BAZI GIDA KATKI MADDELERİNİN GENOTOKSİK ETKİLERİ. Serkan YILMAZ DOKTORA TEZİ BİYOLOJİ GAZİ ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ KASIM 2008 ANKARA

BAZI GIDA KATKI MADDELERİNİN GENOTOKSİK ETKİLERİ Serkan YILMAZ DOKTORA TEZİ BİYOLOJİ GAZİ ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ KASIM 2008 ANKARA

Serkan YILMAZ tarafından hazırlanan BAZI GIDA KATKI MADDELERİNİN GENOTOKSİK ETKİLERİ adlı bu tezin Doktora tezi olarak uygun olduğunu onaylarım. Prof. Dr. Fatma ÜNAL Tez Danışmanı, Biyoloji Anabilim Dalı. Bu çalışma, jürimiz tarafından oy birliği ile Biyoloji Anabilim Dalında Doktora tezi olarak kabul edilmiştir. (Prof. Dr. Fatma ÜNAL) (Biyoloji, Gazi Üniversitesi) (Prof. Dr. Eşref YÜKSEL) (Biyoloji, Gazi Üniversitesi) (Prof. Dr. Sebahattin Özcan) (Tarla Bitkileri, Ankara Üniversitesi) (Prof. Dr. Orhan ARSLAN) (Biyoloji Eğitimi, Gazi Üniversitesi) (Prof. Dr. Cafer Sevimay) (Tarla Bitkileri, Ankara Üniversitesi)..... Tarih: Bu tez ile G.Ü. Fen Bilimleri Enstitüsü Yönetim Kurulu Doktora derecesini onamıştır. Prof. Dr. Nail ÜNSAL Fen Bilimleri Enstitüsü Müdürü.

TEZ BİLDİRİMİ Tez içindeki bütün bilgilerin etik davranış ve akademik kurallar çerçevesinde elde edilerek sunulduğunu, ayrıca tez yazım kurallarına uygun olarak hazırlanan bu çalışmada orijinal olmayan her türlü kaynağa eksiksiz atıf yapıldığını bildiririm. Serkan YILMAZ

iv BAZI GIDA KATKI MADDELERİNİN GENOTOKSİK ETKİLERİ (Doktora Tezi) Serkan YILMAZ GAZİ ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ Kasım 2008 ÖZET Bu çalışmada, gıdalarda sıklıkla kullanılan sitrik asit, fosforik asit, benzoik asit, kalsiyum propiyonat ve sitrik asit ile fosforik asit karışımının in vitro genotoksik etkileri, insan perferal kan lenfositlerinde, kromozom anormalliği (KA), kardeş kromatit değişimi (KKD), mikronükleus (MN) ve komet testleri kullanılarak belirlenmiştir. Sitrik asitin 50, 100, 200 ve 3000 µg/ml, fosforik asitin 25, 50, 100 ve 200 µg/ml, benzoik asitin 50, 100, 200 ve 500 µg/ml, kalsiyum propiyonatın 50, 100, 200 ve 1000 µg/ml ile sitrik asit ve fosforik asit karışımının 25, 50, 100 ve 200 µg/ml lik konsantrasyonları kullanılmıştır. Yapılan analizlerde, kullanılan katkı maddelerinin tümü kromozomal anormallik, kardeş kromatit değişimi ve mikronükleus frekansını kontrole göre istatistiksel olarak anlamlı şekilde artırmıştır. Komet testinde ise, primer DNA hasarı sitrik asitin en yüksek dozunda, diğer uygulamalarda ise hemen hemen tüm dozlarda kontrole göre anlamlı oranda artış göstermiştir. Komet kuyruk yoğunluğu ve komet kuyruk uzunluğu, kontrole göre tüm uygulamalarda önemli düzeyde artmıştır. Mitotik indeks, tüm uygulamalarda kontrole göre anlamlı düşüş göstermiştir. Replikasyon indeksi ve nükleer bölünme indeksi, çalışmada kullanılan maddeler tarafından herhangi bir şekilde etkilenmemiştir. Elde edilen bulgular, çalışmada kullanılan maddelerin in vitro kültüre alınmış ve izole edilmiş insan lenfositlerinde klastojenik, mutajenik ve sitotoksik etkili olduğunu ayrıca primer DNA hasarını indüklediğini göstermiştir.

v Bilim Kodu : 203.1.048 Anahtar Kelimeler : Sitrik asit, fosforik asit, benzoik asit, kalsiyum propiyonat, kromozomal anormallik (KA), kardeş kromatid değişimi (KKD), mikronükleus (MN), komet testi, mitotik indeks (MI), replikasyon indeksi (Rİ), nükleer bölünme indeksi (NBİ), genotoksik etki Sayfa Adedi : 112 Tez Yöneticisi : Prof. Dr. Fatma ÜNAL

vi THE GENOTOXIC EFFECTS OF SOME FOOD ADDITIVES (Ph. D. Thesis) Serkan YILMAZ GAZİ UNIVERSITY INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY November 2008 ABSTRACT In this study, the in vitro genotoxic effects of citric acid, phosphoric acid, benzoic acid, calcium propionate and combination of citric acid and phosphoric acid, frequently used in foods, have been determined in human peripheral blood lymphocytes by using chromosome aberrations (CAs), sister chromatid exchanges (SCEs), micronuclei (MN) and comet assay. 50, 100, 200 and 3000 µg/ml concentrations of citric acid; 25, 50, 100 and 200 µg/ml concentrations of phosphoric acid; 50, 100, 200 and 500 µg/ml concentrations of benzoic acid; 50, 100, 200 and 1000 µg/ml concentrations of calcium propionate; 25, 50, 100 and 200 µg/ml concentrations of citric acid and phosphoric acid combination were used. All of the additives used in this study statistically increased the frequency of chromosome aberrations, sister chromatid exchanges and micronuclei compared to controls. The primary DNA damage in comet assay significantly increased by the highest concentration of citric acid and by almost all the concentrations of other additives. The comet tail intensity and comet tail length significantly increased compared to controls. Mitotic index statistically decreased in all the treatments compared to controls. Replication and nuclear division indices were not effected by the additives used. The results of experiments showed that the additives used in this study have clastogenic,

vii mutagenic, cytotoxic and also DNA damaging effects in cultured and isolated human lymphocytes. Science Code : 203.1.048 Key Words : Citric acid, phosphoric acid, benzoic acid, calcium propionate, chromosomal aberration (CA), sister chromatid exchange (SCE), micronuclei (MN), comet assay, mitotic index (MI), replication index (Rİ), nuclear divison index (NDI), genotoxic effect Page Number : 112 Adviser : Prof. Dr. Fatma ÜNAL

viii TEŞEKKÜR Tez çalışmalarım sırasında her konuda beni destekleyen, tecrübesi, bilgileri ve önerileri ile yönlendiren, saygıdeğer hocam sayın Prof. Dr. Fatma ÜNAL a; tez izleme komitesinde yer alan sayın hocalarım Prof. Dr. Sebahattin ÖZCAN ve Prof. Dr. Eşref YÜKSEL e tezime yaptıkları katkılardan dolayı ayrıca teşekkür ediyorum. Çalışmalarım boyunca bilgi ve görüşlerinden her zaman yararlandığım, değerli dost ve hocalarım Doç. Dr. Deniz YÜZBAŞIOĞLU na, Yrd. Doç. Dr. Hüseyin AKSOY a ve Dr. Mustafa ÇELİK e, deneysel aşamaların bir bölümünde yardımlarını esirgemeyen Yrd. Doç. Dr. Gonca ÇAKMAK DEMİRCİGİL e ve laboratuvarda çalışan tüm arkadaşlara saygı ve sevgilerimle teşekkür ederim. Ayrıca doktora çalışmam boyunca maddi, manevi destekleri ile her zaman yanımda olan sevgili eşim Araş. Gör. Ebru YILMAZ a ve aileme sonsuz teşekkürlerimi sunarım. Bu çalışma, Gazi Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri 05/200641 No lu projesiyle desteklenmiştir. Maddi katkılarından dolayı Gazi Üniversitesi Rektörlüğü ne de teşekkür ederim.

ix İÇİNDEKİLER Sayfa ÖZET...iv ABSTRACT... vi TEŞEKKÜR...viii İÇİNDEKİLER...ix ÇİZELGELERİN LİSTESİ...xii ŞEKİLLERİN LİSTESİ....xiv RESİMLERİN LİSTESİ...xv SİMGELER VE KISALTMALAR...xvii 1. GİRİŞ... 1 2. GENEL BİLGİLER... 4 2.1. Gıda Katkı Maddeleri... 4 2.2. Gıda Katkı Maddelerinin Kullanımı... 8 2.2.1. Gıda katkı maddelerinin güvenli kullanımı için çalışan uluslararası kuruluşlar... 10 2.3. Antioksidan Gıda Katkı Maddeleri...10 2.4. Sitrik Asit (E330)...11 2.5. Fosforik Asit (E338)...13 2.6. Antimikrobiyal Gıda Katkı Maddeleri...14 2.7. Benzoik Asit (E210)...15 2.8. Kalsiyum Propiyonat (E282)...17 2.9. Mutajenite Testleri...18 2.9.1. Kromozom anormallikleri metodu...20

x Sayfa 2.9.2. Kardeş kromatit değişimi=kkd (sister chromatid exchange sce) metodu...21 2.9.3. Mikronükleus (mn) metodu...22 2.9.4. Comet (kuyruklu yıldız) (single cell gel electrophoresis) metodu...23 3. MATERYAL VE METOT...27 3.1. Materyal...27 3.1.1. Kromozom incelemesi için materyal...27 3.1.2. Test materyali...27 3.2. Metot...29 3.2.1. Kültüre alınmış insan lenfositlerindeki çalışmalar...29 3.2.2. izole edilmiş insan lenfositlerindeki çalışmalar...33 4. ARAŞTIRMA BULGULARI...36 4.1. Sitrik Asit Uygulaması...36 4.2. Fosforik Asit Uygulaması...44 4.3. Benzoik Asit Uygulaması...52 4.4. Kalsiyum Propiyonat Uygulaması...61 4.5. Sitrik Asit ve Fosforik Asit Birlikte Uygulaması...69 5. TARTIŞMA...77 KAYNAKLAR...98 ÖZGEÇMİŞ...108

xi ÇİZELGELERİN LİSTESİ Çizelge Sayfa Çizelge 2.1. Sitrik asidin gıdalarda kullanımına izin verilen değerleri...11 Çizelge 2.2. Sitrik asidin çeşitli canlı gruplarında bazı LD 50 değerleri...12 Çizelge 2.3. Fosforik asidin gıdalarda kullanımına izin verilen değerleri...14 Çizelge 2.4. Fosforik asidin çeşitli canlı gruplarında bazı LD 50 değerleri...14 Çizelge 2.5. Benzoik asidin gıdalarda kullanımına izin verilen değerleri...15 Çizelge 2.6. Benzoik asidin çeşitli canlı gruplarında bazı LD 50 değerleri...17 Çizelge 2.7. Kalsiyum propiyonatın gıdalarda kullanımına izin verilen değerleri 17 Çizelge 2.8. Kalsiyum propiyonatın çeşitli canlı gruplarında bazı LD 50 değerleri18 Çizelge 4.1. Sitrik asit uygulaması ile insan periferal lenfositlerinde oluşan kromozomal anormallikler ve frekansları...36 Çizelge 4.2. Sitrik asitin insan lenfositlerinde KKD, Rİ ve Mİ frekansları üzerine etkisi...41 Çizelge 4.3. Sitrik asitin insan lenfositlerinde mikronükleus frekansları ve nükleer bölünme indeksi üzerine etkisi...42 Çizelge 4.4. Sitrik asit ile 1 saat uygulama sonucunda insan lenfositlerinde oluşan DNA hasarı...43 Çizelge 4.5. Fosforik asit uygulaması ile insan periferal lenfositlerinde oluşan kromozomal anormallikler ve frekansları...44 Çizelge 4.6. Fosforik asitin insan lenfositlerinde KKD, Rİ ve Mİ frekansları üzerine etkisi...48 Çizelge 4.7. Fosforik asitin insan lenfositlerinde mikronükleus frekansları ve nükleer bölünme indeksi üzerine etkisi...49 Çizelge 4.8. Fosforik asit ile 1 saat uygulama sonucunda insan lenfositlerinde oluşan DNA hasarı...50

xii Çizelge Sayfa Çizelge 4.9. Benzoik asit uygulaması ile insan periferal lenfositlerinde oluşan kromozomal anormallikler ve frekansları...52 Çizelge 4.10. Benzoik asitin insan lenfositlerinde KKD, Rİ ve Mİ frekansları üzerine etkisi...57 Çizelge 4.11. Benzoik asitin insan lenfositlerinde mikronükleus frekansları ve nükleer bölünme indeksi üzerine etkisi...58 Çizelge 4.12. Benzoik asit ile 1 saat uygulama sonucunda insan lenfositlerinde oluşan DNA hasarı...59 Çizelge 4.13. Kalsiyum propiyonat uygulaması ile insan periferal lenfositlerinde oluşan kromozomal anormallikler ve frekansları...61 Çizelge 4.14. Kalsiyum propiyonatın insan lenfositlerinde KKD, Rİ ve Mİ frekansları üzerine etkisi...65 Çizelge 4.15. Kalsiyum propiyonatın insan lenfositlerinde mikronükleus frekansları ve nükleer bölünme indeksi üzerine etkisi...66 Çizelge 4.16. Kalsiyum propiyonat ile 1 saat uygulama sonucunda insan lenfositlerinde oluşan DNA hasarı...67 Çizelge 4.17. Sitrik asit ve fosforik asit uygulaması ile insan periferal lenfositlerinde oluşan kromozomal anormallikler ve frekansları...69 Çizelge 4.18. Sitrik asit ve fosforik asitin insan lenfositlerinde KKD, Rİ ve Mİ frekansları üzerine etkisi...73 Çizelge 4.19. Sitrik asit ve fosforik asitin insan lenfositlerinde mikronükleus frekansları ve nükleer bölünme indeksi üzerine etkisi...74 Çizelge 4.20. Sitrik asit ve fosforik asit ile 1 saat uygulama sonucunda insan lenfositlerinde oluşan DNA hasarı...76

xiii ŞEKİLLERİN LİSTESİ Şekil Sayfa Şekil 2.1. Sitotoksik ve genotoksik ajanların etkisiyle mikronükleus oluşumu, apoptozis ve nekrozis...23 Şekil 2.2. Comet Assay Tekniği Kullanılarak İncelenebilecek Hücre Tipleri.....26 Şekil 3.1. Benzoik asitin yapısal formülü...28 Şekil 3.2. Birli, ikili, üçlü ve dörtlü kardeş kromatid değişimleri..33

xiv RESİMLERİN LİSTESİ Resim Sayfa Resim 4.1. Sitrik asit uygulamasıyla insan lenfositlerinde oluşan kromozomal anormallikler... 37 Resim 4.2. Sitrik asit uygulamasıyla insan lenfositlerinde oluşan kromozomal anormallikler... 38 Resim 4.3. Sitrik asit uygulamasıyla insan lenfositlerinde oluşan kromozomal anormallikler... 39 Resim 4.4. Sitrik asit uygulamasıyla insan lenfositlerinde oluşan kromozomal anormallikler... 40 Resim 4.5. Sitrik asit uygulamasıyla insan periferal lenfositlerinde oluşan kardeş kromatit değişimleri... 41 Resim 4.6. Sitrik asit uygulamasıyla insan lenfositlerinde oluşan mikronükleuslu binukleat hücreler... 42 Resim 4.7. Sitrik asit ile muamele edilen izole insan lenfositlerinde oluşan DNA hasarlarının komet testi ile görünümü... 43 Resim 4.8. Fosforik asit uygulamasıyla insan lenfositlerinde oluşan kromozomal anormallikler... 45 Resim 4.9. Fosforik asit uygulamasıyla insan lenfositlerinde oluşan kromozomal anormallikler... 46 Resim 4.10. Fosforik asit uygulamasıyla insan lenfositlerinde oluşan kromozomal anormallikler... 47 Resim 4.11. Fosforik asit uygulamasıyla insan periferal lenfositlerinde oluşan kardeş kromatit değişimleri... 48 Resim 4.12. Fosforik asit uygulamasıyla insan lenfositlerinde oluşan mikronükleuslu binukleat hücreler... 49 Resim 4.13. Fosforik asit ile muamele edilen izole insan lenfositlerinde oluşan DNA hasarlarının komet testi ile görünümü... 51 Resim 4.14. Benzoik asit uygulamasıyla insan lenfositlerinde oluşan kromozomal anormallikler... 53

xv Resim Sayfa Resim 4.15. Benzoik asit uygulamasıyla insan lenfositlerinde oluşan kromozomal anormallikler... 54 Resim 4.16. Benzoik asit uygulamasıyla insan lenfositlerinde oluşan kromozomal anormallikler... 55 Resim 4.17. Benzoik asit uygulamasıyla insan lenfositlerinde oluşan kromozomal anormallikler... 56 Resim 4.18. Benzoik asit uygulamasıyla insan periferal lenfositlerinde oluşan kardeş kromatit değişimleri... 57 Resim 4.19. Benzoik asit uygulamasıyla insan lenfositlerinde oluşan mikronükleuslu binukleat hücreler... 58 Resim 4.20. Benzoik asit uygulamasıyla insan lenfositlerinde oluşan mikronükleuslu binukleat hücreler... 59 Resim 4.21. Benzoik asit ile muamele edilen izole insan lenfositlerinde oluşan DNA hasarlarının komet testi ile görünümü... 60 Resim 4.22. Kalsiyum propiyonat uygulamasıyla insan lenfositlerinde oluşan kromozomal anormallikler... 62 Resim 4.23. Kalsiyum propiyonat uygulamasıyla insan lenfositlerinde oluşan kromozomal anormallikler... 63 Resim 4.24. Kalsiyum propiyonat uygulamasıyla insan lenfositlerinde oluşan kromozomal anormallikler... 64 Resim 4.25. Kalsiyum propiyonat uygulamasıyla insan lenfositlerinde oluşan kardeş kromatit değişimleri... 66 Resim 4.26. Kalsiyum propiyonat uygulamasıyla insan lenfositlerinde oluşan mikronükleuslu binukleat hücreler... 67 Resim 4.27. Kalsiyum propiyonat ile muamele edilen izole insan lenfositlerinde oluşan DNA hasarlarının komet testi ile görünümü... 68 Resim 4.28. Sitrik asit ve fosforik asit uygulamasıyla insan lenfositlerinde oluşan kromozomal anormallikler... 70 Resim 4.29. Sitrik asit ve fosforik asit uygulamasıyla insan lenfositlerinde oluşan kromozomal anormallikler... 71

xvi Resim Sayfa Resim 4.30. Sitrik asit ve fosforik asit uygulamasıyla insan lenfositlerinde oluşan kromozomal anormallikler... 72 Resim 4.31. Sitrik asit ve fosforik asit uygulamasıyla insan periferal lenfositlerinde oluşan kardeş kromatit değişimleri... 73 Resim 4.32. Sitrik asit ve fosforik asit uygulamasıyla insan lenfositlerinde oluşan mikronükleuslu binukleat hücreler... 75 Resim 4.33. Sitrik asit ve fosforik asit ile muamele edilen izole insan lenfositlerinde oluşan DNA hasarlarının komet testi ile görünümü... 76

xvii SİMGELER VE KISALTMALAR Bu çalışmada kullanılmış bazı simgeler ve kısaltmalar, açıklamaları ile birlikte aşağıda sunulmuştur. Simgeler Açıklama % Yüzde C Santigrat derece μg/ml Mikrogram/ Mililitre mg/kg Miligram/kilogram μl Mikrolitre ml Mililitre LD 50 Letal doz 50 rpm Devir sayısı V Volt ma Miliamper mm Milimetre Kısaltmalar Açıklama CAs CytB DNA KA KKD Mİ MMC MN NBİ Rİ Chromosomal aberretions SitokalasinB Deoksiribonükleikasit Kromozoamal anormallikler Kardeş kromatid değişimi Mitotik indeks MitomycinC Mikronükleus Nükleer bölünme indeksi Replikasyon indeksi

xviii Kısaltmalar Açıklama SCE BrdU SSC DMSO H 2 O 2 EDTA NaOH NaCl PBS S9 Sister chromatid exchange Bromodeoksiüridin Salin sitrat tamponu Dimetil sülfoksit Hidrojen Peroksit Etilendiaminotetra asetik asit Sodyum Hidroksit Sodyum Klorür Fosfat Tamponu Karaciğer özütü

