Kılavuz. G5 Series Embriyo Kültür Medyumları nın David K. Gardner tarafından önerilen kullanımı

Kılavuz G5 Series Embriyo Kültür Medyumları nın David K. Gardner tarafından önerilen kullanımı

2002-2007 Vitrolife AB. Tüm hakları mahfuzdur. Bu kılavuz yalnızca dahili kullanım için çoğaltılabilir, ancak yayınlama amacıyla çoğaltılamaz. Vitrolife logosu, Vitrolife AB nin Avrupa, Amerika ve diğer ülkelerde tescilli ticari markasıdır. Vitrolife Sweden AB Faktorvägen 13 SE-434 37 Kungsbacka İsveç Tel: +46-31-721 80 00 Vitrolife Inc. 3601 South Inca Street Englewood Colorado 80110 ABD Tel: +1-866-848-7687 (866-VITRO US) G5, G5 Series, G5 logosu, GIII, GIII Series, GIII logosu, G-MM, HSA-solution, G-IVF, G-IVF PLUS, G-1, G-1 PLUS, G-2, G-2 PLUS, G-MOPS, G-MOPS PLUS, G-RINSE, G-FreezeKit Blast, G- ThawKit Blast, G-PGD, SpermGrad, HYASE, ICSI, ClearVision ve V-Tip ; Vitrolife AB nin ticari markalarıdır. EmbryoGlue, Vitrolife AB nin tescilli ticari markasıdır.

Kılavuz G5 Series Embriyo Kültür Medyumları nın David K. Gardner tarafından önerilen kullanımı 1. Baskı, Kasım 2007

ii

İçindekiler Giriş...1 Başarı Oranlarını Geliştirme...1 Vitrolife Fertilite Ürünleri...1 Genel...2 Vitrolife Ürünlerinin Açılması...2 Karbondioksit CO 2 Dengelenmesi...3 Medyumlara G-MM veya HSA-solution İlavesi...3 G-MOPS /G-MOPS PLUS Medyumunun Önerilen Kullanımı...5 ph Nasıl Ölçülür?...7 IVF ve Kültür Sistemi...9 Sperm Hazırlama...10 Yüzdürme Yöntemi (Swim-up, Migrasyon)...11 Yoğunluk Gradyan Santrifüj Yöntemi...13 IVF-ET...15 Folikül Aspirasyonu...15 Oosit Tanımlama...16 Oosit Kültürü ve Fertilizasyon...17 İnseminasyon...17 Fertilizasyonun Değerlendirilmesi...17 Pronükleer İnsan Embryolarını Skorlama...19 Kültür Sisteminin Seçilmesi...20 Kültür Sisteminin Hazırlanması...20 Embriyo Kültürü...22 Embriyonun Değerlendirilmesi...25 İnsan Blastokistlerini Skorlama Kriterleri...25 Skorlama Sistemi...27 4AA olarak sınıflandırılan bir blastokist örneği....28 Blastokist Değerlendirme Tablosu...28 Blastokist Çizelgesi (örnek)...29 Embriyo Transferi...30 Embriyoların Yerleştirilmesi...30 Katetere Yükleme Yapma...32 Mikromanipülasyon...33 ICSI için Oositlerin Soyulması...34 ICSI Prosedürü...36 Zor ICSI Vakaları...38 Testiküler Biyopsi...38 Embriyo Biyopsisi...39 Embriyo Kriyoprezervasyonu...41 Donanım Listesi...41 Bölünme Evresindeki Embriyoların Kriyoprezervasyonu...43 Bölünme evresindeki embriyolar için dondurma programı örneği...43 Bölünme evresindeki embriyolar için çözme Programı...45 Blastokist Evresindeki Embriyoların Kriyoprezervasyonu...46 Blastokist evresindeki embriyolar için dondurma programı örneği...47 Blastokist evresindeki embriyolar için Çözme Programı...48 Kalite Kontrol Programı...50 Validasyon ve kalibrasyon...50 Fizikokimyasal Testler...50 Biyolojik Testler...51 İşlevsel Testler...51 Vitrolife dan G5 Series ve ilgili ürünler...53 G5 Series : Medyumların İçerikleri...55 Vitrolife dan Swemed Ürünleri...56 Önlemler ve Uyarılar...57 Ek Bilgiler...58 iii

Giriş Başarı Oranlarını Geliştirme Vitrolife, kendini İnsanlarda Yardımla Üreme alanında başarı oranlarını geliştirmeye adamıştır. Üreme fizyolojisi konusundaki uzun süreli araştırmalar ve embriyo gelişimi hakkındaki çalışmalar, günümüzün en gelişmiş IVF medyumlarının üretilmesini sağlamıştır. Bu kılavuz, Vitrolife ın G5 Series ürünlerinin Dr David K. Gardner tarafından kullanım şeklini anlatmaktadır. Yardımla üreme teknolojisinin uygulanmasında birçok farklı yöntemin olduğu bilinmektedir. Aşağıda anlatılmış olan yöntemler, bizim ürünlerimizle yüksek başarı oranları sağlamıştır. Vitrolife Fertilite Ürünleri IVF Medyumları Vitrolife, en yüksek etkinlik ve güvenliğe sahip IVF medyumlarını sunmaktadır. Her bir LOT, müşterilere sunulmadan önce Fare Embriyosu Testi (MEA) dahil birçok Kalite Kontrol testinden geçer. Satışa sunulan her bir LOT ile birlikte bir Analiz Sertifikası verilir. Kalite Kontrol ün yanı sıra kalite güvence işlemleri (ISO 13485:2003 ve 21 CFR Kısım 820:QSR) tüm LOT ların birbiriyle tutarlı olmasını sağlar. Vitrolife Fertilite Ürünleri nin imalatında kullanılan tüm hammaddeler, dünya piyasalarında mevcut olan en iyi ürünlerden seçilir. Tüm hammaddeler, medyumların imalatında kullanılmadan önce tek tek katı kalite kontrol prosedürleri ve MEA dan geçirilirek değerlendirilir. Vitrolife tarafından üretilen Swemed IVF ürünleri Vitrolife, IVF uygulamalarında kullanılan aspirasyon iğneleri, denudasyon pipetleri, ICSI pipetleri, biyopsi pipetleri ve embriyo transfer kateteri gibi birçok ürünü de sağlamaktadır. Kültür medyumlarında olduğu gibi, bu ürünler de tek tek katı kalite kontrol testlerine tabi tutulmakta ve kültür medyumlarıyla aynı Kalite Kontrol standartlarında üretilmektedir. Yeni insan yaşamının yaratılmasının mümkün olan en iyi ortamı hak ettiği konusunda bizimle hemfikir olacağınızdan eminiz. Size en yüksek kalitedeki ürünleri getirmeye kendimizi adadık. 1

Genel Vitrolife Ürünlerinin Açılması Vitrolife ürünleri elinize geçtiğinde bu ürünlerin özel bir şekilde ambalajlandığını fark edeceksiniz. Bunun özel nedenleri vardır: Tüm Vitrolife ürünleri herhangi bir hasarı ortaya çıkaracak şekilde kapatılmıştır. Ambalaj, gözle görülür bir belirti olmadan şişeye giriş olmasını engeller. Ambalajda kullanılan hiçbir malzeme toksik değildir ve dolayısıyla nihai ürüne hiçbir şekilde zarar vermez. PETG şişeler, vidalı kapaklar, özel olarak tasarlanmış etiketler ve farmasötik contalama, ambalajda meydana gelebilecek hasarı ortaya çıkarmayı amaçlayan bu protokolün parçalarıdır. G5 Series PLUS ürünleri G-IVF hariç, 5 mg HSA/ml içerir. G-IVF PLUS 10 mg HSA/ml içerir. Diğer hiçbir medyum protein içermez (etikette aksi yönde bir işaret bulunmadığı sürece) ve medyumlara şişe etiketleri doğrultusunda, G-MM (rekombinant insan albümini) ya da HSA-solution (insan serum albümini) eklentisi yapılmalıdır. 4. Sayfadaki Tabloya bakınız. Temel Unsurlar Herhangi bir ürüne el sürmeden önce ellerinizi yıkayın ve dezenfekte edin. Kan, foliküler sıvı ya da semen gibi biyolojik bir sıvıyı işleme almadan önce gerekli önlemleri alın. Uygulama 1. Tüm ürünleri temiz laminer hava akımlı kabin (LAF) içinde açın. 2. Şişeleri LAF kabinine getirmeden önce, şişelerin dışının temiz olduğundan emin olun. Şişelerin pamuksuz bezle ve etanolla silinmesi tavsiye edilir. 3. Ürünün kullanmak istediğiniz ürün olduğundan emin olun ve son kullanma tarihini kontrol edin. Daha önce açılmadığını gösteren emniyet bandını sıyırın ve atın. 4. Kapağı açın ve ağzı aşağıya bakacak şekilde steril bir petri kabına yerleştirin. 5. Steril, toksik olmayan bir pipet kullanarak istediğiniz hacmi alın. Kapağı yerine takın ve sıkıca kapatın. Kapağın iç kısmına dokunmayın. 6. Ürünü mümkün olduğunca soğuk tutunuz. Şişeleri buzdolabından çıkarır çıkarmaz kaplarınızı hazırlayın. Medyum şişeleri, kapların ya da tüplerin hazırlanmasından sonra ortam sıcaklığında uzun süre bırakılmamalıdır. 2

Aseptik çalışma teknikleri, enfeksiyon ya da kontaminasyona neden olabilecek herhangi bir mikroorganizmanın bulunmadığı ortamda yapılan çalışma anlamına gelir. DİKKAT Şişenin içeriğini dökerek boşaltmayın, çünkü kapak açıldıktan sonra şişenin ağzı sterilitesini kaybetmiş olabilir. Karbondioksit CO2 Dengelenmesi İnsan embriyolarının kültürlenmesinde optimal ph değeri 7.2 ile 7.4 arasındadır. Doğru ph düzeyini elde edebilmek için tüm G5 Series medyumları (G-MOPS /G- MOPS PLUS, G-PGD G-Freezekit Blast, G-Thawkit Blast haricindekiler) %6 CO 2 ortamında dengelenmelidir. Bu, deniz seviyesinde veya deniz seviyesine yakın rakımdaki laboratuarlar için bir genel önermedir. Yüksek rakımdaki laboratuarlarda CO 2 yüzdesi her 1000 metrede yaklaşık yüzde 0,6 oranında yükseltilmelidir. İnkübatör içinde sağlanan ph düzeyi, ph ölçen cihazlarla daima doğrulanmalıdır. Bkz: Sayfa 10 Medyumlara G-MM veya HSA-solution İlavesi Bu kılavuza eklentili kelimesi sıklıkla kullanılmaktadır. Eklentili kelimesi, bu bölümde tarif edildiği gibi G-MM ya da HSA-solution eklenmesi veya G5 Series PLUS ürünler anlamına gelmektedir. G5 Series PLUS medyumları ve EmbryoGlue albümin eklenmesine ihtiyaç duymamaktadır. PLUS olarak tasarlananlar dışındaki tüm G5 Series kültür medyumları, protein içermemektedir ve bu medyumlara aşağıdaki tabloda listelenmiş uygun konsantrasyonlarda G-MM ya da HSA-solution eklenmelidir. Protein eklentisini seçerken İnsan Serum Albümini nin (HSA) kandan türetilen bir madde olduğunu ve henüz bilinmeyen ya da tanımlanmayanlar da dahil olmak üzere, insan için patojenik ajanlar içerebileceğini unutmamak gerekir. Dolayısıyla, HSA kullanırken bu tür bulaşıcı ajanların aktarılması riski tamamen ortadan kaldırılamaz. HSA'nın yerine kullanılabilecek rekombinant insan albümini içeren G- MM imalat sürecinden gelen son derece küçük miktarda maya antijenleri (0.15 ppm'den az) içerebilir. Rekombinant insan albümininin, imalat sürecinde hiçbir hayvan ya da insan türevli hammadde kullanılmadığı için, ürünün biyosentetik karakteri sayesinde tüm insan ya da hayvan kaynaklı bulaşıcı ajanlar engellenmiştir. G5 Series medyumları, G-IVF istisnası dışında % 5 oranında G-MM ya da HSAsolution içermelidir (9.5 ml ye eklenmiş 0.5 ml). G-MM nin nihai konsantrasyonu 2.5 mg/ml ve HSA nın nihai konsantrasyonu 5 mg/ml olacaktır. 3

G-IVF %10 oranında G-MM ya da HSA-solution içermelidir (9,0 ml ye 1,0 ml). G- MM nin nihai konsantrasyonu 5 mg/ml ve HSA nın nihai konsantrasyonu 10 mg/ml olacaktır. İlave yapılacak medyum öncelikle steril, toksik olmayan doku kültürüne uygun kalitedeki tüp ya da şişelere bölünmelidir. Herhangi bir parçacığın ya da toksik maddenin kalmadığından emin olmak için, tüm kapların G-RINSE kullanılarak önceden durulanması gerekir. G-MOPS, G-1,G-2,G-PGD için albümin eklenmesi Medyum (ml) G-MM ya da HSA-solution (ml) Nihai hacim (ml) 9.5 0.5 10.0 19.0 1.0 20.0 28.5 1.5 30.0 38.0 2.0 40.0 47.5 2.5 50.0 57.0 3.0 60.0 66.5 3.5 70.0 76.0 4.0 80.0 85.5 4.5 90.0 95.0 5.0 100.0 G-IVF için albümin eklenmesi Medyum (ml) G-MM ya da HSA-solution (ml) Nihai hacim (ml) 9.0 1.0 10.0 18.0 2.0 20.0 27.0 3.0 30.0 36.0 4.0 40.0 45.0 5.0 50.0 54.0 6.0 60.0 63.0 7.0 70.0 72.0 8.0 80.0 81.0 9.0 90.0 90.0 10.0 100.0 G-FreezeKit Blast, G-ThawKit Blast için albümin eklenmesi aşağıdaki gibidir (lütfen 47-50. sayfaları okuyunuz) : 9,0 ml Freeze/Thaw çözeltisi + 1,0 ml G-MM ya da HSA-solution 4

Kriyoprezervasyon çözeltilerine albümin, direkt olarak kap içinde eklenebilir. Her kriyoprezervasyon çözeltisinden 900 μl hacmi ayrı ayrı kaplara koyun + 100 μl G- MM ya da HSA-solution ekleyin. Medyumlarınızı, öngörülen günlük kullanımız kadar eklentili olarak hazırlamanız tavsiye edilir. G-MOPS /G-MOPS PLUS Medyumunun Önerilen Kullanımı G-MOPS /G-MOPS PLUS, CO 2 inkübatörünün dışında gamet ve embriyo manipülasyon medyumu olarak kullanılır. Temel Unsurlar Oositleri ve embriyoları, CO 2 inkübatörünün dışında çalışırken, gereksiz strese tabi tutmamak için mümkün olduğunca hızlı çalışmak gereklidir. Oositleri ve embriyoları, bir kaptan diğerine aktarırken ve ICSI uygularken kapların kapaklarının açılması gerektiği için, bir süre sonra ph'ın yanı sıra sıcaklık ve osmolalite de değişebilir. Bu, G-MOPS /G-MOPS PLUS da dahil olmak üzere tüm medyumlar için geçerlidir. ph'ın Önemi G-MOPS /G-MOPS PLUS; MOPS tamponlu medyumlardır ve +37 C'da oda atmosferinde kullanılmalıdır. Bu medyumu CO 2 ortamına maruz bırakmayın, çünkü ph, olması gereken değer aralığının altına düşebilir. Ayrıca G-MOPS /G-MOPS PLUS ı kaplarken kullanacağınız parafin yağı, CO 2 inkübatöründe dengelenmiş olmamalı, sadece ısıtılmalıdır. Sıcaklığın Önemi Oositler ve embriyolar her zaman +37 C'da tutulmalıdır. G-MOPS /G-MOPS PLUS'ın bir tüp/kap içindeki sıcaklığının +37 C olduğundan emin olmak için ısıtma bloğunda (tüp) ya da ısıtıcı tablada (kap) iken örnek medyum içeren tüpün/kabın içine yerleştirilmiş bir termometre kullanarak prosedürü doğrulamanız tavsiye edilir. Buradaki amaç, kullanımdan önce G- MOPS /G-MOPS PLUS 'ın +37 C da olduğundan emin olmaktır. Isıtıcı cihazın parçaları bu amacı gerçekleştirmek için ayrı ayrı ayarlanmalıdır. Osmolalitenin Önemi 5

