Talasemi ve Orak Hücreli Anemide Hematolojik Tanı Dr. Zümrüt Uysal 19 Kasım 2011
Anemik Çocuğa Yaklaşım Öykü Fizik muayene Laboratuar
LABORATUVAR 1.Tam Kan Sayımı Hb,Hkt, KK, OEV, OEH, OEHK, BK, Trombosit 2. RDW 3.Retikülosit 4.Periferik Yayma Demir rezervi - Serum demiri, UDBK, TS - Ferritin -Serum eritrosit protoporfini Coombs test Eksiklik testleri - Folik asit, B12 düzeyi Hemoglobin elektroforezi Kemik iliği Osmotik frajilite Eritrosit enzimleri Radioizotopik araştırmalar
YAŞ Yaşlara Göre Eritrosit İndekslerinin Değişimi MCV (fl) MCH (pg) MCHC (g/dl) Mean -2SD Mean -2SD Mean -2SD 1-3 gün 108 95 34 31 33 29 2 hafta 105 86 34 28 33 28 1 ay 104 85 34 28 33 29 2 ay 96 77 30 26 33 29 3-6 ay 91 74 30 25 33 30 0.5-2 yaş 78 70 27 23 33 30 2-4 yaş 80 72 27 24 34 31 4-10 yaş 83 77 28 25 34 31 10-15 yaş 86 78 29 25 34 31
NORMAL Hb ve MCV Değerleri Hb (g/dl) MCV (µ 3 ) Yaş(yıl) Ortalama Alt sınır Ortalama Alt sınır YD 16.8 13 110 100 0.5-1.9 12.5 11.0 77 70 2-4 12.5 11.0 79 73 5-7 13.0 11.5 81 75 8-11 13.5 12.0 83 76 12-14 13.5 14.0 12.0 12.5 85 84 78 77 15-17 14.0 15.0 12.0 13.0 87 86 79 79
Anemi ve Mikrositoz Hb alt sınır g / dl MCV alt sınır 3 YD 13 110 3 ay 9.5 70 6ay - 6yaş 10.5 70-74 7-12 yaş 11 76-80 Erişkin 12-14 80
Tam Kan İncelemesi
ANEMİ MCV Mikrositer Normositer Makrositer -Demir eksikliği anemisi -Kronik enflamasyon anemileri (normositik te) -α ve β talasemi sendromları -Kurşun zehirlenmesi -Sideroblastik anemiler -Bakır, pridoksin ve Zn eksikliği Megaloblastosis olmaksızın makrositoz yenidoğan dönemi -retikülostoz -karaciğer hastalıkları -hipotroidi -aplastik anemiler -Pure red cell anemi -MDS Megaloblastosisle makrositoz B 12 eksikliği -folik asit eksikliği -konjenital ve akkiz pürin ve pirimidin metabo. bozuklukları
Beta talasemi taşıyıcılarında ayırıcı tanı Demir eksikliği RBC, RDW Mikrositoz + eritrositoz RDW normal MCV / RBC olan Mentzer İndeks <13 MCV<61fl MCHC<28g/dl MCV/MCHC> 1 Enflamasyon anemisi Sed, CRP, Ferritin Alfa talasemi : mikrositoz, hipokromi, eritrositoz DE değil, Hb A 2 Hb F artmamış ise düşünülür Alfa ve beta talasemi birlikte ise beta talasemideki değişiklikler (A 2 artışı) görülmeyebilir. Aile çalışmaları, moleküler çalışmalar gerekir Kurşun entoksikasyonu (FEP )
Talasemi minör Demir eksikliği
Normal erişkin insan hemoglobinleri Hb A : α 2 β 2 %96 98 Hb F : α 2 γ %0.5 2 2 HbA 2 : α 2 δ 2 %1.5 3.5 Αlfa talasemi Beta talasemi
Periferik yayma 1/1 metil viole ile karıştırıp, 37 0 C ½ sa parafinle kapatıp Metilen mavisi ile retikülosit boyama
