 de gösterildiği gibi Tukey HSD, Scheffe, LSD ve Bonferroni post hoc testleri sonucunda Ch-V ve Ch-L uygulama gruplarının ortalama zon çapları ile Oksitetrasiklin ve Ampisilin antibiyotiklerinin etkisiyle oluşan ortalama zon çapları arasında istatistiki olarak anlamlı bir fark olduğu görülmektedir. Tablo 1 Ch-V ve Ch-L solüsyonlarının S. aureus bakterileri üzerine antimikrobiyal etkilerinin Oksitetrasiklin ve Ampsilin antibiyotiklerinin etki alanlarıyla karşılaştırılması Uygulama Grupları Ortalama Zon Çapı (±0,1 mm) Minimum Zon Çapı (±0,1 mm) Maksimum Zon Çapı (±0,1 mm) Oksitetrasiklin 27,44 ± 3,34 22,95 30,32 Ampisilin 34,10 ± 3,03 29,57 36,01 Ch-V 33,77 ± 4,41 28,47 39,27 Ch-L 40,35 ± 6,74 34,51 49,53 ANOVA sonuçları analiz edildiğinde p= 0,001 0,05 önem düzeyinde uygulama gruplarının ortalamaları arasında istatistiki olarak anlamlı bir fark bulunduğu görülmüştür. 6
Hangi uygulama grupları arasında istatistiki olarak anlamlı fark bulunduğunu anlayabilmek adına tablo 2 de gösterildiği gibi Tukey HSD, Scheffe, LSD ve Bonferroni post hoc testleri yapılmıştır. Posthoc testleri sonucunda Ch-V ve Ch-L uygulama gruplarının ortalama zon çapları ile Oksitetrasiklin ve Ampisilin antibiyotiklerinin etkisiyle oluşan ortalama zon çapları arasında istatistiki olarak anlamlı bir fark olduğu görülmektedir. Tablo 2 Ch-V ve Ch-L solüsyonlarının E. coli bakterisi üzerine antimikrobiyal etkilerinin Oksitetrasiklin ve Ampsilin antibiyotiklerinin etki alanlarıyla karşılaştırılması Uygulama Grupları Ortalama Zon Çapı (±0,1 mm) Minimum Zon Çapı (±0,1 mm) Maksimum Zon Çapı (±0,1 mm) Oksitetrasiklin 29,42 ± 1,83 26,92 31,00 Ampisilin 24,08 ± 3,34 19,90 28,08 Ch-V 41,02 ± 2,16 38,23 43,30 Ch-L 40,70 ± 8,56 33,80 51,43 ANOVA sonuçları analiz edildiğinde p= 0,001 0,05 önem düzeyinde uygulama gruplarının ortalamaları arasında istatistiki olarak anlamlı bir fark bulunduğu görülmüştür. S. aureus bakterisi üzerine Ch-L solüsyonunun Oksitetrasiklin den daha etkili olduğu bulunmuştur. Oksitetrasiklin, Ampisilin, Ch-V ve Ch-L solüsyonlarının uygulanması sonucunda oluşan zon çaplarının ortalamaları ANOVA ile test edildiğinde posthoc testlerine göre S. aureus bakterisi üzerine Ch-L ile Oksitetrasiklin antibiyotiklerinin oluşturduğu zon çapları ortalamalarının arasında istatisiki olarak anlamlı bir fark olduğu görülmüştür. E. coli bakterisi üzerine Ch-L solüsyonunun Oksitetrasiklin ve Ampisilin den daha etkili olduğu bulunmuştur. Oksitetrasiklin, Ampisilin, Ch-L solüsyonunun uygulanması sonucunda oluşan zon çaplarının ortalamaları ANOVA ile test edildiğinde posthoc testlerine göre E. coli bakterisi üzerine Ch-L ile Oksitetrasiklin ve Ampisilin antibiyotiklerinin oluşturduğu zon çapları ortalamalarının arasında istatisiki olarak anlamlı bir fark olduğu görülmüştür. E. coli bakterisi üzerine Ch-V solüsyonunun Oksitetrasiklin ve Ampisilin den daha etkili olduğu bulunmuştur. Oksitetrasiklin, Ampisilin, Ch-V solüsyonunun uygulanması sonucunda oluşan zon çaplarının ortalamaları ANOVA ile test edildiğinde posthoc testlerine göre E. coli bakterisi üzerine Ch-V ile Oksitetrasiklin ve Ampisilin antibiyotiklerinin 7
oluşturduğu zon çapları ortalamalarının arasında istatisiki olarak anlamlı bir fark olduğu görülmüştür. 4. SONUÇ VE TARTIŞMA Son yıllarda tavuk yumurtalarının S. aureus gibi bakterilerin insanlara bulaşmasında Avrupa da (Lee, 2000), etkili olduğu ve gelişmekte olan ülkelerde dahi birçok işletmenin uygun şartlar altında olmadığı bilinmektedir (Theron vd., 2003). Elde ettiğimiz sonuçlar, yapılan istatistiki analizlerle karşılaştırıldığında Kitosan-sirke ve Kitosan-limon solüsyonlarının kontrol amacıyla kullanılmış olan Ampisilin ve Oksitetrasiklin den daha etkili olduğu yönündedir. Bu bulgular doğrultusunda projede amaçlandığı üzere yumurta üreticilerine yumurtaları ambalajlama aşamasında bu doğal antioksidan ve biyolojik-çözünür maddeler olan solüsyonların kullanımı önerilmektedir. Bu çalışmanın sonucunda: 1. E. coli bakterisi üzerine Ch-V solüsyonunun Oksitetrasiklin ve Ampisilin den daha etkili olduğu bulunmuştur. 2. E. coli bakterisi üzerine Ch-L solüsyonunun Oksitetrasiklin ve Ampisilin den daha etkili olduğu bulunmuştur. 3. S. aureus bakterisi üzerine Ch-L solüsyonunun Oksitetrasiklin den daha etkili olduğu bulunmuştur. Medikal anlamda antibiyotik disklerinden daha anlamlı zon oluşumu gözlemlendiğinden ötürü de antibiyotik tedavisine alternatif olarak E. coli ve S. aureus bakterileri üzerine kullanılabileceği önerilmektedir. Sadece Kitosan, elma sirkesi ve limon yağı tek başına antimikrobiyal özellikleri test edilmeli ve regrasyonda bir artış olup olmadığı bakılmalıdır. 8