Osmolalitedeki değişiklikleri önlemek için, tüpler mümkün olduğunca doldurulmalı ve kapakları sıkıca kapatılmalıdır. Kaplar ise yağ ile kaplanmalı ve kullanılmadıklarında kapakları kapalı tutulmalıdır. Oosit aspirasyonu için G-MOPS Oosit aspirasyonu için G-MOPS a herhangi bir eklenti yapılmamalıdır. Kullanımdan önce G-MOPS 'un uygun şekilde +37 C'a kadar ısıtıldığından emin olmak için ağzı sıkı şekilde kapatılmış bir şişe içerisindeki G-MOPS, CO 2 'siz bir ısıtma inkübatörüne yerleştirerek ön ısıtmaya tabi tutulmalıdır. Şişenin kapağının, osmolalitedeki değişiklikleri engellemek üzere sıkı şekilde kapatılmış olması gereklidir. G-MOPS şişesinin +37 C'a ulaşması 4 saat sürebilir. G-MOPS şişesinin ısıtıcı inkübatörden alınıp her kullanıldığında kapağının sıkıca kapatıldığından emin olun. Isıtılan, ama önerilen süre içinde kullanılmayan G- MOPS 'u atın. Medyum, kapağı sıkıca kapatılmış tüpte ise aynı günün sonuna kadar, 1 ml den az hacme sahip ve yağ ile kaplanmamış ise 60 dakika içerisinde, yağ ile kaplanmış ise uygun ısı değerleri korunduğu takdirde 2 saate kadar kullanılabilir. Gamet ve Embriyo manipülasyonu için G-MOPS Gamet ve embriyoların manipülasyonunda kullanılacak G-MOPS, eklentili olmalıdır. Laminar akımlı kabin içinde toksik olmayan test tüplerine G-MOPS /G- MOPS PLUS ı pipetleyin. Eğer G-MOPS kullanıyorsanız uygun miktarda G-MM ya da HSA-solution eklentisi yapın. Osmolalitedeki değişikliklerden kaçınmak için tüpün doldurulup kapağının sıkı bir şekilde kapatılması gereklidir. Tüpü, karbondioksitsiz bir ısıtma inkübatörüne ya da yeterince kalibre edilmiş bir ısıtma bloğuna yerleştirin. Isıtılmış kültür kabına ısıtılmış G-MOPS /G-MOPS PLUS pipetleyin. Osmolalitedeki değişikliklerden korunmak için medyumu hazırladıktan sonra mümkün olan en kısa sürede kullanın. Kapta 1 ml den az hacimde medyum varsa ve yağ ile kaplanmamış ise 60 dakika içerisinde, kap yağ ile kaplanmış ise uygun ısı değerleri korunduğu takdirde 2 saate kadar kullanılabilir. Isıtılmış G-MOPS /G-MOPS PLUS'ı, karbondioksitsiz bir ısıtma inkübatörüne veya ısıtıcı tablaya yerleştirilmiş olan bir kültür kabına pipetleyin ve kabın kapağını kapalı tutun. Osmolalitedeki değişikliklerden kaçınmak için medyumu yağ ile kaplayın veya hazırlama sonrası 60 dakika içinde kullanın. Bu yönerge 1 ml ve üzeri hacimler için geçerlidir. Kültür kabının içindeki sıcaklığın +37 C olmasını temin için ısıtılmış bir raf üzerindeki G-MOPS /G-MOPS PLUS içeren kültür kabının içine yerleştirilecek bir termometre kullanmak suretiyle prosedürü teyit etmek gereklidir. Isıtıcı tablanın sıcaklık ayarı, kültür kabındaki medyumun sıcaklığı +37 C olacak şekilde ayarlanmalıdır. 6

ÖNEMLİ G-MOPS /G-MOPS PLUS ın kültür kaplarına taşınmadığından emin olabilmek için G-MOPS kabı ile kültür kapları arasında yıkama aşamaları uygulayın. Yıkama prosedürü en az 2 aşamalı olmalı ve her aşamada 1 ml kültür medyumu içerisinde yıkamayı içermelidir. Yıkama kapları 5 oosit veya embriyodan sonra değiştirilmelidir. ph Nasıl Ölçülür? Giriş ph'ın ölçümü, cam membranlı elektrod ve modern cihazlar kullanılarak kolayca yapılabilir. Bununla birlikte olası en yüksek doğruluğun elde edilmesi amacıyla dikkat edilmesi gereken bazı unsurlar vardır. Bu, özellikle çözünmüş gaz içeren ya da yüksek protein içeriğine sahip çözeltilerde ph ölçülürken geçerlidir. Temel Unsurlar Entegre referans elektrodu ve sıcaklık ölçümü yapabilen yarı mikro ya da mikro elektrod kullanın. Cihazı, otomatik sıcaklık kompansasyonu yapacak şekilde ayarlayın. İçlerinden en az birinin test edilen çözeltinin ph ına yakın bir ph'a sahip olduğu yeni tampon çözeltiler kullanın. Her test arasında tampon çözeltileri değiştirin. Eğim ve ofseti test etmek suretiyle elektrodun gerektiği şekilde çalışıp çalışmadığını kontrol edin. Bozulma belirtileri başlar başlamaz elektrodu değiştirin. Bir ph elektrodunu 12 aydan fazla kullanmak nadiren mümkün olur ve genelde iki ya da üç ayda bir değiştirmek gerekir. Elektrodu nötr bir tampon çözelti ya da özel depolama çözeltisi içinde saklayın. Cihazı her kullanımdan önce kalibre edin. Uygulama - Önerilen ph Ölçüm Prosedürü (Kesin prosedür kullanılan cihaza ve örneğin yapısına bağlı olarak değişebilir) 1. Elektrodu depolama çözeltisinden alın, durulayın ve ph 7.00 tampon çözeltisi içine yerleştirin. Elektroda hava girişini bloke eden tıpa ya da tüpü çıkarın. 2. Elektrodu ph 7.00 tampon çözeltisi içinde bir ila iki saat bekletin. Eğer elektrod geceleyin ph 7.0 tampon çözeltisinde bekletilmişse bu süre kısalabilir. 7

3. Biri ph 7.00'a yakın ve diğeri de örneğin ph 10.00 olan iki yeni tampon çözelti kullanarak elektrodu kalibre edin. 4. Elektrodun eğim ve ofsetinin elektrod imalatçısının belirttiği sınırlar dahilinde olup olmadığını teyit edin. Eğimin, teorik değerin % 95'i ile 102'si arasında olmasını ve ph 7.00'daki ofsetin önceki kalibrasyon sırasında edinilen değerden ±4 mv'dan fazla farklılık göstermemesini tavsiye ederiz. 5. Kalibrasyonun uygun şekilde yapıldığından emin olmak için, ph'ı yaklaşık 8.00 olan bir tampon çözeltisini test edin. Test sıcaklığında ölçülen ile belirtilen ph'ı karşılaştırın. Ölçülen ph, belirtilen ph'dan ±0.05 birimden fazla farklılık göstermemelidir. 6. Elektrodu, örneğin test sırasında sahip olacağı sıcaklığa yakın sıcaklıktaki distile suya yerleştirin. 7. Örneği gerekli sıcaklık ve gaz kompozisyonunda dengeleyin. Karbondioksit ile dengeleme 16 saat sürebilir. 8. Elektrodu distile sudan çıkarın, ıslaklığını gidermek için elektrodun ucunu temiz bir kağıt mendil ile silin. Elektrodu vakit geçirmeksizin dengelenmiş medyum içine yerleştirin. Referans elektrodunun cam bombesi ve temas noktası dengelenmiş medyumla kaplanmalıdır. Sinterli Disk Penceresi Manşon derzi 9. ph kararlı hale gelir gelmez ph cihazındaki değeri okuyun. Eğer test medyumu karbondioksit ile dengelenmiş ise tüm test prosedürü, medyumun inkübatörden çıkarılmasından itibaren 30 saniye içinde tamamlanmalıdır. Eğer test daha uzun sürerse karbondioksit örnekten atmosfere saçılacak ve medyumun ph ı olduğundan daha yüksek gözükecektir. 10. Ekstra bir önlem olarak mevcut koşullarda bulunan ve ph'ı bilinen bir kontrol medyumu bilinmeyen örnek ile paralel olarak test edilebilir. Böylelikle tüm test prosedürünün doğru yapılıp yapılmadığı teyit edilebilir. 11. Kalibrasyon verileri de dahil olmak üzere testten elde edilen tüm bilgileri kaydedin. 8

IVF ve Kültür Sistemi IVF için kültür sistemini değerlendirirken aralarında tercih yapılabilecek çok sayıda seçeneğin olduğu bilinmektedir. Bu kılavuz, ürünlerimiz için başarısı ispatlanmış yöntemleri anlatmaktadır. Temel Unsurlar Kültür sistemlerinizi verimlilik, basitlik ve yeniden üretilebilirlik kriterlerine göre seçin. Kendinizi organize edin ve önceden hazırlanın. Kullanacağınız sarf malzemeleri, toksik olmayan, steril ve sadece embriyo kültürüne özel kalite kontrolünden geçmiş ürünlerden seçilmelidir ve kullanılan tüm ürünler ve uygulanan tüm prosedürler not edilmelidir. İşlemlerinizde tutarlılık sağlamak için protokollerinize sadık kalın. Tüm ekipmanlarınızın bakımının doğru şekilde yapıldığından ve düzenli olarak kontrol edilip kalibre edildiğinden emin olun. Tüm prosedürler temiz ve bu iş için yapılmış bir çalışma ortamında (LAF kabini) yapılmalıdır. Aseptik çalışma teknikleri kullanın. Medyumları kullanan tüm elemanlarınızın kalifiye olmasını ve eğitim protokollerinizin tutarlı olmasını sağlayın. Biyolojik sıvılara dokunurken mutlaka toksik olmayan eldiven giyin. İşleme başlamadan önce hastanın kimliğini kontrol edin ve tüm malzemeleri etiketleyin. 9

Sperm Hazırlama IUI, IVF ve ICSI teknikleri için kullanılmadan önce motil sperm hücreleri, seminal plazma, ölü sperm ve diğer hücrelerden ayrıştırılır. Bu uygulama farklı şekillerde yapılabilir. Hangi semen hazırlama yönteminin kullanılacağı konusunda karar, hastanın geçmişi, önceki semen analizleri ve mevcut örneğin muayenesine göre verilir. Göz önüne alınacak başka bir husus da fertilizasyonun IVF ile mi yoksa ICSI ile mi yapılacağıdır. IVF de inseminasyon için daha fazla sperme ihtiyacınız olacaktır. Hazırlama yöntemleri, spermlerin hareket yeteneklerine göre yalnızca canlı spermleri, ya da spermlerin yoğunluklarına göre yalnızca olgun spermleri seçer. Eğer sperm sayısı ve hareket yeteneği yeterli ise yüzdürme yöntemi(swim-up, migrasyon) uygundur. Eğer semen kalitesi kötü ise ve fazla sayıda başka hücre içeriyorsa, yoğunluk gradyan santrifüj yöntemi tercih edilir. Toplam verim açısından, spermin yeteneğini geri kazanması, gradyan santrifüjü yönteminde, yüzdürme yönteminden daha etkindir. Bununla birlikte, bazı durumlarda hareket yeteneği yüzdesi, yüzdürme yöntemiyle sperm hazırlamada daha yüksek olabilir. Temel Unsurlar Sperm hazırlama temiz, aseptik çalışma alanında yürütülmelidir. Semen örneklerine dokunurken toksik olmayan, tozsuz eldivenler ve koruyucu gözlükler giyilmelidir. Tüm örnekler uygun, steril, toksik olmayan kaplarda toplanmalıdır. Semen örneğinin, hazırlıktan en fazla bir saat önce toplanması tavsiye edilir. Semen örneği soğuk ve sıcaktan korunmalıdır. Hastanın kimliğinin belirlenmesi konusunda kapsamlı bir protokol de dahil olmak üzere tüm laboratuar prosedürleri uygulanmalıdır. Spermin hazırlanmasında steril, toksik olmayan tüp, iğne ve pipetler G- RINSE ile durulandıktan sonra kullanılmalıdır. 10

Yüzdürme Yöntemi (Swim-up, Migrasyon) Uygulama Bu yöntem sperm sayısı ve spermlerin hareket yeteneklerinin iyi olduğu semen örneklerinde kullanılmalıdır. 1. Semenin sıvılaşması için yaklaşık 20 dakika bekleyin. Eğer örnek sıvılaşmazsa örneği 23 gauge ölçüsünde iğneden ya da toksik olmayan dar bir Pasteur pipetinden geçirmeniz gerekir. 20 dakika sıvılaştırın. 2. Yıkama yöntemini teyit etmek için sperm örneğini mikroskobik değerlendirmeye tabi tutun. 3. Bir test tüpüne hastanın adını yazın. Eğer semen kalitesi iyi değilse birden fazla tüp hazırlanabilir. 4. Pipetle 1.0 ml semeni tüpe koyun. Önceden dengelenmiş eklentili G- IVF /G-IVF PLUS dan 2.0 ml yi dikkatli bir şekilde semenin üzerine koyun. Yüzdürme tüpünü +37 C daki % 6 CO 2 içeren inkübatöre 30-60 dakikalığına eğik olarak yerleştirin. 30-60 dakika +37 C ve % 6 CO 2 de dengeleyin. G-IVF /G-IVF PLUS Semen 5. Alt kısımdaki semene dokunmadan üst kısımdaki medyumu aspirasyon yöntemiyle alın ve temiz bir tüpe nakledin. Dengelenmiş eklentili G- 11

IVF /G-IVF PLUS dan 5.0 ml ekleyin, karıştırın ve 300-600 g kuvvetinde 10 dakika santrifüjleyin. Üst kısımdaki medyumu aspire edip atın. G-IVF /G- IVF PLUS ile dilüe edin. Santrifüjleyin. 6. Süpernatanı aspirasyon yöntemiyle alın ve peleti dengelenmiş eklentili G- IVF /G- IVF PLUS ının 5.0 ml si içinde süspanse edip tekrar santrifüjleyin. Süpernatanı atın. Yıkamayı tekrar edin. 7. Süpernatanı atın ve tüm peletleri birleştirin. Birleştirilmiş peleti örnek kalitesine göre dengelenmiş eklentili G- IVF /G- IVF PLUS ın 0.5-1.0 ml si içinde yeniden süspanse edin. Peleti az miktarda G- IVF /G- IVF PLUS içinde süspanse edin. 8. Yıkanan örnekteki spermlerin hareket yeteneğini ve konsantrasyonunu belirleyin. 9. Yıkanmış örneği dengelenmiş eklentili G-IVF /G-IVF PLUS içerisinde dilüe ederek nihai konsantrasyonun 75.000 200.000 motil sperm/ml olmasını sağlayın. 10. 0.5-1.0 ml sperm süspansiyonu içeren durulanmış inseminasyon kapları hazırlayın ve en az 2 saat +37 C ve % 6 CO 2 de dengeleyin. 12

Alternatif olarak; dengelenmiş kaplardaki oositlere dengelenmiş sperm süspansiyonu ekleyin. İnseminasyonu 0.5-1.0 ml lik bir hacimde ve yağsız olarak yapmanız tavsiye edilir. Eğer yağ altında inseminasyon yapılacaksa en az 100 μl lik damlacıklar yapılması tavsiye edilir. Yoğunluk Gradyan Santrifüj Yöntemi Bu yöntem sperm kalitesi gözetmeksizin tüm sperm örneklerinin yıkanmasında kullanılabilir. SpermGrad, izotonik tuz çözeltisi içinde yer alan silan kaplı, koloidal silika parçacıklarından oluşan bir çözeltidir. SpermGrad dan farklı dilüsyonlar hazırlanarak farklı yoğunluklar elde edilir. Farklı yoğunluklardaki bu çözeltilerin bir santrifüj tüpünde katmanlanması ile bir yoğunluk gradyanı oluşturulur. Farklı yüzme yoğunluklarına sahip hücreler ve diğer parçacıklar, daha yüksek bir yoğunluğa sahip bir çözeltiye ulaşıncaya kadar çökelecektir. Santrifüj bu çökelmeyi hızlandırır. Yaygın olarak, % 90 ve % 45 lik, iki basamaklı SpermGrad gradyanı kullanılır. Sıkı biçimde paketli DNA ya sahip olan olgun spermin, % 90 lık SpermGrad dan daha yüksek bir yoğunluğu olduğu için bu spermler bu katmandan çökelir ve tüpün tabanında bulunurlar; öte yandan olgun olmayan ve ölü spermler de dahil olmak üzere diğer hücreler % 90 ya da % 45 lik ara yüzde çökelmeyi bırakırlar. SpermGrad ın, % 90 ve % 45 lik gradyanlar için G- IVF /G- IVF PLUS içinde dilüe edilmesi tavsiye edilir. G- IVF e G-MM ya da HSA-solution eklentisi yapılmalıdır. G- IVF /G- IVF PLUS kullanım öncesi +37 C da ve % 6 CO 2 ile dengelenmelidir. Uygulama 1. % 90 ve % 45 lik stok çözeltileri elde edecek şekilde SpermGrad ı eklentili G- IVF /G- IVF PLUS ile ayrı tüplerde karıştırın. % 90 lik stok çözelti için 9.0 ml SpermGrad ı 1.0 ml eklentili G- IVF /G- IVF PLUS ile karıştırın. % 45 lik stok çözelti için 4.5 ml SpermGrad ı 5.5 ml eklentili G- IVF /G- IVF PLUS ile karıştırın. Çözeltileri iyice karıştırın ve steril, toksik olmayan tüplerde ya da steril doku kültürü şişelerinde depolayın. Kullanıma kadar etiketleyin ve buzdolabında saklayın. Her bir sperm hazırlığı için gerekli miktarları taksim etmek üzere mutlaka steril, toksik olmayan pipet kullanın. Stok çözeltileri tarihle birlikte etiketlenmeli ve önerilen süre boyunca (şişelerin üzerindeki son kullanma tarihine bakınız) saklanmalıdır. Kullanım öncesi çözeltilerin oda sıcaklığına gelecek şekilde ısınmasına izin verin. 2. Yoğunluk gradyanı, hastanın adı yazılmış 2 yada 4 adet steril, konik, toksik olmayan, durulanmış santrifüj tüpü içinde katman-laştırılmalıdır. Önce 1.5 ml % 90 lık çözeltiyi tüpe pipetleyin ve sonra bunun üzerine 1.5 ml % 45 lik çözeltiyi yavaşça pipetleyin. Son olarak, 1,0 ml semen örneğini nazikçe en üste katman halinde koyun (A). 2-4 yoğunluk tüpü hazırlayın. Eğer semen örneğinin kalitesi iyi değilse gradyanın üzerine konulacak semen miktarı 2 ml ye kadar arttırılalabilir. Eğer semen örneğinin kalitesi normal ise semen 13

