İşlevsel Genomik Nedir? İşlevsel Genomik, yapısal genomik tarafından sağlanan bileşenlerin ve bilginin kullanımı ile gen işlevinin değerlendirilmesinde, deneysel yaklaşımların (genom veya sistem boyunca) geliştirilmesini ve uygulanmasını içermektedir. Geniş ölçekte uygulanan deneysel teknolojilerin, elde edilen sonuçlarla istatistiksel veya bilgisayar analizleriyle birleştirilmesiyle tanımlanabilir. Klasik bir gen anlatımı araştırmasında, in vivo da bir organizmanın gelişimiyle birlikte bir genin anlatımının nasıl değişeceği araştırılırken, modern işlevsel genomik yaklaşımı, organizmanın gelişimiyle birlikte sayıca 1,000 den 10,000 e kadar değişen genin anlatımının nasıl değiştiğini incelemektedir.
İşlevsel Genomik Amaç: Genomik bilgiye biyolojik bir anlam kazandırma Çeşitli sistematik yaklaşımlar, bir genomdaki genlerin bir çoğu için sorulan basit sorulara cevaplar oluşturabilirler Gen anlatımı ne zaman gerçekleştirilir? Gen ürününün yerleşimi nerede olur? Bir gen hangi genlerle etkileşime girer? Bir gende mutasyon yapılırsa hangi fenotip ile sonuçlanır?
Klasik dizi analizi İşlevsel Genomik in Üç Merkezi Uygulaması: - Genome-wide knock-out - Gen Anlatımı - Genetik Haritalama Çalışmaları
Dizileme İçin Gerekli Olan Teknikler Restriksiyon Enzimleri DNA yı parçalara ayırmada Klonlama DNA yı 2-200kb lık bazlık diziler halinde çoğaltma Dizileme Kısa DNA dizisinin okunması. fluoresan maddeler ve jel-elektroforezi kullanılarak. Dizilerin Birleştirilmesi parçaların bir araya getirilmesinde kullanılan bilgisayarlı aşama.
Genom Dizilemesi - Büyük genomlar robotik ve otomasyon gerektirir. Ortak dizilerin birleştirilmesi - ideal olan, kromozom başına bir ortak dizi - standart, her bir nükleotidin 10 kez okunması - bilgisayar kullanımı ile birleştirme
İki temel dizileme stratejisi - Düzenli klon dizilemesi * fiziksel bir haritayı oluşturan klonlardan yapılan birleştirme * pozisyonların bilinmesinden dolayı tekrarlı diziler için uygun yerleştirilme
Tüm genom shot-gun dizilemesi - rastgele dizilenen klonların birleştirilmesi - küçük (ör:bakteri) genomlar için uygun - boşluklar primer yürüme ile doldurulur
WGS: Whole Genome Shotgun sequencing 1. Klon Kitaplığının Oluşturulması 2. Her bir Klonun iki ucunun dizilenmesi 3. Çakışan okumaların kontigler içine birleştirilmesi 4. Kontiglerin super-kontigler içine birleştirilmesi 5. Super kontiglerin genom içine dahil edilmesi 6. Genomun Tamamlanması
DNA Dizilenmesinde Otomasyon
Dzi analiz cihazı: MegaBACE Dizi analiz cihazı: ABI 3700
Otomatik jel okuyucu
Kapiler elektroforez cihazı
Klon Temelli Fiziksel Haritalama
DNA Dizilemesi Çoğunlukla dideoksi metodu (zincir sonlandırma metodu) ile yapılır. Dizilemesi yapılacak olan DNA dizilerinin birçok kopyası aşağıdaki bileşikler ile karıştırılır. Primer DNA tek zincirine bağlanan kısa dizi (~20bp) Normal (deoksi) nükleotidler dntp datp, dgtp, dctp, dgtp dideoksi nükleotidler ddntp DNA polimeraz I Enzim ddatp, ddgtp, ddctp, ddgtp
DNA Dizilemesinde Zincir Sonlandırma Metodu Voet Fig. 3-23
Sequencing 2
Sequencing 3
Bir Klonun Okunması 2,4,6,10, 12 ve 40 kb lik büyüklüklerdeki parçalardan oluşan kitaplıkların elde edilmesi Her bir ayrı klon, her bir kitaplıktan seçilir.