1 1. GİRİŞ 20. yüzyılın başında, çoğu doğal kaynaklı olmak üzere bir kaç bin kimyasal madde kullanılmakta iken, son yıllarda yaklaşık 80.000 civarında kimyasal madde, çeşitli amaçlar için kullanılmakta ve bu sayı her geçen yıl artmaktadır. Kimyasal maddelerin kullanımı özellikle 1940'lardan sonra hızla artmış ve 1985 yılında 250 milyon ton/yıl'a yükselmiştir. Bugün bu rakam 400 milyon ton/yıl'a ulaşmıştır. Kimyasal maddelerin yoğun ve nispeten kontrolsüz olarak kullanılmaya başlandığı yıllarda yapılan hatalardan dolayı insan sağlığı ve çevre zarar görmüştür. Gerek kimyasal maddelerin her alanda yoğun olarak kullanılmaya başlanması gerekse kontrolsüz kullanımın yarattığı ciddi sağlık ve çevre sorunları, toplumlarda kimyasal kullanımına karşı korku ve tepkilerin oluşmasına neden olmuştur. Kimyasalların insan sağlığı üzerindeki etkileri devamlı tartışma konusu olmaktadır [Karakaya A. E., 2008]. Özellikle 1960 lardan sonra, toksikoloji bilimindeki hızlı gelişmenin yanı sıra, kimyasal maddeler için risk yönetimi uygulamalarının geliştirilmesi, güvenli kimyasal kullanımı olanağını getirmiştir. Bugün ilaç, gıda katkı maddeleri, kozmetik, tarım ilacı, endüstri kimyasalı olarak kullanılan her kimyasalın insan sağlığı ve çevreye olan etkisi ayrıntılı olarak incelenmekte, insan sağlığı ve çevre üzerinde kabul edilemez ölçüde risk taşıyanların kullanımına izin verilmemektedir [Beier, 1990; Sarıkaya, 2005]. Artan dünya nüfusu yeni gıda kaynaklarının bulunmasını zorunlu kıldığı gibi, mevcut kaynakların daha verimli kullanılmasını da zorunlu hale getirmiştir. Ayrıca hızlı endüstrileşme ve kentleşme, hazır yiyeceklere olan talebi de arttırmıştır. Bundan dolayı da, gıdaların uzun süre bozulmaksızın saklanabilmesi önem kazanmıştır. Son 30 yıldır, başta gelişmiş ülkelerde olmak üzere, yiyeceklere katılan kimyasal maddelerin sayıları hızlı bir şekilde artmıştır. Örneğin sadece İngiltere de 1 yıl içerisinde kullanılan kimyasal maddelerin toplam miktarının 200.000 tonu geçtiği sanılmaktadır [Arslan, 2004].

2 Gıda katkı maddeleri, çeşitli amaçlar için kullanılan kimyasal madde grupları içerisinde en çok dikkati çeken gruptur. Çünkü bu maddeler, kişinin istemi dışında hayatı boyunca maruz kalabildiği maddelerdir. Bu maddeler genel anlamda gıdaların özelliklerini istenilen biçimde etkilemek amacıyla kullanılan maddeler olarak tanımlanmaktadır. Bu özellikler arasında görünüm, lezzet, doku, besleyici değer ve depolama ömrü sayılabilir [Altuğ ve ark., 2000]. Gıda katkı maddeleri; yiyeceklerin hazırlanması sırasında besinlerin bozulmasını önlemek, tadını, yapısını ya da besin değerini artırmak amacıyla besinlere eklenmiş maddelerdir. Önceleri bu amaçla doğal katkı maddeleri kullanılmakla birlikte son yıllarda teknolojinin gelişmesi ile birlikte, üretimi hızlandıran ve maliyeti düşüren suni katkı maddeleri de kullanılmaya başlanmıştır [Gürsoy, 2001]. Gıdalara katılan kimyasal maddeler mikrobiyolojik bozulmayı önleme ve dayanıklılığı artırma, besleyici değeri koruma, teknolojik işlemlere yardımcı olma, renk, görünüş, lezzet, koku gibi duyusal özellikleri düzeltme gibi pek çok amaçla kullanılan maddelerdir. Bu maddeler gelişigüzel ve tüzük dışı kullanıldığında, tüketiciler arasında alerjik ve toksik reaksiyonların görülmesine neden olabilmektedir [Arslan, 2004]. Kullanılan gıda katkı maddeleri sağlığa zarar vermeyecek miktarda kullanılsalar bile, bu maddelerin zaman içerisinde vücutta birikerek dokularda tahribata neden olabileceği, dolayısıyla insan sağlığını doğrudan ya da dolaylı olarak tehdit edebileceği göz önünde bulundurulması gereken önemli hususlardır. İşte bu risk nedeniyle gıda katkı maddeleri de dâhil olmak üzere çeşitli maddelerin mutajenik, klastojenik, aneugenik etkileri in vivo ve in vitro testlerle araştırılmaktadır. Yapılan bir çok araştırmada kimyasalların mutajenik etkileri ile kanser oluşturma riski arasında pozitif bir ilişki olduğu saptanmıştır [Kaderlik ve ark., 1992] Çeşitli kimyasalların mutajenik, klastojenik, aneugenik etkilerinin belirlenmesinde kullanılan in vitro test yöntemlerinden insan lenfosit kültürü oldukça sık kullanılan bir yöntemdir. Periferik kandaki beyaz kan hücrelerinden lenfositler kullanılarak, çeşitli kimyasalların genotoksik etkili olup olmadıkları, kromozomal anormallik,

3 kardeş kromatit değişimi ve mikronükleus testi kullanılarak değerlendirilebilmektedir. Ayrıca kimyasalların primer DNA hasarını indükleyip indüklemediği de, son yıllarda geliştirilen komet testi kullanılarak değerlendirilmektedir. Bu çalışmanın amacı, gıdalarda sıklıkla kullanılan katkı maddeleri olan sitrik asit, fosforik asit, benzoik asit ve kalsiyum propiyonatın genotoksik etkilerini, kültüre alınmış insan periferal lenfositlerinde kromozom anormalliği (KA) testi, kardeş kromatit değişimi (KKD) testi, mikronükleus (MN) testi ve izole edilmiş lenfositlerde komet testi kullanarak in vitro yöntemlerle araştırmaktır.

4 2. GENEL BİLGİLER 2.1. Gıda Katkı Maddeleri 1950 li yıllardan bu yana hızla artan dünya nüfusuna paralel olarak gıda maddelerine duyulan gereksinimin çoğalması, şehirleşme ve insanların yaşam biçimlerinde oluşan değişmeler, yüksek kalitede ve çeşitlilikteki gıda maddelerine duyulan ihtiyaç, seyahat ve nakil imkânlarının gelişmesi, yeni gıda işleme ve pazarlama yöntemleri nedeniyle katkı maddelerinin üretimi ve gıdalarda kullanımı büyük oranda artmıştır. Gıdaların organoleptik özelliklerinin düzeltilmesi, depolama ömrünün uzatılması, mikrobiyal kaynaklı bozunmaların engellenmesi ve gıda işlemede yardımcı olmak gibi nedenlerle kullanılan katkı maddeleri, gıda endüstrisinin vazgeçilmez bir parçasını oluşturmaktadır. Bu maddelerin gıdalarda güvenilir bir şekilde kullanımı ise, tüketiciler açısından bu konunun en önemli yönünü oluşturmaktadır. Bu nedenle dünyadaki pek çok uluslar arası ve ulusal kuruluşlar, katkı maddelerinin gıdalarda güvenilir bir şekilde kullanımları amacıyla spesifikasyonlar ve sınırlamalar getirmişlerdir. Ülkemizde de 6 Mart 1988 de yürürlüğe giren gıda katkı maddeleri yönetmeliği gıda katkı maddelerinin kullanılmasına ilişkin tanım ve kısaltmaları, genel hükümleri, işaretleme ve etiketleme ile ilgili prensipleri ve teknik hükümleri kapsamaktadır [Altuğ ve ark., 2000]. Gıda katkı maddeleri, Türk Gıda Kodeksi yönetmeliğinde Tek başına gıda olarak tüketilmeyen veya gıdanın karakteristik bileşeni olarak kullanılmayan, tek başına besleyici değeri olan veya olmayan, teknolojik bir amaç doğrultusunda üretim, işleme, hazırlama, ambalajlama, taşıma veya depolama aşamalarında gıdaya ilave edilmesi sonucu, kendisi ya da yan ürünleri, doğrudan ya da dolaylı olarak o gıdanın bileşeni olan maddeler olarak tanımlanmıştır. Bu tebliğ kapsamında, renklendiriciler ve tatlandırıcılar dışında yer alan gıda katkı maddelerinin fonksiyonlarının tanımları ise aşağıdaki şekilde verilmiştir.

5 a) Ambalajlama gazları: Gıda maddesi kaba yerleştirilmeden önce, yerleştirilirken veya yerleştirildikten sonra kap içine verilen hava dışındaki gazlardır. b) Antioksidanlar: Yağların acılaşması ve renk değişikliği gibi oksidasyonun neden olduğu bozulmaları önleyerek, gıdaların raf ömürlerinin uzatılmasını sağlayan maddelerdir. c) Aroma arttırıcılar: Gıdanın mevcut tat ve/veya kokusunu artıran maddelerdir. ç) Asitler: Asitliği arttıran ve/veya gıdada ekşi bir tat oluşumunu sağlayan maddelerdir. d) Asitlik düzenleyiciler: Gıdaların asitlik veya alkaliliğini değiştiren veya kontrol eden maddelerdir. e) Emülgatörler: Bir gıda maddesinde, yağ ve su gibi birbiri ile karışmayan iki veya daha fazla fazın homojen bir karışım oluşturmasını veya oluşan homojen karışımın sürekliliğini sağlayan maddelerdir. f) Emülsifiye edici tuzlar: Peynirde bulunan proteinleri dispers hale getirerek yağ ve diğer bileşenlerin homojen dağılımını sağlayan maddelerdir. g) Hacim arttırıcılar: Gıdaların faydalanılabilir enerji değerini önemli oranda artırmadan, gıdaların hacmini artıran maddelerdir. ğ) İtici gazlar: Gıdanın bulunduğu kaptan dışarı çıkmasını sağlayan hava dışındaki gazlardır. h) Jelleştiriciler: Jel oluşumu ile gıdada farklı bir yapı oluşturan maddelerdir. ı) Kabartıcılar: Gaz oluşturarak hamurun/yumurtalı soslu hamurun hacmini artıran madde veya madde karışımlarıdır. i) Kıvam arttırıcılar: Gıdanın kıvamını arttıran maddelerdir. j) Koruyucular: Gıdaların mikroorganizmalarla bozulmalarını önleyerek, raf ömürlerinin uzatılmasını sağlayan maddelerdir. k) Köpük oluşturucular: Sıvı veya katı gıdalarda, gaz fazın homojen dağılımını sağlayan maddelerdir. l) Köpüklenmeyi önleyiciler: Köpüklenmeyi azaltan veya önleyen maddelerdir. m) Metal bağlayıcılar: Metalik iyonlarla kimyasal kompleks oluşturan maddelerdir. n) Modifiye nişastalar: Fiziksel veya enzimatik uygulamaya, asit veya alkali ile inceltmeye veya ağartmaya tabi tutulmuş olsun veya olmasın yenilebilir

6 nişastaların bir veya daha fazla kimyasal işleme tabi tutulması ile elde edilen maddelerdir. o) Nem vericiler: Gıda maddelerinin düşük nemli ortamdan etkilenip kurumasını önleyen veya toz gıdaların sıvı ortamlarda çözünmesini kolaylaştıran maddelerdir. ö) Parlatıcılar: Yağlayıcılar da dahil, gıdaların dış yüzeyine uygulandığında parlak bir görünüm veren veya koruyucu bir tabaka sağlayan maddelerdir. p) Sertleştiriciler: Meyve ve sebzelerin yapısını koruyan ya da dokularını sert veya gevrek hale getiren veya mevcut jelleştiriciler ile reaksiyona girerek jel oluşumunu sağlayan veya güçlendiren maddelerdir. r) Stabilizörler: Gıdaların fizikokimyasal durumlarını korumalarını sağlayan; gıdada bulunan iki veya daha fazla birbiri ile karışmayan fazın homojen dağılımının sürekliliğini sağlayan, gıdaların var olan renklerini koruyan veya kuvvetlendiren, proteinler arası çapraz bağ oluşturarak gıda parçacıklarının bağlanmasının sağlanması gibi gıdaların bağlanma kapasitelerini artıran maddelerdir. s) Taşıyıcılar: Taşıyıcı çözücüler dahil olmak üzere, gıda katkı maddelerini ve aromaları çözmek, seyreltmek veya bunların dağılımını sağlamak için kullanılan ya da herhangi bir teknolojik etki göstermeden gıda katkı maddeleri ve aromaları fiziksel yollarla modifiye ederek, bu maddelerin teknolojik fonksiyonlarını değiştirmeden, uygulama ve kullanımını kolaylaştıran maddelerdir. ş) Topaklanmayı önleyiciler: Gıda parçacıklarının birbirine yapışma eğilimini azaltan veya önleyen maddelerdir. t) Un işlem maddeleri: Hamurun işlenme ve pişirilme kalitesini geliştirmek amacı ile una veya hamura ilave edilen, emülgatörler dışındaki maddelerdir. Yine Türk Gıda Kodeksi Yönetmeliğinin 5. maddesinin a ve b bendinde hangi maddelerin gıda katkı maddesi olarak kullanılamayacağı belirtilmiştir. Bunlar; 1) İşlem yardımcıları, 2) Bitki üretiminde bitkileri korumak için kullanılan maddeler, 3) Aromalar, 4) Gıda maddelerine beslenme öğesi olarak katılan mineral vitamin, iz elementler ve benzeri ürünler,

7 5) Pektin içeren maddeler ve kurutulmuş elma posası veya turunçgillerin kabuğundan veya her ikisinin karışımından, seyreltik asit muamelesini takiben sodyum ve potasyum tuzları ile kısmi nötralizasyon sonucu elde edilen türev maddeler (sıvı pektin), 6) Sakız mayaları, 7) Beyaz veya sarı dekstrin, kavrulmuş veya dekstrine edilmiş nişasta, asit veya alkali uygulaması ile modifiye edilmiş nişasta, ağartılmış nişasta, fiziksel olarak modifiye edilmiş nişasta ve amilolitik enzim uygulamasına tabi tutulmuş nişasta, 8) Amonyum klorür, 9) Kan plazması, yenilebilir jelatin, protein hidrolizatları ve bunların tuzları, süt proteini ve gluten, 10) Glutamik asit, glisin, sistein, sistin ve bunların tuzları dışındaki aminoasitler ve bunların tuzları ve katkı fonksiyonuna sahip olmayanları, 11) Kazeinatlar ve kazein, 12) İnülin. Hazır besinlerdeki katkı maddelerinin kullanımında, üreticiler özellikle aşağıdaki kıstasları dikkate almaktadırlar. Besinsel değeri artırmak, Kaliteyi artırmak, İsrafı azaltmak, Saklama kalitesini artırmak, Gıdanın kabulünü artırmak, Hazırlamayı kolaylaştırmak, Gıdayı daha kullanışlı hale getirmek. Dünyada kullanımına onay verilen yaklaşık 2800 katkı maddesinin 300 tanesine Türk Gıda Kodeksi Yönetmeliği nde gıdalarda değişik miktarlarda kullanılmasına izin verilmiştir. Avrupa Birliği nde kullanımına onay verilen katkı maddesi sayısı ise 297 dir [Sarıkaya, 2005].