hacmini azaltın. Çok fazla semenin eklenmesi ayrışmanın iyi olmamasına yol açar. Semen Gradyan solüsyonları ve semeni konik santrifüj tüpüne katmanlar halinde pipetleyin. 300-600 g kuvvetinde 20 dakika santrifüjleyin. % 45 % 90 3. Daha sonra tüp, 300-600 g kuvvetinde 10-20 dakika santrifüjlenir. 4. En üstteki iki katmanı alın ve tüp duvarında herhangi bir kalıntı bırakmamaya özen gösterin (B). Sperm peletini, mümkün olduğunca az miktarda % 90 lık çözeltiyle birlikte, 5 ml dengelenmiş eklentili G- IVF /G- IVF PLUS içeren steril konik tüpe nakledin. 5. 300-600 g kuvvetinde 10 dakika santrifüjleyin. 6. Süpernatanı atın ve yıkamayı tekrar edin (C). İkinci yıkamadan sonra pelet, 1 ml dengelenmiş eklentili G- IVF /G- IVF PLUS içinde yeniden süspanse edilir (D). Daha sonra yıkanan örnek hareket yeteneği ve konsantrasyon açısından değerlendirmeye alınır. Üst iki katmanı atın. Peleti temiz bir tüpe alın. Peleti G- IVF /G- IVF PLUS ile yıkayın. TEKRARLAYIN Peleti az miktarda G- IVF /G- IVF PLUS içinde süspanse edin. Pelet 7. Yıkanmış örneği dengelenmiş eklentili 1.0 ml G- IVF /G- IVF PLUS içerisinde dilüe ederek nihai konsantrasyonun 75.000 200.000 motil sperm/ml olmasını sağlayın. 8. 0.5-1.0 ml sperm süspansiyonu içeren durulanmış inseminasyon kapları hazırlayın ve en az 2 saat +37 C ve % 6 CO 2 de dengeleyin. Alternatif olarak; dengelenmiş kaplardaki oositlere dengelenmiş sperm süspansiyonu ekleyin. İnseminasyonu 0.5-1.0 ml lik bir hacimde ve yağsız olarak yapmanız tavsiye edilir. Eğer yağ altında inseminasyon yapılacaksa en az 100 μl lik damlacıklar yapılması tavsiye edilir. 14

IVF-ET Vitrolife, embriyo gelişiminin her evresi için farklı kültür medyumları geliştirmiştir. G-IVF /G-IVF PLUS, in-vitro fertilizasyon için kullanılmalıdır. Erken evredeki embriyoların bölünme ve kültürü için G-1 /G-1 PLUS kullanılmalıdır. 3. günden blastokist evresine kadar kültür için G-2 / G-2 PLUS kullanılmalıdır. ICSI den sonra embriyolar doğrudan G-1 /G-1 PLUS içerisine yerleştirilmelidir. Embriyolar, evreden bağımsız olarak, uterusa EmbryoGlue ya da eklentili G-2 /G-2 PLUS içinde transfer edilmelidir. Folikül Aspirasyonu Oosit toplama prosedürünün amacı, mümkün olduğunca fazla sayıda oositi mümkün olduğunca hızlı biçimde toplamak ve bu oositlerin fizyolojik olmayan koşullarda bulunma süresini en aza indirgemektir. Önemli parametreler; sıcaklık, osmolalite ve ph dır. Fizyolojik şartlardan herhangi bir şekilde sapılması, oositin döllenme ve implantasyon öncesi gelişim yeteneği üzerinde zararlı etkilere yol açabilir. Temel Unsurlar 0. gün, oosit toplama günü olarak tanımlanır. Hastanın kimliğini kontrol edin ve devam etmeden önce kültür kapları ve pipetlerin etiketlerini kontrol edin. Tüm yüzeylerin ısıtıldığından ve oositlerle temas edecek tüm malzemelerin steril olduğundan, toksik olmadığından ve doku kültürü kalitesinde olduğundan, tercihen fare embriyosu testinden geçtiğinden emin olun. Oosit aspirasyonu genellikle çift ya da tek lümeni olan ultrason kılavuzlu bir iğne kullanılarak gerçekleştirilir. Önerilen aspirasyon iğneleri için Sayfa 57 deki Vitrolife dan Swemed Ürünleri den V-Tip Folikül Aspirasyon İğneleri ne bakınız. İğne lümenindeki negatif basınç, çoğunlukla regüle edilmiş bir aspirasyon pompası ile sağlanır. Yüksek ve kontrolsüz negatif basınçlar oositlere zarar verebilir. Isıtılmış G-MOPS, prosedür için oosit durulama sıvısı olarak kullanılır. G-MOPS, oda atmosferinde ph ı korumak üzere MOPS ve sodyum bikarbonat ile tamponlanarak modifiye edilmiş G-1 medyumudur. Foliküler sıvıdaki yüksek protein içeriği nedeniyle, aspirasyonla toplama ve folikül flushing için ön ısıtılmış G-MOPS, proteinsiz olarak kullanılabilir. Eklentili G- IVF /G- IVF PLUS içinde inkübasyondan önce oositlerin yıkanması için, ön ısıtılmış ve eklentili G-MOPS /G-MOPS PLUS kullanılmalıdır. Maksimum beş folikül için bir yıkama kabı hazırlamak tavsiye edilir. 15

Uygulama 1. G-RINSE i % 6 CO 2 ve +37 C da öndengeleyin. 2. Oosit yıkama için G-MOPS PLUS ın ısıtılması: Önceden durulanmış tüplere medyumu pipetleyin. Tüpün ağzını sıkıca kapatın ve CO 2 içermeyen +37 C daki ısıtıcı inkübatörünüze yerleştirin. 3. Folikül yıkamak için eklentisiz G-MOPS un ısıtılması: Önceden durulanmış tüplere medyumu pipetleyin. Tüpün ağzını sıkıca kapatın ve CO 2 içermeyen +37 C daki ısıtıcı inkübatörünüze yerleştirin. Kullanmadan önce medyum sıcaklığının +37 C olduğundan emin olun. 4. G-RINSE i kullanarak iğne lümenini ve hortumları durulayın ve durulama sıvısını atın. 5. Foliküller tek tek ya da topluca aspire edilebilir. Aspire edilen foliküler sıvı, durulanmış, steril, toksik olmayan bir kültür tüpünde toplanmalıdır. Kan içeren foliküler aspiratların pıhtılaşmasını azaltmak amacıyla, G-MOPS medyumuna kalite testi yapılmış farmasötik Heparin (2.5-10.0 ünite/ml) eklentisi yapılabilir. 6. Folikül aspiratları, steril, toksik olmayan, tek kullanımlık doku kültürü tüplerinde toplanmalıdır ve laboratuar tarafından derhal incelenmelidir. Hemen incelenmeleri mümkün değilse tüpler sıkı bir şekilde kapatılıp +37 C da saklanmalıdır. Oosit Tanımlama Temel Unsurlar Toksik olmayan eldiven takın. Devam etmeden önce hastanın kimliğini kontrol edin. Soğumayı önlemek için hızlı çalışın. Uygulama 1. Folikül aspiratları + 37 C da saklanmalıdır. Bunu kolaylaştırmak için mikroskobun yanına bir test tüpü ısıtma bloğu yerleştirilebilir. Folikül aspiratları, steril doku kültürü Petri kaplarında mikroskobik olarak incelenir. 2. Bir folikülü flush yapmak gerekirse + 37 C a ısıtılmış G-MOPS kullanılabilir. 3. Folikül aspiratlarını boş bir kaba transfer edin. Oositleri tanımlayın; steril bir pipeti eklentili G-MOPS /G-MOPS PLUS ile yıkayın ve vakit geçirmeksizin oositleri foliküler sıvı ve olası kan kontaminasyonundan uzaklaştırın. 4. Oositleri önce ısıtılmış eklentili G-MOPS /G-MOPS PLUS içinde, sonra dengelenmiş eklentili G- IVF /G- IVF PLUS içinde yıkayın. Yıkama işlemi en az iki basamaktan oluşan 1.0 ml G-IVF /G-IVF PLUS içermelidir. 16

Oositleri dengelenmiş eklentili G-IVF /G-IVF PLUS içeren kaplara aktarın ve kapları vakit geçirmeksizin inkübatöre yerleştirin. Oosit Kültürü ve Fertilizasyon Temel Unsurlar Gametlerin manipülasyonu ve fertilizasyon açısından önemli hususlar sıcaklık, ph ve osmolalitedir. Sıcaklık kaybı hızlı biçimde gerçekleşir ve bir kültür kabının inkübatör dışında kaldığı süre ile ve yüzeyin (örneğin; mikroskobun ısıtıcı tablası) ısıtılmış olup olmadığı ile ilişkilidir. Osmolalitedeki değişiklikler, hacme, sıcaklığa ve yağ ile kaplı olup olmamasına bağlı olarak gelişebilir. Osmolalitedeki değişiklikler yavaş ve çoğunlukla da farkına varılmayan bir şekilde gerçekleşir. Kültür sistemi doğru şekilde nemlendirilmiş ve tercihen yağ altında olmalıdır. ph daki değişiklikler hızlı bir şekilde olur ve sıcaklıktaki değişiklikler gibi kültür kabının inkübatör dışında kaldığı süreye ve havaya maruz kalma süresine bağlıdır. Tüm yüzeylerin ısıtıldığından ve oositlerle temas edecek tüm malzemelerin, steril olduğundan, toksik olmadığından ve doku kültürü kalitesinde olduğundan, tercihen fare embriyosu testinden geçtiğinden emin olun. İnseminasyon Uygulama 1. Oositleri 75.000-200.000 sperm/ml içeren inseminasyon kaplarına transfer edin ve gece boyu +37 C ve % 6 CO 2 ortamında bırakın. Alternatif olarak; Dengelenmiş kaplardaki oositlere dengelenmiş sperm süspansiyonu ekleyin. Aynı kapta birkaç oosit insemine edilebilir. İnseminasyonu 0.5-1.0 ml lik bir hacimde ve yağsız olarak yapmanız tavsiye edilir. Fertilizasyonun Değerlendirilmesi Temel Unsurlar IVF yoluyla insemine edilen oositler, spermin eklenmesinden (1. Gün) yaklaşık 15-20 saat sonra fertilizasyon açısından kontrol edilir. ICSI oositleri ise enjeksiyondan 12-18 saat sonra kontrol edilebilir, çünkü pronükleuslar (PN) daha önce ortaya çıkabilir. 17

Döllenmiş oositler sıcaklık ve ph değişikliklerine karşı hassastır ve inkübatör dışında ısıtılmış eklentili G-MOPS /G-MOPS PLUS ı manipülasyon medyumu olarak kullanarak bu değişiklikleri en aza indirgemek önemlidir. G-MOPS /G-MOPS PLUS, oda atmosferinde manipülasyon sırasında ph ı stabilize etmeye yarayan MOPS tamponunu içerir ve kullanımdan önce CO 2 atmosferinde dengelenmeyi gerektirmez. Tersine bu medyum, CO 2 atmosferi dışında ph ı 7.2-7.4 oranında tutmak üzere tasarlanmıştır. Eklentili G-MOPS /G-MOPS PLUS yerine alternatif olarak G-GAMETE kullanılabilir. G-GAMETE kullanılmadan önce +37 C ve 6 % CO 2 ortamında dengelenmelidir. Tüm mikroskop tablalarını ısıtmak ve hızlı çalışmak tavsiye edilir. Kaplarda +37 C ı elde etmek için, ısıtıcı tablanın daha yüksek bir sıcaklığa, örneğin 39-41 C'a ayarlanması gereklidir. Sıcaklığın kabın iç kısmında doğru olduğundan emin olmak için, lütfen tablaya ya da kabın iç kısmına sabitlenebilen onaylanmış bir termometre ya da kalibre edilmiş dijital bir termometre kullanarak teyit edin. Uygulama - Fertilizasyonun Değerlendirmesi 1. Oositleri ısıtılmış eklentili G-MOPS /G-MOPS PLUS kaplarına aktarın. 2. Bir denudasyon pipeti kullanarak (Bkz; Vitrolife tarafından üretilen Swemed ürünleri sayfa: 57) +37 C da oositlerden kümülüs ve korona hücrelerini alın. Kümülüs ve korona hücreleri genellikle spermdeki hyaluronidase ile iyice yokedilirler. Eğer kümülüs hücreleri iyice yokedilemiş ise oosit, korona hücrelerinin dışına bir pipet ile dikkatli bir şekilde çıkarılabilir. Oositler, kutup cisimcikleri ve pronükleusları açıkça gözlenebileceği kadar soyulmalıdır. 3. Mikroskobik olarak gözlemleyerek pronükleuslar ve kutup cisimciklerinin sayısını ve germinal vesikül mevcut olup olmadığını kaydedin. Bu gözlemlerin, Nomarski ya da Hoffman mercekleri olan inverte mikroskop ile yüksek bir büyütme derecesinde (200X) yapılması tavsiye edilir. Daha düşük büyütme derecelerinde doğru fertilizasyon değerlendirmesi yapmak güç olabilir. Sadece normal olarak döllenmiş oositlerden türeyen embriyolar (2 PN), embriyo kültürü ve transfer için göz önüne alınmalıdır. Fertilize olmamış ya da dejenere olmuş oositler, sadece 1 PN'ye sahip oositler ve 2 den daha fazla PN ye sahip oositler kültürden uzaklaştırılmalıdır. Pronükleer skorlama için lütfen sayfanın devamına bakınız. 4. Değerlendirmeden sonra, döllenmiş oositler dengelenmiş eklentili G-1 /G- 1 PLUS içinde yıkanmalı ve tercihen yağ altında dengelenmiş eklentili G- 1 /G-1 PLUS damlacıkları içinde kültürlendirilmelidir. 18

Pronükleer İnsan Embryolarını Skorlama Kaynak: Scott L, Alvero R, Leondires M ve Miller B (2000). İnsan pronükleer embryolarının morfolojisi, blastokist gelişimi ve implantasyon üzerinde pozitif orantılıdır. Hum Repr 15, No 11, sayfa 2394-2403. Temel Unsurlar Zigot morfolojisi; blastokist gelişimi, implantasyon ve gebelik ile doğru orantılıdır. Skorlama sistemi, zigotun gelişim kapasitesini değerlendirmek için kullanılmaktadır ve iki pronükleusun (2PN) morfolojisi temeline dayanmaktadır. Pronükleer Skorlama; 3. gün ve/veya blastokist skorlama ile ilişkilendirilebilir. Çoğul gebelik komplikasyonlarından kaçınmak için ikiden fazla embriyonun transfer edilmemesi tavsiye edilir. Uygulama Zigotların skorlanması inverte mikroskopta ve fizyolojik ph ve sıcaklık sağlanarak yapılmalıdır. Skorlama inseminasyondan 16-20 saat, ICSI işleminden 12-18 saat sonra yapılmalıdır. Çünkü enjekte edilmiş oositlerdeki pronükleuslar, insemine edilmiş oositlere göre daha erken görülüp, yokolabilirler. Bu prosedür için eklentili G-MOPS /G-MOPS PLUS veya G-GAMETE kullanılması tavsiye edilir. Skorlama Sistemi Çekirdek boyutları aynı olmalıdır. Çekirdekçikler pronükleer bağlantı noktalarında doğrusal olarak sıralanmış olmalıdırlar. Çekirdek başına 3-7 arası çekirdekçik olmalı ve çekirdek başına bir çekirdekçikten fazla fark olmamalıdır. Çekirdekçikler aynı boyutta olmalıdır. Optimum gebelik ve implantasyon oranlarını yakalamak için, PN evresinde Z1 de gösterilen modeldeki zigotlar transfer için seçilmelidir. Model 19