Hemoglobin Elektroforezi Metot: Bir tüpün içine 50 l venöz kan ve 300 l hemolizat solüsyonu konur ve karıştırılır. En az beş dakika bekletilir. Selüloz asetat plağı dikkatlice ve hava kabarcığı olmaksızın alkali (Ph 8.2-8.6) Supre Heme tampon içine yavaşça daldırılır. Beş dakika sonra plak tampondan çıkarılıp, kurutma kâğıtları arasında tek bir hareketle kurutulduktan sonra örnekler aplikatör ile plağa basılır. Örnekler selüloz plak üzerinde katot ile anot arasındaki bir başlama noktasına yüklenir. Plak elektroforez tankına örnek tatbik edilen ucu katot kutba gelecek şekilde yerleştirilir. Elektroforez cihazı 3,1amper ve 20 dakika olacak şekilde çalıştırılır. Bu süre sonrası plaklar çıkarılarak sırayla aşağıdaki çözeltilerde ve sürelerde tutulur. Poncuez boyası 5 dakika %5 lik Asetik Asit 5 dakika %5 lik Asetik Asit 5 dakika %5 lik Asetik Asit 5 dakika Metanol 5 dakika % 80 Metanol + % 20 Asetik Asit 5 dakika Bu işlemlerden sonra plak tankın içinde kurutulup, tam şeffaflaştıktan sonra dansitometrede 520 nm dalga boyunda okunur. Hemoglobin varyantlarının yüzdeleri tespit edilir. Hemoglobinler kırmızı bantlar halinde görülür.
Elektroforezde hemoglobinler taşıdıkları elektrik yüklerine göre selüloz plak üzerinde hareket ederler. Bütün hemoglobinlerin anoda doğru hareket etmesi, onların toplam olarak negatif yük taşıdıklarını göstermektedir. Ancak her bir hemoglobin molekülü farklı yol alır. Dolayısıyla her birinin taşıdığı toplam negatif yük miktarı farklıdır. Ör: Hb A 1 in toplam negatif yükü HbA 2 den daha fazla olduğu için daha uzakta bir noktaya yürümüştür.
Talasemide Sınıflandırma 1. Sessiz taşıyıcı Hematolojik olarak normal 2. Talasemi minör (taşıyıcı, heterozigot ) Hafif hipokrom mikrositer anemi 3. Talasemi intermedia (hasta, homozigot) orta derecede anemi, transfüzyon ihtiyacı az 4. Talasemi major (hasta, homozigot) Ağır anemi, transfüzyona bağımlı
Sessiz Taşıyıcı Sessiz taşıyıcılık Farklı klinik ve biyokimyasal bir durum Hb A 2 düzeyleri ve periferik yaymaları normal Taşıyıcılar klinik olarak tamamen normal, mikrositoz Globin sentezinde orta derecede azalma ( 101 promotor mut ve + 1 cap site ınr mut) Hastalar Sessiz taşıyıcı talasemi geni için homozigot olanlar Orta derecede bir anemi (Hb 6 7g/dl) nadiren transf gereksinimi Önemli derecede hepatosplenomegali olabilir. Hemoglobin elektroforezinde HbF %10 15, HbA 2 ise klasik talasemi taşıyıcılarında olduğu gibi (% 3,5 ).
Beta talasemi minor (beta talasemi trait, beta talasemi taşıyıcılığı) Beta tal majörlü hastaların anne ve babaları, taşıyıcılığın farkında değiller Bir geni tamamen normal, diğer geninde mutasyon HbA 2 : Mutant geni ve karşı taraftaki kromozomdaki sağlam genine bitişik geninden yapılan globin zincirlerinin, eksik geni yüzünden zincirleri ile birleşmesi nedeniyle 2 2 A 2 düzeyi artar HbA 2, HbF veya her ikisi de,nadiren normal, globülinin %2,5 u Eğer globulin ekspresyonunu etkileyen bir mutasyon varsa daha da az HbA 2 Demir eksikliğinde A 2 düzeyi azalır. Bu nedenle beta talasemi taşıyıcılarının tanısı maskelenebilir. Demir tedavisinden sonra HbA 2 de Hipokrom mikrositik hafif bir anemileri olabilir Demir, folik asit eksikliği, gebelik, enfeksiyonlar gibi stres durumları anemilerini artırabilir.
