Differential Display Özgür Çakır
Differential gen anlatımı Gelişmeye bağlı gen anlatımı değişiklikleri Ortam uyaranları ile gen anlatımı değişimleri Doku veya hücreye özel gen anlatımları
Farklı anlatım yapan genlerin analizi tanımlama differential filter hybridization cdna subtraction differential display PCR (DD-PCR) serial analysis of gene expression (SAGE) Miktar belirleme Northern blotting reverse Northern blotting RNase protection competitive PCR quantitative PCR (Q-PCR) cdna (micro)array hybridization
Başlangıç için bir hedefe ihtiyaç yok Küçük farklılıklar yakalanabilir Substraksiyondan daha bilgi verici Laboratuvar işi uzun Klonlama gerekir Dizi tayini yapılmalı
Differential display Differential display, bir RT-PCR reaksiyonundan sonra oluşan farklı boydaki parçalrın karşılaştırılması temeline dayanır. PCR primerlerinden biri olası 16 nukleotid çifti tarafından takib edilen oligo(dt)dir. Diğer primer ise genellikle 6 bazlık oligolar veya onların karışımıdır. Bu karışım çok yüksek çözünürlüklü akrilamid jelde ayrılır, flouresan veya radyoaktif olarak görünür hale getirilir ve iki durum arasındaki fark izlenir. Hızlı bir metoddur. Ucuzdur, birçok gen izlenebilir Ekspresyon analizi yapmak için uygun bir yöntemdir Miktar belirlemek zordur Gen anlatımındaki küçük değişikler yakalanamaz Genler başlangıçta bilinen veya bilinmeyen genlere uygulanabilir Çok sayıdaki örnek uygun Artefkt sayısı çoktur
DD Çok ekstrem koşullar taranmamalı Her örnek için tekrarlar yapılmalı Çok sayıda örnek kullanılmalı Bilinmeyen veya bilinen genler için kullanılabilir
Differential Display-PCR mrna AAAAAAAAAA reverse transcription cdna AAAAAAAAAA TTTTTTTTTT PCR with dt-anchor primers and random decamers 80x GATGCATTAG control separate on polyacrylamide gel stimulated TTTTTTTTTT GTTTTTTTTTT 4x dow n- regulated upregulated
DD-PCR: mrna amplification mrna AAAAAAAAAA crna transcription using T7 RNA polymerase cdna reverse transcription AAAAAAA TTTTTTT T7 crna AAAAAAA TTTTTTT T7 T7 TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT 2nd strand synthesis reverse transcription ds cdna AAAAAAA TTTTTTT T7 T7 cdna TTTTTTT AAAAAAA DD-PCR
Differential Display Analysis Genhunter
Differential Display Analysis Genhunter mrna 5 UTR Coding region 3 UTR UCG AAAAAAA n
Differential Display Analysis Genhunter mrna 5 UTR Coding region 3 UTR UCG AAAAAAA n Reverse transcribe
Differential Display Analysis Genhunter mrna Anchor Primer (3) 5 UTR Coding region 3 UTR UCG AAAAAAA n Reverse transcribe
Differential Display Analysis Genhunter mrna Anchor Primer (3) 5 UTR Coding region 3 UTR UCG AAAAAAA n Reverse transcribe
Differential Display Analysis Genhunter mrna Anchor Primer (3) 5 UTR Coding region 3 UTR UCG AAAAAAA n Reverse transcribe 5 UTR Coding region 3 UTR UCG AAAAAAA n cdna(s)
5 UTR Coding region 3 UTR UCG AAAAAAA n cdna(s) PCR Amplify labeled dntps
Anchor Primer (3) 5 UTR Coding region 3 UTR UCG AAAAAAA n cdna(s) PCR Amplify labeled dntps
Anchor Primer (3) 5 UTR Coding region 3 UTR Arbitrary Primers (80) UCG AAAAAAA n cdna(s) PCR Amplify labeled dntps
Anchor Primer (3) 5 UTR Coding region 3 UTR Arbitrary Primers (80) UCG AAAAAAA n cdna(s) PCR Amplify labeled dntps X Y Z