8 2.2. Gıda Katkı Maddelerinin Kullanımı Gıda katkı maddeleri, insanların doğrudan ya da dolaylı olarak maruz kaldıkları kimyasallar içinde önemli bir yere sahiptir. Zira dünyada milyonlarca insan bu maddelere istekleri dışında maruz kalmaktadırlar. Bu nedenle bir gıda katkı maddesinin kullanıma sunulmadan önce, ulusal ve uluslararası birçok kuruluşun onayından geçmesi gerekmektedir. Gıda katkı maddelerinin kullanım izinlerinin verilmesinde ilk basamak, kullanıma sunulacak olan kimyasalın deney hayvanlarında hangi miktarlarda hangi etkileri göstereceğinin saptanmasıdır. Bu amaçla genellikle fare, rat, kobay gibi deney hayvanları kullanılmaktadır. Kimyasalın etkisini belirlemek amacıyla öncelikle bu maddenin yüksek konsantrasyonlar da dâhil olmak üzere çeşitli dozları oral, intraperitonal veya buna benzer yollarla deneklere verilerek muhtemel tüm toksik etkileri araştırılır. Tüm toksisite testlerinde bir kimyasal madde için ortalama 3000 civarında deney hayvanı kullanılır. Bu testler uluslar arası kuruluşların belirlediği iyi laboratuar uygulamaları (GLP) kurallarına göre çalışan laboratuarlarda yapılır. Çalışmalarda kullanılan testler aşağıdaki gibidir [Saygı, 2003; Sarıkaya, 2005]. A. Toksikokinetik Çalışmalar: İncelenen katkı maddesinin organizmada emilimi, dağılımı, biyotransformasyonu ve atılımı incelenir. B. Toksisite Testleri: 1. Akut Toksisite Testi: En az üç doz ve tek seferde uygulanan ve 1, 2, 24, 48, 72 ve 96 saat gibi kısa süreler içinde uygulanan testlerdir. 2. Subakut Toksisite Testi: Kimyasal madde deney hayvanlarına her gün bir veya daha fazla tekrarlanan şekilde verilir.test süresi 13 haftadır. 3. Subkronik Toksisite Testi: Sıçan ve köpek gibi deney hayvanlarının seçildiği bu testte deney süresi 3 aydır. 4. Kronik Toksisite Testi: Uzun dönemde kimyasal madde maruziyetinin neden olabileceği toksik etkilerin saptanması için dizayn edilen toksisite testidir.

9 Deneysel kronik toksisite testi süresi deneyde kullanılan hayvanın tüm ömrünce, örneğin bu süre sıçanlarda yaklaşık 2 yıl, köpeklerde ise 57 yıl kadar olabilir. 5. Mutajenik etki: DNA üzerinde kalıcı değişikliklerdir. 6. Karsinojenik etki: Kanser yapıcı etkidir. 7. Teratojenik etki: Sakat yavru doğumlarına yol açan etkidir. 8. Transplasental Karsinojenik etki: Gebenin yavrusunda doğumdan yıllar sonra kanser oluşumudur. 9. İmmünotoksik etki: İmmün sistem üzerinde toksik etkidir. 10. Fertilite testi: Üreme yeteneği üzerine etkidir. 11. Nörotoksik etki: Sinir sistemi üzerine toksik etkidir. Toksisite test sonuçları uluslararsı/ulusal kuruluşlarca oluşturulan bilimsel komitelerce değerlendirilerek güvenli kullanım için gerekli sayısal değerlere ulaşılır [Sarıkaya, 2005]. Çalışmalar sonunda katkı maddesinin hiçbir etkisinin bulunmadığı bir doz elde edilmezse, bu maddenin kullanımına izin verilmez. Eğer deney hayvanına hiçbir etki göstermeyen bir doz elde edilirse, bu doz etkisiz doz veya NOAEL (No Obversed Adverse Effect Level) olarak tanımlanır. Besinlere katılacak katkı maddesinin maksimum miktarlarının belirlenmesi için katkı maddesinin ADI (Acceptable Daily Intake) yani günlük alınabilecek miktarının belirlenmesi gereklidir. Katkı maddesinin ADI değeri toksikolojik testlerle belirlenir. Deney hayvanlarına belirli dozlarda katkı maddesi verilerek bunların metabolizması, atılımı ve emilimi incelenir [WHO, 2001]. Deney insanlar üzerinde uygulanamayacağından, güvenlik faktörü olarak isimlendirilen bir faktör kullanılır. Güvenlik faktörü genellikle 100 dür. Yani deney hayvanında hiçbir etki göstermeyen dozun 1/100 ü insan için kabul edilir. Böylece günlük alınabilecek miktar (ADI) insanın vücut ağırlığının kilogramı başına mg olarak belirlenir. Günlük maksimum alım= ADI X Vücut ağırlığı [WHO, 2001].

10 2.2.1. Gıda Katkı Maddelerinin Güvenli Kullanımı İçin Çalışan Uluslararası Kuruluşlar 1. CAC (Codex Alimentarius Commission): Birleşmiş milletlere bağlı olarak çalışan bir kuruluştur. Kuruluşun görevi, dünyada gıda ile ilgili uygulamaların teknoloji ve sağlık açısından standardize edilmesidir. 2. JECFA (The Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives): 1956 yılından bu yana katkı maddelerinin insan sağlığı yönünden değerlendirilmesi için toplanan FAO/WHO ortak uzmanlar komitelerine verilen isimdir. Bu komiteler, gıda katkı maddeleri için tüm bilimsel verileri inceleyerek değerlendirmeler yapmakta ve ADI değerlerini tespit etmektedir. 3. JMPR (The Joint FAO/WHO Meeting on Pesticides Residues): Bu kuruluş gıda ürünlerindeki pestisit kalıntılarını değerlendiren ve gıdalarda günlük alımda insan sağlığına zarar mermeyecek maksimum pestisit miktarlarını belirleyen bir kuruluştur. 4. SCF (EuScientific Committe on Food): Avrupa Birliği nin gıdalarla ilgili toksikoloji, hijyen ve beslenme konularında yetkili olan komitesidir. 5. FDA (Food and Drug Administration): Yukarıda bahsedilen kuruluşlar arasında en eski tarihe sahip olan kuruluştur. ABD nin ulusal kuruluşu olsa da tüm dünyada referans olarak gösterilen bir kurumdur [Sarıkaya, 2005; Karaali, 1994]. 2.3. Antioksidan Gıda Katkı Maddeleri Antioksidan maddeler uzun ömürlü gıdalarda oksitlenmeyi engelleyerek gıdaların daha uzun ömürlü olmasını sağlayan maddelerdir. Serbest radikal oluşumunu engelleyerek oksidasyon reaksiyonlarını inhibe ederler. Serbest radikaller, aminoasitlerin oksidasyonu yanında, peptid bağlarının hidrolizi, disülfit bağlarının oluşumu ve çapraz bağlanmalara yol açabilirler. Bunun sonucunda enzimler fonksiyon kaybına uğrayabilirler ve böylece gıdalarda bozulmalara yol açabilirler [Gürsoy, 2001]. Antioksidan maddelere örnek olarak sitrik asit, fosforik asit, butillendirilmiş hidroksi anisol, butillendirilmiş hidroksi toluen verilebilir.

11 2.4. Sitrik Asit (E330) Sitrik asit, bitki ve hayvanların bilinen metabolitleri arasında yer alır. İlk olarak limon suyundan izole edilmiş daha sonra birçok organizmanın fermentesyonla bu asidi ürettiği belirlenmiştir. Endüstriyel olarak kullanımına da 1860 yılında İtalya da başlanmıştır. 1893 yılında Penicillium mold türü mantarın şekerden sitrik asit ürettiği tespit edilmiştir. Yine 1917 yılında Aspergillus niger in de hızlı ve verimli bir sitrik asit üreticisi olduğu belirlenmiştir [Elmacı, 2001]. Bu madde, ticari olarak kolayca elde edilmesi ve ekonomik olarak uygun olması nedeniyle gıdalarda sıklıkla kullanılır. Gıdalara asitleştirme, ph düzenleyicisi, nadiren renk verici olarak katılmaktadır. Bu madde meşrubatlarda, şekerli gıdalarda, konservelerde kullanılmasının yanı sıra, kozmetik endüstrisinde de kullanılmaktadır. Sitrik asidin Türk Gıda Kodeksi nde hangi gıdalarda ne kadar kullanılacağını belirten göstergeleri Çizelge 2.1 deki gibidir. Çizelge 2.1. Sitrik asitin gıdalarda kullanımına izin verilen değerleri Gıda Maddesi Kakao ve kakao ürünleri ile Çikolata ve Çikolata ürünleri Tebliği nde yer alan ürünler Şaraplar Meyve Suları Nektarlar En yüksek Miktar % 0,5 1 g/l 3 g/l 5 g/l Sitrik asit, bitki ve hayvan hücrelerinin yapısında doğal olarak bulunan zayıf organik bir asittir. Organizmada sitrik asit döngüsü olarak da isimlendirilen (Krebs döngüsü, trikarboksilik asit döngüsü) döngü ile oluşur. Sitrik asit döngüsünde karbohidratlar, yağ asitleri ve aminoasitler gibi enerji bakımından zengin moleküller oksidasyona uğrar. Dairesel bir yol izleyen ve oksijenli ortamda gerçekleşen bu döngünün ilk basamağında asetilcoa ve oksaloasetik asitten sitrik asit sentezi gerçekleştirilir. Sitrik asit döngüsü ile organizma için gerekli olan enerji yani ATP sentezlenir

12 [Gözükara, 1989; Koçak, 2005]. Bu madde için bazı LD 50 değerleri Çizelge 2.2 de verilmiştir [Gürsoy, 2001]. Çizelge 2.2. Sitrik asitin çeşitli canlı gruplarında bazı LD 50 değerleri Canlı türü Uygulama Şekli LD 50 değeri Rat Oral 11700 mg/kg Rat İntraperitonal 883 mg/kg Rat Subkutan 5500 mg/kg Fare Oral 5040 mg/kg Fare İntraperitonal 961 mg/kg Fare Subkutan 2700 mg/kg Fare İntravenöz 42 mg/kg Tavşan Oral 7000 mg/kg Tavşan İntravenöz 330 mg/kg Gıdalarda oldukça sıklıkla kullanılan bu maddenin genotoksik etkileri ile ilgili olarak çok fazla çalışma yapılmamıştır. Yapılan sınırlı sayıdaki çalışmaların bazıları şu şekildedir. 1984 yılında Japonya da yapılan bir çalışmada sitrik asit de dâhil olmak üzere toplam 347 sentetik katkı maddesinin Salmonella/mikrozom testi ve in vitro Çin hamsteri fibroblast hücreleri kullanılarak genotoksisitesi belirlenmeye çalışılmıştır. Sitrik asit her iki testte de herhangi bir etki göstermemiştir [Ishidate ve ark., 1984]. Aktaç ve ark. (2003) yaptıkları bir çalışmada sitrik asidin fare karaciğeri üzerine toksik etkilerini incelemişlerdir. 10 gün süre ile bu maddelerin uygulanmasıyla tüm deney gruplarında karaciğerde kromatin yıkımı, vakuollü ve camsı sitoplâzmalı hepatositler, hepatositler içerisinde kollajen fiberlerinde artış şeklinde nekrotik değişikliklere rastlamışlardır. Yine urikaz aktivitesi kontrole göre tüm gruplarda artarken, katalaz aktivitesinde istatistiksel olarak önemli bir artışa rastlamamışlardır [Aktaç ve ark., 2003].

13 Koçak (2005), sitrik asitin in vivo genotoksik etkisini Tinca tinca (L., 1758) (Pisces: Cyprinidae) eritrositlerinde mikronükleus testi ile araştırmıştır. Araştırıcı sitrik asidin 200, 300 ve 400 µg/ml lik dozlarını kullanmış ve uygulama gruplarının tamamında MN oluşumunun kontrole göre önemli oranda arttığını belirlemiştir [Koçak, 2005]. Türkoğlu (2007), sitrik asidin A. cepa da mitotik indeksi kontrole göre anlamlı oranda düşürdüğünü, ayrıca 5 saatlik uygulamadan sonra metafaz safhasında artış olduğunu, 10 ve 20 saatlik uygulamalarda anafaz ve telofaz safhalarında düşüş olduğunu belirtmiştir. Ayrıca sitrik asidin anafazda köprüler, cmitoz, kalgın kromozomlar ve yapışıklığa sebep olduğunu göstermiştir. Tüm uygulama gruplarında sitrik asidin kromozomal anormalliklerde kontrole göre anlamlı oranda artışa neden olduğunu göstermiştir [Türkoğlu, 2007]. Yukarıda belirtilen çalışmalar dışında, sitrik asitin insan lenfositlerinde genotoksisitesi ile ilgili herhangi bir çalışma bulunmamaktadır 2.5. Fosforik Asit (E338) Fosforik asit, fosfor grubu içeren inorganik bir asittir. Gıdalarda asitleştirici, emülsifiyer, şelatör, tampon olarak pişirilmiş yiyeceklerde, kolalı içeceklerde, peynirde, pişirilmiş uzun ömürlü etlerde, alkol içermeyen aromalı içeceklerde sıklıkla kullanılmaktadır. Fosforik asit vücutta özellikle kemik ve dişlerin yapısına katılması nedeniyle önemli bir maddedir. Yine karbohidrat, yağ ve proteinlerin birçok metabolik işlemlerinde oldukça önemli bir yere sahiptir. Bununla birlikte vücutta aşırı miktarda fosforik asit bulunması, kalsiyum eksikliğine ve dolayısıyla zayıf diş ve kemik yapısının ortaya çıkmasına sebep olmaktadır. Fosforik asitin Türk Gıda Kodeksi nde hangi gıdalarda ne kadar kullanılacağını belirten göstergeleri Çizelge 2.3 deki gibidir.

14 Çizelge 2.3. Fosforik asitin gıdalarda kullanımına izin verilen değerleri Gıda Maddesi Alkol içermeyen aromalı içecekler Ek besinler En yüksek Miktar 700 mg/l 1 g/kg Fosforik asitin karsinojenik, nörotoksik etkileriyle ilgili olarak bir bilgi bulunmamaktadır. Bununla birlikte genotoksisite çalışmaları da oldukça az ve sadece bakterilerle sınırlıdır. Fosforik asit Salmonella typhimurium TA97, TA98, TA100, TA104 suşlarında ve Escherichia coli de herhangi bir mutajenik etki göstermemiştir [Dose, 1994]. Yukarıda belirtilen çalışmalar dışında, benzoik asitin insan lenfositlerinde genotoksisitesi ile ilgili herhangi bir çalışma bulunmamaktadır. Uzun ömürlü gıdalarda sıklıkla kullanılan bu madde için bazı LD 50 değerleri Çizelge 2.4 de verilmiştir. Çizelge 2.4. Fosforik asitin çeşitli canlı gruplarında bazı LD 50 değerleri Canlı türü Uygulama Şekli LD 50 değeri Rat Oral 1530 mg/kg Fare Oral 1250 mg/kg Tavşan Deri 2740 mg/kg 2.6. Antimikrobiyal Gıda Katkı Maddeleri Antimikrobiyal katkı maddeleri, gıdalarda bulunabilecek mikroorganizmaların hücre zarı, hücre duvarı, gen yapısı, protein yapısı ya da enzim sistemlerini etkileyerek durdurucu veya öldürücü özelliğe sahip olan maddelerdir [Ekşi, 1989]. Gıdalara eklenen antimikrobiyal maddeler tat ve kokuyu korurken, yağ ve benzeri maddelerin acılaşmasını engeller. En önemli görevleri besinleri mikroorganizmalardan korumaktır [Saldamh, 1985]. Antimikrobiyal maddeler yukarıda bahsedilen olumlu etkilerinin yanı sıra, çeşitli şekillerde sağlığı olumsuz yönde de etkileyebilirler, bu nedenle en yüksek kullanım sınırlarının üzerinde kullanılmaması gerekli olan

15 maddelerdir. Yaygın olarak kullanılan antimikrobiyal maddelere örnek olarak benzoik asit, kalsiyum propiyonat, sodyum nitrat, sodyum nitrit, sorbik asit, kalsiyum asetat verilebilir. 2.7. Benzoik Asit (E210) Benzoik asit, toluenin likid faz oksidasyonu ile elde edilmektedir. Benzoik asit ve tuzları katkı maddesi olarak gıdalarda, bunun yanı sıra kozmetik endüstrisinde de kullanılmaktadır. Yıllık benzoik asit üretiminin 638.000 ton olduğu belirtilmektedir. Benzoik asit, birçok bitki ve hayvanda doğal olarak bulunan bir maddedir. Özellikle süt ve süt ürünlerinde çokça bulunmaktadır. Kirazda yaklaşık % 0.05 oranında, bir çok Vaccinium türlerinin olgun meyvası (örneğin kızılcık) 3001300 mg oranında serbest benzoik asit içermektedir. Yine Nectria galligena mantarı ile infekte olmuş elmada da gözlemlenmektedir. Hayvanlarda da ilk olarak omnivorlar veya herbivorlarda (örneğin Lagopus mutus, Ovibos moschatus ve Elephas maximus da tespit edilmiştir [Wilson ve ark. 2004]. Diğer yandan memelilerde idrarda hippurik asidin bir parçası olarak bulunur [WHO, 2000]. Bu madde aromalı içeceklerde, alkollü içeceklerde, soslarda ve diğer birçok gıdada yoğun olarak kullanılmaktadır. Gıdalarda özellikle asitleştirme amacıyla kullanılmaktadır. Benzoik asitin Türk Gıda Kodeksi nde hangi gıdalarda ne kadar kullanılacağını belirten göstergeleri Çizelge 2.5 deki gibidir. Çizelge 2.5. Benzoik asitin gıdalarda kullanımına izin verilen değerleri Gıda Maddesi Aromalı içecekler Alkollü içecekler Soslar Pişmiş kırmızı pancar En yüksek Miktar 150 µg/ml 200500 µg/ml 1000 µg/ml 2000 µg/ml Tohda ve ark. (1980), benzoik asitin insan lymphoblastoid hücrelerinde 30 mm lık konsantrasyonda [Tohda ve ark., 1980], yine Zeiger ve ark. (1988) S.