Bir Klonun Okunması >clone47_f AAGCAATTTCATAAGAATAACTTTGAGCACAAGCCCGTAAACCACCAATAAAAGAATACT TACCACCACTAAAAATTCCAGATAGCATAATAAAATACGCAGAAACCCCCATTAAGCAAA ATAAAAAAACACCAGAATAATCAAAAGACATAAAAACAAAAAAATAAGGCAAAGTAAACC AAAAAAAAATCATCAAAATAAAACTACAAACAGGCATCAATAAAAAAGATAGTCATGAAGA AAAATAAAAAAAAAGCTGTTCTTTCTTTAATAATTTAAGACCATCAAACAACGCCTGAAAA ATACCAGAGTAACCAACTTTATTGGGACCAATACGACACTGAGTGCCACCCAAAAAATGA CGTTCTATTAAAGTTAAAAAAGCAATGGCTTGTAAAATAAAAATAATTATAAGAAAAATAC CAATATAATAAAAAATAAACAAAGTAAAATCCAAAGAATTTACnnTTCTTTATTCTAATATAA ACTAATACTTTAAAAAATAGAGACAAGTTTCCTTACCTCTACCATACTACAACTTACGCCC CTATAGGCCATTGACGGATGGTTTGTACCACTTTGTTTATTAAATTCATTAATATATAAAAA AAAAATTACTTTCTTTTCCAATTTCAAAAAAAAATAAAAAAATA >clone47_r TGATTGGTGTTTGTTTTCTTATTGTTAATTTTTTTCGTGCTAAATTACATAATTTTAATTGGT ATCATACTCAAGCTTATGATATGTCTATTGACTATTGACGGTTCTTAGAATGAATGTGAGG TATTATATTTTGTTTATTATATGTTTGAGGTTCTTAATTTTTAATTGTAAGATATCTGTTTTA CTTCATTATTTTTTATAGCTTATTTTTAATGATGATTTTTTTAATTATTTCTTCTTTTTTTTTTT TGGTTTTTTTATTTTTTGTACGTTCAATATAATTATGAATAATTATTAGTAATTATTTAAAAA TAATTACTAAATTAAATACAATTCTCAGAGTATTATAACATTAAAGTTATAATACTCTGTTA GAATTGTATTTATTTAATAGACCAACTACTTAAATTACTAACTAAAGATTATTTTTTTACTAT AGTGTATATATTATAnAGTTATTATATTTGATTTGCAATCTTAAGATTTTTATACACTATGGC TTTTTAGTATAATAAGTATATTCGTTTTAAGCGCGGCTGGTTTTAAGCTATTAGAATTTTA
Dizilerin Birleştirilmesi Direkt dizi okuma tekniği, 10kb. a kadar olan bir diziyi okuyabilir. Uzun dizi bilgisi elde edebilmek için, kısa okumaların birbirleriyle birleştirilmelerinde bilgisayara gereksinim duyulur.
Kontiklerin Birleştirilmesi Okumaların ucunda dizilerin üst üste çakışması belirlendiğinde, iki okuma tek bir dizi şeklinde birleştirilebilir
Superkontiklerin Oluşturulması scaffolds olarak da tanımlanmaktadır.
BCM- HGSC
Büyük Genomlar İnsan Genomu, daha büyüktür ve süperkontiklerin bir şekilde birleştirilmesi gerekir. Bu da genetik haritalama ile yapılmaktadır.
Birleştirmeler Sonucunda Genom Üzerinde Yerleştirme Bir dizi etiketi tüm genom boyunca tek olan kısa bir dizidir. Genetik Harita,bir çok dizi etiketini ve onların yerleşimini içermektedir. Böylelikle, etiketlere göre süper kontiklerin genom içinde sıraya dizilmeleri sağlanır.
Primer Yürüme: Genom Dizilemesinin Sonlandırılmasında Bir Yol Eğer bir baz üç okuma ile belirlendiyse kesin olarak tanımlanabilmektedir. Kesin olmayan pozisyonlar da mevcuttur. There are gaps in the Süperkontiklerde ve süperkontikler arasında boşluklar vardır. Primer Yürüme bu bölgelerin daha ileri dizilemesinin yapılmasında kullanılabilir.
