Gökhan Özge (*), R za Güngör (*), Güngör Sobac (*), Ferit Avcu (**), Murat Demiriz (***), Elvin Akdag (****), Ali Ugur Ural (**)

T. Oft. Gaz. 38, 320-329, 2008 Tavflan Tapetoretinal Dejenerasyon Modelinde ntravitreal Uygulanan Kemik ligi Mezenkimal Kök Hücre Arac l Gen Tedavisi çin Canl ve Cans z Ortamda Kan t: Yeflil Flöresan Protein (YFP) Gökhan Özge (*), R za Güngör (*), Güngör Sobac (*), Ferit Avcu (**), Murat Demiriz (***), Elvin Akdag (****), Ali Ugur Ural (**) ÖZET Amaç: Tavflanlarda tapetoretinal dejenerasyon modelinde kemik iligi mezenkimal kök hücre (MKH) intravitreal uygulamas n n etkinligini göstermifltik (TOD UOK, 2006). Bu çal flmam zda MKH arac l gen tedavisinin uygulanabilirligi araflt r lm flt r. Yöntem-Gereçler: GATA Araflt rma Merkezi'nde eriflkin Yeni Zelanda albino tavflan n femur proksimali kemik iliginden al nan MKH'ler vücut d fl nda farkl laflt r ld ve 4. pasajdaki hücreler kullan ld. Kültür ortam nda bu hücrelere plazmid arac l olarak 48 saat içinde 2 defa Yeflil Flöresan Protein (YFP) aktar m sagland. Eriflkin, pigmentli 3 tavflana intravenöz 40 mg/ kg sodyum iyodat-naio(3)- enjeksiyonu uyguland (çal flma grubu). Hemen sonras nda bu tavflanlar yan s ra bir eriflkin pigmentli tavflan n (kontrol) sag gözlerine 2.5X10(5) hücre/0.1ml, sol gözlerine dengeli tuz solusyonu 0.1ml intravitreal uyguland. 1, 5, 10 ve 45. günlerde enükleasyon uygulanan tavflanlarda, izlem sürecinde, klinik, Fundus Floresein Anjiyografi (FFA, HRA- 2 ), Elektroretinografi (ERG, Roland ) ve histopatoloji (immünflöresan) incelemeleri yap ld. Bulgular: Birinci günde çal flma grubundaki tavflanlarda anormal ERG b dalga degerleri ve HRA(Heidelberg Retinal Anjiografi)'da vitreusta YFP'li hücre kümeleri gözlendi. Beflinci günde retinada ödem, ERG'de b dalgas nda silinme ve FFA'da lokalize hiper ve hipoflöresan odaklar saptand. Birinci tavflanda uygulanan enükleasyon sonras immünflöresan yöntemi ile retinada YFP tafl yan hücreler gösterildi. Onuncu günde FFA'da lokalize hiperflöresan ve hipoflöresan odaklarda art fl, ERG'de silinme izlenen bir tavflanda canl ve cans z ortamda uygulanan yöntemler (HRA ve immünflöresan) ile vitreusta ve retinada YFP'li hücrelerin varl g gösterildi. K rkbeflinci gündeki kontrollü gözlemlerde bu hücrelerin retina katmanlar ndaki varl g n n devam ettigi saptand. Sonuçlar: Akut tapetoretinal dejenerasyon modelinde, plazmid arac l g yla transfekte edi- (*) Gata T p Fakültesi, Göz Hastal klar Ad, Ankara (**) Gata T p Fakültesi Hematoloji Bd, Ankara (***) Gata T p Fakültesi, Patoloji Ana Bilim Dal, Ankara (****) Gata T p Fakültesi, Araflt rma Merkezi, Ankara Türk Oftalmoloji Dernegi 41.Ulusal Oftalmoloji Kongresi'nde serbest bildiri olarak sunulmufl ve bilimsel araflt rma ödülü alm flt r. Yaz flma adresi: Asistan Gökhan Özge, Gata Göz Hastal klar Anabilim Dal Etlik/Ankara E-posta: dr_gozge@yahoo.com Mecmuaya Gelifl Tarihi: 12.01.2008 Düzeltmeden Gelifl Tarihi: 30.06.2008 Kabul Tarihi: 02.07.2008

Tavflan Tapetoretinal Dejenerasyon Modelinde ntravitreal Uygulanan Kemik ligi Mezenkimal Kök Hücre Arac l Gen Tedavis i çin Canl ve Cans z Ortamda Kan t: Yeflil Flöresan Protein (YFP) 321 len ve intravitreal uygulanan allojenik kök hücrelerden retinaya YFP aktar m saglanabilmektedir. Bu yöntem, otolog MKH'lerin kullan lma avantaj bulunan retinal dejenerasyon olgular için yeni bir gen tedavisi yaklafl m olarak gelifltirilebilir. Anahtar Kelimeler: gen tedavisi, kök hücre, tavflan, tapetoretinal dejenerasyon, yeflil flöresan protein (YFP) SUMMARY In Vivo and in Vitro Proof for Intravitreal Implanted Bone Marrow Mesenchimal Stem Cell (MSC) Mediated Gene Therapy in Rabbit Tapetoretinal Degeneration Model: Green Fluorescent Protein (GFP) Purpose: We have shown the efficacy of intravitreal use of bone marrow mesenchimal stem cell (MSC) in rabbit tapetoretinal degeneration model. In this study, the feasibility of MSC mediated gene therapy is investigated. Material-Methods: In GATA Research Center, MSCs were differantiated in vitro from bone marrow which was obtained from proximal femur of a New Zelland albino rabbit, and the cells from the forth passage were used. In cultere environment, plasmid mediated green fluorescent protein (GFP) transmission to these cells was performed two times in 48 hours. Intravenous 40 mg/kg NAIO(3) injection was done to 3 adult pigmented rabbits.