Tüm Genom Analizi ve Klinik Mikrobiyoloji Dr. Burak Aksu M.Ü. Tıp Fakültesi T.Mikrobiyoloji AD.
Tüm Genom Analizi ve Klinik Mikrobiyoloji DNA dizileme yöntemleri Tüm genom analizi Mikrobiyolojide kullanım alanları Klinik Mikrobiyolojide kullanım alanları Bakteri tanımlama Antibiyotik direnci saptama Virulans saptama Klinik Virolojide kullanım alanları Sonuç
DNA Dizileme Yöntemleri 1975, Sanger Sanger F, Nicklen S, Coulson AR. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci USA 1977; 74: 5463 7.
DNA Dizileme Yöntemleri 2002, Yeni nesil sistemler 2. nesil dizileme Schadt EE, Turner S, Kasarskis A. 2010. A window into third-generation sequencing. Hum Mol Genet. 19(R2):R227-40.
DNA Dizileme Yöntemleri 2005, 3. nesil dizileme Schadt EE, Turner S, Kasarskis A. 2010. A window into third-generation sequencing. Hum Mol Genet. 19(R2):R227-40.
DNA Dizileme Yöntemleri Bertelli C, Greub G. Rapid bacterial genome sequencing: methods and applications in clinical microbiology. Clin Microbiol Infect. 2013;19(9):803-13.
DNA Dizileme Yöntemleri
Tüm Genom Dizileme 1995, Haemophilus influenzae 1.8 Mb genom 13 ay 1.5 milyon $ 2016, Genomes OnLine Database (GOLD) 16150 bakteri genomu dizisi 1.8 Mb genom <24 saat 10 $ Reddy TBK et al. The Genomes OnLine Database (GOLD) v.5: a metadata management system based on a four level (meta)genome project classification. Nucl. Acids Res. (2014) doi: 10.1093/nar/gku950
Tüm Genom Dizileme Son birkaç yıldır dizilemeye alınan genom sayısı her 6-9 ayda bir katlanmaktadır Caboche S, Audebert C, Hot D. High-Throughput Sequencing, a VersatileWeapon to Support Genome-Based Diagnosis in Infectious Diseases: Applications to Clinical Bacteriology. Pathogens. 2014 2;3(2):258-79.
Yeni Nesil Dizileme ve Mikrobiyoloji Mikrobiyota çalışmaları Barsak Cilt Mukoza Transkriptom Virom Mikobiyom Metagenomik çalışmaları Deniz, göl Kanalizasyon Toprak
Tüm Genom Analizi Klinik Bakteriyolojide Kullanım Bakteri tanımlama 2010 MALDI TOF MS (matriks aracılı lazer desorpsiyon iyonizasyon uçuş süresi kütle spektrometresi) Hızlı, doğru tanımlama*** Epidemiyolojik tiplendirme Toksin tespiti Antibiyotik duyarlılığını saptama Mikroorganizmanın tüm özellikleri
Tüm Genom Analizi Klinik Bakteriyolojide Kullanım Bakteri tanımlama 16s rdna ~1500 bp 16s rdna PCR AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG CGG TTA CCT TGT TAC GAC TT Dizileme Veri tabanıyla karşılaştırma Cins tür düzeyinde tanımlama Tüm Genom Dizisi
Tüm Genom Analizi Klinik Bakteriyolojide Kullanım Bakteri tanımlama 16s rdna PCR 16s rdna ~1500 bp AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG CGG TTA CCT TGT TAC GAC TT Dizileme Veri tabanıyla karşılaştırma Cins tür düzeyinde tanımlama Tüm Genom Dizisi Veri tabanıyla karşılaştırma Cins tür düzeyinde tanımlama
Tüm Genom Analizi Klinik Bakteriyolojide kullanım Kültürden tanımlama Doğrudan örnekten tanımlama Özgün primer seçimine gerek yok Özellikle üretilmesi zor, zaman alıcı veya mümkün olmayan patojenler İnsan/patojen DNA oranı yüksek Daha etkin nükleik asit saflaştırma yöntemleri gerekli PCR duyarlılığına ulaşmak zor Kullanılan solüsyonlarda bakteri kontaminasyonu
14 yaş erkek çocuk 4 ay süren ateş ve başağrısı Hidrosefali ve epilepsi nöbetleri Menenjit?
Menenjit?