Kültür Sisteminin Seçilmesi Temel olarak, gametler ve embriyoların kültürü için tercih edilebilecek iki farklı kültür sistemi vardır: A- Büyük hacimler (0.5 ml - 1.0 ml) tüp ya da well içinde, yağlı ya da yağsız B- Küçük hacimler (damlacıklar 0.05 ml - 0.1 ml) yağ altında Yağsız sistemlerin yüzey alanları, osmolalitenin birkaç gün içinde değişmesine yetecek kadar büyüktür. Bu yüzden yağın, ph, sıcaklık ve osmolalitedeki değişikliklere karşı bir koruma olarak ve atmosferden gelebilecek toz parçalarına ve mikroorganizmalara karşı bir bariyer olarak kullanılmasını tavsiye ederiz. Viskozitesi ve saflığının yüksek olması yüzünden parafin yağı seçilir. OVOIL ; 0.22 μm gözenek büyüklüğüne sahip farmasötik filtre ile filtrasyon yoluyla sterilize edilen farmasötik hafif parafin yağıdır. OVOIL OVOIL Medyum Medyum damlacıkları 10-100 μl Kültür medyumları, embriyo kültürü yapılırken her 48 saatte bir değiştirilmelidir. Kültür Sisteminin Hazırlanması Embriyo kültürleri tüm medyumlar için ideal olarak % 6 CO 2 ve % 5 O 2 de gerçekleştirilmelidir. Bu gaz ortamı ya üç gazlı inkübatör ya da modüler inkübatör odacığı/izolet kullanılarak ve gaz karışımı ile (% 6 CO 2, % 5 O 2 ve % 89 N 2 ) beslenerek oluşturulabilir. Düşük oksijenli bir ortamın kullanılmasının büyük faydaları vardır. Eğer düşük oksijenli ortam kullanmak mümkün olmazsa oda atmosferinde % 6 CO 2 kullanın. 20

Uygulama 1. Tüm kültür kapları (well yada tüpler) G-RINSE ile durulanmalı ve prosedürden önce hazırlanmalıdır. 2. Oosit toplamanın yapıldığı gün öğleden sonra, 60 mm kapları hastanın kimliğiyle etiketleyin. En yüksek kalitedeki kapların kullanılması tavsiye edilir. Önceden durulanmış steril bir uç kullanarak eklentili G-1 /G-1 PLUS dan en az 6 x 25 μl damlacığı kaba koyun. Uçlar, gerekli miktarda (25 μl) hacim alınıp bu hacmin atık medyum kabına boşaltılması yoluyla durulanır. Dört damlacık saat 3, 6, 9 ve 12 konumunda olmalıdır (embriyo kültürü için), geriye kalan damlalar kabın ortasında olmalıdır (yıkama damlaları). Buharlaşmayı önlemek için vakit geçirmeden damlaları OVOIL ile kapatın. Aynı anda 2 den fazla kap hazırlamayın. Her bir damla için yeni bir uç kullanarak önce ucu durulayın ve daha sonra her bir orijinal damlaya 25 μl medyum daha ekleyin. Bu teknik damlacıkların yassılaşmaktansa dik halde kalmalarını sağlar. 3. Kabı vakit geçirmeksizin % 6 CO 2 içeren ve +37 C'daki inkübatöre yerleştirin. Kabın kapağını nazikçe kaldırın ve açılı olarak üzerine kapatın. Bu şekilde kabın uygun dengelenmesi temin edilecektir. Kaplar inkübatörde kapağı yarı açık vaziyette minimum 6 saat (bu süre, medyumun yağ altında doğru ph a ulaşması için gereken ölçülmüş minimum süredir), maksimum 18 saat dengelenmelidir. 21

Embriyo Kültürü Temel Unsurlar Embriyo kültüründe göz önünde alınması gereken faktörler sıcaklık, ph ve osmolalitedir. Sıcaklık kaybı hızlı biçimde gerçekleşir ve bir kültür kabının inkübatör dışında kaldığı süre ile ilişkilidir. Mikroskop tablası gibi ısıtılmış bir yüzey üzerinde çalışmak tavsiye edilir. Osmolalitedeki değişiklikler yavaş ve çoğunlukla da farkına varılmayan bir şekilde gerçekleşir. Kültür sistemi doğru şekilde nemlendirilmiş ve tercihen yağ altında olmalıdır. ph daki değişiklikler medyum havaya maruz kaldığında hızlı bir şekilde gerçekleşir. Kültür kaplarının inkübatör dışında kaldığı süreyi mümkün olduğunca azaltın. Yüksek implantasyon ve gebelik oranları, blastokist transferiyle elde edilebilir. Ancak blastokist kültür ve transferinin, hatalı bir 2. Gün/3. Gün IVF-ET programını kurtarmayacağı akılda bulundurulmalıdır. Blastokistlerin transfer ve kriyoprezervasyon için kültürlenmesi, laboratuar koşullarının sıkı bir biçimde kontrol edilmesini gerektirir. Yeterli sayıda inkübatör olması, başarılı bir uzun süreli kültür için ön şarttır. İdeal olarak, en çok haftada 5 toplama için iki inkübatör kullanılmalıdır. İnkübatörlerden biri embriyo kültürü için kullanılırken diğeri medyum kaplarının ön dengelenmesi için kullanılmalıdır. Kapak açılma sayısının en aza indirgenmesi için kültür inkübatörleri medyumların ön dengelenmesinde kullanılmamalıdır. Uygulama: Bölünme Evresindeki Embriyoların Kültürü 1. Gün - G-1 /G-1 PLUS da Kültür 1. Kümülüs alındıktan sonra tüm manipülasyonlar, çekilmiş Pasteur pipeti ya da Transfer pipeti (Bkz; Vitrolife tarafından üretilen Swemed ürünleri sayfa: 57) ile yapılmalıdır. Eğer çekilmiş Pasteur pipeti kullanılırsa sıvının kontrolü, Pasteur pipetine eklenmiş silastik hortuma bağlı bir şırınga kullanılarak yapılabilir. Çapı, embriyonun çapından çok az büyük olan bir pipet kullanmak önemlidir. Hasar vermemek için bu çapın, embriyodan küçük olmaması son derece önemlidir. Örneğin, 1-3. gündeki embriyolar için 150-200 μm büyüklüğünde bir pipet ucu yeterlidir. Uygun büyüklükte uç kullanılması her bir embriyo ile alınan kültür medyumu hacmini azaltır; bu hacim tipik olarak bir mikrolitreden az olmalıdır. 22

Başarılı bir kültür için, hacim ayarlamasına bu şekilde özen göstermek ön şarttır. 2. Kümülüs hücrelerinin alınmasından ve fertilizasyonun değerlendirilmesinden sonra, pronükleer embriyolar 1 çukurlu kaba transfer edilir ve ısıtılmış eklentili G-MOPS /G-MOPS PLUS ya da G- GAMETE içinde yıkanır. Yıkama, embriyonun 2-3 kez minimal hacimde tutulup çukur içinde hareket ettirilmesini içerir. Daha sonra embriyolar kültür kabının ortasındaki iki damlacık içinde art arda yıkanmalıdır. Embriyoların en az iki ayrı damlacık içerisinde yıkanması gerektiğini lütfen unutmayınız. Daha yoğun yıkama tekniği, eski kaplardan yeni kaplara transfer edilen embriyonun, daha fazla medyum ile taşınması riskini azaltır. Kültür damlacıklarındaki MOPS tampon kalıntıları, ph düzeyini olması gereken seviyenin altına düşürebilir. 3. Dengelenmiş eklentili G-1 /G-1 PLUS ın her 50 μl damlası içine maksimum 5 embriyo yerleştirin. Beslenme gereklilikleri yüzünden her bir damlacıkta kültürlenecek embriyoların maksimum sayısı beştir. 5 ten fazla embriyo, besleyici havuzun embriyolar tarafından büyük ölçüde tüketilmesine yol açabilir. İhtiyati bir önlem olarak, eğer hastanın 10 dan fazla embriyosu varsa iki kültür kabı hazırlayın. Kabı vakit geçirmeksizin inkübatöre yerleştirin. Embriyoları en az 2 şerli gruplar halinde kültürlemeniz önerilir. Örneğin, 6 embriyosu olan bir hasta için 4 ve 2 ya da 5 ve 1 halinde değil de, 3 lü iki grup halinde kültürlemeniz en iyi yoldur. 4. 3. günde embriyolar dengelenmiş EmbryoGlue ya da dengelenmiş eklentili G-2 /G-2 PLUS içinde uterusa transfer edilebilir. Alternatif olarak 3. günde embriyolar dengelenmiş eklentili G-2 /G-2 PLUS 'a transfer edilerek blastokist evresine kadar kültürlenebilir. Uygulama: Blastokist Evresindeki Embriyoların Kültürü 3. Gün - G-2 / G-2 PLUS da Kültür 1. 3. Günün sabahında 60 mm kapları hastanın kimliğiyle etiketleyin. Kullanacağınız steril ucu önce durulayın ve sonra eklentili G-2 /G-2 PLUS dan 9 x 25 μl damlacığı kaba koyun. Vakit geçirmeden damlacıkları OVOIL ile kaplayın. Osmolalitedeki değişikliklerden kaçınmak için aynı anda 2 den fazla kap hazırlamayın. Her bir damlacık için yeni bir uç kullanarak önce ucu durulayın ve daha sonra her bir orijinal damlaya 25 μl medyum daha ekleyin. Kabı vakit geçirmeksizin % 6 CO 2 içeren ve +37 C'daki inkübatöre yerleştirin. Kabın kapağını nazikçe kaldırın ve açılı olarak üzerine kapatın. Eğer hastanın 10'dan fazla embriyosu varsa iki kültür kabı hazırlayın. Alternatif olarak, blastokist kültürü için kullanacağınız kapları 2. Gün öğleden sonra hazırlayıp % 6 CO 2 içeren ve +37 C'daki inkübatörde öndengeleme için bir gece bekletebilirsiniz. 2. Her bir hasta için, 10 embriyo başına ısıtılmış eklentili G-MOPS /G-MOPS PLUS ya da dengelenmiş G-GAMETE içeren bir yıkama kabı hazırlayın. 1 çukurlu kabın çukuruna 1 ml ısıtılmış eklentili G-MOPS /G-MOPS PLUS ya 23

da G-GAMETE koyun. Kabın dış bölümüne 2 ml ısıtılmış eklentili G- MOPS /G-MOPS PLUS ya da G-GAMETE koyun. Bir ısıtıcı tabla üzerine yerleştirin. 3. Her hasta için bir gruplandırma kabı hazırlayın. 1 çukurlu kabın çukuruna 1 ml ısıtılmış eklentili G-MOPS /G-MOPS PLUS ya da G-GAMETE koyun. Kabın dış bölümüne 2 ml ısıtılmış G-MOPS /G-MOPS PLUS ya da G- GAMETE koyun. Bir ısıtıcı tabla üzerine yerleştirin. G-MOPS /G-MOPS PLUS kapları CO 2 inkübatörüne yerleştirilmemeli, aksine sıkıca kapatılmış bir kapta karbondioksitsiz bir inkübatörde ya da tüp ısıtıcı blokta ısıtılmalıdır. 4. 3. Gün sabah bölünme açısından değerlendirmeye alınan embriyolar; öğleden sonra dengelenmiş eklentili G-2 /G-2 PLUS a transfer edilir. Embriyolar, 5. günün sabahında transfer için değerlendirmeye alınıncaya kadar %6 CO 2 içeren ve 37 C'da eklentili G-2 /G-2 PLUS içinde kalır. Eğer embriyonun bölünme oranı konusunda herhangi bir kaygı varsa hemşire ve tıbbi personele haber verilmelidir. 5. Embriyoları ısıtılmış eklentili G-MOPS /G-MOPS PLUS içeren yıkama kabında yıkayın (bu aşama G-1 /G-1 PLUS daki EDTA nın giderilmesi için önemlidir). Yıkama, embriyonun 2-3 kez minimal hacimde tutulup çukur içinde hareket ettirilmesini içerir. Yıkamadan sonra embriyoları ısıtılmış gruplandırma kabına transfer edin ve benzer embriyoları gruplayın. Kültür kabının içinde dengelenmiş eklentili G-2 /G-2 PLUS ile hazırlanmış yıkama damlacıklarıyla durulayın ve dört kültür damlacığının her birine maksimum 5 embriyoyu tekrar yerleştirin. Vakit geçirmeksizin kabı CO 2 inkübatörüne geri koyun. 6. 4. Günde üç adet eklentili G-2 / G-2 PLUS kabı hazırlayın. Kapları Transfer, Dondurma ve "Bekletme" (6. güne kadar kültür için) olarak etiketleyin. Kaplar, gece boyunca +37 C da ve % 6 CO 2 de dengelenmelidir. Kaplar kullanılmadan önce en az 6 saat ve en fazla 18 saat ön dengelenmeye tabi tutulmalıdır. 7. Transfer, ya dengelenmiş EmbryoGlue ya da dengelenmiş eklentili G-2 /G- 2 PLUS içinde yapılmalıdır. Transfer kaplarını kullanım öncesi en az 6 saat (en fazla 18 saat) +37 C da ve % 6 CO 2 de dengeleyin. 8. 5. Gün embriyolar değerlendirilmeli ve en çok puanı alan bir ya da iki blastokist transfer için seçilmelidir. Transfer edilmeyen iyi kalitedeki blastokistler kriyoprezervasyona gönderilebilir. Eğer bir embriyo 5. güne kadar bir blastokist oluşturmamışsa 24 saatliğine dengelenmiş eklentili G- 2 /G-2 PLUS ın taze bir damlacığında kültürlenmeli ve 6. günde değerlendirmeye alınmalıdır. 9. Seçilen blastokistler transferden 10-30 dakika öncesinden dengelenmiş eklentili G-2 /G-2 PLUS içerisinde +37 C da ve % 6 CO 2 inkübatöründe bekletilmelidir. 24

Embriyonun Değerlendirilmesi Temel Unsurlar Embriyolar uterusa 2. Günde (inseminasyon sonrası 40-48. saatler) ya da 3. Günde (inseminasyon sonrası 66-74. saatler) ya da 5-6. günde blastokist aşamasında (inseminasyon sonrası 120-144. saatler) transfer edilebilir. Embriyo morfolojisi transfere mümkün olduğunca yakın bir zamanda değerlendirmeye alınmalıdır. Erken evredeki embriyolar; toplam blastomer sayısı, blastomerlerin düzenliliği, fragmantasyon varlığı ve yüzdesi, blastomerlerin granülaritesi ve bölünme oranı açısından değerlendirmeye alınır. Blastokistlerin değerlendirilmesi için ilerleyen sayfalardaki İnsan Blastokistlerini Skorlama Kriterleri bölümüne bakınız. Transfer için seçilen embriyolar bulundukları evreye bakılmaksızın dengelenmiş EmbryoGlue ya da dengelenmiş eklentili G-2 / G-2 PLUS içeren yeni bir kaba yerleştirilir. İnsan Blastokistlerini Skorlama Kriterleri Kaynak: Gardner DK ve Schoolcraft WB (1999). In-vitro culture of human blastocysts. in Towards Reproductive Certainty: Infertility and Genetics Beyond 1999. eds. Jansen, R. ve Mortimer, D. Parthenon Press, Carnforth, s. 378-388. Temel Unsurlar Skorlama sistemi, morfolojik görünüşlerine göre blastokistlerin gelişim kapasitesini değerlendirmek ve böylece transfer ya da kriyoprezervasyon için seçilmelerini mümkün kılmakta kullanılır. Blastokistlerin skorlanması inverte mikroskopta ve fizyolojik ph ve sıcaklık sağlanarak yapılmalıdır. Blastokistlerin çoğunluğunun 5. Güne kadar gelişmiş olması gereklidir (aşağı bakınız). Transfer için seçilen blastokistler (maksimum iki) Transfer etiketli kaba konmalıdır ve kriyoprezervasyon için seçilen blastokistler Dondurma etiketli kaba konmalıdır. Çoğul gebelik komplikasyonlarından kaçınmak için ikiden fazla blastokistin transfer edilmemesi tavsiye edilir. 3 ya da üzeri olarak sınıflandırılan blastokistlere öncelik verilmelidir. Tercihen en iyi puan alan (örneğin AA) blastokistleri seçin. Uygulama 25

1. Blastokistlere, genişleme derecesi ve hatching durumuna göre 1 ile 6 arasında alfanümerik; iç hücre kütlesi (ICM) ve trofektoderm için iki harfli puan verilir. 2. Değerlendirmenin ilk aşaması bir diseksiyon mikroskobunda yürütülebilir. 3. Blastokistlerin skorlanmasındaki ikinci aşama bir inverte mikroskopta yapılmalıdır; 3 ile 6 arasında sınıflandırılan blastokistler için (yani tam blastokist ve sonrası) iç hücre kütlesi (ICM) ve trofektoderm değerlendirilebilir. 26

Skorlama Sistemi Genişleme Derecesi ve Hatching Durumu: 1 2 3 4 1 Erken blastokist blastosel, embriyo hacminin yarısından az 2 Blastokist blastosel, embriyo hacminin yarısından büyük ya da yarısına eşit 3 Tam blastokist blastosel, tamamen embriyoyu dolduruyor 4 Genişlemiş blastokist blastosel hacmi artık erken embriyonun hacminden daha büyük ve zona kalınlaşıyor 5 Hatching blastokist trofektoderm, zona yoluyla çıkıntı yapmaya başlamış 6 Hatched blastokist blastokist, zonadan tamamen çıkmış İç hücre kütlesi (ICM) Sınıflandırması: A Sıkı biçimde gruplanmış, çok sayıda hücre B Gevşek biçimde gruplanmış, birkaç hücre C Çok az sayıda hücre Trofektoderm Sınıflandırması: A Birbirine bağlı bir epitelyum oluşturan çok sayıda hücre B Gevşek bir epitelyum oluşturan az sayıda hücre C Çok az sayıda hücre 27