(study group). Afterwards 2.5x10(5) cell/0,1 ml to right eyes and 0,1 ml balanced salt solution to left eyes intravitrealy, were performed in the study and the control eyes (1 pigmented rabbit, two eyes). Clinical, angiographic (FA-HRA 2), ERG and hystopathological evaluations were performed during the observation period (1., 5., 10., 45th day). Findings: On first day, abnormal ERG b-wave amplitudes and cluster of GFP loading cells in the vitreous were observed. On the fifth day, retinal edema, diminished b-wave amplitudes and hypofluorescent and hyperfluorescent areas on FA were noted. Immunofluorescence examination of the first rabbit showed GFP loading cells in the retinal layers. In vivo and n vitro assays done on the 10th day showed GFP loading cells in the vitreous and in the retina which had angiographically increased hypo and hyperfluorescent spots. Our controlled observation showed that these cells were still in the retinal layers on the 45th day. Results: In this acute tapetoretinal degeneration model intravitreally injected allogenic stem cells transfected by plasmid enabled GFP transmission to the damaged retina. This method may be developed as a new made of gene therapy in the retinal degeneration patients who has the advantage of using otolog MSCs. Key Words: Gene therapy, stem cell, rabbit, tapetoretinal degeneration, green fluorescent protein GFP) G R fi Retinan n kal tsal ve edinsel kökenli dejeneratif hastal klar tüm toplumlarda önde gelen körlük nedenidir. Günümüzde bu hastal klar n kökten tedavileri konusunda somut geliflmeler izlenmektedir. Bunlar aras nda kök hücre arac l tedavi aray fllar önde gelmektedir. Bu hücrelerin özgün hücre tiplerine dönüflme potansiyeli hücre replasman tedavisinde yeni bir ç g r açmakla birlikte uygun koflullar alt nda genetik olarak modifiye edilebilmeleri yeni bir dönemin iflaretçisi olabilir (1-3). Bu hücrelerin hemen her organda bulunduklar ve doku yenilenmesinde görev ald klar bilinmektedir. Multipotent olan bu hücre grubunun ortamdaki uygun uyaranlar ile pek çok ifllevsel hücre tipine farkl laflt r labilecegi gösterilmifltir (4,5). Varl g son y llardaki çal flmalarla kan tlanm fl olan göz içi dokular ile retinadaki kök hücrelerin miktar n n azl g ve teminindeki zorluklar, bunlar n tedavi maksatl uygulamalar n zorlaflt rmaktad r. Halen klinik uygulanmada temini kolay ve etkinligi kan tlanm fl olan kemik iligi kökenli mezenkimal kök hücrelerin (K -MKH) kas, cilt ve nöron hücrelerine dönüfltügü ve koroid neovasküler membran (KNM) gelifliminde de rol ald g gösterilmifltir (4,6). nsanda bu hücrelerin temini kolayd r ve otojenik ya da allojenik baflar l klinik uygulamalar da vard r. Genetik olarak modifiye edilebilen bu hücreler, retina dejenerasyon ve distrofilerinin tedavisinde bir umut kaynag olabilir.

322 Gökhan Özge, R za Güngör, Güngör Sobac, Ferit Avcu, Murat Demiriz, Elvin Akdag, Ali Ugur Ural Tavflanlardaki tapetoretinal dejenerasyon modelinde K -MKH'lerin intravitreal implantasyonundaki tedavi etkinligini göstermifltik (7). Ayn modelde gerçeklefltirdigimiz bu çal flmam zda, d fl ortamda YFP (Yeflil Flöresan Protein) üretmek üzere plazmid arac l olarak modifiye edilen bu hücrelerin intravitreal implantasyonundaki tedavi etkinligi araflt r lmaktad r. GEREÇ ve YÖNTEM Çal flmam z Nisan-May s 2007 tarihlerinde Gülhane Askeri T p Akademisi (GATA) Araflt rma Merkezinde gerçeklefltirildi. Çal flma için GATA Hayvan Çal flmalar Etik Kurulu'nun onay al nd. Uygulamalar: 1. K -MKH'lerin elde edilmesi: GATA Araflt rma Merkezi'nde eriflkin bir Yeni Zelanda albino tavflan n femur proksimalinden al nan kemik iligi stromal hücrelerden in-vitro koflullarda K - MKH diferansiye edildi ve 4. pasajdaki hücreler kullan ld. Bu amaçla hücresel içerik 1:1 oran nda düflük glukozlu DMEM (Dulbecco'nun hücre kültür ortam ) ortam nda seyreltildi. Elde edilen süspansiyon 15ml Ficoll- Pague Plus (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, svec) üstünde topland ve oda s s nda 800 devirde santrifüj ifllemi uyguland. Üstteki k s m ara yüzey ile birlikte 0.1 ml PBS (fosfat tamponlu tuzlu su solusyonu) ile seyreltilip 800 devirde 10 dakika santrifüj ifllemi uyguland. Üst k sm at l p 1ml'lik k s mda pellet kar flt r ld. Nukleuslu hücreler say ld ve kültür ortam nda (2mg/ml L- glutamin 50mg/ml streptomisin ve %10 oran nda s inaktivasyonlu buzag serumu içeren DMEM solusyonu) 1x10(7)/ml olacak flekilde süspanse edildi ve 100ml'lik kültür tabaklar nda 3x10(6) hücre/cm(2) olacak flekilde ekildi. Bu hücreler 3 gün kültür ortam nda tutuldu ve yap flmayan hücreler 3 kez y kanarak ortamdan uzaklaflt r ld. Kültür ortam nda yeterince yogunlasan (konfluent) hücrelere tripsin-edta uygulanarak üreme ortam ndan ayr lmalar sagland. 