16 typhimurium un TA97, 98, 100, 1535 ve 1537 lik suşlarında 5000 µg/petri üzerinde sitotoksik etkili olduğunu belirtmişlerdir [Zeiger ve ark., 1988]. Ishidate ve arkadaşları (1984), benzoik asitin genotoksik etkilerini Salmonella/mikrozom testi ve in vitro Çin hamsteri fibroblast hücreleri kullanılarak belirlemişlerdir. Araştırıcılar benzoik asitin her iki testte de zayıf genotoksik etkili bir madde olduğunu belirtmişlerdir [Ishidate ve ark., 1984]. Sasaki ve arkadaşları (2002), benzoik asit ve tuzlarının genotoksik etkilerini 8 farklı fare organında (mide, idrar kesesi, beyin, karaciğer, böbrek, akciğer, kolon, kemik iliği) komet test yöntemiyle araştırmışlardır. Araştırıcılar benzoik asit ve tuzlarının çalışılan fare organlarında DNA hasarına neden olmadığını belirlemişlerdir [Sasaki ve ark., 2002]. Aktaç ve ark. (2003), benzoik asitin fare karaciğerinde tüm deney gruplarında nekrotik değişikliklere neden olduğunu belirlemişlerdir. Bu değişiklikler kromatin yıkımı, vakuollü ve camsı sitoplazmalı hepatositler, hepatositler içerisinde kollagen fiberlerinde artış şeklinde gerçekleşmiştir. Urikaz aktivitesi kontrole göre tüm gruplarda artarken, katalaz aktivitesinde istatiksel olarak önemli bir artışa rastlamamışlardır [Aktaç ve ark., 2003]. Sarıkaya ve Solak (2003), benzoik asidin 50, 75 ve 100 mm lık dozlarını kullanarak Drosophila da SMART testi ile etkilerini incelemişlerdir. Araştırıcılar, benzoik asitin Drosophila da mutasyonlarda artışa neden olduğunu, ayrıca yaşam süresi üzerinde de önemli oranda etkili olduğu ve kontrole göre yaşam süresini kısalttığını bildirmişlerdir [Sarıkaya ve Solak, 2003]. Yukarıda belirtilen çalışmalar dışında, benzoik asitin insan lenfositlerinde genotoksisitesi ile ilgili herhangi bir çalışma bulunmamaktadır. Gıdalarda sıklıkla kullanılan bu madde için bazı LD 50 değerleri Çizelge 2.6 daki gibidir.

17 Çizelge 2.6. Benzoik asitin çeşitli canlı gruplarında bazı LD 50 değerleri Canlı türü Uygulama Şekli LD 50 değeri Rat Oral 17002530 mg/kg Fare Oral 17362370 mg/kg 2.8. Kalsiyum Propiyonat (E282) Uzun ömürlü ekmeklerde antimikrobiyal bir madde olarak kullanılmaktadır. Ekmek hamuruna un ağırlığı üzerinden yaklaşık olarak % 0,10,3 oranında katılabilmektedir. Propiyonat, küfleri inhibe ettiği ve mayalara etki etmediği için bir antirop ajanı olarak uygun görülmektedir. Fırınlanmış gıdalarda hem sodyum hem de kalsiyum propiyonat kullanılabilmekte, ancak ekmekte bir zenginleştirici olmasından dolayı kalsiyum propiyonat tercih edilmektedir [Göçmen, 2001]. Kalsiyum propiyonatın Türk Gıda Kodeksi nde hangi gıdalarda ne kadar kullanılacağını belirten göstergeleri Çizelge 2.7 deki gibidir. Çizelge 2.7. Kalsiyum propiyonatın gıdalarda kullanımına izin verilen değerleri Gıda Maddesi Ambalajlı dilimli ekmek ve çavdar ekmeği Enerjisi azaltılmış ekmek Kısmen fırınlanmış ambalajlı ekmek Ambalajlı ekmek çeşitleri En yüksek Miktar 3000 mg/kg 2000 mg/kg 2000 mg/kg 2000 mg/kg Kalsiyum propiyonatın karsinojenik, teratojenik ve nörotoksik etkileri ile ilgili çalışmalar bulunmamaktadır. Genotoksisitesi ile ilgili olarak yapılan birkaç çalışma bulunmaktadır. Kalsiyum propiyonat Bacillus subtilis rekombinasyon testi, E. coli ve S. typhimurium reversion testinde herhangi bir mutajenik etki göstermemiştir [Ohta ve ark. 1980]. Yapılan başka bir çalışmada kalsiyum propiyonatın AMES testinde negatif etkili olduğu ancak Çin hamsteri akciğer hücrelerinde kromozomal

18 anormalliklere neden olduğu belirlenmiştir [Ishidate ve ark., 1984]. Türkoğlu (2008), kalsiyum propiyonatın A. cepa kromozomlarında kromozomal anormallik frekansını kontrole göre önemli oranda artırdığını, mitotik indeksi de önemli oranda düşürdüğünü belirtmiştir [Türkoğlu, 2008]. Kalsiyum propiyonatın insan lenfositlerinde genotoksik etkileri ile ilgili herhangi bir çalışma yoktur. Çoğunlukla uzun ömürlü ekmeklerde kullanılan bu madde için bazı LD 50 değerleri Çizelge 2.8 deki gibidir. Çizelge 2.8. Kalsiyum propiyonatın çeşitli canlı gruplarında bazı LD 50 değerleri Canlı türü Uygulama Şekli LD 50 değeri Rat Oral 3920 mg/kg Fare Oral 2350 mg/kg 2.9. Mutajenite Testleri Son yıllarda dünya nüfusunun hızla artması nedeniyle gıda maddeleri gereksinimi de artmıştır. Gıda endüstrisindeki çok hızlı gelişim sonucunda günlük yaşantımıza giren birçok yeni kimyasal maddenin karsinojenik risklerini ortaya çıkarmak için en akılcı yaklaşım, deney hayvanlarında tümör oluşumudur. Bu testlerde, kimyasal maddenin uygulanmasıyla, deney sonuçlarının alınması arasında geçen sürenin çok uzun olmasından ötürü, bunlara uzun süreli testler adı verilmiştir. Uzun süreli testler maliyet açısından oldukça pahalıdır. Bu nedenle araştırıcılar, karsinojenite ile ilgili olarak bilgi verecek, kısa zamanda sonuç veren ve düşük maliyetli testler geliştirmişlerdir. Bu testler, kimyasalların mutajenik etkilerini belirlemeye yöneliktir [Akın, 1990; Sarıkaya, 2005] Çeşitli kimyasal maddelerin genotoksik, mutajenik, sitotoksik etkilerinin araştırılmasında değişik canlı gruplarını kapsayan çeşitli metodlar kullanılmaktadır. Bu testlerde bakteriler, mayalar, bitkiler, hayvanlar ve insan hücre kültürleri kullanılmaktadır. Bakterilerle yapılan testler arasında en iyi bilineni ve en fazla kullanılanı Ames testidir. Salmonella typhimirium kullanılarak yapılan bu yöntem, genotoksik ve karsinojenik etkinin araştırılmasında birçok kimyasal madde için

19 uygulanmaktadır. Bakteriyel uygulama, fazla masraflı olmaması ve kimyasalların çok farklı dozlarının uygulanabilmesi nedeniyle tercih edilen bir test metodudur [Çelik, 2003]. Ayrıca Salmonella mutasyon testi, kimyasallların potansiyel karsinojen olup olmadıklarını kısa sürede ortaya koyan özgün bir metot olarak tanımlanmaktadır [Johnson, 2003]. Mayalar, ökaryot oldukları ve yüksek yapılı organizmaların hücre yapılarına benzerlik gösterdikleri için çok fazla kullanılan gruplardan birisidir. Saccharomyces cerevisiae ve Saccharomyces pompe en fazla kullanılan türlerdir. ph değişimlerini ve sıcaklık değişimlerini tolere edebilecek şekilde fizyolojik açıdan dayanıklı organizmalardır. Genotoksisite çalışmalarında Saccharomyces cerevisiae soylarının hem haploid hem de diploit formları kullanılabilirken, Saccharomyces pompe soylarının sadece haploitlerinde gen mutasyonları için genotoksisite çalışmaları yapılabilir [Çelik, 2003]. Genotoksik etkinin belirlenmesinde kullanılan kısa süreli test yöntemlerinden birisi de Allium testidir. Allium test hızlı, hassas ve yenilenebilir özelliklere sahip olması nedeniyle sıkça kullanılan bir testtir. Allium testinde, Allium cepa, Allium sativum ve Vicia faba yaygın olarak kullanılan yüksek yapılı bitkilerdir. Allium testi, ilk olarak 1938 de Levan tarafından kullanılmış daha sonra Fiskesjö tarafından çeşitli kimyasalların toksisitesinin belirlenmesinde standart bir metod olarak önerilmiştir [Fiskesjö, 1985; Rank ve Nielsen, 1993]. Bitkiler kolay ve ucuz elde edilmesi, kromozomlarının genellikle büyük ve az sayıda olması nedeniyle toksisite çalışmalarında tercih edilmektedir. Drosophila nın kullanıldığı mutajenite testlerinde, toksisite testi, sterilite testi, Basc (Muller5) testi gibi çeşitli metodlar geliştirilmiştir. Drosophila da en çok kullanılan test, eşeye bağlı letalite testidir. Bu testte üreme hücrelerinde görülen mutasyonlar incelenmektedir. In vivo mutajenite testleri için rat, fare, hamster gibi memeli hayvanlar kullanılarak, kimyasalların etkileri araştırılmaktadır [Çelik, 2003].

20 2.9.1. Kromozom anormallikleri (KA) metodu Sıkça kullanılan testlerden biridir. Kültüre alınmış periferal kan lenfositlerinde kromozomal anormallik frekansının belirlenmesi esasına dayanır. Mesleki olarak ya da çevresel olarak, bilinen ya da şüphelenilen genotoksik maddelere maruziyeti ya da maruziyetin biyolojik etkilerini değerlendirmede en fazla kullanılan yöntemdir. Genetik hasarın boyutunu saptar. Yapısal değişimler, kromozomal anormallik tekniği kullanılarak, mitotik metafaz kromozomlarında değerlendirilir [Çakmak, 2000]. Kromozom aberasyonları uzun zamandan beri, genotoksik maddelere maruz kalan insanların, bu maddelerden nasıl etkilendiklerinin sağlam bir göstergesi olarak kullanılmaktadır. İnsan populasyonları üzerine yapılan çalışmalar, periferal lenfositlerdeki spontan kromozom anormalliklerinin frekansı ile kanser oluşumu arasında doğru orantı (pozitif korelasyon) olduğunu ortaya koymaktadır [Natarajan, 2002; Bolognesi, 2003; Yüzbaşıoğlu ve ark., 2006; Yılmaz ve ark., 2008]. Kullanılan fiziksel veya kimyasal ajanların etkisine göre kromozom kırığı, kromatid kırığı, fragment, disentrik kromozom, kardeş kromatidlerde birleşme (sister union), halka kromozom, kromatidlerde değişim (triradial, quadriradial şekiller), gap, kromozom kontraksiyonu, poliploidi, endoreduplikasyon, translokasyon, inversiyon gibi kromozom aberasyonları meydana gelebilir [Çakmak, 2000; Çelik, 2003]. Yakın kromozomlardaki basit kırıklarda, kırık uçlar tekrar birleşebilmekte ve ortaya yeniden düzenlenmiş kromozomlar çıkmaktadır. Bu olay onarılma şeklinde ya da disentrik kromozomlar, translokasyonlar, ters dönmeler (inversiyon) biçiminde olabilmektedir. Daha karmaşık düzenlemeler ise halka (ring) şeklinde ortaya çıkabilmektedir. Asentrik fragmentlerin oluşumu ise kromozomlardaki basit kırıklar sonucudur. Kromatid açıklığı olan gap ise kromatid kolundaki boyanmamış açıklıklar olarak bilinir, bunlar kromatid koluyla aynı uzantıdadır ve kromatid koluyla arasındaki uzaklık kol kalınlığına eşit ya da daha küçüktür [Çakmak, 2000].

21 2.9.2. Kardeş kromatit değişimi (KKD) (Sister Chromatid ExchangeSCE) metodu Kimyasal mutajenlerin ve karsinojenlerin genotoksik etkilerinin araştırılmasında kullanılan sitogenetik uygulamalardan biri de kardeş kromatit değişimi (KKD) metodudur. Kardeş kromatit değişimi ilk olarak Taylor un 1958 yılında bitki hücrelerinde yapmış olduğu çalışmalarla gözlemlenebilmiştir [Taylor, 1958]. Kromozomların işaretli timin varlığında 1. mitozda bir defa kendilerini eşlemelerine izin verilmiş, ikinci replikasyonda ise ortamda izotop bulunmadan kendilerini eşlemeleri beklenmiş, daha sonra otoradyografide DNA nın semikonservatif eşlenmesi sonucunda, her kromozoma ait sadece bir kromatidin işaretlendiği gözlenmiştir. İşaretleme sonucu oluşan kardeş kromatidler arasında özdeş segmentlerin simetrik değişimi ilk kez Taylor tarafından kardeş kromatid değişimi olarak tanımlanmıştır [Çelik, 2003]. Daha sonraları KKD lerdeki kırıkları görünür hale getirmek için, DNA da timin analoğu gibi davranan 5Bromodeoxyuridine (BrdU) nin hücre döngüsü sırasında kardeş kromatidlerin arasına girmesi sağlanmıştır, ardından flörasan ışık altında ışınlanıp Giemsa ile boyanarak görünür hale getirilmiştir [Natarajan, 2002]. BrdU, deoksitimin (dt) ve deoksiuridin (du) birbirlerinin analoğu olan maddelerdir. BrdU, dt ve du arasındaki tek fark, taşıdıkları benzen halkasındaki 5. karbon atomuna dt de CH 3 (metil), du de H (hidrojen) atomu ve BrdU de Br (brom) atomunun bağlı olmasıdır. DNA replikasyonu sırasında eğer ortamda BrdU varsa, DNA nın semikonservatif sentez mekanizmasına göre, sentezlenen yeni polinükleotid zincirinde timinin yerini BrdU alacaktır. DNA içine yerleşmiş olan BrdU, uv lambası ile ışınlanmaya maruz bırakıldığında, boyama sonucunda bu bölgelerin daha açık renkli gözlenmesini sağlar [Topaktaş ve Rencüzoğulları, 1995]. Bu boyanma farkı, DNA da kardeş kromatidler arasında oluşan değişimleri göstermektedir. KKD yöntemi, DNA hasarlarının belirlenmesinde hassas testlerden bir tanesidir [Palitti ve ark., 1982, Aksoy ve ark., 2006; Yüzbaşıoğlu ve ark., 2008]. Kardeş kromatit değişimleri sadece flörasan ve gimsa ile değil aynı zamanda DAPI veya propidium iodid gibi flörasan ışıma gösteren boyalar ile de belirlenebilmektedir.

22 2.9.3. Mikronükleus metodu Çeşitli kimyasal ve fiziksel ajanların klastojenik ve aneugenik etkilerini belirlemek için kullanılan yöntemlerden birisi de, sitokinezi bloklanmış hücrede mikronükleus (CytokinesisBlocked Micronucleus Assay=CBMN Assay) metodudur. Mikronükleus (MN) yöntemi ilk olarak 1886 yılında anemik kedilerin kırmızı kan hücrelerinde Howell ın gözlemleriyle ortaya çıkmıştır. 1907 de Jolly, mikronükleusların varlığını doğrulamıştır. Bu yüzden mikronükleuslar, hematolojide HowellJolly cisimleri olarak bilinirler [Çakmak, 2000]. 1950 lerde bitki hücrelerinde kromozom hasarının ölçülmesinde, 1970 lerde hayvan hücrelerinde ve daha sonra 1976 yılında Haddle ve arkadaşları tarafından kültüre edilmiş insan lenfositlerinde kimyasal kanserojenleri belirlemeye yönelik bir test olarak kullanılmaya başlanmıştır [Çakmak, 2000; Demirel ve Zamani, 2002]. Yöntemin kabul görmesi yavaş olmuştur, çünkü değerlendirmeye alınan hücrelerin bölünme geçirip geçirmediğini saptamak güçtür. 1985 de Fenech ve Morley tarafından mikronükleus yönteminde, sitokinezi durdurmak üzere sitokalasin B (Cyt B) adlı kimyasalın kullanılmasıyla ilk bölünmesini geçirmiş mitotik hücrelerin binükleer görüntülerinin tanınabilmesi bu zorluğun üstesinden gelinmesini sağlamıştır [Fenech ve Morley, 1985]. 1993 de Migliore ve arkadaşları, in vitro çalışmalarda izole lenfositler yerine, tam kanın kültüre alınmasını, mikronükleus yönteminde daha iyi deneysel koşulları ve sonuçları sağlaması açısından önermiştir [Migliore ve ark., 1989]. Sitokinezin durdurulduğu mikronükleus yönteminde kullanılan Cyt B, aktin polimeraz inhibitörü olan bir maddedir. Bu özelliği ile nükleer bölünmeyi durdurmadan, mitotik sitokinezi yani sitoplâzmanın bölünmesini durdurur. Cyt B etkisiyle, hücre çekirdeği bölünürken, sitoplâzma bölünmesi (sitokinez) durur ve binükleer hücreler ortaya çıkar. Mikronükleuslar, spontan olarak ya da genotoksik ajanlara maruziyet sonucunda, asentrik kromozomal fragmentlerin ya da tüm kromozomların hücre bölünmesi sırasında, ana çekirdek dışında yavru çekirdek şeklinde kalmasından oluşmaktadır. Mitozun anafazında sentrik elementler kutuplara çekilirken, genotoksik ve/veya aneugenik etkiler sonucu ortaya çıkmış asentrik

23 elementler ve iğ ipliklerine bağlanamamış kromozomlar kutuplara çekilmeyerek, hücre bölünmesi sonunda aynı sitoplâzma içinde, hücre çekirdeğinden ayrı olarak membranla çevrili bir yapı oluşturur (Şekil 2.1) [Çakmak, 2000]. Günümüzde mikronükleus metodu; genotoksisite ve sitotoksisite çalışmalarında; kromozom kırığı, kromozom kaybı, kromozomların farklı şekillenmesi (nükleoplasmik köprüler), hücre bölünmesinin inhibe edilmesi, gen ampilifikasyonu, nekrosis ve apoptosisin basit morfolojik ölçütler kullanılarak değerlendirilmesini sağlar [Fenech, 2000 ve 2006]. Şekil 2.1. Sitotoksik ve genotoksik ajanların etkisiyle mikronükleus oluşumu, apoptozis ve nekroz [Fenech, 2006 dan] 2.9.4. Comet (Kuyruklu yıldız) (Single Cell Gel Electrophoresis) Metodu DNA da klastojenik etki ortaya çıkaran çeşitli kimyasal ajanların, bu etkilerini belirlemek için hızlı ve kolay test yöntemleri geliştirilmeye çalışılmıştır. Bu geliştirilmeye çalışılan test tekniklerinden birisi de tek hücre jel elektroforezi veya

24 comet (kuyruklu yıldız) (Single cell gel electrophoresis=microgel Electrophoresis Technique) testidir. Son yıllarda gelişen comet assay tekniği DNA hasarını ve tamirini belirlemek için hassas bir genotoksisite testidir [Singh ve ark., 1988; Fairbairn ve ark., 1995; Sasaki ve ark., 2002]. Bu teknik DNA tek zincir kırıklarını ve tamamlanmamış DNA tamir bölgelerini gösteren hassas, basit ve hızlı bir genotoksisite testi olarak kabul görmektedir [Ross ve ark. 1995; Tice ve Vazquez, 1998; Tice ve ark., 2000; Sasaki ve ark., 2002]. Genetik toksikolojide, apoptosis ve DNA tamiri çalışmalarında sıklıkla kullanılan bu yöntem ile hemen hemen tüm hücrelerde DNA hasarı direkt olarak belirlenebilmektedir. Canlı hücrelerde DNA tek sarmal kırılmalarının tespiti ilk kez Rygberg ve Johanson (1978) tarafından gerçekleştirilmiştir. DNA nın ayrılmasına izin veren hafif alkali şartlar altında, lam üzerindeki agarozda gömülmüş olan hücreleri lize ederek proteinlerinden ayırmışlardır. Daha sonra nötralize edip, akridin oranj kullanarak DNA yı boyamışlar ve kırmızı flörasanla (tek sarmal) yeşilin (çift sarmal) oranını saptamışlardır. Fakat bu teknik çok yaygın olarak kullanılmamıştır [Ünal, 1998]. Bu nedenle nötral teknik 1984 te Ostling ve Johanson tarafından modifiye edilmiştir. Ostling ve Johanson [1984], agarozla süspanse edilen hücreleri lam üzerine yayarak, yüksek tuz ve deterjanla lize etmişler ve ardından elektroforezise tabi tuttuktan sonra akridin oranjla boyamışlardır. Eğer DNA kırık içeriyorsa, çekirdekten anoda doğru göç ederek kuyruklu yıldız görünümünü vermektedir. Bu nedenle hasarlı hücrelere comet yani kuyruklu yıldız adı verilmiştir. Fakat DNA çift sarmal kırıklarının tespitine izin veren nötral şartlar, tek sarmal kırıklarının belirlenmesine izin vermemektedir. Oysa, DNA da hasar oluşturan çoğu ajan, DNA çift sarmalından çok, DNA tek sarmalında hasar meydana getirmektedir. Bunun yanında nötral şartlarda proteinler tam olarak uzaklaştırılamamaktadır. Bu nedenlerden dolayı, 1988 de Singh ve arkadaşları tarafından alkali şartlar altında DNA tek zincir kırıklarının tespitine izin veren teknik geliştirilmiştir. Kullanılan daha güçlü lizis koşulları, proteinlerin % 95 inden fazlasını çöktürebilmektedir [Ünal, 1998].