4AA olarak sınıflandırılan bir blastokist örneği. Odak: İç hücre kütlesi Odak: Trofektoderm Blastokist Değerlendirme Tablosu Genişleme Derecesi / Hatching Durumu 3 Tam blastokist; blastosel, tamamen embriyoyu dolduruyor 4 Genişlemiş blastokist; blastosel artık erken embriyonun hacminden daha büyük, zona kalınlaşıyor 5 Hatching blastokist; trofektoderm, zona yoluyla çıkıntı yapmaya başlamış 6 Hatched blastokist; blastokist, zonadan tamamen çıkmış İç hücre kütlesi Sıkı biçimde Gevşek gruplanmış,ç biçimde ok sayıda gruplanmış,b hücre irkaç hücre A B Çok az sayıda hücre C Birbirine bağlı bir epitelyum oluşturan çok sayıda hücre A Trofektoderm Gevşek bir epitelyum oluşturan az sayıda hücre B Çok az sayıda hücre C 28

Blastokist Çizelgesi (örnek) Blastokist kültürü prosedürü, rutin IVF 2. gün/3. gün prosedüründen son derece farklıdır. Aşağıda günlük özet yer almaktadır. Bu sayfanın tüm laboratuar personeli tarafından görülebilecek bir yere asılmasını tavsiye ederiz. Eğer PLUS ürünler kullanılıyorsa albümin eklentisi gerekmemektedir. Aksi takdirde, G-RINSE, EmbryoGlue ve G-GAMETE dışında tüm medyumlara, G-MM ya da HSA-solution eklentisi gereklidir. -1. Gün 0. Gün 1. Gün (oosit toplamadan önceki gün) Rutin IVF protokolü uyarınca oosit toplama ve inseminasyon için G-RINSE, G-MOPS ve G- IVF i hazırlayın. Eğer ICSI uygulanacaksa ayrıca G-1 kaplarını da hazırlayın. Eğer G- GAMETE kullanılacaksa, oosit yıkama için kaplar hazırlayın. G-IVF içinde oosit toplama ve inseminasyon. ICSI oositleri, enjeksiyon sonrası hemen G-1 içine konulmalıdır. 1. Günde kullanmak üzere G-1 kaplarını öğleden sonra geç bir vakitte hazırlayın. Oosit toplama için G-MOPS kaplarını hazırlayın. 2. Gün 3. Gün 4. Gün Embriyo değerlendirmesi isteğe bağlıdır. 5. Gün 6. Gün Blastokistlerin morfolojisini değerlendirin. Transfer, dondurma ya da bekletme için skorlama ölçütlerini kullanın. Uterusa transfer etmeden önce blastokistleri EmbryoGlue ya da taze eklentili G-2 ye transfer edin. Embriyoları bölünme açısından değerlendirin. Öğleden sonra erken saatlerde, embriyoları G- MOPS ya da G-GAMETE içinde durulayın ve iyice yıkayın ve kültür için G-2 'ye aktarın. Blastokistlerin morfolojisini değerlendirin. Transfer ya da dondurma için skorlama ölçütlerini kullanın. 6. Gün itibariyle 3BB nin altında puan alan blastokistlerin kriyoprezervasyonu iyi sonuç vermez. Uterusa transfer etmeden önce blastokistleri EmbryoGlue ya da taze eklentili G-2 ye transfer edin. IVF ve ICSI fertilizasyonunu değerlendirin. G-MOPS ya da G-GAMETE içinde durulayın ve kültür için G-1 içine yerleştirin. Embriyo değerlendirmesi isteğe bağlıdır. Öğleden sonra geç vakitlerde, transfer için EmbryoGlue ya da G-2 kapları ile dondurma ve 6. güne bekletmek için G-2 kapları hazırlayın. 29

Embriyo Transferi Embriyo transferi (ET), embriyoların uterus içine yerleştirilmesi sürecidir. Bu işlem genellikle anestezi yapılmaksızın transservikal olarak gerçekleştirilir. Temel Unsurlar Kateteri kullanırken steril, toksik olmayan, pudrasız eldivenler takılmalıdır. Kateter ucunun kontaminasyonu önlemek için her zaman aşırı özen gösterilmelidir. Her hastaya bir ya da iki embriyo transfer etmek yaygın bir uygulamadır. Büyük hacimli (60 mikrolitre) transfer medyumu ve büyük bir hava ara yüzü, embriyoların servikse bırakılmasına ya da kateterin dışına yapışmasına yol açabilir. Hava sütununun giderilmesi bu tür komplikasyonları en aza indirgeyebilir. Bu yüzden, dengelenmiş EmbryoGlue ya da dengelenmiş eklentili G-2 /G-2 PLUS dan çekilmiş 30 mikrolitrelik kesintisiz sıvı sütununun, 1 cc lik hava geçirmez bir enjeköre iliştirilmiş bir kateterde kullanılması tavsiye edilir. Embriyolar tercihen transfer medyumu sütununun kateter ağzına en yakın kısmına doğru yüklenir. Embriyoların Yerleştirilmesi Jinekologlar için Uygulama 1. Embriyo transferi yapılacak hastanın kısmen dolu bir mesane ile gelmesini önceden ayarlayın. Birçok durumda hastanın bu şekilde gelmesi, yumuşak, kolay ve atravmatik kateter girişi için uterusun konumlandırılmasına yardımcı olur. Retrovert uterusu olan hastalar mesanelerini boşaltabilirler. 2. Toksik olmayan, kalite testinden geçmiş, tek kullanımlık, atravmatik bir kateter kullanılmalıdır. 3. Embryo transferini ultrason yardımı ile yapmak tavsiye edilir. 4. Hasta, litotomi konumuna getirilir. Bir spekulum kullanılarak serviks açığa çıkarılır ve antibiyotik eklenmiş dengelenmiş G-RINSE ile yıkanır. Steril bir enjektörle ile servikal mukusun alınması gerekebilir. 5. Kateterin servikal kanal içinden geçişini abdominal ultrason ile gözlemlemek şiddetle önerilir. Kanal içinden geçişin kolay olup olmadığını test etmek için bir deneme kateteri sokulabilir. Eğer geçiş kolay ise embriyolar temiz bir katetere yüklenip embriyo transferi gerçekleştirilebilir. Eğer deneme kateteri herhangi bir engelle karşılaşırsa çeşitli seçenekler göz önüne alınabilir. Bir miktar esnekliği olan bir obturator, kateteri kaviteye yöneltmekte kullanılabilir. Hangi yöntem kullanılırsa kullanılsın, servikal kanal ve kaviteye olacak travmayı en aza indirgemek için özen gösterilmelidir. 30

6. Embriyoların kateterden istemeden çıkmasını önlemek için, embriyo transferini yapan operatör, kateteri eğmemeli, sıkmamalı ve zarar vermemelidir. 7. Kateter, servikal kanalın içinden geçerek internal os un ötesine gitmelidir. Operatör bunu dokunma yoluyla hissedebilir. Kateterin ne kadar içeri sokulduğunun belirlenebilmesi için kateterin açık biçimde işaretlenmiş olması gereklidir. Kateterin pozisyonunu teyit etmek için ultrason kullanılmalıdır. 8. Embriyo transferi için, kateterin ucunu fundusa yaklaşık 1 cm mesafe kalana kadar ilerletin ve yaklaşık 25-30 μl medyum içinde bulunan embriyoları uterus kavitesine aktarın. enjektörün pistonu üzerinde basınç sabit tutularak kateter yavaşça geri çekilir Şırınganın tıpası üzerinde sabit bir basınç uygulayarak kateteri yavaş biçimde geri çekin. 9. Kateter, içinde kalan embriyo olup olmadığını görmek amacıyla son bir kez daha mikroskop altında kontrol edilir. Bu konuyla ilgili ayrıntılı bir değerlendirme için bkz.: Schoolcraft, Surrey ve Gardner (2001) Embryo transfer: techniques and variables affecting success. Fertil. Steril. 76; 863-870. 31

Katetere Yükleme Yapma Laboratuar için Uygulama 1. Embriyo transferi, dengelenmiş EmbryoGlue ya da dengelenmiş eklentili G-2 /G-2 PLUS içinde yapılabilir. 2. Yaklaşık 1 ml EmbryoGlue durulanmış 1 çukurlu kabın çukuruna konur. 3. Yaklaşık 2 ml EmbryoGlue 1 çukurlu kabın dış bölümüne konur. 4. Kabı +37 C de ve % 6 CO 2 de 4-18 saat boyunca ön dengelemeye tabi tutun. 5. Transfer edilecek embriyoları EmbryoGlue içeren çukurda, transferden önce % 6 CO 2 ortamında 10 dakika ön dengelemeye tabi tutun. 6. 1 cc lik toksik olmayan enjektörü, transfer kabının dış bölümünden çekilecek medyum ile enjektör içinde hiç hava kabarcığı kalmadığı görülene kadar durulayın. Daha sonra yaklaşık 0,5 ml medyumu yine kabın dış bölümünden çekin. 7. Transfer kateterini, 1 cc lik toksik olmayan enjektöre sıkı bir şekilde iliştirin. Enjektör içindeki 0,5 ml medyum kabın dış bölümüne boşaltılarak kateter durulanmış olur. 8. Durulamadan sonra, çukurdan yaklaşık 0.1 ml EmbryoGlue çekin ve geriye yaklaşık 20 μl kalıncaya kadar kabın dış bölümüne boşaltın. 9. Mikroskop altında çok nazik hareketlerle, embriyoları katetere yaklaşık 5-10 μl EmbryoGlue içinde yükleyin. ve kateterin ucun çok az miktarda hava çekin (Uç kısımda bırakılan az miktardaki hava cebi, ultrason yardımlı transferde uç kısmının görüntü kalitesini arttıracaktır). Embriyo transferi için, kateterin ucunu fundusa yaklaşık 1 cm mesafe kalana kadar ilerletin ve yaklaşık 25-30 μl medyum içinde bulunan embriyoları uterus kavitesine aktarın. enjektörün pistonu üzerinde basınç sabit tutularak kateter yavaşça geri çekilir Şırınganın tıpası üzerinde sabit bir basınç uygulayarak kateteri yavaş biçimde geri çekin. Kateteri, içinde kalan embriyo olup olmadığını görmek amacıyla son bir kez daha mikroskop altında kontrol edin. 32

Mikromanipülasyon Mikromanipülasyon, ICSI (Intra Cytoplasmic Sperm Injection), yardımla (assisted) hatching ve embriyo biyopsisi prosedürlerini içerir. Temel Unsurlar Maksimum stabilite için tüm mikromanipülasyon donanımı doğru şekilde sıralanmalı ve konumlandırılmalıdır. Mikromanipülasyon donanımını; kapı, asansör ve hava akımlarının neden olabileceği titreşimlerden; işlem sırasında kesintiye yol açabilecek gürültü ve hareketlilikten uzak tutmak gereklidir. İnverte mikroskobun, kaptaki sıvıyı + 37 C de tutacak şekilde ayarlanmış ısıtıcı tablası olmalıdır. Prosedürler sırasında sıcaklığın muhafaza edilmesi önemlidir. Osmolalite, dengelenmiş medyum damlacıklarının dengelenmiş yağ altındaki kullanılmasıyla kontrol edilir. Tutarlılık ve kalite kontrolü için tüm prosedürlerde en yüksek kalitede toksik olmayan mikro aletler kullanılmalıdır (Bkz; Vitrolife tarafından üretilen Swemed ürünleri sayfa: 57- ICSI ve Holding Pipetler). 33

ICSI için Oositlerin Soyulması Eğer ICSI uygulanacaksa oositlerin kümülüs kütlesi ve koronalarının alınması gerekecektir. Bu işleme denudasyon denir. Bu işlem, multi-well kaplar kullanılarak yağsız büyük hacim yöntemi ile ya da yağ altında damlacık yöntemi ile gerçekleştirilebilir. HYASE (hyalurinodase), kümülüs kütlesi ve koronanın dağılmasını kolaylaştırmakta kullanılır. İnce cam pipetler ya da pipet uçları kullanılarak (Bkz; Vitrolife tarafından üretilen Swemed ürünleri sayfa: 57), nazikçe oositi yukarı aşağı pipetleyerek hücreler uzaklaştırılır. Pipetin çapı, oositin çapından biraz büyük olmalıdır (yaklaşık 130-175 μm). Eğer cam pipetler kullanılıyorsa farklı büyüklükte birkaç pipete ihtiyaç olabilir. Çok dar ya da ucu tırtıklı bir pipetin kullanılması oosite zarar verebilir. Fizyolojik düzeyin altındaki ph ve sıcaklıkların yanı sıra HYASE a çok fazla maruz tutma ya da sert hareketler de oosite zarar verebilir. Özellikle germinal vesikül evresindeki oositler hassastır. Yukarıda sayılan nedenlerden dolayı, doğru HYASE konsantrasyonunun kullanılması ve önerilen bekletme süresine uyulması önemlidir. HYASE -10X, 10 kat konsantredir ve eklentili G-MOPS /G-MOPS PLUS ya da G-GAMETE ile 1:10 oranında dilüe edilmelidir. DİKKAT Oositlerin 30 saniyeden fazla HYASE içerisinde tutulması zarar görmelerine sebep olabilir. Uygulama 1. HYASE yi eklentili G-MOPS /G-MOPS PLUS ya da G-GAMETE kullanarak 10 kat dilüe edin. 2. Oosit yıkama işlemi için, durulanmış denudasyon kaplarınızı dilüe edilmiş HYASE ve eklentili G-MOPS /G-GAMETE kullanarak hazırlayınız. 3. Dilüe edilmiş HYASE içeren her bir well için, 1 ml lik 3 well ya da yağ altında 6 damlacık (50-100 μl) eklentili G-MOPS /G-MOPS PLUS ya da G- GAMETE hazırlayın (A, B). 15 dakika boyunca oda atmosferinde + 37 C de dengeleyin. Aynı zamanda ICSI kaplarını da hazırlayın (bkz. Aşağıdaki Uygulama Ayarlama ). A.Yağ altında damlacıklar a) HYASE b-f) G-MOPS /G-MOPS PLUS ya da G- GAMETE yıkama damlacıkları 34

B. Multi-well. Yağ altında veya yağsız a) HYASE b d) G-MOPS /G-MOPS PLUS ya da G-GAMETE ; yıkama damlacıkları 4. Büyük çaplı bir pipet (Transfer Pipeti) kullanarak (Bkz. Vitrolife tarafından üretilen Swemed ürünleri sayfa: 57), 3-5 oositi dilüe edilmiş HYASE içine yerleştirin. Hyaluronidase ve oositleri nazikçe pipetleyin. Kümülüs hücreleri dağılmaya başlayacaktır. Oositleri hyaluronidase çözeltisine 30 saniyeden fazla maruz bırakmamak önemlidir. 5. Kısmen soyulmuş oositleri birinci yıkama medyumuna alın ve minimum miktarda hyaluronidase çözeltisi taşımaya özen gösterin. Koronayı çıkarmak için dar çaplı soyma pipeti kullanarak (Bkz. Vitrolife tarafından üretilen Swemed ürünleri sayfa: 57 Denudation pipeti), her bir oositi tek tek aspire ederek aşağı-yukarı hareket ettirin. Oositleri ısıtılmış eklentili G- MOPS /G-MOPS PLUS ya da G-GAMETE içinde durulayın. Tüm oositler soyuluncaya kadar yeni kaplarla tekrarlayın. 6. Kutup cisimciği mevcudiyetini (M2) ya da eksikliğini (M1) ya da germinal vesikülün mevcudiyetini (GV) inceleyerek oositlerin olgunluğunu gözlemleyin. ICSI işlemi hemen uygulanacaksa tüm olgun oositleri (M2) hazırlanan ICSI damlacıklarına yerleştirin. Eğer soyulmuş oositler enjeksiyon öncesi bir süre inkübatörde bekletilecekse, enjeksiyon anına kadar oositlerin eklentili G-1 /G-1 PLUS da bekletilmesi gerekir. Olgun olmayan oositler (M1 ve GV), inkübasyon ve olgunlaşma için kültür medyumuna yerleştirilebilir. Uygulama Ayarlama 1. İlaveli G-MOPS /G-MOPS PLUS ve OVOIL i yaklaşık 15 dakika boyunca +37 C de ısıtın ya da G-GAMETE i +37 C de 6% CO 2 ortamında 4 saat boyunca dengeleyin. 2. ICSI yı (viskoz sperm enjeksiyon çözeltisi) soğuk depodan çıkarın ve + 20 ± 5 C sıcaklığına dengeleyin. 3. ICSI kapları hızlı bir şekilde hazırlanmalıdır. 1-10 μl lik ICSI damlacığını kabın merkezine yerleştirin ve 6-10 μl lik eklentili G-MOPS /G-MOPS PLUS ya da G-GAMETE damlacıklarını konumlandırıp OVOIL ile kaplayın. Damlacıkların buharlaşmasını önlemek için aynı anda birden fazla kap hazırlanmamalıdır. Hızlı çalışın ve gerekli malzemeleri yakınınızda bulundurun (A, B). Hasta başına iki kap hazırlayın. 35