2. K -MKH'lerde YFP Plazmid vektör transfeksiyonu: Transfeksiyon uygulamalar için K -MKH kültürlerinde 4. pasajdaki hücreler kullan ld. Gen ekspresyonu için YFP olarak, Monster Green Flöresan protein phmgfp (Promega, USA) kullan ld. Kültür ortam nda bu hücrelere plazmid arac l olarak 48 saat içinde iki defa Yeflil Flöresan Protein (YFP: GFP) aktar m sagland. Daha önceden tan mlanm fl protokole (8) uygun olarak yap lan ön çal flmalarla K -MKH'lerinde yüksek transfeksiyon etkinligi saglayan parametreler belirlendi. K - saca, bir gün önceden kültür ortam ndan al narak serum ve antibiyotik içeren tafl ma ortamlar na geçirilen hücreler 10ml'lik tüplerde y kama ve santrifüjleme ifllemleri ile kültür ortam ndan uzaklaflt r ld. Hücrelerin ekimi, seyreltilmesi, inkübasyonu ile haz rlanan DNA-Enhans r solusyonunun pipetle kar flt r lmas, çalkalanmas sonras elde edilen efektif reagant içeren kar fl m, 60ml kültür ortam için 1µg (mikrogram) plazmid DNA's na 8 µg Enhans r ve 25 µg Effektan Reagan olacak flekilde uyguland. 3. Tapetoretinal dejenerasyon modelinde uygulamalar: Üç eriflkin (3-3.5 kg) pigmentli tavflana kulaktan intravenöz yolla, dengeli tuz solusyonundaki (FTS) %1'lik sodyum iyodat (NaIO(3), Sigma, St Louis, MO) solusyonundan 40 mg/kg dozunda enjeksiyon uyguland (çal flma grubu). Hemen sonras nda bu tavflanlar yan s - ra bir eriflkin pigmentli tavflan n (kontrol tavflan) sag gözlerine 2.5X10 (5) hücre/0.1ml, sol gözlerine 0.1ml FTS uyguland. Bunun için %0.5 tropicamide (Tropamid, Bilim, Istanbul, Türkiye) ile pupiller midriyazis ve Betadine %10 solusyon ile konjunktival sterilizasyon sagland. 30 G igne ile limbustan 1.5 mm geriden ve üst temporalden kontrollü olarak intravitreal enjeksiyon uyguland. Bazal degerleri belirlemek üzere tedavi öncesinde ve tedavi sonras 1., 5., 10., ve 45. günlerde oftalmoskopik, anjiyografik, elektrofizyolojik ve immünflöresan incelemeler yap ld. Bu amaçla klinigimizde mevcut görüntüleme sistemleri (Zeiss HRA, Roland Elektrodiagnostik ünit ) kullan ld. Histopatolojik inceleme için intrakardiak embolizasyon ile feda edilen tavflan gözlerinde enükleasyonu takiben gözlerin gözd fl bag ve kas dokular yan s ra Ora Serrata önündeki dokular makroskopik olarak ay kland ve bu dokulardan haz rlanan parafin bloklar ndan 5 mikronluk transvers kesitler al nd. Bu örnekler mmunflöresan mikroskop ve Hemotoksilen-Eozin ile boyama sonras fl k mikroskopu ile retina katmanlar incelendi. Çal flma grubundaki tavflanlar ve kontrol tavflan n sag ve sol gözlerindeki bulgular grup içi ve gruplar aras degifliklikler bak m ndan karfl laflt r ld. BULGULAR Kültür ortam nda YFP-plazmid ile transfekte K - MKH gözlenmektedir (fiekil 1). Birinci günde kontrol ve çal flma grubundaki ERG (Elektroretinografi) kay tlar fiekil 2'de izlenmektedir. HRA ile otoflöresan modda gözlem yap ld g nda kontrol ve çal flma grubundaki tüm tavflanlarda intravitreal YFP'li hücreler saptand (fiekil 3a, 3b).

Tavflan Tapetoretinal Dejenerasyon Modelinde ntravitreal Uygulanan Kemik ligi Mezenkimal Kök Hücre Arac l Gen Tedavis i çin Canl ve Cans z Ortamda Kan t: Yeflil Flöresan Protein (YFP) 323 Beflinci günde retinada ödem, ERG'de b dalgas nda silinme ve FFA'da lokalize hiper ve hipoflöresan odaklar belirginleflme gözlendi. HRA'da vitreusta ve retinada fotoreseptör ve RPE katman nda YFP eksprese eden hücreler saptand (fiekil 4a, 4b). Onuncu günde FFA'da lokalize hiperflöresan ve hipoflöresan odaklarda art fl (fiekil 5a) ile ERG de silinme izlenen bir tavflanda canl ve cans z ortamda uygulanan yöntemlerle (HRA ve immünflöresans) vitreusta ve retinada yayg n YFP'li hücre kümelerinin varl g gösterildi (fiekil 5b). K rkbeflinci gündeki gözlemlerde retinan n minimal pigmentasyon degifliklikleri ile birlikte normaldekine benzer görünüme kavufltugu ve bu hücrelerin retina katmanlar ndaki varl g n n devam ettigi saptand (fiekil6a, 6b). Kontrol tavflan gözünde 15.gün muayenesinde izlenebilen YPF'li hücrelerin 45.günde kayboldugu saptand. TARTIfiMA Kemik iligi kök hücrelerin retina nöron hücrelerine transdiferansiasyonu ile vasküler ve nörotropik etkinlikleri gösterilmifltir (9). Amfibiandakinin aksine insan retina nöral hücreleri apoptosise ugray p kayboldugunda kay plar n rejenerasyonla karfl lanamad g bilinmekte idi. Son y llarda insanda retinal nöral kök hücreleri (RNKH) ve bunlara öncülük eden embriyonik kök hücreler (EKH), nöral kök hücreler (NKH) ve retinal kök hücreler (RKH) gösterilmifltir (10,11). Ancak bu kök hücre gruplar n n tedavi maksatl uygulamalar nda ciddi sorunlar