25 DNA da meydana gelen kırılmaların artmasıyla, DNA parçaları comet kuyruğu içine göç etmektedir. Daha hasarlı olan apoptotik hücrelerde ise baş ve kuyruk tamamen dağılmış ve hedgehog (kirpi) olarak isimlendirilmiştir [Fairbairn ve ark., 1995]. Comet tekniğinin sonuçlarının değerlendirilmesinde farklı yöntemler kullanılmaktadır. Gelişmiş laboratuarlarda genellikle görüntü analizi programları kullanılmaktadır. Bunun yanında cometler hasarsız, az hasarlı, orta derecede hasarlı ve hasarlı şeklinde göz ile değerlendirilebilmektedir. Görüntü analizi yapılan laboratuarlarda kuyruk uzunluğu, kuyruk yoğunluğu ve kuyruk momenti (kuyruk uzunluğu ve kuyruk içindeki toplam DNA miktarının birbirine oranı) dikkate alınarak sonuçlar değerlendirilebilmektedir. Comet tekniğinin farklı şekillerdeki uygulamaları sonuçları etkilemektedir. Örneğin elektroforez şartları (süre, voltaj), lysing solüsyonu şartları (tuz konsantrasyonu, süre, ph) metodun hassasiyetini etkileyebilmektedir. Bu nedenle deneyde şartlar standart tutulmak zorundadır. Bu tekniğin; az sayıda hücre gerektirmesi, değişik hücre ve dokulara uygulanabilmesi, hassas, hızlı ve güvenilir olması genotoksisite araştırmaları içerisinde oldukça fazla düzeyde kullanılmasına neden olmaktadır [Singh ve ark., 1988; Ünal, 1998; Tice ve ark., 2000].

26 Doku İnsan Dokuları Hayvan Dokuları Kan (Lenfositler, T hücreleri, Granülositler) Lenfositler Epitelyum (Lens, mukoza) Splenositler Fibroblastlar (Deri) Timositler Spermatositler Kemik İliği Adenokarsinoma Beyin Lenfoma Böbrek Karaciğer Mukoza epiteli Pankreas Testis Embriyo Kolon İdrar kesesi Akciğer Mide Kültür İnsan Hücre Kültürü Hayvan Hücre Kültürü Kan Hamster (CHO, HIT Karsinoma T15, V79) Meme keratinositleri Fare (FO, L5178Y) Melanoma Glioma Fibroblast Şekil 2.2. Comet Assay Tekniği Kullanılarak İncelenebilecek Hücre Tipleri [Ünal, 1998 den]

27 3. MATERYAL VE METOT 3.1. Materyal 3.1.1. Kromozom incelemesi için materyal Bu araştırmada sitrik asit, fosforik asit, benzoik asit ve kalsiyum propiyonatın genotoksik etkilerini incelemek amacıyla insan periferal kan kültürü ve izole lenfositler kullanılmıştır. Her bir test materyali için kullanılacak olan periferik kan, sigara, alkol ve ilaç kullanmayan, herhangi bir sağlık problemi ve genotoksik ajanlara maruz kalma öyküsü olmayan 2425 yaşlarında bir bayan ve bir erkek donörden temin edilmiştir. 3.1.2. Test Materyali Test materyali olarak kullanılan maddelerden sitrik asit (Katalog No: 5949291) Merck den, benzoik asit (Katalog No: 65850) ve fosforik asit (Katalog No:231 6332) Sigma dan, kalsiyum propiyonat (Katalog No: 4075814) ise Fluka dan temin edilmiştir. Sitrik Asit Sitrik asit (2hidroksi1,2,3 propan tri karboksilik asit) gıdalarda antioksidan asitleştirici olarak kullanılan zayıf organik bir asittir. Suda çözülebilir, yarı şeffaf, renksiz veya beyaz kristal tozlar halindedir. Molekül formülü C 6 H 8 O 7 H 2 O olup, moleküler ağırlığı 210,14 gr dır. Fosforik Asit Fosforik asit gıdalarda antioksidan asitleştirici olarak kullanılan kuvvetli inorganik bir asittir. Suda çözülebilir sıvı bir asittir. Molekül formülü H 3 PO 4 olup moleküler ağırlığı 97,9924 gr dır

28 Benzoik Asit Benzoik asit gıdalarda antimikrobiyal olarak kullanılan zayıf bir organik asittir. Katı beyaz kristal yapısında bir maddedir. Molekül formülü C 7 H 6 O 2 olup moleküler ağırlığı 122,13 gr dır. Yapısal formülü aşağıdaki gibidir. Şekil 3.1. Benzoik asitin yapısal formülü Kalsiyum Propiyonat Kalsiyum propiyonat gıdalarda antimikrobiyal olarak kullanılan bir maddedir. Katı, beyaz kristal yapıda olan maddenin molekül formülü C 6 H 10 CaO 4, moleküler ağırlığı 186,22 gr dır. Çalışmada kullanılan diğer maddeler olan; Bromodeoksiüridin (Katalog No: 5914 3), MitomisinC (Katalog No: 2000086), Kolkisin (Katalog No: 64868), SitokalasinB (Katalog No: 14930962), NaCl (Katalog No: 7647145) Sigma dan, EDTA (Katalog No: 6381926), Tris (Katalog No: 77861), NaOH (Katalog No: 1310732), Triton X100 (Katalog No: 9002931), DMSO (Katalog No: 67685), Düşük erime ısılı agar (LMA) (Katalog No: 9012366), Yüksek erime ısılı agar (NMA) (Katalog No: 9012366), EtBr (Katalog No: 1239458), KCl (Katalog No: 7447407) Applichem den, Kromozom Medium B (Katalog No: F 5023), PBS (Katalog No: L 1825), Trypan Blue (Katalog No: L 6323) ve Biocoll (Katalog No: L 6115) Biochrom dan alınmıştır.

29 3.2. Metot 3.2.1.Kültüre Alınmış İnsan Lenfositlerindeki Çalışmalar Kromozom Anormalliği ve Kardeş Kromatid Değişimi Çalışmaları Lenfosit kültürlerinin hazırlanmasında her bir katkı maddesi için ayrı ayrı sağlıklı, sigara içmeyen 2425 yaşlarında bir bayan ve bir erkek bireyden alınan ve 1/10 oranında heparinize edilmiş 0,2 ml periferik kan, steril şartlarda 2,5 ml lik besi ortamına (Kromozom Medium B) ekilmiştir. Bu ortama, daha önceden sartorius membran filtre ile steril edilerek hazırlanan BrdU (5Bromo2 deoksiuridin=bromodeoksiüridin) solüsyonundan 10 µg/ml (mikrogram/mililitre) olacak şekilde ilave edilmiştir. Daha sonra kültür tüpleri, 37 ºC deki inkübatörde 72 saat inkübasyona alınmıştır. Kültür süresinin başlangıcından 24 ve 48 saat sonra sitrik asitin 50, 100, 200 ve 3000 µg/ml lik, benzoik asitin 50, 100, 200 ve 500 µg/ml lik, kalsiyum propiyonatın 50, 100, 200 ve 1000 µg/ml lik, fosforik asitin 25, 50, 100, ve 200 µg/ml lik, sitrik asit ve fosforik asit karışımının 25, 50, 100 ve 200 µg/ml lik dozları ilave edilmiştir. Ayrıca her bir kimyasal için bir negatif kontrol bir de pozitif kontrol (MMC, 0,10 µg/ml) kullanılmıştır. İnkübasyon süresinin bitiminden 2 saat önce (kültürün 70. saatinde) her tüpe, 0,06 µg/ml olacak şekilde kolkisin solüsyonu ilave edilmiştir. İnkübasyon süresinin bitiminde tüpler 1200 rpm de (dakikadaki devir sayısı) 10 dakika santrifüj edilmiş ve üstte kalan sıvı (süpernatant) atılmıştır. Tüpün dibinde kalan ve hücreleri ihtiva eden 0,50,7 ml lik kısmı vorteks yardımıyla iyice karıştırılarak homojen hale getirilmiştir. Sonra bu tüplere, 37 ºC de bekletilen hipotonik solüsyondan (0,075 M KCl), vorteks üzerinde damla damla (5 ml) ilave edilmiştir. Tüpler 37 ºC deki etüvde 30 dakika bekletilmiştir. Süre sonunda 1200 rpm de 10 dakika santrifüj edilmiş ve süpernatant atıldıktan sonra, tüplere önceden buzdolabında soğutulan 3:1 metanol:asetik asitten oluşan soğuk fiksatif, vorteks üzerinde damla damla (5 ml) ilave edilmiştir. Buzdolabında 45 dakika bekletilmiştir.

30 Bu tüpler 1200 rpm de 10 dakika santrifüj edildikten sonra süpernatant atılmıştır. Fiksatifle yıkama işlemi üç kez tekrarlanmıştır. Son fiksatif işleminden sonra tüpün dibinde kalan 0,50,7 ml lik beyaz kan hücrelerini içeren çökelti pipetaj yapılarak homojen hale getirilmiştir. Pastör pipetine çekilen bu süspansiyon, önceden 1 N HNO 3 (Nitrik asit) te temizlenmiş ve % 70 lik etil alkolde buzdolabında bekletilen nemli lamlar üzerine 1520 cm yükseklikten farklı alanlara damlatılarak hücrelerin patlatılması ve kromozomların yayılmaları sağlanmıştır. Hazırlanan bu preparatlar 24 saat oda sıcaklığında ışık almayan ortamda kurumaya bırakılmışlardır. Mikronükleus Çalışması Mikronükleus çalışmasında, lenfosit kültürlerinin hazırlanmasında her bir katkı maddesi için ayrı ayrı sağlıklı, sigara içmeyen 2425 yaşlarında bir bayan ve bir erkek bireyden alınan ve 1/10 oranında heparinize edilmiş 0,2 ml periferik kan, steril şartlarda 2,5 ml lik besi ortamına (Kromozom Medium B) ekilmiştir. Daha sonra kültür tüpleri, 37ºC deki inkübatörde 72 saat inkübasyona alınmıştır. Kültür süresinin başlangıcından 24 saat sonra, sitrik asitin 50, 100, 200, 3000 µg/ml lik, benzoik asitin 50, 100, 200, 500 µg/ml lik, kalsiyum propiyonatın 50, 100, 200, 1000 µg/ml lik, fosforik asitin 25, 50, 100, 200 µg/ml lik, sitrik asit ve fosforik asit karışımının 25, 50, 100 ve 200 µg/ml lik dozları ekilmiştir. İnkübasyonun 44. saatinde hücrelerin sitokinezini bloklamak amacıyla ortama sitokalasin B (5,2 µg/ml) ilave edilmiştir İnkübasyon süresinin bitiminde tüpler 1000 rpm de 10 dakika santrifüj edilmiş ve süpernatant atılmıştır. Tüpün dibinde kalan ve hücreleri ihtiva eden 0,50,7 ml lik kısmı vorteks yardımıyla iyice karıştırılarak homojen hale getirilmiştir. Sonra bu tüplere, 4ºC de bekletilen hipotonik solüsyondan (0,075 M KCl), vorteks üzerinde damla damla (5 ml) ilave edilmiş ve tüpler 4ºC de 5 dakika bekletilmiştir. Süre sonunda 1000 rpm de 10 dakika santrifüj edilmiş ve süpernatant atıldıktan sonra, tüplere önceden buzdolabında soğutulan 3:1 metanol:asetik asitten oluşan soğuk

31 fiksatif, vorteks üzerinde damla damla (5 ml) ilave edilmiş ve buzdolabında 10 dakika bekletilmiştir. Fiksatifle yıkama işlemi üç kez tekrarlanmıştır. Üçüncü fiksatife sitoplâzmaların korunması amacıyla % 1 lik formaldehit ilave edilmiştir. Son fiksatif işleminin sonunda tüpün dibinde kalan 0,50,7 ml lik çökelti pipetaj yapılarak homojen hale getirilmiştir. Pastör pipetine çekilen bu süspansiyon, daha önceden 1 N HNO 3 (Nitrik asit) te temizlenmiş ve % 70 lik etil alkolde buzdolabında bekletilen nemli lamlar üzerine 1015 cm yükseklikten farklı alanlara damlatılmıştır. Hazırlanan bu preparatlar 24 saat oda sıcaklığında kurumaya bırakılmışlardır. Preparatların boyanması Her bir uygulama için yapılan preparatların bir kısmı, mitotik indeks, kromozomal anormallikler ve mikronükleus oluşumlarının tespiti için, homojen boyamada kullanılmıştır. Bunun için preparatlar kuruduktan sonra Sorensen tamponu ile hazırlanmış % 5 lik Giemsa ile (ph=6,8) 1520 dakika boyanmıştır. Preparatların bir kısmı ise, bir kromozoma ait kardeş kromatidlerin farklı boyanmasını sağlamak amacıyla kullanılmıştır. Bu yönteme göre bir gün boyunca kurutulan preparatlar düz bir tepsiye konarak üzeri ince bir tabaka halinde ışınlama solüsyonu (Sorensen tamponu, ph=6,8) ile kapatılmıştır. Bu preparatlar, 15 cm yükseklikten, 254 nm (nanometre) dalga boyunda ışık yayabilen UV lambası ile karanlıkta 13 dakika ışınlanmıştır. Preparatlar 60ºC sıcaklıktaki 1xSSC (Sodyum klorür + TriSodyum sitrat) solüsyonunda 1 saat inkübe edildikten sonra, Sorensen tamponu ile hazırlanan % 5 lik Giemsa ile (ph= 6,8) 20 dakika boyanmıştır. Her iki yöntemde de Giemsadan çıkarılan preparatlar saf sudan geçirilerek, boyanın fazlasının akması sağlanmıştır. Oda sıcaklığında kurutulan preparatlar, DPX ile daimi hale getirilmiş ve mikroskobik incelemeye alınmıştır.

32 Mitotik indeks ve kromozom anormalliklerinin saptanması Mitotik indeksin (Mİ) saptanmasında, bütün uygulamalar için kadın ve erkek bireye ait preparatların her birinden 1000 er hücre olmak üzere toplam 2000 hücre incelenmiştir. Bölünen hücre sayısının toplam hücreye oranı yüzde cinsinden hesaplanarak mitotik indeks belirlenmiştir. Kromozomal anormalliklerin saptanmasında, her bir uygulama için kadın ve erkek bireye ait preparatlarda 46±1 kromozomlu ve kromozomları iyi dağılmış olan 100 er hücre (toplam 200 hücre) değerlendirilerek kromozom anormallikleri tespit edilmiştir. İncelenen toplam hücre içindeki anormal hücrelerin yüzdesi ve hücre başına düşen kromozom anormalliği (KA/Hücre) sayısı belirlenmiştir. Replikasyon İndeksi ve Kardeş kromatid değişiminin saptanması Replikasyon indeksini hesaplamak için kadın ve erkek bireyden hazırlanan preparatların her birinden 100 hücre olmak üzere her uygulama için toplam 200 hücre incelenmiştir. İncelenen hücreler arasında birinci (M 1 ), ikinci (M 2 ) ve üçüncü (M 3 ) metafaz evresindeki hücreler sayılmış ve replikasyon indeksi (Rİ) = 1x(M 1 )+ 2x(M 2 )+ 3x(M 3 )/N (N= incelenen toplam hücre sayısı) formülüyle hesaplanmıştır. Kardeş kromatid değişimi (KKD) sayısının belirlenmesinde, kadın ve erkek bireye ait preparatların her birisinde, kromozomları iyi dağılmış ve ikinci mitoz bölünme geçiren 25 er hücre olmak üzere, her bir uygulama dozu için toplam 50 hücre incelenmiştir. Kardeş kromatid değişimi sayısı, bir kromozomun açık boyanmış kromatidindeki koyu boyanmış parçaların veya koyu boyanmış kromatidindeki açık boyanmış parçaların sayılmasıyla, oluşan kırılma sayısına göre birli, ikili, üçlü ve dörtlü değişimler olarak değerlendirilmiştir (Şekil 3.2).