Beta talasemi minor Yüksek A2 ile olan talasemi taşıyıcılığı En fazla görülen tip, tek baz mutasyonu sonucu HbA2: %3,5 8, HbF %1 5 + veya o mutasyonlarla olan heterozigotlar farklıdır. Klinik fenotipi mutasyonun tabiatı belirler. + taşıyıcılarda MCV ve MCH daha yüksektir. Homozigot çocuklarında transfüzyona bağımlı anemi, fakat bazen de talasemia intermedia fenotipi olur. Yüksek A 2, yüksek F ile olan talasemi taşıyıcılığı Farklı bir varyant. Hem A 2 hem %5 20 gibi Hb F yüksektir. geni delesyonu ve genleri sağlam. Normal A 2 ile olan talasemi taşıyıcılığı Sessiz taşıyıcılardan ayrılmalıdır. Farkı hipokrom mikrositer anemi oluşu Hem hem geni azalmış (aynı kromozom veya karşı sağlam kromozomda) Ebeveynlerden biri bu tip, diğeri klasik taşıyıcı ise ağır klinik tablo
Talasemi İntermedia Homozigot talasemi fakat klinik olarak ağır değil transfüzyon ihtiyacı yok veya çok az Enfeksiyon, cerrahi ve bazı özel stres durumları dışında Hb leri 6-10g/dl düzeyinde İlerleyen yaşla kemik iliği genişlemesine bağlı kemik değişiklikleri Ekstramedüller hematopoez kitleleri Artmış demir emilimi sonucu demir birikim bulguları Talasemide hastalığın ağırlığı α ve non α globin sentezi arasındaki dengesizliğin derecesine bağlıdır β mutasyonunun tipi β + β 0 α globinin artması veya azalması genetik olarak Hb F yapma kapasitesi)
Talasemik hastada veya aile taramalarında klasik olmayan elektroforez sonuçları varsa α veya γ genlerinin eksikliği veya fazlalığı düşünülmelidir α talasemi de varsa talasemi kliniği hafifler, Hb daha yüksektir, Hb F düzeyi düşüktür α gen fazlalığında klinik daha ağırdır, Hb F artar. β gen delesyonlarında taşıyıcılarda A 2 belirgin yüksek, klinik ağırdır. Promotor delesyonlarda Hb F belirgin yüksektir δβ talasemide taşıyıcılarda HbA 2 yükselmez, Hb F %5-15 gibidir Homozigot β tal gibi olan hastanın anne veya babasının veya her ikisinin Hb A 2 leri normal ise o taşıyıcılarda: - Beraberinde demir eksikliği δβ talasemi taşıyıcılığı β taşıyıcılığı + δ talasemi varlığı -101 mutasyonu gibi sessiz taşıyıcılık Başka anormal Hb varlığı Dominant talasemi : globin genleri kodlama bölgesi mutasyonu, β sentezi çok az, inkülizyon cisimcikleri, Hb elektroforezinde bant görmek çok zor
B.Ö., 5 yaş, Ankara Yakınma: Kulak ağrısı Öykü : Beslenme: İnek sütü : 400 ml/gün Jeofaji : Yok Soygeçmiş: Anne: 36 yaş, sağlıklı Baba: 36 yaş, DM Fizik Muayene: VA: 21.5 kg (%50-75) Boy: 116 cm (%25-50) Cilt soluk Hb: 10.3 g/dl Diğer sistem bulguları doğal
Tam kan sayımı: Hb : 10.6 g/dl Htc : % 32.3 MCV: 62.3 fl MCH: 20.5 pg MCHC: 32.8 g/dl RDW : %13 BK : 7600/mm 3 Plt : 326000/mm 3 PY : Hipokromi, target hücreleri