gözlenmesi olas l g vard r. EKH'de MHC (Major Histocompatibility Complex) sisteminin d fllay c etkisi yan s ra teratom gelifltirebilme riski vard r (12); NKH'nin ise Hipokampus'tan temini zordur. S kl kla Korpus Siliare'de bulunduklar gösterilmifl olan RNKH (retinal nöral kök hücre)'nin say lar oldukça s n rl olup temini zordur. Günümüzde, uygulanmas kolay ve hematoloji pratiginde etkinligi kan tlanm fl olan kemik iligi kökenli kök hücrelerinden evrensel boyuttaki beklentiler, Kociok'un "Hastan n kendi kök hücresi retinitis pigmentoza ve diger göz hastal klar nda koni görüflünü koruyabilir mi?" bafll kl makalesinde ifadesini bulmufltur (13). K -MKH gibi eriflkin kök hücre grubunda etkin transfeksiyon yöntemlerinin gelifltirilmifl olmas bu sorunun yan t n n olumlu olacag na inanc m z artt rmaktad r (2). Kemik iligi kök hücrelerin kemirici ve insanlarda hemopoetik kök hücreler yan s ra mezenkimal kökenli kas, cilt ve nöron hücrelerine dönüfltügü gösterilmifltir (4). Koroid neovasküler membran (KNM) gelifliminde K -MKH katk s n n gösterilmesi dikkat çekicidir (11). Japon araflt rmac lar, retina yaralanmal s çanlarda K - MKH'lerin yaralanmal alana lokalizasyonu ile birlikte retina sinir hücresine dönüfltügünü göstermifllerdir (14). Ayn araflt rmac grup B6 transjenik fare gözlerine retina fotokoagulasyonu ile birlikte intravitreal kök hücre transplantasyonu uygulad klar nda bunlar n retinal nöron hücrelerine dönüfltüklerini ve bu transforme hücrelerin 1 y l süreyle ifllevselliginin devam ettigini saptam fllard r. Fotokoagulasyon ile uyar m yap lmayan kontrol gözlerde ise nöronal hücrelere dönüflüm daha k sa süreli ve daha az say da olmufltur (15). Kemiricilerde sodyum iyodat ile tapetoretinal dejenerasyon geliflimi, uzun y llar içinde oldukça iyi tan mlanm fl örnek bir modeldir. Enzmann ve arkadafllar B6 transjenik fare sujunda yapt klar özgün çal flmada RPE (Retina Pigment Epiteli)'nin anatomik degiflikliklerine efllik eden ifllevsel degiflikliklerin uygulanan sodyum iyodat dozu ve uygulama sonras süre ile dogrusal etkilenim gösterdigini bildirmektedirler (16). Çal flmam z tavflan retinas n n geç dönemde kendini yenileme olas l - g na karfl 45 günlük dönem için planlanm fl ve sodyum iyodat n etkinligi kan tlanm fl olan 40mg/kg dozu uygulanm flt r. Bu modeldeki tomografik, fundoskopik, anjiyografik, elektrodiyagnostik ve histopatolojik degifliklikler geçen y lki Türk Oftalmoloji Dernegi Ulusal Kongresinde sunulmufltur (7). K saca, bu çal flmam zda önceki çal flmam zdakine benzer flekilde 1. günde ERG ile tan mlanan ifllevsel degifliklikler gözlenmifltir (fiekil 1). Beflinci günden itibaren OKT (Optikal Koherens Tomografi) retinada kal nlaflmay göstermifl ve FFA'da 1. haftada RPE defektleri oluflmufl, 2. haftadan itibaren tüm retinada yerleflmifltir. Geçen y lki gözlemimizdekine benzer tarzda K -MKH uygulanan gözlerde kayda deger enflamasyon gözlenmemifltir. Bunda K -MKH'lerin varoldugu ileri sürülen antienflamatuvar etkilerinin rolü bulunabilir (5). K -MKH'lerin intravitreal implante edildigi gözlerde fonksiyonel kazanç elde edilmesinde bu hücrelerin retinaya migrasyonu ve transdiferasyonunun rolü bulunabilecegi bildirilmiflti (17). Retinan n kal tsal ve edinsel pek çok hastal g nda RPE yap sal ve ifllevsel bozukluklar göstermektedir. Fötal yada embriyonik hücre transplantasyonu yan s ra eriflkin RPE hücreleri ile RPE yap sal ve ifllevsel bozukluklar n n giderilmesi çal flmalar nda karfl lafl lan sorunlar, üzerinde yogun çal flmalar n yap ld g subretinal RPE transplantasyonu benzeri yöntemlerin klinik uygulamaya geçirilmesini güçlefltirmektedir. Bu sorunlar n bafl nda progenitor hücrelerin nitelik ve niceliksel olarak yetersiz kalmas, retinaya ulaflt r lamamas yada reorganizasyon olamamas gelmektedir. Bu zorluklar, K -MKH'lerin intravitreal imp-

324 Gökhan Özge, R za Güngör, Güngör Sobac, Ferit Avcu, Murat Demiriz, Elvin Akdag, Ali Ugur Ural lantasyonu ile afl labilir gözükmektedir. Ancak, bu yöntemin oftalmolojide uygulanmas nda gözün özgün anatomik ifllevsel bütünlügü, örnegin kan-retina ve kanaköz bariyerleri yan s ra gözün immün özgünlügünün dikkate al nmas gerektigini düflündük. Bu maksatla, bafllang ç aflamas nda bu yöntemin uygulanabilirliginin irdelendigi bu çal flmam z n sonuç hedefi, bu yöntemin klinik uygulamaya geçirilmesidir. Yöntemin pratikte uygulanabilirligini araflt rmak üzere, temini, muayenesi ve izleminin kolayl g ile öteden beri preklinik çal flmalarda kulland g m z ve insandakine yak n boyutta gözü olan tavflan, denek olarak seçilmifltir. Bu