33 Şekil 3.2. Birli, ikili, üçlü ve dörtlü kardeş kromatid değişimleri Nükleer Bölünme İndeksi ve Mikronükleus Frekansının Saptanması Daimi hale getirilmiş preparatlarda her bir doz ve süre için erkek ve dişi donörde toplam olarak 2000 binükleat hücrede mikronükleus frekansları belirlenmiştir. Nükleer bölünme indeksi belirlenirken, her bir donörden 500 hücre sayılmış ve 1xN 1 +2xN 2 +3x(N 3 +N 4 )/N formülünden yararlanılarak 1, 2, 3, 4 çekirdekli hücrelerin sayısına göre nükleer bölünme indeksi tespit edilmiştir. 3.2.2. İzole Edilmiş İnsan Lenfositlerindeki Çalışmalar Comet Testi Komet tekniği, Singh ve ark. nın (1988) yaptığı çalışmalar dikkate alınarak ve bazı modifikasyonlarla kullanılmıştır. Bu test tekniğinde de her bir katkı maddesi için ayrı ayrı sağlıklı ve sigara içmeyen bir bayan ve bir erkek bireyden alınan periferal kan lenfositleri kullanılmıştır. Bu amaçla donörlerden heparinli enjektörle alınan taze periferal kan ependorflara konulmuştur. Daha sonra içerisinde 1 er ml PBS bulunan ependorflara, stok kandan 100 er µl eklenmiş, süspanse edilmiş ve 10 dak. buz dolu kapta bekletilmiştir. Süre sonunda, her bir ependorfun dip kısmına 100 er µl lenfosit ayırıcı solüsyon (Biocoll) eklenmiş ve 4 ºC de 1060 rpm de 3 dakika santrifüj edilmiştir. Santrifüj sonrası ependorfların içerisinde eritrostlerin üzerinde oluşan

34 bulutsu kısmın 100 er µl si alınarak ayrı ependorfa aktarılmış ve buz üzerine konulmuştur. Daha sonra stok haline getirilmiş izole lenfositlerin 100 er µl si kullanılacak her bir doz için ayrı ependorflara alınmıştır. Lenfositler, 100 er µl test maddesinin çeşitli dozları ile (sitrik asitin 50, 100, 200 ve 3000 µg/ml lik, benzoik asitin 50, 100, 200 ve 500 µg/ml lik, kalsiyum propiyonatın 50, 100, 200 ve 1000 µg/ml lik, fosforik asitin 25, 50, 100 ve 200 µg/ml lik, sitrik asit ve fosforik asit karışımının 25, 50, 100 ve 200 µg/ml lik, pozitif kontrolün 0.30 µg/ml lik dozları) süspanse edilmiş ve 37 ºC de 1 saat inkübasyona alınmıştır. İzole edilen lenfositlerde, trypan blue ile hücrelerin canlılıklarının % 97 olduğu tespit edilmiştir. İnkübasyon süresinin bitiminde ependorflar 3000 rpm de 5 dak. santrifüj edilmiş, süpernatant atılmış ve her bir doz için 100 er µl PBS ile resüspanse edilmiştir. Düşük erime ısılı agarın 75 µl si, 100 µl lenfositle karıştırılıp, önceden yüksek erime ısılı agar ile kaplanan lamların üzerine damlatılmış ve 24X60 mm lik lamel ile kapatılmıştır. Bu halde preparatlar 1520 dak. buzdolabında bekletilmiştir. Lamların üzerindeki lameller dikkatlice kaldırılmış ve içerisinde lizing solüsyonu bulunan şaleler içerisine konulmuş ve buzdolabında en az 1 saat bekletilmiştir. Liziz işleminden sonra lamlar, içerisinde elektroforez tamponu (ph>13) bulunan tanka yerleştirilmiş ve DNA sarmalının çözülmesi için 20 dak. bekletilmiştir. Daha sonra 25 V, 300 ma da 20 dakika elektroforez yapılmıştır. Preparatlar, nötralizasyon tamponu (ph=7.5) ile 5 er dakika, toplam 3 kez muamele edilmiştir. Nötralizasyon sonucunda lamların üzerine 20 μg/ml lik etidyum bromid in 50 μl si yayılmış ve 24X60 mm lik lamel ile kapatılmıştır. Boyamaya alınan preparatlar +4 ºC de 1015 dakika bekletilmiştir. Tüm bu işlemler, çevre kaynaklı DNA hasarını önlemek amacıyla karanlık ortamda yapılmıştır. Görüntü Analizi ve Komet Sayımı Boyanan preparatlar Olympus marka flörasan mikroskop (546 nm eksitasyon ve 590 nm bariyer filtreli) altında 40X büyütmede incelenmiştir. Kullanılan her bir kimyasal

35 için her bir donörden 100 er komet olmak üzere toplam 200 komet Comet Assay IV, Perceptive Instruments Ltd., UK kullanılarak incelenmiş ve sonuçlar % kuyruk yoğunluğu ve kuyruk uzunluğu cinsinden değerlendirilmiştir. İstatistiksel Analizler Yapılan çalışmada, mitotik indeks, replikasyon indeksi, nükleer bölünme indeksi, hücre başına düşen kardeş kromatid değişimi sayısı, anormal hücre frekansı, hücre başına düşen kromozom anormalliği, mikronükleus frekansı ve % kuyruk yoğunluğu ve kuyruk uzunluğu için dozetki ilişkisini ortaya koymak amacıyla SPSS 13.0 bilgisayar programıyla regresyon analizi uygulanmıştır. Deney gruplarındaki mitotik indeks, replikasyon indeksi, nükleer bölünme indeksi, kromozomal anormallikler ve mikronükleus frekanslarının kontrol grupları ile farklılık gösterip göstermediğinin belirlenmesinde z dağılım testi kullanılırken, kardeş kromatid değişimleri ve komet değerlendirilmesinde studentst testi kullanılmıştır.

36 4. ARAŞTIRMA BULGULARI 4.1. Sitrik Asit Uygulaması Sitrik asit uygulaması ile insan lenfosit kültürlerinde 5 tip yapısal, 2 tip de sayısal olmak üzere toplam 7 tip anormalliğin oluştuğu saptanmıştır. Bunlardan yapısal anormallikler kromatid ve kromozom kırıkları, kardeş kromatidlerde birleşme, kromatid değişimi ve disentrik kromozomlardır. Sayısal anormallikler ise poliploidi ve endoreduplikasyon dur (Resim 4.1 4.4). Bu anormalliklerden en sık rastlanılanları kardeş kromatidlerde birleşme ve kromatid kırığıdır. Yapılan analizler, anormal hücre yüzdesinin ve hücre başına düşen anormalliklerin kontrole göre tüm uygulamalarda istatistiksel olarak önemli oranda arttığını ve bu artışın doza bağlı olduğunu göstermiştir (24 saatlik uygulamada r=0,87, 48 saatlik uygulamada r=0,67) (Çizelge 4.1). Çizelge 4.1. Sitrik asit uygulaması ile insan periferal lenfositlerinde oluşan kromozomal anormallikler ve frekansları Test maddesi Uygulama Anormallikler Anormal hücre KA/Hücre Süre Doz Yapısal Sayısal ± SH (%) ± SH (saat) (μg/ml) kkb ktk dis kzk ktd p er Kontrol 24 0,00 2 1,00 ± 1,10 0,025 ± 0,01 Pozitif Kontrol 24 0,10 18 25 7 3 12 3 30,00 ± 3,24 0,325 ± 0,03 Sitrik asit 24 50 15 4 5 1 1 1 12,50 ± 2,34* 0,135 ± 0,02* 100 25 5 7 1 5 19,00 ± 2,77* 0,190 ± 0,03* 200 35 5 10 5 20,00 ± 2,83* 0,250 ± 0,03* 3000 Toksik Toksik Kontrol Pozitif Kontrol Sitrik asit 48 48 48 0,00 0,10 50 100 200 3000 3 42 34 27 30 1 7 2 9 2 6 2 3 1 ktk: kromatid kırığı, kzk: kromozom kırığı, kkb: kardeş kromatidlerde birleşme, dis: disentrik, er: endoreduplikasyon, kd: kromatid değişimi, p: poliploidi *Kontrole göre p< 0,001 düzeyinde anlamlı (z testi) 31 1 1 3 1 1 4 2,00 ± 0,98 34,00 ± 3,35 19,00 ± 2,77* 18,50 ± 2,75* 18,50 ± 2,75* Toksik 0,020 ± 0,01 0,430 ± 0,04 0,190 ± 0,03* 0,185 ± 0,03* 0,185 ± 0,03* Toksik

Resim 4.1. Sitrik asit uygulamasıyla insan lenfositlerinde oluşan kromozomal anormallikler a) kardeş kromatitlerde birleşme, b) kromatit kırığı 37

Resim 4.2. Sitrik asit uygulamasıyla insan lenfositlerinde oluşan kromozomal anormallikler a) disentrik kromozom, b) kromozom kırığı 38

Resim 4.3. Sitrik asit uygulamasıyla insan lenfositlerinde oluşan kromozomal anormallikler a) kromatid değişimi, b) poliploidi 39

40 Resim 4.4. Sitrik asit uygulamasıyla insan lenfositlerinde oluşan kromozomal anormallikler a) endoreduplikasyon Kardeş kromatid değişim frekansı 50 µg/ml nin 24 saatlik uygulaması hariç tüm uygulamalarda kontrole göre istatistiksel açıdan önemli düzeyde artış göstermiştir ve bu artış doza bağlı olarak gerçekleşmiştir (24 saatlik uygulamada r=0,97, 48 saatlik uygulamada r=0,96) (Çizelge 4.2, Resim 4.5). Yapılan çalışmalarda sitrik asidin replikasyon indeksi üzerine herhangi bir etkisi gözlenememiştir. Mitotik indeks tüm uygulamalarda kontrole göre doza bağlı düşüş göstermiştir. Bu düşüş, istatistiksel olarak önemli düzeydedir (24 saatlik uygulamanın 50 µg/ml lik konsantrasyonu hariç) (24 saatlik uygulama için r=0,88, 48 saatlik uygulama için r=0,67). 3000 µg/ml lik konsantrasyon ise tüm uygulamalarda toksik etki göstermiştir (Çizelge 4.2).

41 Çizelge 4.2. Sitrik asitin insan lenfositlerinde KKD, Rİ ve Mİ frekansları üzerine etkisi Test maddesi Uygulama Süre (saat) Doz (μg/ml) Min. maks. KKD KKD/hücre ± SH M 1 M 2 M 3 Rİ ± SH Mİ ± SH (%) Kontrol 24 0,00 119 4,70 ± 0,45 42 81 77 2,18 ± 0,053 7,60 ± 0,59 Pozitif Kontrol 24 0,10 953 32,20 ± 1,65 48 99 53 2,03 ± 0,052 4,80 ± 0,47 Sitrik asit 24 50 117 5,52 ± 0,43 22 61 117 2,48 ± 0,048 6,70 ± 0,56 100 223 5,82 ± 0,46+ 46 64 91 2,24 ± 0,056 5,10 ± 0,49* 200 123 6,32 ± 0,56+ 52 69 79 2,14 ± 0,045 5,00 ± 0,48** 3000 Toksik Toksik Toksik Kontrol 48 0,00 113 3,36 ± 0,27 39 70 91 2,26 ± 0,054 10,40 ± 0,68 Pozitif Kontrol 48 0,10 2269 46,38 ± 1,72 110 72 18 1,54 ± 0,046 6,30 ± 0,54 Sitrik asit 48 50 114 5,48 ± 0,36+ 49 79 72 2,12 ± 0,054 7,20 ± 0,57** 100 314 5,76 ± 0,32+ 50 69 81 2,16 ± 0,056 6,60 ± 0,53** 200 315 7,20 ± 0,43+ 50 68 82 2,16 ± 0,056 7,10 ± 0,57** 3000 Toksik Toksik Toksik + Kontrole göre p< 0,05 düzeyinde anlamlı (t testi) * Kontrole göre p< 0,05 düzeyinde anlamlı (z testi) ** Kontrole gore p< 0,001 düzeyinde anlamlı (ztesti) Resim 4.5. Sitrik asit uygulaması ile insan periferal lenfositlerinde oluşan kardeş kromatid değişimleri

42 Sitrik asit uygulamasıyla, kültürdeki insan lenfositlerinde mikronükleus frekansları kontrole göre tüm uygulamalarda doza bağlı olarak önemli oranda artış göstermiştir (r=0,88) (Çizelge 4.3, Resim 4.6). Sitrik asit uygulamasıyla binükleat hücreler içerisinde bir, iki ve dört mikronükleus gözlenmiştir. Bununla birlikte sitrik asidin nükleer bölünme indeksi üzerine herhangi bir etkisinin olmadığı belirlenmiştir. Çizelge 4.3. Sitrik asitin insan lenfositlerinde mikronükleus frekansları ve nükleer bölünme indeksi üzerine etkisi Test Uygulama Sayılan BN hücreler içinde maddesi Süre Doz binükleat mikronükleus (saat) (μg/ml) hücre frekansları sayısı (1) (2) (3) (4) Kontrol 48 0,00 2000 6 0 0 0 Pozitif Kontrol 48 0,10 2000 220 20 0 0 Sitrik Asit 48 50 2000 33 0 0 0 100 2000 45 1 0 0 200 2000 48 0 0 1 3000 * Kontrole gore p< 0,001 düzeyinde anlamlı (ztesti) MN ± SH (%) 0,30±0,12 13,0±0,75 1,65±0,28* 2,35±0,34* 2,60±0,36* Toksik Nükleer bölünme indeksi ± SH (NBİ) 1,84±0,30 1,30±0,25 1,43±0,27 1,41±0,26 1,34±0,26 Toksik Resim 4.6. Sitrik asit uygulamasıyla insan lenfositlerinde oluşan mikronükleuslu binukleat hücreler a) bir mikronükleuslu binükleat, b) iki mikronükleuslu binükleat Sitrik asit, komet testinde kuyruktaki DNA yoğunluğunu ve komet kuyruk uzunluğunu, kontrole göre tüm konsantrasyonlarda artırmış ancak bu artış sadece en

43 yüksek doz olan 200 µg/ml de istatistiksel olarak anlamlı bulunmuştur (Çizelge 4.4, Resim 4.7). 200 µg/ml lik konsantrasyon, pozitif kontrolden daha fazla DNA hasarına neden olmuştur. Çizelge 4.4. Sitrik Asit ile 1 saat uygulama sonucunda insan lenfositlerinde oluşan DNA hasarı Test Maddesi Doz (μg/ml) Kuyruk yoğunluğu (%) Kuyruk uzunluğu (µm) Kontrol 0,00 5.81 ± 1.46 48.91 ± 1.82 Pozitif Kontrol 0,30 14,45 ± 1,64 68.65 ± 1.97 Sitrik Asit 50 5,88 ± 1,45 49,09 ± 1,62 100 9,25 ± 2,48 51,73 ± 3,25 200 16,10 ± 2,95+ 74,92 ± 4,44+ 3000 Toksik Toksik +Kontrole göre p< 0,05 düzeyinde anlamlı (t testi) Resim 4.7. Sitrik asit ile muamele edilen izole insan lenfositlerinde oluşan DNA hasarlarının komet testi ile görünümü a) hasarsız DNA, b) az hasarlı DNA, c) orta hasarlı DNA, d) çok hasarlı DNA

44 4.2. Fosforik Asit Uygulaması Fosforik asit uygulaması sonucunda insan lenfositlerinde 5 tip anormalliğe rastlanmıştır. Bunlardan 4 tanesi yapısal (kromatid ve kromozom kırıkları, kardeş kromatidlerde birleşme ve disentrik kromozom), 1 tanesi ise sayısal (poliploidi) anormalliktir (Resim 4.8 4.10). Bu anormalliklerden en sık rastlananı kromatid kırığıdır. Yapılan analizler, anormal hücre yüzdesinin ve hücre başına düşen anormalliklerin kontrole göre tüm uygulamalarda istatistiksel olarak önemli oranda arttığını (25 µg/ml hariç) ve bu artışın doza bağlı olduğunu göstermiştir (24 saatlik uygulamada r=0,70, 48 saatlik uygulamada r=0,94) (Çizelge 4.5). Çizelge 4.5. Fosforik Asit uygulaması ile periferal insan lenfositlerinde oluşan kromozomal anormallikler ve frekansları Test maddesi Uygulama Anormallikler Süre Doz Yapısal Sayısal ktk kzk ktd f kkb dis p Anormal hücre ± SH (%) KA/Hücre ± SH (saat) (μg/ml) Kontrol 24 0,00 1 2 1,50 ± 0,86 0,015 ± 0,008 Pozitif kontrol 24 0,10 26 2 10 2 2 21,00 ± 2,88 0,210 ± 0,029 Fosforik asit 24 25 7 1 4,00 ± 1,39 0,040 ± 0,013 50 11 1 1 1 7,00 ± 1,80* 0,070 ± 0,018* 100 11 2 1 1 7,50 ± 1,86* 0,075 ± 0,019* 200 12 2 7,00 ± 1,80* 0,070 ± 0,018* Kontrol Pozitif kontrol Fosforik Asit 48 48 48 0,00 0,10 25 50 100 200 1 63 8 10 15 19 15 2 1 33 2 11 ktk: kromatid kırığı, kzk: kromozom kırığı, ktd: kromatid değişimi, f: fragment, kkb: kardeş kromatidlerde birleşme, dis: disentrik kromozom, p: poliploidi. * Kontrole göre P< 0,01 düzeyinde anlamlı (ztesti) ** Kontrole göre P< 0,001 düzeyinde anlamlı (ztesti) 2 1 1 4 1 1 1 1 1,50 ± 0,86 45,00 ± 3,52 4,50 ± 1,47 7,00 ± 1,80* 9,00 ± 2,02** 11,50 ± 2,25** 0,015 ± 0,013 0,620 ± 0,034 0,045 ± 0,015 0,070 ± 0,018* 0,090 ± 0,020** 0,120 ± 0,023**

Resim 4.8. Fosforik Asit uygulaması ile insan lenfositlerinde oluşan kromozomal anormallikler a) kromatid kırığı, b) kromozom kırığı 45

Resim 4.9. Fosforik Asit uygulaması ile insan lenfositlerinde oluşan kromozomal anormallikler a) kardeş kromatidlerde birleşme, b) disentrik kromozom 46

47 Resim 4.10. Fosforik Asit uygulaması ile insan lenfositlerinde oluşan kromozomal anormallikler a) poliploidi Fosforik asit uygulaması sonucunda, hem 24 saatlik ve hem de 48 saatlik uygulamada, tüm konsantrasyonlarda, kardeş kromatid değişimi frekansı kontrole göre istatistiksel açıdan önemli düzeyde artış göstermiştir. Bu artış doza bağlı olarak gerçekleşmiştir (24 saatlik uygulamada r=0,89, 48 saatlik uygulamada r=0,87) (Çizelge 4.6, Resim 4.11). Fosforik asit ile hücrelerde minimum 2 ve maksimum 24 arasında kardeş kromatid değişimi gözlenmiştir. Bu uygulamada, mitotik indeks, 24 saatlik sürede, 100 ve 200 µg/ml lik dozlarda kontrole göre istatistiksel olarak önemli oranda düşüş gösterirken, 48 saatlik uygulamada 50 ve 200 µg/ml lik konsantrasyonlar istatistiksel olarak anlamlı düşüş göstermiştir (Çizelge 4.6). Yapılan çalışmalarda fosforik asitin replikasyon indeksini etkilemediği belirlenmiştir.