İdrar yolu enfeksiyonu şüphesi 35 idrar örneği İdrar kültürü 19 üreme (+) Örnekten Tüm Genom Dizileme Klasik tanımlama Koloniden Tüm Genom Dizileme
Tüm Genom Analizi Klinik Bakteriyolojide kullanım Antibiyotik direnci saptama In siliko antibiyotik duyarlılık testi Genotip Fenotip Büyük hata: Bir genin varlığı, direnç ile eş anlamlı olmayabilir Çok büyük hata: Bir genin yokluğu, direnç olmaması ile eş anlamlı olmayabilir
Tüm Genom Analizi Klinik Bakteriyolojide kullanım Antibiyotik direnci saptama Gen aktarımı ile gelişen direnç (beta laktamaz genleri gibi) Özgül genlerdeki mutasyonlara bağlı gelişen direnç (rpob, gyra..) Ekspresyon artışı, birden fazla geni ilgilendiren karmaşık düzenleyici sistemlerde oluşan değişiklikler
Tüm Genom Analizi Klinik Bakteriyolojide kullanım Antibiyotik direnci saptama
Tüm Genom Analizi Klinik Bakteriyolojide kullanım A.baumannii enfeksiyonu Tedavi sırasında tigesikline direnç Tedavi öncesi/sonrası izolatlarda genom analizi 18 tek nükleotid değişimi (SNP) ve 3 delesyon Hornsey M et al. Whole-genome comparison of two Acinetobacter baumannii isolates from a single patient, where resistance developed during tigecycline therapy. J Antimicrob Chemother 2011,66:1499 1503
Tüm Genom Analizi Klinik Bakteriyolojide kullanım Tüm genom dizileme verisinin antibiyotik duyarlılığını belirlemede kullanımı sınırlı: Direnç geni veya mutasyonu, dirence neden olmayabilir indüklenebilir dirençle ilişkili olabilir antibiyotik duyarlılığına ait kantitatif veri sağlamaz
Tüm Genom Analizi Klinik Bakteriyolojide kullanım Antibiyotik duyarlılığını belirleme amacıyla hazırlanmış ve sürekli güncellenen veri tabanları Tüm genom dizileme verisinden antibiyotik duyarlılığına ait bilgiyi süzecek yazılımlar Sürekli kontrolün sağlanabilmesi için fenotipik direnç testleri de yapılmalı
Tüm Genom Analizi Klinik Bakteriyolojide kullanım
Tüm Genom Analizi Klinik Bakteriyolojide kullanım Virulans saptama Hastadaki patolojik değişiklikler ve sonuçları ile patojenin genom bilgisi arasındaki ilişkinin incelenmesi ile yeni virulans faktörlerini belirleme imkanı Güncel veritabanı/yazılım gereksinimi
Tüm Genom Analizi Klinik Bakteriyolojide kullanım Epidemiyolojik tiplendirme Enfeksiyon kontrolü Sürveyans
Tüm Genom Analizi Klinik Bakteriyolojide kullanım Epidemiyolojik tiplendirme Tüm genom dizileme verisi = son durak
Tüm Genom Analizi Klinik Bakteriyolojide kullanım Kong Z, Zhao P, Liu H, Yu X, Qin Y, Su Z, et al. (2016) Whole-Genome Sequencing for the Investigation of a Hospital Outbreak of MRSA in China. PLoS ONE 11(3): e0149844.
Tüm Genom Dizileme Klinik Virolojide Kullanım Tüm viral genom dizileme Virus hastalık ilişkisi Virus florasının içeriği ve insan sağlığına etkileri Rezervuarların ve bulaş yollarının saptanması Türümsülerin (quasispecies) aynı konakta veya konaklar arasında çeşitliliği, virus bulaşı, viral adaptasyon dinamiği ve hastalık progresyonu üzerindeki etkileşimleri
Tüm Genom Dizileme Klinik Virolojide Kullanım Antiviral ilaç direnci saptama İlaca dirençli virus (mutant) oranı Sanger dizileme ile saptama sınırı >%15 20 Yeni nesil dizileme ile saptama sınırı: %0.1 1 Reseptör tropizminin belirlenmesi HIV
Tüm Genom Dizileme & Klinik Mikrobiyoloji Teknolojideki gelişmeler, rekabet ve maliyetlerin düşmesi ile bu yöntemler artık daha ulaşılabilir Elde edilen veri çok kapsamlı ve büyük Veri depolama!!! Biyoinformatik!!! Kullanılan teknolojiden bağımsız veri analizi yazılımlarına gereksinim Sürekli güncellenen ve denetlenen veri tabanlarına gereksinim
Sonuç Bugün için; Düşük hata oranı, yüksek okuma kapasitesi ve uygun maliyete sahip, mükemmel bir yeni nesil dizileme platformu henüz yok Tüm genom dizileme yöntemlerinin klinik mikrobiyolojide kullanıma girmesi artık sadece bir zaman meselesi
İlginiz için teşekkürler