amaçla, tapetoretinal dejenerasyon oluflturdugu kaynakçada iyi tan mlanm fl olan sodyum iyodat modeli kullan lm flt r. Oksidasyon yoluyla etkili oldugu bilinen sodyum iyodatla tepkimeye girmesi için retinas nda melanin içeren pigmente tavflanlar seçilmifl, böylece insandakine benzer bir konum saglanm flt r. K -MKH temin etmek üzere GATA Araflt rma Laboratuar 'nda üretimi gerçeklefltirilen Yeni Zelanda tipi albino tavflan n proksimal femurundan al nan kemik iligi stromal hücrelerden in-vitro koflullarda mezenkimal kök hücreler diferansiye edilmifl ve yenilenme potansiyellerini kaybetmemeleri için 4. pasajdaki hücreler kullan lm flt r. Bu hücreler in vitro koflullarda YFP protein sentezleyen plazmidler arac l g ile transfekte edilmifltir. YFP proteini retinaya gen transferinin araflt r ld g kontrollü gözlemlerde tan mlay c olarak kullan lmaktad r. Bu geni içeren hücreler mavi fl k alt nda yeflil flöresans ile mikroskop alt nda izlenebilmektedir. Gen transferinin yap ld g hücreler canl ortamda izlenerek, gen aktar m n n etkinligi mevcut organizmaya zarar vermeden kan tlanabilmektedir. Çal flmam zda, tapetoretinal dejenerasyona ugrayan katmanda YFP eksprese eden bu hücrelerin varl g n n kan tlanmas K -MKH'lerin bu maksatla uygulanabilecegini göstermektedir. Kontrol tavflandakinin aksine vitreustaki MKH'lerin akut dejenerasyona ugrayan gözde retinaya göç etmeleri ve bu hücrelerin retinan n rejenerasyonu aflamas ndaki fonksiyonel katk s düflündürücüdür. Liposomal transfeksiyon yöntemi, d fl ortamda transfeksiyonun gerçeklefltirilmesinde günümüzde etkin bir yöntem olarak oldukça s k olarak uygulanmaktad r. Nükleotransfeksiyon olarak da adland r lan bu yöntemin digerleri ile k yasland g nda en etkin gen transfer yöntemi oldugu bildirilmifltir (3). Bununla birlikte, bu yöntemin hücreye özgün olarak farkl l klar gösterebildigi ve gen transferi aflamas nda toksik olmayan en etkin kar fl - m n elde edilmesi gerektigi bilinmektedir. Bunun için çal flmam zda, ön çal flmalarla transfeksiyon etkinligi daha önceden kan tlanm fl olan protokole uygun YFP transfeksiyon yöntemi uygulanm flt r. K -MKH teminindeki sorunlar nedeniyle çal flmam zda denek say s s n rl tutulmufl (3 adet), etik nedenler ve kontrol saglanabilmesi bak m ndan sol gözlere plasebo ifllem (FTS) uygulanm flt r. Ayn nedenle otojen yerine allojenik transplantasyon uygulanarak bu yöntemin tedavideki etkinligi araflt r lm flt r. Çal flmam z allojenik K -MKH intravitreal uyguland g nda immün redde ugrayamayacaklar n göstermektedir. Bu durum K - MKH uyguland g diger çal flmalarda da izlenmifl olup bunun bu hücrelerin immünosüpressif etkisinden kaynakland g ileri sürülmüfltür (5). Kontrol tavflan gözünde daha önceki çal flmam zdakine benzer kayda deger bir yap sal degifllik gözlenmedi. Bununla birlikte vitreustaki YFP hücre yogunlugunu giderek azalmakla birlikte 45 günlük takipte retinada yerleflmedikleri gözlendi. Nd:YAG hasar oluflturulan s çan gözlerindeki 50 günlük takiplerde, normaldekine k yasla intravitreal K -MKH uygulanan tarafta retinaya kök hücre geçifli ve antiapopitotik gen aktar m gözlenmifltir (9). Li ve arkadafllar, RPE'den sal nan kemoatraktanlar n (SDF: stromal kökenli büyüme faktörü ve C3: kompleman 3) K -MKH'lerin migrasyonu ve transdiferasyonunu saglad g n göstermifllerdir (18). Obata ve arkadafllar tavflan sodyum iyodat mododelinde, fibroblast ve vasküler endotel hücrelerindan farkl olarak RPE üzerinde stimülan etkisi olan doku faktör plazminojen yol inhibitörü (TFPI) nün intravitreal uyguland g tarafta RPE katman n n korundugunu, bu koruman n kal tsal retina dejenerasyonlu RCS s çanlarda k smen gerçeklefltigini göstermifllerdir (19). Hayvan modellerinde büyüme faktörlerinin retinay dejenerasyon gelifliminden koruduklar gösterilmifltir (20). Bununla birlikte bu faktörlerin uygulanmas nda karfl lafl lan en önemli sorun ortamdaki homeostazisin bozularak istenmeyen hücre gruplar, örnegin, fibroblastlar üzerinde trofik etki gösterebilme olas l klar d r. K -MKH'lerin edinsel faktörler yan s ra kal tsal faktörler ile ortama çagr ld g n, migrasyona ve transdiferansiasyona zorland g n gösteren çal flmalar vard r (21). Daha ileri çal flmalarla bu faktörler daha iyi tan mlanabilir ve immünhistokimyasal boyama yöntemleri kullan larak rejenere olan hücrelerin kök hücre ile iliflkileri tam olarak ortaya konabilir. Gözün immün özgünlügünün, d fl ortamlardan soyutlanm fl anatomik ve ifllevsel düzeneginin kök hücre ve gen tedavileri için uygun bir ortam oluflturdugu bilinmektedir (22). Kök hücre arac l yöntemlerle istenilen hücre tipinin, eksikligi duyulan alanda yeniden kazan lmas mümkündür. Ancak, bunun için uygun bir uyaran ortama gereksinim duyulmaktad r (23). Retina distrofi ve dejenerasyonlar böyle bir ortam saglayabilir. Giderek saflaflt r lan ve kolaylaflt r lan kök hücre üretme teknikleri gündemdedir. Bu maksatla CNTF (Siliyer nörot-