TEŞEKKÜR Çalıştay koordinatörümüz Prof.Dr Mehmet AY a, proje danışmanımız Prof. Dr. Güven ÖZDEMİR e, Doç. Dr. Murat TOSUNOĞLU na, Dr Nurcihan Hacıoğlu na, teknisyenimiz Nursel HASANOĞLU na, tüm çalıştay ekibine ve Çanakkale Üniversitesine laboratuvarlarını kullanmamıza olanak sağladıkları ve Ege Üniversitesi Mikrobiyoloji Bölümüne sağladıkları Kitosan ve bakteri suşları ile çalışmamıza yaptıkları katkı ve desteklerinden dolayı teşekkür ederiz. 9
KAYNAKLAR Arda, M.,1968. Kuluçka makinelerinde embriyosu ölen ve embriyosuz yumurtalar üzerinde bakteriyolojik ve virolojik çalışmalar. Ankara Üniv Vet Fak Yyn. 227:28-31. Cowden, JM., 1990. Salmonellosis and eggs: public health, food poisoning, and food hygiene. Curr Opin Infect Dis. 3:246-249. Çakıroğlu, S., Gümüşsoy, S., 2005. Ankara garnizonunda tüketime sunulan tavuk yumurtalarının Salmonella spp. Yönünden analizi. Sağlık Bilimleri Dergisi. 14(3): 158-162 Demir, A., Seventekin, N., 2009. Kitin, Kitosan ve genel kullanım alanları. Tekstil Teknolojileri Elektronik Dergisi. 3(2): 92-103. Dorn, P., Krabisch, P., Rapp, W., 1985. Untersuchung zur S. aureus kontamination des frischen Huhnereies. Arch Lebemsmittelhyg. 36:49-76. Humphrey, J., Baskerville, A., Mawer, S., Rowe, B., Hopper, S., 1989. Salmonella enteritidis phage type 4 from the contents of intact eggs: a study involving naturally infected hens. Epidemiol Infect. 103:415-423. Papadopoulou, C., Dimitriou, D., Levidiotou, S., Gessouli, H., Panagiou, A., Golegou, S., Antoniades, G., 1997. Bacterial strains isolated from eggs and their resistance to currently used antibiotics: is there a health hazard for consumers? Comp. Immun. Microbiol. Infect. Dis. 20 (1): 35-40. Perdones, A., Gonzalez, S., Chiralt, A., Vargas, M., 2012. Effect of chitosan-lemon essential oil coatings on storage-keeping quality of strawberry. Pareles, I., Audicana, A., 1988. The role of hens eggs in outbreak of salmonellosis in north Spain. Int J Food Microbiol. 8:175-180. Theron, H., Venter, P., Lues, J., 2003. Bacterial growth on chicken eggs in various storage environments. Food Research International. 36: 969-975 Tuncel, G., 1986. Farklı Sıcaklıklarda Depolanan Yumurtaların Mikrobiyolojik Bozulmaları ve S. aureus nın Kabukta Geçme Süresi. Yüksek Lisans Tezi, Ege Ün. Sağlık Bilimleri Enstitüsü. Var, I., 1993. Yumurtalarda S. aureus Enfeksiyonu ve Isıl İşlemin S. aureus Üzerine Etkisi. Doktora Tezi, Çukurova Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü. 10
GRUP ÜYELERİNİN ÖZGEÇMİŞLERİ Öykü DULUN (BİLKENT ÜNİVERSİTESİ) 1986 da Balıkesir de doğdu. 2008 de Abant İzzet Baysal Üniversitesi Biyoloji (İngilizce) Bölümünden mezun oldu. 2008 de Bilkent Üniversitesi Eğitim Fakültesinde MA programına burslu olarak kabul edilip Istanbul Robert Kolej, Ankara TED Koleji ve Bilkent Laboratory International School başta olmak üzere Istanbul ve Ankara daki özel okullarda stajını tamamlayıp 2010 yılında Cambridge Üniversitesi Eğitim Fakültesinden de dersler alarak mezun oldu. 2010 yılında devlet destekli Doğu İllerini Kalkındırma Projesi nin ilk ayağı olarak Erzurum da kurulmuş olan Bilkent Erzurum Laboratory School da IB Biyoloji öğretmeni olarak göreve başlayıp halen görevine Theory of Knowledge (Bilgi Kuramı) derslerini de vererek devam etmektedir. 2011-2013 Eğitim-Öğretim yılları süresince Biyoloji Zümre Başkanlığı yapmış olup 2012 yılından bu yana Uluslar arası Bakalorya Diploma Programı Koordinatörü olarak devam etmektedir. 2013 yılı itibariyle Bilkent Üniversitesi Eğitim Bilimleri Enstitüsünde Curriculum and Instruction üzerine doktorasını yapmakta olup akademik hayatına devam etmektedir. Murat KODAT 1973 da Erzurum da doğdu. 1996 de Atatürk Üniversitesi Biyoloji Bölümünden mezun oldu ve öğretmen olarak göreve başladı. Halen Giresun fen lisesinde Biyoloji öğretmeni olarak görev yapmaktadır. 11