1,2,3,4,5,6) Oosit dropletleri, (G-MOPS /G-GAMETE ) 1,2,3,4,5,6) Oosit dropletleri, (G-MOPS /G-GAMETE ) ICSI ICSI 4. Eğer G-MOPS kullanılıyorsa kapları en az 15 dakika boyunca + 37 C de dengeleyin. Eğer G-GAMETE kullanılıyorsa kapları +37 C de 6% CO 2 ortamında 4 saat boyunca dengeleyin. ICSI Prosedürü ICSI, spermin oosite enjekte edilmesi prosedürüdür. ICSI, erkeğe bağlı ciddi kısırlığın olduğu çiftlerde gebeliğin mümkün kılınmasını sağlar. Polivinilpirolidon (PVP), viskozite özelliklerinden dolayı ICSI de yaygın olarak kullanılır. Spermin hareket yeteneğini azaltarak spermin yakalanmasını, enjeksiyondan önce spermin doğru şekilde hareketsizleştirilmesini ve kuyruk membranın ezilmesini kolaylaştırır. Aynı zamanda enjeksiyon sıvısının hızını yavaşlatarak spermin kontrollü bir şekilde enjekte edilmesine de yardımcı olur. Böylelikle mikroenjeksiyon prosedürü stabilize edilir ve oosit içinde enjekte edilen sıvı hacmi azaltılır. Tüm bu faktörler prosedürün başarısına katkıda bulunur. Temel Unsurlar Enjeksiyon pipetiyle spermin boynunun hemen altına darbe indirerek spermi doğru biçimde hareketsizleştirin (kuyruk ezme). Spermi sitoplazmanın iyice içine (oosit çapının % 50-75 i) enjekte edin ve spermin enjeksiyon pipetiyle birlikte dışarı çıkmamasını sağlayın. Spermin perivitellin boşluğuna atılmasını engellemek için, az miktarda sitoplazmayı hafifçe içeri çekerek oolemmanın kırılmasını sağlayın. ICSI nin (PVP) oosite enjekte edilen hacmini en aza indirgeyin. ICSI ve Holding pipetler için, bkz. Vitrolife tarafından üretilen Swemed ürünleri sayfa: 57 Uygulama 1. Hazırlanan sperm süspansiyonundan az bir miktarı (1-2 μl) ICSI damlacığının merkezine yerleştirin. Spermin, damlacığın dış çevresine migrasyonunu sağlamak amacıyla ısıtıcı tabla üzerinde kapları birkaç dakika ısıtın. 2. Spermin pipetin iç kısmına yapışması riskini azaltmak için enjeksiyon pipetini ICSI ile doldurun. 36

3. Soyulmuş oositleri, eklentili G-MOPS /G-MOPS PLUS ya da G-GAMETE damlacıklarına yerleştirin, damlacık başına 1 oosit, maksimum 4 oosit aynı anda yapılabilir. 4. Enjeksiyon pipetini kullanarak sperm kuyruğu ezmek suretiyle bir spermi hareketsizleştirin. Spermin boyun bölgesine zarar vermemek önemlidir; çünkü bu bölge, hücre bölünmesinde kromozomların migrasyonu açısından hayati öneme sahip olan sentriolü içerir. Kuyruğun yeterince ezilmemesi, fertilizasyon oranlarının azalmasına yol açacaktır. Hareketsiz hale gelen spermi aspire edin. 5. Oosit damlacığını görüş alanına getirin. Enjeksiyon için oositi sabitlemek üzere bir holding pipet kullanın. Polar body saat 7 ya da 1 pozisyonunda olacak şekilde oositi konumlandırın. Mitotik iğe zarar verme riskini en aza indirgemek için spermi saat 4 pozisyonundan enjekte edin. Spermi olabilecek en az ICSI miktarıyla birlikte enjekte edin ve enjeksiyon sonra enjeksiyon pipetindeki akışı durdurduğunuzdan emin olun. Kapların inkübatör dışında kaldığı süreye dikkat edin. Eğer operatör deneyimsiz ise ya da vaka zor ise kap başına daha az sayıda oosit ayarlanabilir. 6. Tüm oositler enjekte edildikten sonra birkaç eklentili G-1 /G-1 PLUS yıkama damlacığında yıkayıp gece boyu kültürlemek için hazırlanmış G-1 kültür sistemlerine yerleştirin. 7. Sonraki gün oositler 2PN ve 2 polar body nin mevcudiyetine göre fertilizasyon açısından değerlendirilir. Fertilize olmamış, dejenere olmuş oositler ve ikiden fazla ya da az PN si olan oositler kültürden çıkarılmalıdır. Değerlendirmeden sonra, zigotlar dengelenmiş eklentili G-1 /G-1 PLUS içinde durulanmalı ve kültür için dengelenmiş eklentili G-1 /G-1 PLUS içeren yeni bir kaba transfer edilmelidir. 37

Zor ICSI Vakaları Bir vakanın zorluk düzeyi üç faktöre göre değerlendirilir: Operatör Donanım Sperm örneği Operatörün eğitim, deneyim, sabır ve yeteneği birinci faktörü oluşturur. ICSI için düzenleme yaparken özellikle zor vakalar için yeterli zaman ve kaynağın elverişli olması önemlidir. Donanımın kullanılması kolay olmalı ve operatörün, spermi bulup tutmaya çalışırken karşılaşılan güçlükler üzerinde yoğunlaşmasını mümkün kılacak stabil ayarlara sahip olmalıdır. Ergonomik olarak tasarlanmış bir ICSI çalışma istasyonu işin pürüzsüz ilerlemesini sağlar ve operatörün sabrını artırır. Sperm örneği de zorluklara yol açabilir. Örneğin, testiküler biyopsilerden hazırlanan sperm süspansiyonlarında ya da seyrek görülen oligoasthenoteratospermia vakalarında genellikle sperm sayısı son derece düşüktür, hareket yeteneği azdır; döküntü ve başka hücreler mevcuttur. Dondurulmuş çözülmüş epididimal sperm de sorunlu olabilir. Sadece çok az sayıda sperm hayatta kalabilir ve hayatta kalan spermler de son derece düşük ilerleme hareketi sergileyebilir ya da hiçbir hareket göstermeyebilir. Zor ICSI vakalara üçüncü örnek ise elektro-ejakülasyon yoluyla elde edilen spermdir. Bu tür durumlarda, sperm sayısı son derece yüksek ve hareket yeteneği son derece düşük olabilir. Ayrıca döküntünün yanı sıra başka hücreler de mevcut olabilir. Düşük sperm sayısı, hareket yeteneği ve ilerleme Spermi elde etmek için SpermGrad kullanın (bkz. Sperm Hazırlama). Sperm süspansiyonunu, dengelenmiş eklentili G-IVF /G-IVF PLUS damlacığına ekleyin. Devam etmeden önce spermi ICSI ye transfer edin. Sperm sayısının son derece düşük olduğu durumlarda, semen örneği eklentili G- IVF /G- IVF PLUS içinde yıkanabilir ve daha önceden herhangi bir gradyan santrifüjüne tabi tutulmadan 10 dakikalığına 300-600 g de santrifüje tabi tutulabilir. Spermler, 200-500 μl dengelenmiş eklentili G- IVF /G- IVF PLUS içinde yeniden süspanse edilir ve en kısa sürede kullanılır. Testiküler Biyopsi Örnek toplamak için G-MOPS TM PLUS kullanın. Dokuyu steril, non-toksik Petri kabına transfer edin ve dokuyu küçük parçalar halinde yayın. Yayılmış doku parçalarını küçük konik test tüplerine transfer edin ve 300-600 g kuvvetinde 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve peleti G-MOPS TM PLUS içerisinde yeniden süspanse edin. İkinci bir yıkama gerekli olabilir. 38

Testiküler doku parçacıklarını 5-10 μl damlacıklar halinde küçük bir Petri kabına yerleştirin ve OVOIL TM ile üzerini kaplayın. Testiküler sperm hücrelerini toplayın ve enjeksiyon yapılana kadar temiz bir G-MOPS TM PLUS damlacığında biriktirin. Eğer hazırlıklar takip eden günde yapılacaksa doku eklentili G-IVF / G-IVF PLUS içinde +37 C de 6% CO 2 ortamında inkübe edilmelidir. Embriyo Biyopsisi Embriyo biyopsisi, bir blastomerin İmplantasyon Öncesi Genetik Teşhis (PGD) için embriyodan çıkarılması prosedürüdür. Temel Unsurlar Embriyo biyopsisi genellikle, blastomerlerin yoğunlaşması başlamadan önce 3. günün sabahında yapılır. Tyrode Asiti, lazer yada parsiyel zona diseksiyonu ile zonada bir delik açılabilir. Biyopsisi yapılan blastomerin alınması için ayrı bir pipete ihtiyaç vardır. (Bkz. Vitrolife tarafından üretilen Swemed ürünleri sayfa: 57- Blastomer Biyopsi Pipeti) DİKKAT G-PGD, MOPS tamponludur ve G-MOPS gibi muamele edilmelidir (bkz. Sayfa 8). G- PGD asla CO 2 inkübatörüne konulmamalı, bunun yerine tüp ısıtıcı blok ya da CO 2 içermeyen bir inkübatörde ısıtılmalıdır. Uygulama 1. OVOIL ile kaplanmış, ısıtılmış eklentili G-PGD damlacıkları içeren kaplar hazırlayın. 2. Embriyoyu eklentili G-PGD nin birkaç damlacığı içerisinde yıkayıp kültür medyumundan tamamen arınmasını sağlayın. 3. Embriyoyu, +37 C de G-PGD (MOPS tamponlu, Ca 2+ ve Mg 2+ siz medyum) içine yerleştirin. 4. Bir Holding Pipet ile embriyoyu sabitleyin. 5. Zonada bir delik açın. Deliğe temiz bir biyopsi pipeti sokun ve analiz için bir ya da iki blastomeri nazikçe aspire edin. 6. Biyopsisi yapılan embriyolar, G-PGD den arındırılmak için G-2 /G-2 PLUS içinde hassas bir yıkama sonrasında embriyo biyopsisi analizi teyit edilinceye kadar kültür için eklentili G-2 /G-2 PLUS içine yerleştirilmelidir. Etkilenmemiş embriyolar, 5. günde embriyo transferi için seçilebilir ya da 39

fazlalık varsa kriyoprezervasyon için ayrılabilir. Embriyo transferi genellikle, genetik teşhis tamamlandıktan sonra 5. günde yapılabilir. DİKKAT Embriyonun holding pipetteki pozisyonunu ayarlamaya zaman ayırın; böylelikle çekirdekli blastomer net olarak belirlenip biyopsisi yapılabilir. Eğer yoğunlaşma gerçekleşmişse blastomerler arasında birleşmeler olabilir ve bunların alınması güç olabilir. Sabırlı olun, pipeti ileri geri doğru hareket ettirerek blastomerin çıkmasını kolaylaştırmaya çalışın. Biyopsi pipetinin tırtıklı kenarları biyopsisi yapılan hücreye zarar verebilir. Bu yüzden, en yüksek kalitedeki pipetleri kullanın. 40

Embriyo Kriyoprezervasyonu Temel Unsurlar Kriyoprezervasyonun sonuçları, kliniğin temel IVF başarı oranlarına bağlıdır. Eğer IVF sonuçları düşük ise, bu aynı zamanda kriyoprezervasyon sonuçlarına da yansıyacaktır. Sonuçlar; bakımı iyi yapılan ve doğru bir şekilde kalibre edilen dondurma donanımı, özenli şekilde manipülasyona tutma ve yalnızca iyi morfolojik görünüşü olan embriyoların seçilmesi konusunda ayrıntılı özen göstermeye bağlıdır. Donanım Listesi Bu önerilen bir listedir; alternatifleri olabilir. 1. Kriyoprezervasyon Makinesi: Maliyet, mevcut mekan ve bakım ve servis imkanlarına göre satın alma kararınızı verin. 2. Depolama Kabı: Bu, sadece insan embriyoları için kullanılan bir kap olmalıdır. Sıvı nitrojene daldırma geleneksel yöntemdir. Bulaşıcı hastalıkları olan hastalardan gelen embriyolar kriyoprezervasyona tabi tutulacaksa ayrı kaplar kullanılmalıdır. 3. Dondurma için straw lar ya da plastik kriyo-vialler: Bunların, steril olması, toksik olmaması ve en yüksek kalitede olması gereklidir. 4. Kullanılan sıvı nitrojen (LN 2 ) miktarı, donanım ve depolama sistemi tercihinize bağlıdır. Kriyoprezervasyon, hücrelerin minimal hasarla dondurulup çözülmesidir. Bu işlem, hücrelerdeki suyu uzaklaştıran ve soğutma sırasında suyun kristalleşmesini engelleyen bir kriyo-koruyucu kullanılmasıyla gerçekleştirilir. Soğutma sırasında uygun bir sıcaklık profilinin seçilmesi de bu süreci kolaylaştırarak hücrelerin maksimum dehidrasyona tabi tutulmasını sağlar. Kriyo-koruyucunun verilmesi, osmotik rüptür riskini ve yüksek osmolalite ile yüksek kriyo-koruyucu konsantrasyonlarının toksik etkilerini azaltacak bir tarzda gerçekleştirilir. Kullanılan kriyo-koruyucunun seçilmesi, embriyoların hücre gelişimine bağlıdır. Bölünme evresindeki embriyolar için yaygın olarak propanediol ve gelişimin blastokist evresi için yaygın olarak gliserol kullanılır. Hücre hasarının sıvı nitrojenin sıvı fazında depolama aşamasında ortaya çıkmayacağını bilmek önemlidir. Hücrenin hayatta kalması açısından can alıcı öneme sahip olan aşama dondurma ve çözme aşamasıdır. 41

Embriyolar, kriyo-koruyucu çözeltilerin içine yerleştirilir ve daha sonra straw ya da vial gibi kaplara konur. Bunun ardından biyolojik dondurucu, bu kapların etrafındaki sıcaklığı kontrollü olarak düşürür. Çözeltinin donma noktasında, sıvı nitrojene batırılmış forseps ile kaplara dokunma yoluyla buz kristali oluşumu başlatılır. Bu sürece, tohumlama ya da buz çekirdeklenmesi denir. Eğer bu süreç unutulursa ya da yetersiz biçimde uygulanırsa yetersiz dehidrasyon ve hücre içi buz oluşumu yüzünden hücreler zarar görecektir. Hücre dışında buz oluşumu, embriyodan kontrollü su kaybının başlaması için son derece önemli bir olaydır. Nüfuz etmeyen çözünücü maddelerin harici konsantrasyonu artıp embriyonun dış kısmındaki su dondukça, su dışarı çıkarak embriyonun dehidrasyonunu gerçekleştirir. Bu süreç, embriyo donma noktasına erişinceye kadar devam eder. Eğer soğuma çok hızlıysa embriyo yeteri düzeyde dehidrasyona uğramayacaktır. Eğer donmadan sonra embriyo çok yavaş çözülürse aşırı soğumuş su, yavaş ısınma sırasında kristalleşecek ve hücre içindeki buz hasara neden olacaktır. Çözülme hızı genellikle kullanılan kriyo-koruyucuya ve -40 C dan sonraki soğuma hızına bağlı olacaktır. Eğer embriyonun dondurulmması hızlı dondurma (yani -40 C ye kadar hızlı soğuma) ise bu durumda çözülme hızlı olacaktır (yani +30 C de su banyosuna daldırma, 500 C/dakika). Alternatif olarak eğer dondurma yavaş dondurma ise (yani - 80 C ye kadar yavaş soğuma) bu durumda çözülme yaklaşık +10 C/dakikalık bir hızla bir dondurma odasında yapılmalıdır. Gliserol, hızlı çözülmeyi gerektirir. Blastokistler için kriyo protokoller hakkında ayrıntılı bilgi aşağıdaki kaynaklarda bulunabilir: Gardner DK, Maybach J, Lane M (2001) Hyaluronan and RHSA increase blostocyst cryosurvival. Proc 17th World Congress on Fertility and Sterility, Melbourne. s. 226. Lane vd. (2003) Cryo-survival and development of bovine blastocysts are enhanced by culture with recombinant albumin and hyaluronan. Mol Reprod Dev 64:70-78. Gardner DK vd. (2003) Changing the start temperature and cooling rate in slowfreezing protocol increases human blastocyst viability. Fertil and Steril 79 (2): 407-410. 42