Tavflan Tapetoretinal Dejenerasyon Modelinde ntravitreal Uygulanan Kemik ligi Mezenkimal Kök Hücre Arac l Gen Tedavis i çin Canl ve Cans z Ortamda Kan t: Yeflil Flöresan Protein (YFP) 325 fiekil 1. n-vitro plazmid arac l YFP aktar lan K -MKH rofik faktör), bfgf (bazik fibroblast grovt fakrör), EGF (epidermel grovt faktör) ve aközhümör ile RPE'nin kullan ld g bilinmektedir (24,25) Memelilerde iris dokusunda retinal dogurgan kök hücre varl g ve bunlar n fotoreseptörlere dönüflümü gösterilmifltir (26). Günümüzde gen transfer yöntemlerindeki h zl geliflmeler dikkat çekicidir (27). Moleküler tan mlay c yöntemlerdeki geliflmeler, insanda retinaya özgün genlerin tan mlanmas n kolaylaflt rm flt r. lerde amfibianlardaki ömür boyu retinal nöronlar n oluflumunu saglayan moleküler mekanizmalar n (regülatör genlerin) ayd nlat lmas ile insanda sürekli retina rejenerasyonu için bu moleküllerin gen transferi ile kal c tedaviler saglanabilir. KNM (Koroid Neovasküler Membran)'lar n oluflumunda etkin rol ald g gösterilen MKH'lerin endotel hücre matürasyonu ile bu hücrelerin hipoksik hasara karfl stabilizasyonunu saglad klar, besledikleri retinal nöronlar apoptosisden koruduklar bilinmektedir. Böyle bir yaklafl m n retinan n iskemik hasar na bagl neovaskülarizasyon geliflimi için koruyucu tedavi yaklafl m saglayabilecegi öne sürülmektedir (28). Örnegin, yafla bagl maküla dejenerasyonundaki KNM için antianjiyogenetik gen transferi ile birlikte uygulanabildiginde böyle bir yaklafl m kökten tedavi olanag sunabilir. K - MKH'leri s çan prematür retinopati modelinde uygulayan Ritter ve arkadafllar, bu hücrelerin iskemik alanlara göçüyle birlikte neovaskülarizasyon geliflimini önlediklerini bildirmektedirler (29). Halen bu amaçla destrüktif fiekil 2a. Kontrol ERG (13.gün) fiekil 2b. Çal flma, ERG (1.gün)

326 Gökhan Özge, R za Güngör, Güngör Sobac, Ferit Avcu, Murat Demiriz, Elvin Akdag, Ali Ugur Ural fiekil 3a. Kontrol, intravitreal YFP-MKH (1.gün) fiekil 4a. Çal flma, intravitreal YFP-MKH (5.gün) fiekil 4b. Çal flma, intraretinal YFP-MKH fiekil 3b. Çal flma, intravitreal YFP-MKH uygulamalara baflvuruldugu göz önüne al n rsa benzer bir tedavi yaklafl m n n klinik uygulamaya geçirilmesinin avantajlar daha iyi anlafl labilir. Tüm bu ümit verici geliflmelerle birlikte göz önüne al nmas zorunlu koflullar da vard r. Allojenik MKH uygulamalar nda immün red gözlenebildigi de bildirilmifltir (30) Henüz, KH tan mlay c moleküller tam olarak ortaya konamam flt r; transplantasyon yada gen transferi için en uygun hücre tipi bilinmemektedir. En uygun uygulama flekli (intravitreal, subretinal) bilinmemektedir. Dönör yafl n n rolü (31), uygulama için en uygun zamanlama, hastal kl ortamdaki yeni homeostazis ile bu uygulamalar n uzun dönem etkinlik, emniyetleri ve olas tümörojenik potansiyelleri göz önünde bulundurulmal - d r. Karfl laflt rmal bir çal flmada fotoreseptörlere taransdiferansiyasyon saglanabilmesi bak m ndan retinal KH'lerin daha avantajl oldugu bildirilmektedir (32) Arnhold ve arkadafllar n n yak n zamandaki çal flmalar nda, dogufltan rodopsin yoklugu ile karakterize RCS (Royal Collage of Surgeon) kör s çan modelinde, K - MKH'lerin transplantasyonunda, bu hücrelerin RPE ve nöroretinal katmanlara entegrasyonu, nöral ve glial hüc-

Tavflan Tapetoretinal Dejenerasyon Modelinde ntravitreal Uygulanan Kemik ligi Mezenkimal Kök Hücre Arac l Gen Tedavis i çin Canl ve Cans z Ortamda Kan t: Yeflil Flöresan Protein (YFP) 327 fiekil 5a. Çal flma, FFA (10.gün) fiekil 6a. Çal flma, fundus görünümü (45.gün) fiekil 5b. Çal flma, immun flöresans (10.gün) fiekil 6b. Çal flma, HRA, otoflöresans relere transdiferansiasyonu ile ifllevsel baflar bildirmektedirler (33). Yak n zamanda yay nlanan çal flmas nda Inoue ve arkadafllar K -MKH'lerin subretinal transplantasyonunda baflar l sonuçlar al nd g n bildirmektedirler (34). K -MKH'lerin tedavi maksatl ilk in vivo uygulamalar Kicic ve arkadafllar ile Tomita ve arkadafllar na aittir (32,35). Onlar, mekanik debritmanl s çan gözlerinde.bu hücrelerin retinan n özellikle d fl nükleer katman nda yogunlaflt g n ve bunlar n retinal nöral hücrelere dönüfltügünü göstermifllerdir (32). Çal flmam zdaki gözlemimiz benzerlik göstermektedir. Çal