48 Çizelge 4.6. Fosforik Asitin insan lenfositlerinde KKD, Rİ ve Mİ frekansları üzerine etkisi Uygulama Test maddesi Süre (saat) Doz (μg/ml) Minmax KKD KKD/hücre ± SH M 1 M 2 M 3 Rİ ± SH Mİ ± SH (%) Kontrol 24 0.00 07 3,12 ± 0,28 33 43 121 2,41 ± 0,049 7,45 ± 0,59 Pozitif kontrol 24 0,10 2244 34,06 ± 0,90 98 81 21 1,62 ± 0,047 4,20 ± 0,45 Fosforik asit 24 25 211 4,04 ± 0,27+ 41 66 103 2,41 ± 0,057 7,25 ± 0,58 50 29 4,44 ± 0,20+ 56 75 69 2,07 ± 0,064 6,30 ± 0,54 100 412 6,26 ± 0,28+ 49 62 89 2,20 ± 0,057 5,90 ± 0,53* 200 313 6,30 ± 0,29+ 45 57 98 2,27 ± 0,057 5,60 ± 0,51* Kontrol 48 0.00 07 3,14 ± 0,28 33 44 123 2,45 ± 0,054 7,40 ± 0,59 Pozitif kontrol 48 0,10 4268 53,74 ± 0,95 97 88 15 1,59 ± 0,044 3,10 ± 0,39 Fosforik Asit 48 25 222 6,54 ± 0,49+ 34 54 112 2,39 ± 0,054 6,85 ± 0,56 50 313 6,48 ± 0,33+ 26 57 117 2,46 ± 0,050 5,75 ± 0,52* 100 221 7,20 ± 0,46+ 45 51 108 2,36 ± 0,058 6,00 ± 0,53 200 624 9,06 ± 0,48+ 31 56 113 2,41 ± 0,053 5,50 ± 0,51* +Kontrole göre P< 0,05 düzeyinde anlamlı (t testi) * Kontrole göre P< 0,05 düzeyinde anlamlı (z testi) Resim 4.11. Fosforik Asit uygulaması ile insan periferal lenfositlerinde oluşan kardeş kromatit değişimleri

49 Fosforik asit uygulamasıyla, mikronukleus taşıyan binukleat hücrelerin frekansında da artışlar meydana gelmiştir. Bu artış, kontrole göre, 25 µg/ml hariç, tüm uygulamalarda istatiksel olarak anlamlı düzeydedir. Mikronükleus frekansındaki artış doza bağlı olarak gerçekleşmiştir (r=0,73) (Çizelge 4.7, Resim 4.12). Fosforik asit, insan lenfositlerinde sadece bir mikroçekirdekli binükleat hücrelerin oluşmasına neden olmuştur. Fosforik asit uygulamasının nükleer bölünme indeksi üzerine herhangi bir etkisinin olmadığı tespit edilmiştir. Çizelge 4.7. Fosforik Asitin insan lenfositlerinde mikronükleus frekansları ve nükleer bölünme indeksi üzerine etkisi Test maddesi Kontrol Pozitif Kontrol Fosforik Asit Uygulama Süre (saat) 48 48 48 Doz (μg/ml) 0,00 0,10 25 50 100 200 Sayılan binükleat hücre sayısı 2000 2000 2000 2000 2000 2000 *Kontrole göre P< 0,05 düzeyinde anlamlı (z testi) BN hücreler içinde mikronükleus frekansları (1) (2) (3) 2 44 5 10 9 10 MN ± SH (%) 0,10 ± 0,07 2,20 ± 0,33 0,25 ± 0,11 0,50 ± 0,16* 0,45 ± 0,15* 0,50 ± 0,16* Nükleer Bölünme İndeksi ± SH (NBI) 1,84 ± 0,42 1,29 ± 0,36 1,69 ± 0,41 1,68 ± 0,41 1,54 ± 0,39 1,71 ± 0,41 Resim 4.12. Fosforik Asit uygulamasıyla insan lenfositlerinde oluşan mikronükleuslu binukleat hücre (binükleat hücredeki 1 mikronükleus)

50 Fosforik asit uygulaması sonucunda, komet testi ile, primer DNA hasarlarının oluştuğu gözlenmiştir. DNA hasarları, kontrole göre tüm uygulamalarda istatistiksel olarak anlamlı düzeydedir. Fosforik asit uygulaması lenfositlerde komet kuyruğundaki DNA yoğunluğunu ve kuyruk uzunluğunu önemli düzeyde artırmıştır. Özellikle 200 µg/ml dozda kontrole göre 5 kat artış gözlenmiştir (Çizelge 4.8, Resim 4.13). Yine fosforik asitin çalışmada kullanılan tüm dozları, pozitif kontrol olan MMC den daha fazla DNA hasarına neden olmuştur. Çizelge 4.8. Fosforik Asit ile 1 saat uygulama sonucunda insan lenfositlerinde oluşan DNA hasarı Test maddesi Doz (μg/ml) Kuyruk yoğunluğu (%) Kuyruk uzunluğu (µm) Kontrol 0,00 5.81 ± 1.46 48.91 ± 1.82 Pozitif Kontrol 0,30 14,45 ± 1,64 68.65 ± 1.97 Fosforik Asit 25 10,64 ± 1,26+ 77,54 ± 4,11+ 50 11,60 ± 1,35+ 73,58 ± 3,10+ 100 11,41 ± 1,09+ 77,22 ± 3,09+ 200 53,74 ± 1,90+ 251,08 ± 4,83+ + Kontrole göre p<0,05 düzeyinde anlamlı (t testi)

Resim 4.13. Fosforik asit ile muamele edilen izole insan lenfositlerinde oluşan DNA hasarlarının komet testi ile görünümü a) hasarsız DNA, b) az hasarlı DNA, c) orta hasarlı DNA, d) çok hasarlı DNA 51

52 4.3. Benzoik Asit Uygulaması Benzoik asit ile yapılan uygulama sonucunda, insan lenfositlerinde toplam 7 tip anormalliğe rastlanmıştır. Bunlardan 6 tanesi yapısal tiptedir. Bu anormallikler, kromatid ve kromozom kırıkları, kardeş kromatidlerde birleşme, kromatid değişimi, fragment, ve disentrik kromozomlardır. Bu uygulama sonucunda 1 adet sayısal anormallik belirlenmiştir ki bu da poliploididir (Resim 4.14 4.17). Yapısal anormalliklerden en sık rastlananı kromatid kırığı ve kardeş kromatidlerde birleşmedir. Yapılan analizler anormal hücre yüzdesinin ve hücre başına düşen anormalliklerin kontrole göre tüm uygulamalarda istatistiksel olarak önemli oranda arttığını ve bu artışın doza bağlı olduğunu göstermiştir (24 saatlik uygulamada sırasıyla r=0,95 ve 0,97, 48 saatlik uygulamada sırasıyla r=0,85 ve r=0,83) (Çizelge 4.9). Çizelge 4.9. Benzoik asit uygulaması ile insan periferal lenfositlerinde oluşan kromozomal anormallikler ve frekansları Test maddesi Uygulama Anormallikler Anormal hücre KA/hücre Yapısal Sayısal ± SH (%) ± SH Süre Doz ktk kzk ktd f dis kkb p (saat) (μg/ml) Kontrol 24 0,00 1 1 1,00 ± 0,70 0,010 ± 0,007 Pozitif Kontrol 24 0,10 20 5 1 2 11 19,00 ± 2,77 0,195 ± 0,028 Benzoik asit 24 50 13 2 7,50 ± 1,86* 0,075 ± 0,019* 100 11 2 1 4 1 9,50 ± 2,07** 0,095 ± 0,027** 200 15 2 2 4 2 12,50 ± 2,34** 0,125 ± 0,023** 500 28 10 5 2 20,00 ± 2,83** 0,225 ± 0,030** Kontrol Pozitif Kontrol Benzoik asit 48 48 48 0,00 0,10 50 100 200 500 4 27 10 14 15 14 3 4 2 3 6 7 2 1 1 3 2 ktk: kromatid kırığı, kzk: kromozom kırığı, ktd: kromatid değişimi, f: fragment, dis: disentrik kromozom, kkb: kardeş kromatidlerde birleşme, p: poliploidi. * Kontrole göre P< 0,01 düzeyinde anlamlı (z testi) ** Kontrole göre P< 0,001 düzeyinde anlamlı (z testi) 1 4 1 2 3 3 10 5 3 5 10 2,50 ± 1,10 24,00 ± 3,02 10,50 ± 2,17* 11,50 ± 2,26** 13,00 ± 2,38** 17,50 ± 2,69** 0,025 ± 0,011 0,265 ± 0,031 0,105 ± 0,022* 0,115 ± 0,023** 0,145 ± 0,025** 0,175 ± 0,027**

Resim 4.14. Benzoik asit uygulamasıyla insan lenfositlerinde oluşan kromozomal anormallikler a) kromatid kırığı, b) kromozom kırığı 53

Resim 4.15. Benzoik asit uygulamasıyla insan lenfositlerinde oluşan kromozomal anormallikler a) fragment, b) disentrik kromozom 54

Resim 4.16. Benzoik asit uygulamasıyla insan lenfositlerinde oluşan kromozomal anormallikler a) kardeş kromatidlerde birleşme, b) kromatid değişimi 55

56 Resim 4.17. Benzoik asit uygulamasıyla insan lenfositlerinde oluşan kromozomal anormallikler a) poliploidi Kardeş kromatid değişim frekansı, benzoik asit uygulaması sonucunda, tüm uygulamalarda kontrole göre istatistiksel açıdan önemli oranda artış göstermiştir. Bu artış doza bağlı olarak gerçekleşmiştir (24 saatlik uygulamada r=0,87, 48 saatlik uygulamada r=0,76) (Çizelge 4.10, Resim 4.18). Minimummaksimum KKD sayısı, 219 arasında değişmektedir. Benzoik asit uygulaması sonucunda, mitotik indeks tüm uygulamalarda kontrole göre doza bağlı düşüş gösterirken, bu düşüş 24 saatlik uygulamada sadece 500 µg/ml de, 48 saatte ise 100, 200 ve 500 µg/ml de istatistiksel olarak anlamlıdır (24 saatlik uygulama için r=0,99, 48 saatlik uygulama için r=0,96) (Çizelge 4.10). Yapılan çalışmalarda, benzoik asidin en yüksek konsantrasyon olan 500 µg/ml de replikasyon indeksini düşürdüğü, ancak bu düşüşün istatistiksel olarak önemli olmadığı belirlenmiştir.

57 Çizelge 4.10. Benzoik asitin insan lenfositlerinde KKD, Rİ ve Mİ frekansları üzerine etkisi Uygulama Test maddesi Süre (saat) Doz (μg/ml) Minmax KKD KKD/hücre ± SH M 1 M 2 M 3 Rİ ± SH Mİ ± SH (%) Kontrol 24 0,00 07 2,80 ± 0,24 27 95 78 2,26 ± 0,048 6,10 ± 0,54 Pozitif kontrol 24 0,10 640 16,70 ± 1,27 83 68 49 1,83 ± 0,056 4,05 ± 0,44 Benzoik asit 24 50 210 4,02 ± 0,24+ 38 59 103 2,33 ± 0,055 5,85 ± 0,52 100 212 5,68 ± 0,34+ 41 67 92 2,26 ± 0,055 5,35 ± 0,50 200 213 6,62 ± 0,36+ 26 64 110 2,42 ± 0,050 4,85 ± 0,48 500 416 7,54 ± 0,35+ 40 65 95 2,28 ± 0,055 3,60 ± 0,42** Kontrol 48 0,00 06 2.88 ± 0,23 40 83 77 2,19 ± 0,053 6,80 ± 0,56 Pozitif kontrol 48 0,10 743 21.84 ± 1,54 80 69 51 1,86 ± 0,056 3,85 ± 0,43 Benzoik asit 48 50 213 6.68 ± 0,37+ 34 58 110 2,40 ± 0,054 5,60 ± 0,51 100 314 6.92 ± 0,39+ 50 76 74 2,12 ± 0,055 4,65 ± 0,47* 200 219 6.92 ± 0,39+ 43 65 92 2,25 ± 0,056 4,15 ± 0,45** 500 517 8.66 ± 0,40+ 72 117 11 1,69 ± 0,040 2,15 ± 0,32** +Kontrole gore P< 0,05 düzeyinde anlamlı (t testi) * Kontrole gore P< 0,01 düzeyinde anlamlı (z testi) ** Kontrole göre P< 0,001 düzeyinde anlamlı (z testi) Resim 4.18. Benzoik asit uygulaması ile insan periferal lenfositlerinde oluşan kardeş kromatid değişimleri

58 Benzoik asit uygulamasıyla mikronükleus frekanslarında da artışlar gözlenmiştir. Benzoik asit, tüm dozlarda MN frekansını artırmış fakat bu artış, sadece 200 ve 500 µg/ml lik dozlarda istatistiksel olarak anlamlıdır. Mikronükleus frekansındaki artış doza bağlı olarak gerçekleşmiştir (r=0,79) (Çizelge 4.11, Resim 4.19 4.20). Benzoik asit uygulamasıyla insan lenfositlerinde bir, iki ve dört mikroçekirdekli binükleatlara rastlanmıştır. Benzoik asit uygulamasının nükleer bölünme indeksi üzerine herhangi bir etkisinin olmadığı tespit edilmiştir. Çizelge 4.11. Benzoik asitin insan lenfositlerinde mikronükleus frekansları ve nükleer bölünme indeksi üzerine etkisi Test maddesi Kontrol Pozitif kontrol Benzoik asit Uygulama Süre (saat) 48 48 48 Doz (μg/ml) 0,00 0,10 50 100 200 500 Sayılan Binükleat hücre sayısı 2000 2000 2000 2000 2000 2000 *Kontrole göre P< 0,01 düzeyinde anlamlı (ztesti) **Kontrole gore P< 0,001 düzeyinde anlamlı (ztesti) BN hücreler içinde mikronükleus frekansları (1) (2) (3) (4) 4 73 7 1 7 1 10 10 2 2 18 1 MN ± SH (%) 0,20 ± 0,09 4,50 ± 0,46 0,45 ± 0,15 0,50 ± 0,16 1,10 ± 0,23** 1,00 ± 0,22* Nükleer bölünme indeksi ± SH (NBİ) 1,44 ± 0,38 1,28 ± 0,36 1,49 ± 0,38 1,45 ± 0,38 1,45 ± 0,38 1,34 ± 0,36 Resim 4.19. Benzoik asit uygulamasıyla insan lenfositlerinde oluşan mikronükleuslu binukleat hücreler a) bir mikronükleuslu binükleat, b) iki mikronükleuslu binükleat

59 Resim 4.20. Benzoik asit uygulamasıyla uygulamasıyla insan lenfositlerinde oluşan mikronükleuslu binukleat hücreler a) dört mikronükleuslu binükleat Benzoik asit ile yapılan komet testi sonuçlarına göre, bu maddenin DNA da tek zincir kırıklarına neden olduğu ve kuyruktaki DNA yoğunluğunu ve kuyruk uzunluğunu kontrole göre tüm uygulamalarda istatistiksel olarak önemli düzeyde artırdığı belirlenmiştir (Çizelge 4.12, Resim 4.21). Çizelge 4.12. Benzoik asit ile 1 saat uygulama sonucunda insan lenfositlerinde oluşan DNA hasarı Test Maddesi Doz (μg/ml) Kuyruk yoğunluğu (%) Kuyruk uzunluğu (µm) Kontrol 0,00 5.81 ± 1.46 48.91 ± 1.82 Pozitif Kontrol 0,30 14,45 ± 1,64 68.65 ± 1.97 Benzoik asit 50 9,83 ± 0,99+ 71,10 ± 2.64+ 100 9,76 ± 1,07+ 78,12 ± 4.41+ 200 9,96 ± 1,12+ 80,29 ± 4.48+ 500 8,94 ± 0,86+ 70,10 ± 2.44+ +Kontrole göre p< 0,05 düzeyinde anlamlı (t testi)

Resim 4.21. Benzoik asit ile muamele edilen izole insan lenfositlerinde oluşan DNA hasarlarının komet testi ile görünümü a) hasarsız DNA, b) az hasarlı DNA, c) orta hasarlı DNA, d) çok hasarlı DNA 60

61 4.4. Kalsiyum Propiyonat Uygulaması Kalsiyum propiyonat uygulaması sonucunda insan lenfositlerinde toplam 6 tip anormalliğe rastlanmıştır. Bunlardan 5 tanesi yapısal (kromatid ve kromozom kırıkları, kardeş kromatidlerde birleşme, fragment, ve pulverizasyon), 1 tanesi ise sayısal anormallik olarak değerlendirilmiştir (poliploidi) (Resim 4.22 4.24). Bu anormalliklerden en sık rastlananı kromatid kırığıdır. Yapılan analizler, anormal hücre yüzdesinin ve hücre başına düşen anormalliklerin kontrole göre tüm uygulamalarda istatistiksel olarak önemli oranda arttığını ve bu artışın doza bağlı olduğunu göstermiştir (24 saatlik uygulamada r=0,84 ve r=0,83, 48 saatlik uygulamada sırasıyla r=0,75 ve r=0,72) (Çizelge 4.13). Çizelge 4.13. Kalsiyum Propiyonat uygulaması ile periferal insan lenfositlerinde oluşan kromozomal anormallikler ve frekansları Test maddesi Uygulama Anormallikler Süre Doz Yapısal Sayısal ktk kzk ktd f kkb pl p Anormal hücre KA/Hücre ± SH (%) ± SH (Saat) (μg/ml) Kontrol 24 0,00 1 1 1,00 ± 0,70 0,010 ± 0,007 Pozitif kontrol 24 0,10 19 9 2 11 20,50 ± 2,85 0,205 ± 0,029 Kalsiyum Propiyonat 24 50 11 6 1 3 10,00 ± 2,12* 0,105 ± 0,022* 100 10 1 2 8 1 12,00 ± 2,30* 0,120 ± 0,023* 200 12 3 2 8,50 ± 1,97* 0,085 ± 0,020* 1000 18 4 2 1 3 12 20,00 ± 2,83* 0,200 ± 0,028* Kontrol Pozitif kontrol Kalsiyum Propiyonat 48 48 48 0,00 0,10 50 100 200 1000 2 25 10 14 14 5 1 1 12 ktk: kromatid kırığı, kzk: kromozom kırığı, ktd: kromatid değişimi, f: fragment, kkb: kardeş kromatidlerde birleşme, pl: pulverizasyon, p: poliploidi. * Kontrole göre P< 0,001 düzeyinde anlamlı (z testi) 4 2 7 5 4 6 2 1,00 ± 0,70 27,50 ± 3,16 9,00 ± 2,02* 9,50 ± 2,07* 10,00 ± 2,12* Toksik 0.010 ± 0,007 0.275 ± 0,032 0.095 ± 0,021* 0.095 ± 0,020* 0.100 ± 0,021* Toksik