Primer Walking Seq 1 primer1 Seq 2 primer2 Time consuming
Yeni Dizileme Metotları 1. MALDI-TOF Mass Spektrometri ile Dizileme 2. Hibridizasyon ile Dizileme 3. Pirodizileme 4. Atomic-Force Mikroskopisi 5. Tek Molekül Fluoresans Mikroskopisi 6. Nanopor Dizileme
MALDI-TOF Mass Spektrometrisi Kullanılarak Dizileme MW spectrum of 33-mer 5 -ACT AAT GGC AGT TCA TTG CAT GAA TTT TAA AAG-3
Hibridizasyon ile DNA Dizilemesi Bu strateji, bilinmeyen etiketli DNA parçasının tüm kısa oligonükleotidlere bağlanmasını (ör: 8-merlik 65,336 kombinasyon ) ve bilinmeyen dizinin bağlanma kalıbından görüntülenmesini İçerir.
Pirodizilemenin Temeli Basamak 1 Bir dizileme primeri tek zincirli, PCR ile çoğaltılmış, DNA kalıbına, hibridize edilir ve DNA polimeraz, ATP sulfurilaz, lusiferaz ve apiraz, enzimleri, adenozin 5 fosfosülfat (APS) ve lusiferin substratları ile inkübasyona bırakılır. Basamak 2 İlk önce dört adet deoksinükleotidtrifosfat (dntp) reaksiyona ilave edilir. DNA polimeraz deoksinükleotid trifosfatların, DNA zincire katılmalarını kataliz eder. Yapıya katılan dntp ile orantılı olarak PPi (pirofosfat) açığa çıkmaktadır.
Basamak 3 ATP sülfürilaz, adenozin 5 fosfosülfat varlığında kantitatif olarak PPi yi ATP ye dönüştürür. Bu ATP molekülü, lusiferaz temelli reaksiyon lusiferinin oksilusiferine dönüşümünü sağlarken, ATP miktarı ile orantılı olarak görünür ışık oluşumu gerçekleşir. Lusiferaz katalizli reaksiyon sonucunda üretilen ışık CCD kamera (charge coupled device) ile belirlenir bir pirogramda pikler halinde görüntülenebilir. Her bir ışık sinyali yapıya katılan nükleotid sayısı ile orantılıdır.
Basamak 4 Bir nükleotid parçalayıcı enzim apiraz, sürekli olarak; yapıya girmeyen dntpleri ve fazla ATP yi parçalar. Parçalama bittiğinde, diğer dntp eklenir. Basamak 5 Her bir işlem için dntplerin eklenmesi bir kez gerçekleştirilir. Doğal deoksiadenozin trifosfat (datp) DNA polimeraz tarafından etkin bir şekilde kullanılmasına rağmen, lusiferaz tarafından tanınmadığından deoksiadenozin alfa-tiyo trifosfat (datpas) kullanılmaktadır. Süreç devam ederken, kalıp DNA zinciri yapılır ve nükleotid dizisi pirogramdaki piklerin oluşturduğu sinyaller ile belirlenir.
Pirodizilemenin Özeti Pirodizileme, DNA nın enzimatik DNA sentezi ile dizilenmesidir, DNA dizisi sentezi sırasında açığa çıkan fotonların oluşturduğu sinyallerin şiddetine göre belirlenir.
Zipper-sequencing of DNA
Polinükleotidlerin Nanopor Dizilemesi Bu yöntemde, tek zincirli polinükleotidlerin ince bir filmdeki nanopor boyunca ilerlemelerini sağlayan elektrik alan sonucu oluşan iyonik akım değişimi görüntülenmektedir.
DNA nın bir yön değiştiren alanda dizilemesi DNA E 2nm E E cos( wt)ˆ i E sin( wt) ˆj
DNA nın Zaman ile Translokasyonu
Bir Dizileme Düzeneği
Sonuçlar - Geleneksel Sanger metodu yavaş, pahalı, ve kesin değildir. İnsan Genom Projesindeki dizileme 15 yıl almış ve 3 trilyon US dolarına mal olmuştur. - Nanopor dizileme daha hızlı, pahalı olmayan, kesin bir yöntemdir. 100 milyon bazın dizilemesi yaklaşık bir gün almaktadır, yüksek oranda kesinlik, örnek serilerinin çok zamanlı incelenmeleri sonucunda sağlanmaktadır.