flmam zda, daha homojen retina hasar oluflturmak ve kal tsal modellerdekine benzerlik göstermesi bak m ndan sodyum iyodat ile tapetoretinal dejenerasyon modeli kullan lm flt r. Bu çal flmam zdaki gözlemlerimiz, intravitreal K - MKH implantasyonunun tapetoretinal dejenerasyon ile seyreden hastal klarda etkin bir yöntem olarak uygulanabilecegini düflündürmektedir. Bununla birlikte, ileri emniyet ve etkinlik çal flmalar na gereksinim duyuldugu da göz ard edilemez.. Çal flmam zda bu etkinligin allojenik transplantasyonlarda gözlenmesi anlaml d r. Allojenik transplantasyon modeli üzerine kurulmufl bu çal flmada, albino tavflan kemik iliginden al nan ve plazmid arac l YFP transdüksiyonu saglanan kök hücreler, pigmentli tavflanda oluflturulan tapetoretinal dejenerasyonlu

328 Gökhan Özge, R za Güngör, Güngör Sobac, Ferit Avcu, Murat Demiriz, Elvin Akdag, Ali Ugur Ural gözlerde intravitreal uyguland g nda, retinadaki tedavi edici etkinligin kök hücre arac l oldugu, bu hücrelerden olan tan t c gen ekspresyonu ile kan tlanm flt r. Bununla ilgili ileri çal flmalar m z halen devam etmekte olup dejenere RPE modelinde kök hücrenin pigment epiteline dönüflümü sagland g nda oluflan RPE tabakas n n melanosit içeriginin bu tedavinin etkinligi için histolojik bir parametre olarak da degerlendirilmesi planlanm flt r. nsanda, intravitreal uygulamadaki tecrübelerimiz, hayvandakinden daha kolay otolog K -MKH temin edebilme olas l g m z ve bu tedaviden beklentilerimizin büyüklügü, in-vivo etkin ve emniyetli oldugunu gösterdigimiz bu yöntemin klinige uyarlanabilmesi dogrultusunda ileri preklinik doz ve emniyet çal flmalar n n yap lmas n zorunlu k lmaktad r. Bu yöntemin kal tsal tipteki tapetoretinal dejenerasyonlar üzerindeki etkinlik ve emniyetini belirlemek üzere ileri preklinik çal flmalar yap lmas planlanm flt r. KAYNAKÇA 1. Lakshmipathy U, Pelacho B, Sudo K, Linehan JL, Coucouvanis E, Kaufman DS, Verfaillie CM, Efficient transfection of embryonic and adult stem cells. Stem Cells. 2004;22(4):531-43. 2. Okazaki A, Jo J, Tabata Y. A reverse transfection technology to genetically engineer adult stem cells. Tissue Eng. 2007 Feb;13(2):245-51. 3. Wang F, Xia X, Hu H, Li L, Tian Y, Chen X, Huang Q. Liposome-mediated gene transfer into retina. Zhonghua Yan Ke Za Zhi. 2002 Sep;38(9):520-2. 4. Brazelton TR, Rossi FM, Keshet GI, Blau HM. From marrow to brain : expression of neuronal phenotypes in adult mice. Science 2000; 290:1775-1779. 5. Le Blanc K, Ringden O. Mesenchymal stem cells: properties and role in clinical bone marrow transplantation. Curr Opin Immunol. 2006; 18:586-591. 6. Li Y, Reca RG, Atmaca-Sonmez P, Ratajczak MZ, Ildstad ST, Kaplan HJ, Enzmann V: Retinal pigment epithelium damage enhances expression of chemoattractants and migration of bone marrow-derived stem cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2006 Apr;47(4):1646-52. 7. Özge G, Sobac G, Avcu F, Safal M, Pamuk K, Ural AU. Tavflan Tapetor etinal Dejenerasyon Modelinde Kemik ligi Mezankimal Kök Hücre Intravitreal mplantasyonunun Uygulanabilirliginin Araflt r lmas. TOD 40. Ulusal Oftalmoloji Kongresi Program ve Özet Kitab (Antalya). sf:145; 2006. 8. Baran Y, Ural AU, Avc F, Sarper M, Elçi P, Pekel A: Mezenkimal Kök Hücrelerin invivo takibinde yeflil floresan protein aktar lmas n n optimizasyonu. 33. Ulusal Hematoloji Kongresi, 2007, Ref No:107. 9. Zhang J, Shan Q, Ma P, Jiang YM, Chen P, Wen J X, Zhou Y, Qian HW, Pei XT. Observation of bone marrow mesenchymal stem cells after subretinally transplanted into laser-injured rat retina. Zhonghua Yi Xue Za Zhi. 2003 Nov 25;83(22):1993-8. Chinese. 10. Hara A, Niwa M, Kunisada T, Y oshimura N, Katayama M, Kozawa O et al. Embriyonic stem cells are capable of generating a neuronal network in adult mouse retina. Brain Res 2004; 999:216-221. 11. Young MJ: Stem cells in the mammalian eye: a tool for retinal repair. APMIS. 2005 Nov-Dec;113(11-12):845-57. 12. Koch CA, Jordan CE, Platt JL. Complement-Dependent Control of Teratoma Formation by Embryonic Stem Cells. J Immunol 2006; 177: 4803-4809. 13. Kociok N. Can the injection of the patient's own bone marrow-derived stem cells preserve cone vision in retinitis pigmentosa and other diseases of the eye? Graefe's Arch Clin Exp Ophthalmol. 2005; 243:187-188. 14. Tomita M, Adachi Y, Yamada H, Takabashi K, Kluchi K, Oyaizu H. Bone marrow-derived stem cells can differentiate into injured rat retina. Stem Cells 2002; 20;279-283. 15. Minamino K, A dachi Y, Yamada H et al: Long-term survival of bone marrow-derived retinal nerve cells in the retina. Neuroreport. 