Bölünme Evresindeki Embriyoların Kriyoprezervasyonu Bu kriyoprezervasyon yöntemi, oositler ve 8 hücreli evredeki embriyolara kadar pronükleer evredeki oositler için kullanılabilir. Bu yöntem, Testart ve ark. nın (1986) 1,2 propanediolu (PrOH) nüfuz edici kriyokoruyucu olarak kullandıkları yöntemden adapte edilmiştir. Sukroz da nüfuz edici olmayan bir kriyo-koruyucu olarak kullanılmıştır. Sukroz, soğutma sırasında osmotik olarak dehidrasyonu artıran ve embriyoların buzdan çözülmesi sırasında hücre yıkımına karşı koruyan büyük bir moleküldür. Fosfat tamponlu bir çözelti kullanıldığı için tüm aşamalar inkübatörün dışında ve oda sıcaklığında yürütülebilir. FREEZE-KIT 1 Cryo-PBS = 25 mg/ml insan serumu albümini (HSA) içeren fosfat tamponlu çözelti Dondurma Çözeltisi 1 = FS1 = Cryo-PBS içinde 1.5M PrOH Dondurma Çözeltisi 2 = FS2 = Cryo-PBS içinde 1.5M PrOH + 0.1 M Sukroz Bölünme evresindeki embriyolar için dondurma programı örneği Kriyo-koruyucu dengelenmesi de dahil olmak üzere dondurma prosedürünün süresi yaklaşık 2 saattir. Başlangıç sıcaklığı +18.0 ila +25 C Aşama 1-2.0 C/dakika hızla -7.0 C a soğutun Aşama 2 10 dakika -7.0 C'da TUTUN, 2 dakika sonra TOHUMLAYIN Aşama 3-0.3 C/ dakika hızla -30.0 C a soğutun Aşama 4-30.0 C dan -80.0 C'ın altına soğutma (en az 10 C/dk) Straw ları alın ve sıvı nitrojen içine batırın, sıvı nitrojen içine batmış şekilde depolayın (buhar aşamasında değil) 43

Temel Unsurlar Çözülmede hayatta kalma oranı, başlangıçtaki embriyo kalitesine bağlı olduğu için yalnızca yüksek kalitedeki embriyoları kriyoprezervasyona alın. Hasta kimliğini kontrol edin ve prosedüre başlamadan önce tüm evrak işlerini hazırlayın. Uygulama 1. Dondurma için kapları etiketleyin ve ilgili kaplara gerekli hacimde Cryo- PBS, FS1 ve FS2 pipetleyin. Oda sıcaklığına getirin. 2. Morfolojiyi ayrıntılı biçimde gözlemleyin ve kaydedin. Cryo-PBS içinde dondurma için embriyoları durulayın. 3. Embriyoları 10 dakikalığına nazikçe FS1 içine yerleştirin (en fazla 20 dakika). Embriyonun hücreleri büzülecektir. Sonra bu aşama sırasında yeniden dengeleyin. 4. Embriyoları FS2 ye alın, daha sonra straw a 1 cc lik enjektör iliştirerek yükleyin (enjektörler 1 cm silastik hortum kullanılarak straw lara iliştirilebilir). Strawları çıkarın ve sıvı nitrojen sızmayacak şekilde sıkıca kapatın. Enjektör Silastik Hortum FS 2, 2 cm FS 2+embriyolar 2-3 cm FS 2, 1 cm Pamuk tıpa Hava, ¼ cm Hava, ¼ cm Kapak, Plastik tıpa 5. Oda sıcaklığındaki dondurma kutucuğuna yerleştirin ve dondurma programını başlatın. 6. Strawları -7 C da pamuk tıpaya yakın bir yerden sıvı nitrojen ile soğutulmuş forseps ile manuel olarak tohumlayın. Embriyolara yakın bölgeden tohumlama yapmayın. Straw u düşürmeyin ve sallamayın. Eğer straw da hava kabarcıkları varsa bu durum hücrelerin hayatta kalma oranını düşürebilir. Dondurma programına devam edin. 7. Dondurma yaklaşık 2 saat sürer. Düşük sıcaklıklardaki straw lar çabuk kırılabileceği için herhangi bir muameleye tabi tutarken dikkatli olunmalıdır. Sıvı nitrojene daldırın ve -196 C de depolama için ayarlayın. 44

Bölünme evresindeki embriyolar için çözme Programı THAW-KIT 1 Çözme Çözeltisi 1 = TS1 = Cryo-PBS içinde 1.0 M PrOH + 0.2 M Sukroz Çözme Çözeltisi 2 = TS2 = Cryo-PBS içinde 0.5 M PrOH + 0.2 M Sukroz Çözme Çözeltisi 3 = TS3 = Cryo-PBS içinde 0.2 M Sukroz Temel Unsurlar Straw ları birer birer çözün. Tüm aşamaları oda sıcaklığında yapın. Hasta kimliğini kontrol edin ve prosedüre başlamadan önce tüm belgeleri hazırlayın. Uygulama 1. Hastanın kimliğini ve straw un konumunu kontrol edin. Tüm belgeleri hazırlayın. Straw u çözme işlemine kadar küçük Dewar kabında sıvı nitrojen altında saklayın. Çözme çözeltileri için kapları etiketleyin ve ilgili kaplara uygun miktarda TS1, TS2, TS3 ve Cryo-PBS pipetleyin. 2. Straw u çıkarın ve havada 30 saniye çözülmesini sağlayın. Bu süre zarfında straw larla dikkatli çalışın ve hava kabarcığı, çatlak ve sıvı nitrojen sızıntısı olup olmadığını kontrol edin. 3. 30 C daki su banyosuna 30 saniyeliğine yerleştirin. Straw u su banyosundan alın ve dikkatli şekilde kurulayın. Straw un pamuk ucunu steril makasla kesin ve kesilen ucunu 1 cc lik enjektöre iliştirin. Straw un diğer ucunu dikkatli şekilde kesin, Straw u sallamayın ve hava kabacıkları oluşturmayın. 4. Embriyoları nazikçe TS1'e püskürtün. Embriyoların straw dan çıktığını gözlemleyin, eğer hepsini göremezseniz, hızlı bir biçimde straw u yeniden doldurun ve yavaşça boşaltın. Zaman zaman embriyolar straw un kenarlarına yapışacaktır. 5. Embriyoları 5 dakikalığına TS1 de inkübe edin. 6. Embriyoları 5 dakikalığına (yaklaşık olarak) TS2 ye transfer edin. Bu embriyoların osmotik olarak STRES ALTINDA olduğunu ve SON DERECE DİKKATLİ OLARAK muameleye tabi tutulmaları gerektiğini unutmayın. 45

7. Embriyoları 5-10 dakikalığına TS3'e transfer edin. Embriyolar stres altında olacak ve membranları son derece kırılgan hale gelecektir. 8. Embriyoları önce 6 dakika oda sıcaklığında sonra 4 dakika ısıtma bloğunda 37 C da Cryo-PBS içine yerleştirin. CO 2 inkübatörüne yerleştirmeyin, çünkü Cryo-PBS'nin tampon kapasitesi %5 CO 2 atmosferi için yeterli değildir. 9. Embriyolar dengelenmiş, eklentili G-1 /G-1 PLUS (ya da eğer embriyolar 3. gün kriyoprezervasyona alınmışsa G-2 /G-2 PLUS) içine yerleştirilebilir. Dondurma öncesine oranla hayatta kalma durumunu ve morfolojisini değerlendirin ve kaydedin. Embriyolar hemen transfer edilebilirler ya da ilave kültür için bırakılabilirler. Pronükleer oositler, gece boyunca G-1 /G- 1 PLUS içinde kültüre bırakılmalı ve ancak normal bölünme olmuşsa transfer edilmelidir. 10. Embriyoların kriyoprezervasyonunun başarısı açısından çözme siklusu son derece önemlidir. Embryo transferinin doğru günde yapıldığından emin olun. Embriyolar doğal ya da yapay siklusta yerleştirilebilir. Blastokist Evresindeki Embriyoların Kriyoprezervasyonu G-FreezeKit Blast 50 mg/ml G-MM ya da 100 mg/ml HSA-solution eklentisi: SADECE KONTROL ET Blastokist İnkübasyon Medyumu (BIM): = 9.0 ml BIM + 1.0 ml G-MM ya da 1.0 ml HSA-solution. Blastokist Dondurma Çözeltisi 1 (BFS 1) = 9.0 ml BFS 1 + 1.0 ml G-MM ya da 1.0 ml HSA-solution. Blastokist Dondurma Çözeltisi 2 (BFS 2) = 9.0 ml BFS 2 + 1.0 ml G-MM ya da 1.0 ml HSA-solution. BIM, sukroz ve gliserol içermeyen modifiye edilmiş MOPS-tamponlu G-2 medyumu bazlıdır. BFS 1 100 mm sukroz ve % 5 gliserol içerir. BFS 2 200 mm sukroz ve % 10 gliserol içerir. 46

Blastokist evresindeki embriyolar için dondurma programı örneği Başlangıç sıcaklığı - 6 C Aşama 1 2 dakika sonra tohumlayın Aşama 2 10 dakika TUTUN Aşama 3 0.5 C/dakika hızla -32 C a soğutun Straw ları alın ve sıvı nitrojen içine batırın, sıvı nitrojen içine batmış şekilde depolayın (buharda değil) Temel Unsurlar Çözülmede hayatta kalma oranı, başlangıçtaki embriyo kalitesine bağlı olduğu için yalnızca yüksek kalitedeki blastokistleri ( 3BB) kriyoprezervasyona alın. Hasta kimliğini kontrol edin ve prosedüre başlamadan tüm belgeleri hazırlayın. Uygulama 1. BIM, BFS 1 ve BFS 2 için kapları etiketleyin. İlgili kaplara 800 μl BIM, BFS 1 ve BFS 2 pipetleyin. +20 ± 5 C a dengeleyin. 2. Morfolojiyi ayrıntılı biçimde gözlemleyin ve kaydedin. BIM içinde dondurmak için blastokistleri durulayın. 3. Embriyoları 10 dakikalığına BFS 1 içine nazikçe yerleştirin. 4. Embriyoları 7 dakikalığına BFS 2 ye alın. 5. Embriyoları aktarırken minimum hacim kullanın. 6. Bu 7 dakika sırasında dondurma straw unu ayrı bir kapta BFS 2 ile durulayın. 7. 7 dakika sonra straw lara yüklenmek üzere blastokistleri BFS 2 içeren yeni bir kap içine transfer edin. 8. Straw u 1 cc lik enjektöre iliştirerek blastokistleri ön durulamadan geçmiş straw lara yükleyin (enjektörler 1 cm silastik hortum kullanılarak straw lara iliştirilebilir). Straw ları çıkarın ve sıvı nitrojen sızmayacak şekilde sıkıca kapatın. BFS 2 de 15 dakikayı aşmayın. 47

Enjektör Silastik Hortum BFS 2, 2 cm BFS 2+embriyolar 2-3 cm BFS 2, 1 cm Pamuk tıpa Hava, ¼ cm Hava, ¼ cm Kapak, Plastik tıpa 9. Vakit geçirmeden -6 C daki dondurma kutucuğuna yerleştirin. 10. 2 dakika bekleyin. 11. Straw ları -6 C da LN 2 ile soğutulmuş forseps ile embriyoları içeren sütunun üst kısmından manuel olarak tohumlayın. Embriyolara yakın bölgeden straw u tohumlamayın. Straw u düşürmeyin ve sallamayın. Straw içinde hava kabarcıkları kalması bu durum hücrelerin hayatta kalma oranını düşürebilir. 10 dakika daha bekleyin ve daha sonra dondurma programını başlatın. 12. Dondurma yaklaşık 50 dakika sürer. Düşük sıcaklıklarda şişeler hızlı biçimde çözülebileceği için straw ları herhangi bir muameleye tabi tutarken dikkatli olunmalıdır. Sıvı nitrojene daldırın ve -196 C de depolama için ayarlayın. Blastokist evresindeki embriyolar için Çözme Programı G-ThawKit Blast 50 mg/ml G-MM ya da 100 mg/ml HSA-solution eklentisi: SADECE KONTROL ET Blastokist Çözme Çözeltisi 1 (BTS 1): = 9.0 ml BTS 1 + 1.0 ml G-MM ya da 1.0 ml HSA-solution. Blastokist Çözme Çözeltisi 2 (BTS 2): = 9.0 ml BTS 2 + 1.0 ml G-MM ya da 1.0 ml HSA-solution. Blastokist Çözme Çözeltisi 3 (BTS 3): = 9.0 ml BTS 3 + 1.0 ml G-MM ya da 1.0 ml HSA-solution. Blastokist İnkübasyon Medyumu (BIM): = 9.0 ml BIM + 1.0 ml G-MM ya da 1.0 ml HSA-solution. 48

BTS 1, 200 mm sukroz ve % 10 gliserol içerir. BTS 2, 100 mm sukroz ve % 5 gliserol içerir. BTS 3, 100 mm sukroz içerir. BIM, sukroz ve gliserol içermeyen modifiye edilmiş MOPS-tamponlu G-2 medyumu bazlıdır. Uygulama Tüm prosedürler oda sıcaklığında gerçekleştirilir. 1. BIM, BTS 1, BTS 2 ve BTS 3 kaplarını etiketleyin. İlgili kaplara pipetle 800 μl BIM, BTS 1, BTS 2 ve BFS 3 pipetleyin. +20 ± 5 C a dengeleyin. 2. Kriyo-nemlendiriciyi sıvı nitrojen ile doldurun ve hızlı biçimde kılıfları kriyodepolama tanklarından alın ve sıvı nitrojen nemlendirici içine yerleştirin. 3. Forseps kullanarak straw u kılıfdan çıkarın ve havada 10 saniye çözün. 4. Straw u 30 C su banyosuna 30 saniyeliğine yerleştirin. 5. Straw u su banyosundan alın ve bir mendille iyice kurulayın. Straw un pamuk ucunu kesin ve kesilen ucu 1 cc lik enjektöre iliştirin. Enjektör, takılan straw daki embriyoları püskürtmekte kullanılacaktır. 6. Straw un diğer ucunu kesin ve kesilen ucu BTS 1 e sokun. Mikroskop altında enjektör kullanarak embriyoları BTS 1 in içine püskürtün. Geriye kalan sıvıyı kabın kapağına püskürtün ve tüm embriyoların BTS 1 e aktarılmış olduğundan emin olun. Straw un su banyosundan alınmasından BTS 1 e püskürtmeye kadar geçen süre minimal olmalıdır (1 dakikadan daha az). Her defasında sadece bir straw çözülmelidir. 7. Embriyoları, embriyo çapından biraz daha büyük çaplı bir pipet kullanarak vakit geçirmeden 5 dakikalığına BTS 2 ye taşıyın. Mümkün olduğunca az medyum transfer edin. 8. Embriyoları 5 dakikalığına BTS 3 e transfer edin. 9. Embriyoları 5 dakikalığına BIM e transfer edin. 10. Embriyoları bir ısıtıcı tabla üzerinde +37 C de ısıtılmış BIM içeren ikinci bir kaba 5 dakikalığına transfer edin. 11. Embriyoları 1 çukurlu kabın çukurunda dengelenmiş eklentili G-2 /G-2 PLUS içinde bir kez yıkayın ve kültüre yerleştirin. 12. Embriyolar uterusa EmbryoGlue ya da dengelenmiş eklentili G-2 / G-2 PLUS içinde transfer edilmelidir. 49

Kalite Kontrol Programı Vitrolife ürünlerinin imalatında kullanılan tüm hammaddeler, yalnızca insanlarda tıbbi amaçlar için kullanılmaya adanmıştır ve mümkün olduğu durumlarda ABD Farmakope si (USP) ve Avrupa Farmakope si (Ph Eur) kalitesindedir. Hammaddelerin ve nihai ürünlerin her bir LOT u katı kalite kontrol prosedürlerine göre test edilip kontrol edilmiştir. Tüm üretim, katı kontrol ve izlemeye tabi aseptik üretim için sınıflandırılmış bir imalat ortamında gerçekleşmektedir. Üretimdeki Kalite Güvence Sistemi ve Kalite Kontrol Sistemi (ISO 13485:2003 ve 21 CFR Kısım 820:QSR), tüm ürünlerde LOT dan LOT a tutarlılığın mükemmel olmasını sağlamaktadır. Her bir ürünün özelliklerine uygun olarak fizikokimyasal, biyolojik ve işlevsel testler yapılmaktadır. Testlerin yapılmasına ilişkin bilinen standartların yanı sıra Vitrolife Kalite Kontrol Rehberi uyarınca dahili Standart İşletme Prosedürlerine de riayet edilmiştir. Vitrolife ın kalite kontrol programı, medyumların hem güvenliğini hem de etkinliğini garanti etmek için gerekli tüm testleri içermektedir. Kalite Kontrol sisteminde kullanılan tüm cihazlar ve standart çözeltiler kalifiye imalatçılardan temin edilmektedir. Validasyon ve kalibrasyon Vitrolife tarafından uygulanan tüm kalite kontrol prosedürleri, son derece kalifiye personel tarafından kalite güvenceli işlemler (21 CFR Kısım 820:QSR) uyarınca yerine getirilmektedir. Kullanılan tüm yöntem ve donanım sürekli ve kapsamlı onaylama ve kalibrasyon programına tabidir. Fizikokimyasal Testler ph ph ölçümü, USP ve Ph Eur uyarınca onaylanmış bir yöntem kullanılarak yapılır. Her bir ürün için kabul aralığı, ürünün doğası ve kullanım amacı göz önüne alınarak mümkün olduğunca düşük tutulur. Örnekler, ölçümden önce uygun sıcaklık ve atmosferde ön inkübasyona tabi tutulur. % 6 CO 2 de medyumların dengelenmesi, onaylanmış CO 2 seviyesine sahip gaz karışımı kullanılarak yapılır. 50