Resim 4.22. Kalsiyum Propiyonat uygulaması ile insan lenfositlerinde oluşan kromozomal anormallikler a) kromatid kırığı, b) kardeş kromatitlerde birleşme 62

Resim 4.23. Kalsiyum Propiyonat uygulaması ile insan lenfositlerinde oluşan kromozomal anormallikler a) kromozom kırığı, b) poliploidi 63

Resim 4.24. Kalsiyum Propiyonat uygulaması ile insan lenfositlerinde oluşan kromozomal anormallikler a) fragment, b) pulverizasyon 64

65 Kalsiyum propiyonat uygulaması, tüm muamelelerde, insan lenfositlerinde, kardeş kromatid değişim frekansını kontrole göre istatistiksel açıdan önemli oranda artırmıştır. Bu artış doza bağlı olarak gerçekleşmiştir (24 saatlik uygulamada r=0,75, 48 saatlik uygulamada r=0,77) (Çizelge 4.14, Resim 4.25). Mitotik indeks tüm uygulamalarda kontrole nazaran, doza bağlı düşüş gösterirken (24 saatlik uygulama için r=0,91, 48 saatlik uygulama için r=0,76), bu düşüş 24 saatlik uygulamada sadece 1000 µg/ml de, 48 saatlik uygulamada ise, tüm konsantrasyonlarda istatistiksel olarak önemli düzeydedir (Çizelge 4.14). Yapılan çalışmalarda kalsiyum propiyonatın replikasyon indeksini etkilemediği belirlenmiştir. Ayrıca 1000 µg/ml lik uygulama, 48 saatte toksik etki göstermiştir, bu nedenle bölünmekte olan hücre görülememiştir. Çizelge 4.14. Kalsiyum Propiyonatın insan lenfositlerinde KKD, Rİ ve Mİ frekansları üzerine etkisi Uygulama Min Test maddesi Süre (Saat) Doz (μg/ml) max KKD KKD/hücre ± SH M 1 M 2 M 3 Rİ ± SE Mİ ± SH (%) Kontrol 24 0,00 08 2,96 ± 0,25 27 34 139 2,56 ± 0,051 6,70 ± 0,56 Pozitif kontrol 24 0,10 825 16,20 ± 0,75 90 56 54 1,82 ± 0,058 4,75 ± 0,48 Kalsiyum Propiyonat 24 50 211 4,98 ± 0,31+ 18 35 147 2,65 ± 0,045 6,30 ± 0,54 100 213 6,14 ± 0,32+ 17 27 156 2,70 ± 0,044 5,85 ± 0,52 200 319 6,82 ± 0,38+ 13 51 136 2,62 ± 0,043 5,50 ± 0,51 1000 222 7,92 ± 0,46+ 64 67 69 2,03 ± 0,058 4,60 ± 0,47* Kontrol 48 0,00 08 2,96 ± 0,25 27 34 139 2,56 ± 0,051 6,70 ± 0,56 Pozitif kontrol 48 0,10 2245 31,54 ± 0,84 103 54 43 1,70 ± 0,057 2,90 ± 0,38 Kalsiyum Propiyonat 48 50 511 6,90 ± 0,23+ 18 55 127 2,55 ± 0,046 4,55 ± 0,47* 100 511 7,02 ± 0,24+ 17 52 131 2,57 ± 0,046 4,25 ± 0,45** 200 513 7,52 ± 0,28+ 28 53 119 2,46 ± 0,052 4,20 ± 0,45** 1000 Toksik Toksik Toksik + Kontrole göre P< 0,05 düzeyinde anlamlı (t testi) * Kontrole göre P< 0,01 düzeyinde anlamlı (z testi) ** Kontrole göre P< 0,001 düzeyinde anlamlı (z testi)

66 Resim 4.25. Kalsiyum Propiyonat uygulaması ile insan periferal lenfositlerinde oluşan kardeş kromatid değişimleri Kalsiyum propiyonat uygulaması sonucunda, insan lenfositlerinde, mikronukleus oluşumları gözlenmiştir. Mikronükleus frekansları tüm uygulamalarda kontrole göre istatistiksel olarak önemli oranda artmıştır. Mikronükleus frekansındaki artış, doza bağlı olarak gerçekleşmiştir (r=0,86) (Çizelge 4.15, Resim 4.26). Kalsiyum propiyonat insan lenfositlerinde bir ve iki mikronükleuslu hücrelerin oluşmasına neden olmuştur. Kalsiyum propiyonat uygulamasının nükleer bölünme indeksi üzerine herhangi bir etkisinin olmadığı tespit edilmiştir. Çizelge 4.15. Kalsiyum Propiyonatın insan lenfositlerinde mikronükleus frekansları ve nükleer bölünme indeksi üzerine etkisi Test maddesi Uygulama Süre Doz (Saat) (μg/ml) Sayılan Binükleat hücre sayısı BN hücreler içinde mikronükleus frekansları MN±SH (%) Nükleer Bölünme İndeksi ± SH (NBI) Kontrol Pozitif kontrol Kalsiyum Propiyonat 48 48 48 0,00 0,10 50 100 200 1000 2000 2000 2000 2000 2000 2000 * Kontrole göre P< 0,01 düzeyinde anlamlı (ztesti) ** Kontrole göre P< 0,001 düzeyinde anlamlı (ztesti) (1) (2) (3) 1 81 3 10 10 1 14 0,05 ± 0,05 4,35 ± 0,46 0,50 ± 0,16* 0,60 ± 0,17* 0,70 ± 0,19** Toksik 1,80 ± 0,42 1,45 ± 0,38 1,76 ± 0,42 1,67 ± 0,41 1,54 ± 0,39 Toksik

67 Resim 4.26. Kalsiyum Propiyonat uygulamasıyla insan lenfositlerinde oluşan mikronükleuslu binukleat hücreler a) bir mikroçekirdekli binükleat hücre b) iki mikroçekirdekli binükleat hücre Yapılan çalışmalar sonucunda kalsiyum propiyonatın, komet testinde primer DNA hasarını kontrole göre tüm uygulamalarda istatistiksel olarak anlamlı düzeyde artırdığı belirlenmiştir. Kalsiyum propiyonat uygulamasıyla, hem kuyruktaki DNA yoğunluğu ve hem de kuyruk uzunluğu, uygulanan dozlarda önemli artış göstermiştir. Kuyruk yoğunluğundaki artış, en yüksek konsantrasyonda, pozitif kontrolden bile daha yüksek düzeydedir (Çizelge 4.16, Resim 4.27). Çizelge 4.16. Kalsiyum Propiyonat ile 1 saat uygulama sonucunda insan lenfositlerinde oluşan DNA hasarı Test maddesi Doz (μg/ml) Kuyruk yoğunluğu (%) Kuyruk uzunluğu (µm) Kontrol 0,00 5.81 ± 1.46 48.91 ± 1.82 Pozitif Kontrol 0,30 14,45 ± 1,64 68.65 ± 1.97 Kalsiyum propiyonat 50 7,60 ± 1,20 65.17 ± 1.69+ 100 10,14 ± 1,32+ 55.54 ± 1.53+ 200 12,75 ± 1,81+ 64.11 ± 1.80+ 1000 16,58 ± 2,01+ 66.41 ± 1.91+ + Kontrole göre P< 0,05 düzeyinde anlamlı (t testi)

Resim 4.27. Kalsiyum propiyonat ile muamele edilen izole insan lenfositlerinde oluşan DNA hasarlarının komet testi ile görünümü a) hasarsız DNA, b) az hasarlı DNA, c) orta hasarlı DNA, d) çok hasarlı DNA 68

69 4.5. Sitrik Asit ve Fosforik Asit Karışımı Uygulaması Sitrik Asit ve Fosforik Asit karışımı uygulaması sonucunda insan lenfositlerinde toplam 5 tip yapısal anormalliğe rastlanmıştır. Bunlar kromatid ve kromozom kırıkları, kardeş kromatidlerde birleşme, fragment ve halka kromozomdur (Resim 4.28 4.30). Bu anormalliklerden en sık rastlanılanı kromatid kırığıdır. Yapılan analizler anormal hücre yüzdesinin ve hücre başına düşen anormalliklerin kontrole göre tüm uygulamalarda istatistiksel olarak önemli oranda arttığını ve bu artışın doza bağlı olduğunu göstermiştir (24 saatlik uygulamada r=0,60, 48 saatlik uygulamada r=0,91) (Çizelge 4.17). Çizelge 4.17. Sitrik asit ve fosforik asit karışımı uygulaması ile insan periferal lenfositlerinde oluşan kromozomal anormallikler ve frekansları Test maddesi Uygulama Anormal hücre KA/Hücre Süre Doz Anormallikler ± SH (%) ± SH (saat) (μg/ml) ktk kzk f kkb kd h Kontrol 24 0,00 3 1,50 ± 0,86 0,015 ± 0,009 Pozitif Kontrol 24 0,10 25 11 7 14 25,00 ± 3,06 0,285 ± 0,032 SA+FA 24 25 16 2 4 10,00 ± 2,12** 0,110 ± 0,022** 50 12 1 3 1 9,00 ± 2,02** 0,090 ± 0,020** 100 15 2 1 8,50 ± 1,97* 0,085 ± 0,020* 200 17 1 3 10,50 ± 2,17** 0,105 ± 0,022** Kontrol Pozitif Kontrol SA+FA 48 48 48 0,00 0,10 25 50 100 200 3 33 18 14 14 28 20 2 4 1 ktk: kromatid kırığı, kzk: kromozom kırığı, f: fragment, kkb: kardeş kromatidlerde birleşme, kd: kromatid değişimi, h: halka kromozom *Kontrole göre p< 0,01 düzeyinde anlamlı (z testi) **Kontrole göre p< 0,001 düzeyinde anlamlı (z testi) 7 2 2 3 2 29 1 1,50 ± 0,86 38,50 ± 3,44 9,50 ± 2,07** 8,00 ± 1,92* 9,50 ± 2,07** 17,50 ± 2,69** 0,015 ± 0,009 0,450 ± 0,035 0,100 ± 0,021** 0,080 ± 0,019* 0,095 ± 0,021** 0,175 ± 0,027**

Resim 4.28. Sitrik asit ve fosforik asit karışımı uygulamasıyla insan lenfositlerinde oluşan kromozomal anormallikler a) kromatid kırığı, b) kromozom kırığı 70

Resim 4.29. Sitrik asit ve fosforik asit karışımı uygulamasıyla insan lenfositlerinde oluşan kromozomal anormallikler a) fragment, b) kardeş kromatitlerde birleşme 71

72 Resim 4.30. Sitrik asit ve fosforik asit karışımı uygulamasıyla insan lenfositlerinde oluşan kromozomal anormallikler a) halka kromozom Sitrik asit ve fosforik asitin birlikte uygulanması sonucunda, kardeş kromatid değişim frekansı, tüm uygulamalarda kontrole göre istatistiksel açıdan anlamlı artış göstermiştir. Bu artış doz artışına bağlıdır (24 saatlik uygulamada r=0,68, 48 saatlik uygulamada r=0,73) (Çizelge 4.18, Resim 4.31). Sitrik asit ve fosforik asitin birlikte uygulaması, mitotik indekste de tüm uygulama grupları ve sürelerinde kontrole göre istatistiksel olarak önemli düzeyde düşüş göstermiş ve bu düşüş yine doza bağlı olarak gerçekleşmiştir (24 saatlik uygulamada r=0,62 ve 48 saatlik uygulamada r= 0,51) (Çizelge 4.18). Yapılan çalışmalarda sitrik asit ve fosforik asitin birlikte uygulamasının replikasyon indeksini etkilemediği belirlenmiştir.

73 Çizelge 4.18. Sitrik asit ve fosforik asit karışımının insan lenfositlerinde KKD, Rİ ve Mİ frekansları üzerine etkisi Test maddesi Uygulama Min. Süre (saat) Doz (μg/ml) maks. KKD KKD/hücre ± SH M 1 M 2 M 3 Rİ ± SH Mİ ± SH (%) Kontrol 24 0,00 311 6.18 ± 0.31 14 20 166 2.76 ± 0.040 8.15 ± 0.61 Pozitif Kontrol 24 0,10 2036 27.76 ± 0.59 64 68 68 2.02 ± 0.058 4.60 ± 0.47 SA+FA 24 25 519 9.60 ± 0.46+ 13 44 143 2.65 ± 0.042 5.20 ± 0.50* 50 517 8.30 ± 0.33+ 25 34 141 2.58 ± 0.050 3.85 ± 0.43* 100 513 8.98 ± 0.32+ 22 31 147 2.63 ± 0.048 4.10 ± 0.44* 200 615 10.02 ± 0.35+ 28 32 140 2.56 ± 0.051 4.10 ± 0.44* Kontrol 48 0,00 311 6.18 ± 0.31 14 20 166 2.76 ± 0.040 8.15 ± 0.61 Pozitif Kontrol 48 0,10 2466 44.36 ± 1.00 96 54 50 1.77 ± 0.058 3.50 ± 0.41 SA+FA 48 25 615 9.24 ± 0.29+ 24 34 142 2.59 ± 0.049 4.90 ± 0.48* 50 416 8.98 ± 0.39+ 29 39 132 2.52 ± 0.052 4.85 ± 0.48* 100 517 8.76 ± 0.33+ 28 49 123 2.48 ± 0.052 5.00 ± 0.49* 200 613 10.20 ± 0.30+ 53 70 77 2.12 ± 0.057 4.95 ± 0.49* + Kontrole göre p< 0,05 düzeyinde anlamlı (t testi) * Kontrole göre p< 0,01 düzeyinde anlamlı (z testi) Resim 4.31. Sitrik asit ve fosforik asit karışımı uygulaması ile insan periferal lenfositlerinde oluşan kardeş kromatit değişimleri Sitrik asit ve fosforik asit karışımı uygulamasıyla mikronükleus frekansları kontrole göre tüm uygulamalarda istatistiksel olarak önemli düzeyde artmıştır. Mikronükleus frekansındaki artış doza bağlı olarak gerçekleşmiştir (r=0,89) (Çizelge 4.19, Resim

74 4.32). Sitrik asit ve fosforik asit, insan lenfositlerinde bir, iki ve dört mikronükleuslu binükleatların oluşmasına neden olmuştur. Sitrik asit ve fosforik asit karışımı uygulamasının nükleer bölünme indeksi üzerine herhangi bir etkisinin olmadığı belirlenmiştir. Çizelge 4.19. Sitrik asit ve fosforik asit karışımının insan lenfositlerinde mikronükleus frekansları ve nükleer bölünme indeksi üzerine etkisi Test maddesi Kontrol Pozitif kontrol SA+FA Süre (saat) 48 48 48 Uygulama Doz (μg/ml) 0,00 0,10 25 50 100 200 Sayılan binükleat hücre sayısı 2000 2000 2000 2000 2000 2000 * Kontrole gore p< 0,05 düzeyinde anlamlı (ztesti) ** Kontrole gore p< 0,001 düzeyinde anlamlı (ztesti) BN hücreler içinde mikronükleus frekansları (1) (2) (3) (4) 5 42 4 4 12 2 8 1 1 9 29 3 MN±SH (%) 0,25 ± 0,11 3,10 ± 0,39 0,80 ± 0,20* 0,70 ± 0,19* 0,60 ± 0,17* 1,75 ± 0,29** Nükleer bölünme indeksi±sh (NBI) 1.96 ± 0.44 1.08 ± 0.33 1.55 ± 0.39 1.70 ± 0.41 1.67 ± 0.41 1.75 ± 0.41

75 Resim 4.32. Sitrik asit ve fosforik asit karışımı uygulamasıyla insan lenfositlerinde oluşan mikronükleuslu binukleat hücreler a) bir MN li binükleat b) iki MN li binükleat c) dört MN li binükleat Sitrik asit ve fosforik asit karışımı uygulamasıyla, izole edilmiş insan lenfositlerinde komet kuyruğundaki DNA yoğunluğu kontrole göre tüm dozlarda anlamlı artış göstermiştir (Resim 4.33). Bu artış özellikle en yüksek konsantrasyonda pozitif kontrolden daha da fazla olmuştur. Komet kuyruk uzunluğundaki artış ise 100 ve 200 µg/ml lik dozlarda önemli düzeydedir. Artış düzeyi, bu iki konsantrasyonda da pozitif kontrolden daha fazla olarak ortaya çıkmıştır (Çizelge 4.20).

76 Çizelge 4.20. Sitrik asit ve fosforik asit karışımı ile 1 saat uygulama sonucunda insan lenfositlerinde oluşan DNA hasarı Test Maddesi Doz (μg/ml) Kuyruk yoğunluğu (%) Kuyruk uzunluğu (µm) Kontrol 0,00 5.81 ± 1.46 48.91 ± 1.82 Pozitif Kontrol 0,30 14,45 ± 1,64 68.65 ± 1.97 Sitrik Asit + Fosforik Asit 25 6,95 ± 0,90+ 54,69 ± 2,58 50 7,33 ± 1,23+ 53,31 ± 1,55 100 20,40 ± 1,72+ 96,43 ± 4,41+ 200 38,21 ± 3,04+ 86,31 ± 3,49+ + Kontrole göre p< 0,05 düzeyinde anlamlı (ttesti) Resim 4.33. Sitrik asit ve fosforik asit karışımı ile muamele edilen izole insan lenfositlerinde oluşan DNA hasarlarının komet testi ile görünümü a) hasarsız DNA, b) az hasarlı DNA, c) orta hasarlı DNA, d) çok hasarlı DNA