2005 Aug 22;16(12):1255-9. 16. Enzmann V, Row BW, Yamauchi Y, Kheirandish L, Gozal D, Kaplan HJ, McCall MA: Behavioral and anatomical abnormalities in a sodium iodate-induced model of retinal pigment epithelium degeneration. Exp Eye Res. 2006 Mar;82(3):441-8. 17. Arnhold S, A bsenger Y, Klein H, Addicks K, Schraermeyer U. Tr ansplantation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells rescue photoreceptor cells in the dystrophic retina of the rhodopsin knockout mouse Graefe's Arch Clin Exp Ophthalmol 2007; 245: 3; 414-422. 18. Li Y, Reca RG, Atmaca-Sonmez P, Ratajczak MZ, Ildstad ST, Kaplan HJ, Enzmann V. Retinal pigment epithelium damage enhances expression of chemoattractants and migration of bone marrow-derived stem cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2006;47(4):1646-52. 19. Obata R, Yanagi Y, Tamaki Y, Hozumi K, Mutoh M, Tanaka Y: Retinal degeneration is delayed by tissue factor pathway inhibitor-2 in RCS rats and a sodium-iodate-induced model in rabbits. Eye.2005 Apr;19(4):464-8. 20. Ohtaka K, Machida S, Ohzeki T, Tanaka M, Kurosaka D, Masuda T, I shii T: Protective effect of hepatocyte growth factor against degeneration of the retinal pigment epithelium and photoreceptor in sodium iodate-injected rats. Curr Eye Res. 2006 A pr;31(4): 347-55. 21. De Becker A, Van Hummelen P, Bakkus M, Vande Broek I, De Wever J, De Waele M, Van Riet I. Migration of culture-expanded human mesenchymal stem cells through bone marrow endothelium is regulated by matrix metalloproteinase-2 and tissue inhibitor of metalloproteinase-3.haematologica. 2007 Apr;92(4):440-9. 22. Sobac G. Oftalmolojide gen tedavisi in Oftalmik ilaçlar, eds: Oto S, Y lmaz G, Ayd n P, Günefl Kitabevi, Ankara 2003. 23. Hori Y, Inoue S, Hirano Y, Tabata Y: Effect of culture

Tavflan Tapetoretinal Dejenerasyon Modelinde ntravitreal Uygulanan Kemik ligi Mezenkimal Kök Hücre Arac l Gen Tedavis i çin Canl ve Cans z Ortamda Kan t: Yeflil Flöresan Protein (YFP) 329 substrates and fibroblast growth factor addition on the proliferation and differentiation of rat bone marrow stromal cells. Tissue Eng 2004; 10: 995-1005. 24. Yang J, Klassen H, Pries M, Wang W, N issen MH. Aqueous Humor Enhances the Proliferation of Rat Retinal Precursor Cells in Culture and this Effect is Partially Reproduced by Ascorbic Acid. Stem Cells. 2006 dec; 24(12): 2766-75. 25. Jérome R, Valérie B, Sylvie T Anni H, José-Alain S, Xavier G, Olivier G. Involvement of Pleiotrophin in CNTFmediated differentiation of the late retinal progenitor cells. Dev Biol. 2006;298:527-39. 26. Abe T, Y oshida M, Yoshioka Y, Wakusawa R, Tokita-Ishikawa Y, Seto H, Tamai M, Nishida K. Iris pigment epithelial cell transplantation for degenerative retinal diseases. Prog Retin Eye Res. 2007 May;26(3):302-21. 27. Sobac G. 2000'li y llara girerken retina hastal klar n n gen tedavisi: Retina-Vitreus 2000;8(2): 187-196. 28. Friedlander M, Dorrell M, Ritter, M, Marchetti,V, Moreno S, El-Kalay, M, Bird, A, Banin E, Aguilar E. Progenitor cells and retinal angiogenesis. Angiogenesis 2007; 10 (2): 89-101. 29. Ritter, M, Banin E, Aguilar EA, Dorrell MI, Moreno S.K, Friedlander M. Myeloid progenitors differentiate into microglia and promote vascular repair in a model of ischemic retinopathy. J. Clin. Invest. 116:3266-3276 (2006). 30. Ryan JM, Barry FP, Murphy JM, Mahon BP. Mesenchymal stem cells avoid allogeneic rejection. J Inflamm 2005; 2: 8. 31. Gudrun UM, Ramesh RB. Donor site, age, and health affect fibroblast growth in culture. In vitro Cell Dev Biol Anim. 1995 Jul-Aug;31(7):494-6. 32. Kicic A, Shen WY, Wilson AS, Constable JJ, Robertson T, Rakoczy PA. Differentiation of Marrow Stromal Cells into Photoreceptors in the Rat Eye. J Neuroscience 2003; 23(21):7742-7749. 33. Arnhold S, Heiduschka P, Klein H, Absenger Y, Basnaoglu S, Kreppel F, Henke-Fahle S, Kochanek S, Bartz- Schmidt KU, Addicks K, Ulrich S. Adenovirally Transduced Bone Marrow Stromal Cells Differentiate into PigmentEpithelial Cells and Induce Rescue Effects in RCS Rats. Invest Ophthalmol Vis Sci 2006; 47.4121-4129. 34. Inoue Y, Iriyama A, Ueno S, Takahas hi H, Kondo M, Tamaki Y, Araie M, Yanagi Y. Subretinal transplantation of bone marrow mesenchymal stem cells delays retinal degeneration in the RCS rat model of retinal degeneration. Exp Eye Res. 2007; 85(2):234-41. 35. Tomita N, Higaki J, Kaneda Y, Yu H, Morishita R, Mikami H, Ogihara T. H ypertensive rats produced by in vivo introduction of the human renin gene. Circ. Res. 1993; 73;898-905.