Demir profili: SD: 90 mcg/ml TDBK: 290 mcg/dl TS : % 31 Ferritin: 28.83 ng/ml Hb elektroforezi: HbA 2 : % 4.8 Hb F : 4 Anormal Hb: Yok Anne: Normal bulgular Baba: Hb: 14.0 g/dl MCV: 64.8 µ 3 MCH: 21.0 pg HbA2: % 6.7 HbF: %2
Talasemi ve Orak Hücreli Anemide Hematolojik Tanı Dr. Zümrüt Uysal
O.K., 4 yaş, Gaziantep ÖYKÜ: 2 ve 3 aylık Halsizlik, kusma, sarılık Anemi Eritrosit transfüzyonu (2 kere) 6 aylık Hastaneye başvuru Tam kan sayımı: Hb : 5.3 g/dl MCV : 66.9 fl BK : 9400/mm 3 Plt : 245000/mm 3 Mikrositer anemi Ferritin: 42.4 ng/ml (N)
O.K., 4 yaş, Gaziantep 4 yaş kız KLİNİĞİMİZE BAŞVURU Solukluk dışında yakınması yok Soygeçmiş: Anne: 26 yaş Sağlıklı, teyze çocukları Baba: 33 yaş Fizik Muayene: VA: 16 kg (%25-50) Boy: 95 cm (%3) Cilt ve mukozalar soluk Karaciğer kot altı MKH da 4 cm, dalak 6 cm ele geliyor Diğer sistem bulguları doğal
Hb : 5.3 g/dl MCV: 66.9 fl RDW: 26 6/100 normoblast Ferritin: 3556 ng/ml Hemoglobin Elektroforezi Hb A2 : %2.1 Hb F : %13.7 Anormal Hb: YOK
Talasemi majorde laboratuar Hipokromik mikrositik anemi (5g/dl ), RDW Normoblastlar (stoplazmaları bozuk) Eritrosit içi inkülüzyonlar Retikülosit artmamış SD, UDBK (0), Transferrin satüre (%100) İndirek bilirübin artmış ama fazla değil, idrar rengi koyu Hb F yüksek Anne ve babalarında HbA 2 >3.5
O.K., LABORATUVAR İNCELEMELERİ HASTA BABA ANNE Hb : 5.3 g/dl MCV : 66.9 fl RDW: 20 Hipokromi, anizopoikilositoz Normoblast 2/100 Hb : 11.5 g/dl Htc : %36.8 MCV : 62.5 fl RDW: 13.8 Hipokromi Hb : 12.1 g/dl Htc : %40.5 MCV: 71.8 fl RDW: %14.5 Hipokromi Ferritin: 3556 ng/ml Ferritin: 48.6 ng/ml Ferritin: 89.2 ng/ml Hb A2: %2.1 Hb F : %13.7 Anormal Hb: YOK Hb A2: %6.6 Hb F : %2 Anormal Hb: YOK Hb A2: %6.2 Hb F : %2 Anormal Hb: YOK Beta Talasemi Majör
Talasemide Patofizyoloji 1. İnefektif eritropoez 2. Hemoliz : İntrasellüler inkülüzyonlar, hemikrom oluşumu 3. Membran hasarı: Membranda rijidite artışı, stabilite azalması 4. Hücre dehidratasyonu 5. Eritrositlerin RES te yıkılışı 6. Demir birikimi ve oksidatif stres
Talasemi majorde hemoliz Talasemik kemik iliğinde Eritrosit öncü hücreler sağlıklı kontrollere göre 5-6 kat fazla, ondan sonraki eritroid gelişim basamaklarında da apopitotik hücreler 15 kat fazla 1- İntrameduller hemoliz kemik iliğinde hemoliz ve bunun neden olduğu inefektif eritropoez 2- Ekstrameduller hemoliz RES ve başlıca dalakta olan hemoliz Ekstrameduller hemoliz fizyopatolojisi: Membran hasarı sonucunda membran rijiditesinde artış ve stabilitesinde azalma İntraselüler inkülüzyonlar, hemikrom oluşumu Hücre dehidratasyonu Demir birikimi ve oksidatif stres
ß Talassemide İnefektif eritropoez ß globulinde azalma, fazla α globulinzincirleri apopitosis Kemik iliğinde eritroid maturasyon boyunca intrameduller yıkım sürer. Eritroid oncülerin yaşam süresi kısalır. Apopitosis, posfotidil serinin membrana hareketi makrofaja sinyal fagositoz
