BT 28 MİKROBİYAL KAYNAKLI LİPAZ ÜRETİMİNE KARBON KAYNAĞI OLARAK BİTKİSEL YAĞLARIN VE GLUKOZUN ETKİSİ B. Ş. Şengel 1, S. Takaç 1, G. Dönmez 2 1 Ankara Üniversitesi, Mühendislik Fakültesi, Kimya Mühendisliği Bölümü Tandoğan Ankara e-posta : sengel@eng.ankara.edu.tr, takac@eng.ankara.edu.tr 2 Ankara Üniversitesi, Fen Fakültesi, Biyoloji Bölümü Tandoğan Ankara e-posta : gdonmez@science.ankara.edu.tr ÖZET Süt mamulleri üretim tesisi yağlı atığından izole edilen, morfolojik ve biyolojik yöntemlerle Saccharomyces sp.olarak belirlenen mikroorganizmadan aktif ve kararlı lipaz üretimine, karbon kaynağı olarak bitkisel yağ, yağ asidi, yağ asidi esterleri ve glukozun farklı derişimlerinin etkisinin incelendiği çalışmada, enzim üretim ortamından t=0 anından itibaren belirli zaman aralıklarıyla örnekler alınarak lipolitik aktivite, protein ve hücre derişimleri belirlenmiştir. Aktivite ölçümleri substrat olarak p- nitrofenil palmitatın kullanıldığı spektrofometrik yöntemle yapılmış; protein derişimleri Bradford yöntemi ile belirlenmiştir. Hücre derişimleri ise 600 nm dalga boyunda spektrofotometrik olarak saptanmıştır. %0.5, %1 ve %1.5 olmak üzere üç farklı bitkisel yağ derişiminden, %1 derişimin kullanımının daha yüksek aktivite verdiği gözlenmiştir. Bitkisel yağlardan en yüksek aktivite, soya yağının kullanımıyla sağlanmıştır. Mikroorganizma, yağ asidi esterleri arasında karbon sayısı fazla olanları daha iyi kullanmaktadır. Doymuş yağ asitlerinde de genel olarak karbon sayısı fazla olanları tercih etmektedir. Yağ asitleri içeren ortamlarda, esterleri içeren ortamlara oranla daha yüksek aktivite gözlenmektedir. Doymamış yağ asitleri içeren ortamlarda çift bağ sayısı arttıkça aktivitenin azaldığı gözlenmiştir. Glukoz, katı ve önçoğalma ortamında hücre derişimini artırmakla beraber, üretim ortamında kullanımı lipolitik aktiviteyi olumsuz etkilemektedir. Bazı iyonların hücre çoğalmasına etkisinin de incelendiği çalışmada katı ve önçoğalma ortamlarında glukozla birlikte iyon kullanımının çoğalmayı artırdığı, ancak belirgin bir fark yaratmadığı belirlenmiştir. Anahtar Kelimeler : mikrobiyal lipaz üretimi, lipolitik aktivite 1. GİRİŞ Lipazlar, deterjan, gıda, farmasötiklerin sentezi, kağıt endüstrisi, kozmetik, deri ve diğer pek çok endüstriyel alanda kullanılan enzimlerdir. Endüstriyel enzimlerin yaklaşık %75 ini oluşturan hidrolitik enzimlerden biri olan lipazların en büyük ticari uygulaması, çamaşır deterjanlarında kullanımlarıdır. Deterjan enzimleri tüm lipaz satışının %32 sini oluşturur. Her yıl üretilen 13 milyar ton deterjana, yaklaşık 1000 ton lipaz eklenmektedir [1]. Lipazlar, yağları hidroliz etme özellikleri ile yağlı lekelerin çıkarılmasında, deterjan katkısı olarak büyük bir kullanım alanı bulmuştur. Deterjan lipazları, farklı bileşimdeki yağların parçalanabilmesi için düşük substrat spesifikliğine sahip olmalı, sert yıkama koşullarına, çok sayıda deterjan formülasyonlarının önemli bileşenleri olan surfaktan ve diğer enzimlerin zararlı etkilerine karşı dayanabilmelidir.