Osmolalite Osmolalite ölçümü, USP ve Ph Eur uyarınca donma noktasını temel alan onaylanmış bir yöntem kullanılarak yapılır. Her bir ürün için kabul aralığı, ürünün doğası ve kullanım amacı göz önüne alınarak mümkün olduğunca düşük tutulur. Biyolojik Testler Bakteriyel Endotoksin Tüm hammaddeler ve imal edilen her bir LOT için toksik endotoksin seviyelerinin mevcut bulunmadığı teyit edilir. Vitrolife tarafından kullanılan onaylanmış bakteriyel endotoksin testi (LAL testi), 0.005 EU ya da IU/ml derecesindeki minimum hassasiyet ile günümüzde kullanılan endotoksin tespit yöntemleri içerisinde en hassas olanıdır. Onaylanmış prosedür, USP, Ph Eur ve FDA yönergelerinden insan ve hayvan parenteral ilaçları, biyolojik ürünleri ve tıbbi cihazları için son ürün endotoksin testi olarak limulus amebosit lizat testinin onaylanmasına ilişkin kılavuz uyarınca yapılır. Sterilite Testi - Membran Filtrasyonu Tüm medyumların sterilitesi, USP ve Ph Eur uyarınca membran filtrasyonu ile teyit edilir. Medyumlar için test süresi 2 hafta, yağ için ise 3 haftadır. Ne sıvı thioglycollate medyumu ne de soya fasulyesi kazein özü medyumunda tespit edilebilen herhangi bakteriyel ya da fungal büyüme kabul edilmemektedir. Sterilite güvence seviyesine (SAL) ilişkin katı gereklilikler kullanıcıların güvenle uygulama yapmasını sağlar. İşlevsel Testler Fare Embriyo Testi Fare embriyo testi (MEA), işlevsel bir test yöntemidir. Tüm medyumlar, medyum bileşenleri ve medyum imalatında kullanılan kritik cihazlar, tek hücre evresindeki fare embriyolarını genişlemiş blastokist evresine kadar kültürlemek suretiyle test edilir. Embriyoların gelişim evreleri her bir testin özgün koşullarına göre kaydedilir. Medyumların güvenliği ve etkinliği, önceden belirlenen bir sürede uygun sayıda hücre ile tanımlanmış gelişim evrelerine ulaşan embriyoların sayısı gözlemlenerek belirlenir. Ayrıca, tüm ürünler için hücre sayılarının belirlenmesi ve özgün sınır değerleri kümesinin kullanılması, MEA nın hassaslığını arttırır. Çünkü blastokistlerin hücre sayıları ile uterusa transfer edildikten sonra yaşayabilirlikleri birbirleriyle ilişkilidir. 51

Klinik ART de Tıbbi Cihazların Değerlendirilmesi için Fare Embriyo Testi Doğrulaması ABD de Üreme Kliniklerini yöneten Amerikan Patologlar Birliği tarafından laboratuar onayı için tek hücreli Fare Embriyo Testi (MEA) gibi bir biyolojik tahlil gereklidir. Tüm ticari medyumların ve laboratuarda üretilen medyumların, klinik kullanımdan önce bu tür bir test ile değerlendirilmesi gereklidir. 1 MEA, klinik ART de kullanılan medyum bileşenleri, kültür medyumları ve donanımlar için en yaygın kullanılan testtir. 2 MEA nın, klinik çalışmalarda kullanılan donanımlar, medyumların üst katmanı olarak kullanılan yağların yeni LOT ları, sarf malzemeleri ve her yeni medyum LOT unda mevcut olan çeşitli potansiyel embriyo toksinlerin incelenmesinde etkin olduğu kanıtlanmıştır. MEA nın hassaslığını en yüksek düzeye çıkarmak için birçok adım atılmıştır. Örneğin, albümin, potansiyel embriyo toksinleri gizleyebileceği için kontak materyalleri test ederken albüminsiz medyumlar kullanıyoruz. Ayrıca, MEA da 2-hücreli evre yerine 1-hücreli fare embriyoları kullanarak testlerimizin hassasiyetini arttırıyoruz. 3 MEA da blastokistlerin hücre sayılarının belirlenmesi, embriyonun yaşayabilirliğinin bir göstergesidir. Aşağıdaki şekilde gösterildiği üzere, fetal gelişim, blastokist hücre sayısıyla doğru orantılıdır. 4 Bu yüzden MEA kullanılarak klinik ART de kullanılan kültür medyumlarının özelliklerini belirtmek üzere nicel ölçütler tanımlamak mümkündür. KAYNAKÇA 1. Amerikan Patologlar Birliği (1998), Reproductive Laboratory- Section 90 Proposed Checklist, s. 26. 2. Gardner DK ve Lane M (1990), Embryo culture systems. Handbook of In Vitro Fertilization (İkinci Baskı), Der. Trounson AO ve Gardner DK, CRC Press, Boca Raton s. 205-264. 3. Davidson, A., Vermesh, M., Lobo, R.A. ve Paulson, RJ (1998), Mouse embryo culture as quality control for human in vitro fertilization: the one-cell versus the two-cell model. Fertil. Steril., 49: 516-521 4. Lane M ve Gardner DK (1997), Differential regulation of mouse embryo development and viability by amino acids. Reprod Fertil., 109: 153-164 52

Vitrolife dan G5 Series ve ilgili ürünler Ürün 510(k) # Kullanım amacı G-MM K021894 G-MM, Rekombinant İnsan Albümini Çözeltisi içerir (50 mg/ml) ve gamet/embriyo manipülasyonu gibi yardımla üreme prosedürlerinde kullanılmak üzere tasarlanmıştır. Bu prosedürler, G-MM nin kültür medyumu için eklenti olarak kullanılmasını içerir. Enjekte edilebilir bir ürün olarak kullanılamaz. HSA-solution K021896 HSA-solution, İnsan Serum Albümini Çözeltisi içerir (100 mg/ml) ve gamet/embriyo manipülasyonu gibi yardımla üreme prosedürlerinde kullanılmak üzere tasarlanmıştır. Bu prosedürler, G- HSA-solution ın kültür medyumu için eklenti olarak kullanılmasını içerir. Enjekte edilebilir bir ürün olarak kullanılamaz. G-IVF G-IVF PLUS G-1 G-1 PLUS G-2 G-2 PLUS K022245 K022244 K021890 DİKKAT: Tüm kan ürünleri potansiyel bulaşıcı olarak muamele edilmelidir. Bu ürünün türetildiği kaynak malzemesi, Şu an FDA'nın gerekli gördüğü testler, HIV, tip 1 ve 2; HBV; HCV ve HTLV tip I ve II ile test edildiğinde negatif olarak bulunmuştur. İnsan kanından türetilen ürünlerin bulaşıcı ajan iletmeyeceğini hiçbir test yöntemi garanti edemez. Gametlerin hazırlanması, manipülasyonu ve in vitro fertilizasyon için medyum. Embriyoların pronükleer evreden 2. yada 3. güne kadar kültürü için medyum. Embriyoların 3. günden blastokist evresine kadar kültürü için medyum. EmbryoGlue K031015 Embriyo transferi için medyum. G-MOPS G-MOPS PLUS K021893 Oosit ve embriyoların oda atmosferinde muamelesi ve manipülasyonu için medyum. G-GAMETE K021893 Oosit ve embriyoların oda atmosferinde muamelesi ve manipülasyonu için medyum. G-RINSE K022295 Kontakt materyaller ve serviksin durulanması için çözelti. Kültür için değildir. G-FreezeKit Blast K032154 Blastokist evresindeki embriyoların dondurulması için medyumlar. G-ThawKit Blast K032155 Blastokist evresindeki embriyoların çözülmesi için medyumlar. G-PGD K033101 Embriyo biyopsi medyumu. SpermGrad K023403 Gradyan sperm ayrımı için. 53

Ürün 510(k) # Kullanım amacı HYASE * K000627 Kümülüs hücrelerinin giderilmesi için. ICSI * K043116 ICSI öncesi spermin immobilizasyonu ve izolasyonu için. FREEZEKIT 1 * K000623 Bölünme evresindeki embriyoların dondurulması için THAWKIT 1 * K000618 Bölünme evresindeki embriyoların çözülmesi için OVOIL K991351 İn vitro fertilizasyon ve mikromanipülasyon prosedürleri sırasında medyumun kaplanması için * Avustralyada satışı bulunmamaktadır Vitrolife tarafından sağlanan diğer ürünler IVF * K991348 Embriyoların in vitro fertilizasyonu, kültürü ve transferi için ASP * K991345 Oosit toplama ve durulanması (folikül flushing) için. SpermRinse * K000621 Sperm hazırlamak için. CCM * Sadece araştırma amaçlı kullanım için 3. günden blastokist evresine kadar kültürlemek ve transfer için 54

G5 Series : Medyumların İçerikleri Medyum Antibiyotik MOPS NaCHO 3 Amino asitler Vitamin Hyaluronan G-RINSE Gentamicin - Evet - - - G-MOPS / G-MOPS PLUS G-IVF / G-IVF PLUS Gentamicin Evet Evet Non ess - - Gentamicin - Evet Non ess - - G-GAMETE Gentamicin Evet Evet Non ess - - G-1 / G-1 PLUS G-2 / G-2 PLUS Gentamicin - Evet Non ess - Evet Gentamicin - Evet Non ess + ess Evet Evet EmbryoGlue Gentamicin - Evet Non ess + ess Evet Evet G-FreezeKit Blast Gentamicin Evet Evet Non ess - - G-ThawKit Blast Gentamicin Evet Evet Non ess - - G-PGD Gentamicin Evet Evet Non ess - - Ess : Esansiyel aminoasitler Non-ess : Esansiyel Olmayan aminoasitler 55

Vitrolife dan Swemed Ürünleri Detaylı bilgi ve sipariş için www.vitrolife.com adresine bakınız. Ürün 510(k) # Kullanım Amacı Folikül Aspirasyon İğneleri, V-Tip, Single, Double ve Luer Lumenli Denudasyon Pipeti, Farklı çaplarda K991273 K991700 Folikül Aspirasyon İğneleri, gametlerin vücuttan alınması için tasarlanmıştır ve flush yapmak ve/veya oositleri ovaryen foliküllerden aspire etmek için özel olarak geliştirilmiştir. Denudasyon pipetleri oositin kumulus katmanlarının çıkarılması için tasarlanmıştır. Transfer Pipeti, İki farklı çapta ICSI Pipet, Farklı çap, açı ve uzunluklarda Holding Pipet, Farklı çap, açı ve uzunluklarda Blastomer Biyopsi Pipet, Farklı çap ve açılarda Parsiyel Zona Disseksiyon (PZD) Pipeti Hatching Pipet, İki farklı çap ve uzunlukta Embriyo Transfer Kateteri, ClearVision Kök Hücre Kesme Aracı, İki farklı çapta K991700 Transfer Pipetleri oosit, embriyo ve blastokistlerin manipülasyonu ve transferi yada döllenme kontrolü için tasarlanmıştır. K991700 ICSI Pipetleri bir spermin oositlere intrasitoplazmik enjeksiyonu için tasarlanmıştır. K991700 Holding Pipetleri, bir spermin intrasitoplazmik enjeksiyonu yada diğer mikromanipülasyon işlemleri için oosit yada embriyoyu vakum uygulayarak belli bir pozisyonda tutmak için tasarlanmıştır. K022643 K991700 K991700 K053208 YOK Sadece araştırma amaçlı kullanım için Blastomer Biyopsi Pipetleri, biyopsi yapılmış hücrelerdeki genetik materyalin preimplantasyonik genetik tanı (PGD) yapılabilmesi amacıyla blastomer biyopsisi yapmak için tasarlanmıştır. Parsiyel Zona Disseksiyon Pipetleri, yardımla embriyo hatching işlemini yapmak için zona pellucida üzerinde bir delik açmak için tasarlanmıştır Hatching pipetler, yardımla embriyo hatching işlemini yapmak için zona pellusida üzerinde bir delik açmaya uygun olarak tasarlanmıştır. Embriyo Transfer Kateteri, in-vitro olarak döllenmiş (IVF) embriyoların uterus boşluğuna transferi için tasarlanmıştır. Kök Hücre Kesme Aracı, embriyonik kök hücre kolonilerinin tekrar ekim yapılarak yeni koloniler oluşturmak üzere parçalara ayrılması için tasarlanmıştır 56

Önlemler ve Uyarılar Ürün bulanık görünüyorsa kullanmayınız. Sterilizasyonu muhafaza etmek için Vitrolife ürünlerin açılmasının ve kullanılmasının sadece aseptik tekniklerle yapılmasını tavsiye eder. Ürün şişesi açıldıktan sonra saklanmamalıdır. Prosedür bitiminden sonra kalan ürünü atınız. Sadece harici kullanım içindir. Enjekte edilebilen bir ürün olarak kullanılamaz. Dikkat: Amerikan Federal Yasaları bu cihazın bir doktor tarafından veya doktorun isteğiyle satılmasını sınırlandırmaktadır. DİKKAT: Tüm kan ürünleri potansiyel bulaşıcı olarak muamele edilmelidir. Bu ürünün türetildiği kaynak malzemesi, şu an FDA'nın gerekli gördüğü testler, HIV, tip 1 ve 2; HBV; HCV ve HTLV tip I ve II ile test edildiğinde negatif olarak bulunmuştur. İnsan kanından türetilen ürünlerin bulaşıcı ajan iletmeyeceğini hiçbir test yöntemi garanti edemez. G5 Series TM i içeren IVF medyumları nın reprodüktif toksisite ve gelişimsel toksisiste riski henüz belirlenmemiştir ve kesin değildir. 57

Ek Bilgiler Bu yazılı materyal Vitrolife ürünleri hakkında sınırlı bilgiler içermektedir. Burada geçen çeşitli testler ve klinik deneylerle ilgili bilgiler, bu ürünlerin geçmiş kullanımına dair sadece bir özet niteliğindedir. Bu bilgiler eksiksiz olarak dikkate alınmamalıdır ve doktor önerisine alternatif olarak değerlendirilebileceği düşünülmemelidir. Bu sebeple, buradaki bilgilerin bir doktorla ele alınması önemlidir. Bir doktorsanız, burada belirtilen ürünlere ve prosedürlere ilişkin tam bilgi edinmek için Vitrolife ile veya yetkili Vitrolife aracıları veya dağıtıcılarıyla irtibata geçmeniz önerilir. Bu yazılı materyal aynı zamanda özellikle sağlık, uygunluk, tıbbi alan ve sadece insanlarda kullanılabilecek tıbbi tedavilere ilişkin bilgileri de içermektedir. Bu yazılı materyalde açıklanan tüm ürünler her ülkede mevcut olmayabilir. Detaylı bilgi için lütfen Vitrolife veya Vitrolife distribütörleriyle temasa geçin. Ürünlerin kullanımları hakkındaki tavsiyeler bu yazılı materyalin basılışından sonra değişmiş olabilir. En güncel bilgiler için lütfen Vitrolife Anasayfası na başvurun (www.vitrolife.com). Lütfen Vitrolife tarafından üretilen ve satılan tüm Vitrolife medyumları ve sarf malzemeleri nin satın alımlarının Vitrolife anasayfasında (www.vitrolife.com) bulabileceğiniz Genel Satış terimlerine bağlı olduğunu not ediniz, içeriğin uyuşmaması durumunda Genel Satış şartları uygulanacaktır. Tüm IVF medyumları ve Swemed IVF Instruments (Sarf Malzemeleri) Avrupa Birliği CE işareti bulunmaktadır. İki istisna (CCM TM ve Cell Cutting Tool(Kök Hücre Kesme Aracı)) haricindeki tüm ürünler Amerika Birleşik Devletleri nde satışa açıktır. Bu kılavuzdaki bilgiler basım tarihinde yanlışsızdır. Son güncel hali www.vitrolife.com adresinde bulunabilir. 58

Vitrolife, Kılavuz daki metin konusundaki görüşlerinize açıktır. Herhangi bir sorunuz varsa ya da ayrıntılı açıklamaya ihtiyaç duyarsanız lütfen bizimle temasa geçin. Kuzey/Orta/Güney Amerika Vitrolife Inc., 3601 South Inca Street Englewood, Colorado 80110, ABD Tel: 866-848-7687 (866-VITRO US) Faks: 866-848-7632 (866-VITROFAX) Avrupa, Ortadoğu, Asya/Pasifik Vitrolife Sweden AB, Faktorvagen 13 SE-434 37 Kungsbacka, İsveç Tel: +46-31-721 80 20, Faks: 46-31-721 80 92 E-Destek ; Kuzey/Orta/Güney Amerika support.us.fertility@vitrolife.com E-Destek ; Avrupa, Ortadoğu, Asya/Pasifik support.fertility@vitrolife.com E-posta fertility@vitrolife.com Web www.vitrolife.com

Sis Medikal Sanayi ve Ticaret Limited Şirketi Merkez: Cinnah Cad. Gelibolu Sok. No:3/7 06690 Kavaklıdere/ANKARA Tel: 0 312 426 06 63; Faks: 0 312 426 74 01 Şube: Cumhuriyet Cad.No:131/2 34674 Bağlarbaşı/İSTANBUL Tel: 0 216 492 46 20; Faks: 0 216 492 46 42 E-Posta: destek@sismed.com Web: www.sismed.com