A B 15y E L4 L5 Kontüzyon/ Beyin cerrahiden konsültasyon Hb : 8.9 g/dl KK : 2.87 mil/mm 3 MCV : 89 fl MCH :30.9pg MCHC : 34.6g/dl BK : 13 500/ mm 3 Tr : 590 000/ mm 3 Ret : %8.6 CRP 20 İnd Bil :2.35 LDH :783
AB Hb S :%98.5
Normositik Anemi RETİKÜLOSİT SAYIMI Düşük Yüksek BK ve Tr. Normal Pure red cell anemi İlaçlar Enfeksiyonlar Geçici eritroblastopeni BK ve Tr. Anormal Lösemi, Kİ İnfiltrasyonu Hipersplenizm Coombs
Coombs Korpüsküler NEGATİF Membran defektleri Morfoloji,osmotik frajilite Hemoglobinopatiler Hemoglobin elektroforezi Enzim eksiklikleri Ekstrakorpüsküler İdiopatik Sekonder: İlaçlar Enfeksiyon Mikroanjiopatik HA (DİC, HÜS, mekanik) POZİTİF Otoimmün hemolitik anemi Primer Sekonder (konnektif doku hast., ilaçlar, vb) İzoimmün hemolitik anemi Rh ABO subgrup uygunsuz kan trans.
HbA2 < % 3,5 Hb F < % 2 HbA2 bandı % 3,5 ise HbA2 bandı % 3,5 8 talasemi taşıyıcılığı HbA2 bandı % 10 ise Hb E, Hb C ve O Arap?
Elektroforezde hemoglobinler taşıdıkları elektrik yüklerine göre selüloz plak üzerinde hareket ederler. Bütün hemoglobinlerin anoda doğru hareket etmesi, onların toplam olarak negatif yük taşıdıklarını göstermektedir. Ancak her bir hemoglobin molekülü farklı yol alır. Dolayısıyla her birinin taşıdığı toplam negatif yük miktarı farklıdır. Ör: Hb A 1 in toplam negatif yükü HbA 2 den daha fazla olduğu için daha uzakta bir noktaya yürümüştür.
Hb S HbD ayırımı Solubilite Testi 4,5 ml lik EDTA lı kan serum fizyolojik ile iki kez yıkanır. 1 ml yıkanmış eritrosit + 1,5 ml distile su + 0,4 ml CCI 4 karıştırılıp(vortex), 15 dakika 3000 rpm de santrifüj edilir. Hemolizat (üstteki kısım) başka bir tüpe alınır. +4 0 C de uzun süre saklanabilir. Başka bir tüp içinde 5 mgr Na 2 S 2 O 4 (Sodyum hiposülfit), 0,9 ml solubilite solüsyonu (ph 6,8, KH 2 PO 4 ) ile karıştırılır. Bu karışıma 0,1ml hemolizat ilave edilir. Birkaç dakika beklenir. Bulanıklık varsa HbS, yoksa Hb D, vb diyoruz. Mutlaka negatif ve pozitif kontrol kullanılmalı. HbS olduğunu ikinci kez ispatlamak için Sickling Testi yapılır. Hb D, vb lerinin tayini için moleküler inceleme yapılır. Sickling Testi A Solüsyonu (0,114 M Na 2 S 2 O 4, ph 6,8) : 0,2 ml B Solüsyonu (0,114 M Na 2 HPO 4, ph 6,8) : 0,3 ml Venöz kan (EDTA lı) : 0,1 ml karıştırılır. Bu karışımdan bir damla lam üzerine alınır, lamel ile kapatılır. Kenarları vazelinle kaplanır. Hava girmesi önlenir. Düşük oksijenli ortamda hemoglobinin polimerazyonu nedeni ile uzar ve bükülür. Bir saat 37 0 C de en az bir saat bekletilir. Bu süre sonunda mikroskopta oraklaşmaya bakılır.
AB Hb S :%98.5 Hb S :% 20.3