Anchor Primer (3) 5 UTR Coding region 3 UTR Arbitrary Primers (80) UCG AAAAAAA n cdna(s) PCR Amplify labeled dntps X Y Z Run on denaturing Polyacrylamide gel
Anchor Primer (3) 5 UTR Coding region 3 UTR Arbitrary Primers (80) UCG AAAAAAA n cdna(s) PCR Amplify labeled dntps X Y Z Run on denaturing Polyacrylamide gel
Constant Induced Induced
Constant Induced Induced
Gel extract PCR amplify
Gel extract PCR amplify Ligate in vector, transform miniprep and sequence
Gel extract PCR amplify Ligate in vector, transform miniprep and sequence Spot sequences on arrays
Differential Display Analysis Genhunter Advantages -bu teknoloji çok basittir -ucuzdur
Differential Display Analysis Genhunter Dezavantajları -Miktar belirlenemez -Anlatımdaki küçük değişimler yakalanamaz
Differential Display Analysis Genhunter Anchor Primer (3) 5 UTR Coding region 3 UTR Arbitrary Primers (80) UCG AAAAAAA n cdna(s)
Differential Display Analysis Genhunter Anchor Primer (3) 5 UTR Coding region 3 UTR Arbitrary Primers (80) UCG AAAAAAA n cdna(s)
Differential Display Analysis Qbiogene Generate cdna (similar to the Genehunter method) 5 UTR Coding region 3 UTR AAAAAAA n UCG cdna(s)
Differential Display Analysis Qbiogene Generate cdna (similar to the Genehunter method) 5 UTR Coding region 3 UTR AAAAAAA n UCG cdna(s) Restriction digest
Differential Display Analysis Qbiogene Generate cdna (similar to the Genehunter method) 5 UTR Coding region 3 UTR AAAAAAA n UCG cdna(s) Restriction digest Ligate adapters
Differential Display Analysis Qbiogene Generate cdna (similar to the Genehunter method) 5 UTR Coding region 3 UTR AAAAAAA n UCG cdna(s) Restriction digest Ligate adapters
Differential Display Analysis Qbiogene Generate cdna (similar to the Genehunter method) 5 UTR Coding region 3 UTR AAAAAAA n UCG cdna(s) Restriction digest Ligate adapters
Differential Display Analysis Qbiogene Generate cdna (similar to the Genehunter method) 5 UTR Coding region 3 UTR AAAAAAA n UCG cdna(s) XYZ Restriction digest Ligate adapters PCR Amplify
Differential Display Analysis Qbiogene Advantages -anlatım yapan bölgeden diziler elde edilir
Differential Display Analysis Qbiogene Dezavantajlar -bu teknoloji çok güvenilir değil.
Farklı yöntemlerin karşılaştırılması genome- sample sensitivity labor quantitaive wide size intensity diff. filter hybridization +/- - +/- + - cdna subtraction +/- - +/- + - DD-PCR + + + + - SAGE ++ +/- + ++ ++ Northern - ++ - - + Rnase protection - + +/- + + comp. PCR - + + + ++ rev. Northern - + +/- +/- + Q-PCR - ++ ++ +/- ++ cdna micro array ++ +/- + + +
Differential Display Proteomics Protein expresyon profili = global profilleme proteomics + proteomics differential display
Visualized by 2-DE + gel staining A B Excise spot; elute; digest Extract peptides; MS analyze Protein identification
Isotopik İşaretleme: differential display proteomics için bir başka yaklaşım
Digital differential display Genlerin bilgisayar ortamında karşılaştırılmasını sağlayan bir metod Ayrı cdna kitaplıklarının profilleri Özetle, farklı dokularda farklı anlatım yapan genler tanımlanır ve gösterilir İstatistik bir test yardımıyla
Digital Differential Display