Lipazlar, bitki ve hayvan dokularından ekstraksiyonla veya mikroorganizmalardan fermantasyon yoluyla üretilir.ticari lipazlar genelde mikrobiyal kaynaklıdır. Lipaz üreten mikroorganizmalar bakteriler, fungi ve mayalardır. Mikrobiyal lipazlar, çoğunlukla sıvı ortamda üretilir; ancak katı faz fermantasyon metotları da kullanılabilir. Lipaz üretiminde; karbon ve azot kaynaklarının türü ve derişimi, üretim ph ı, sıcaklık, metal iyonları ve çözünmüş oksijen derişimi etkilidir [2]. Mikrobiyal lipazların üretiminde çoğunlukla karbon kaynağı olarak daha ekonomik olduğu için zeytinyağı, ayçiçek yağı, soya fasulyesi yağı, susam yağı, pamuk yağı, buğday, yer fıstığı yağı ve palmiye yağı gibi bitkisel yağlar denenmektedir. Yağlı bir ortamda çoğalan mikroorganizmalar, lipaz üretme potansiyeline sahiptir. Mikroorganizmalar yağları karbon kaynağı olarak kullanırken bir yandan da lipaz üretmektedir. Lipaz üretimi için kullanılan karbon kaynaklarından biri de glukozdur. Glukoz bazı mikroorganizmalar için lipaz üretiminde gerekli görülürken, bazılarında aktiviteyi azaltıcı etki göstermektedir. Karbon kaynağı olarak sadece yağlar ve şekerler değil, yağların yapısını oluşturan yağ asitleri ve esterleri de kullanılmaktadır. Lipazlar, farklı yağ ve yağ asidi spesifiklikleri sergilemektedirler. Lipazların bazıları, doymamış yağ asitlerinden kısa zincirli olanlara (asetik, butirik, kaprik, kaproik, kaprilik), bazısı ise daha uzun zincirli yağ asitlerine (oleik, linoleik, linolenik vb) ilgi duyar. Bununla birlikte çok sayıda lipaz spesifik olmayıp, trigliseritlerin yağ asitlerini rastgele parçalar [2]. Bu çalışma ile amaçlanan, süt mamulleri üretim tesisi yağlı atığından -deterjan endüstrisinde kullanımı araştırılmak üzere- izole edilen Saccharomyces sp. nin lipaz aktivitesine ve kararlılığına, karbon kaynağı olarak farklı türde ve derişimde bitkisel yağların, glukozun, farklı yağ asidi ve esterlerinin etkisinin incelenmesidir. 2. DENEYSEL 2.1. Mikroorganizma İzolasyonu Süt mamulleri üretim tesisi yağlı atığından Saccharomyces sp. nin izolasyonu ardışık basamaklardan oluşmaktadır. Mikroorganizmanın çoğalmada kullanacağı besi ortamı olarak, yağlı ortamda çoğalan mikroorganizmanın lipaz üretme potansiyeline sahip olacağı düşünülerek TBA seçilmiştir. TBA, %0.5 pepton, %0.3 maya özütü, %1 tribütirin ve %1.5 agar içermektedir. Agar petrilere paylaştırılarak, yağlı atık örneğinden iki paralel tek koloni ekimi yapılmış ve 30 C ta inkübasyona bırakılmıştır. Petrilerde yeterli çoğalma gözlendikten sonra eğik agarlara ekim yapılmıştır. Bundan sonra deneylere, ön çoğalmaya aktarımlardan önce, tüpten tüpe ekim yapılarak devam edilmiştir. 2.2. Lipaz Üretimi Deneylerde, eğik agar ortamında 24 saat çoğaltılan hücreler, TBA dan farklı olarak agar içermeyen ön çoğalma ortamına aktarılmakta, aktarımdan 24 saat sonra farklı karbon kaynaklarının denendiği üretim ortamlarına 1/10 oranında aşılama yapılmaktadır. Üretim ortamları da önçoğalma ortamlarından karbon kaynağı olarak tribütirin yerine, farklı türde ve derişimde etkileri denenecek yağları içermesiyle ayrılmaktadır. Enzim üretimi, çalkalamalı hava banyosunda izoterm koşullarda gerçekleştirilmiştir. Üretim koşulları, ön çalışmalar ile N=150 rpm, T=30 o C ve ph=4.5 olarak belirlenmiştir. 2.3. Lipaz Üretimine Etkisi İncelenecek Karbon Kaynakları Saccharomyces sp. den lipaz üretiminde karbon kaynağı olarak farklı tür ve derişimlerde yağlar denenmiştir. Yağlar içerdikleri yağ asitlerinin doymuş ya da doymamış olmasına göre sınıflandırılır. Bitkisel yağlar genellikle doymamış yağlar olup, bunlar da kendi aralarında tekli ve çoklu doymamış yağlar olarak ikiye ayrılmaktadır. Tekli ve çoklu
doymamış yağlar, yapılarındaki yağ asitlerinin tek ya da çift bağ bulundurma oranlarına göre isimlendirilir. Çalışmada tekli doymamış yağlardan zeytin yağı ve fındık yağı, çoklu doymamış yağlardan ayçiçek yağı, soya yağı, mısır yağı ve susam yağı denenmiştir. %1 derişimleri incelenen bitkisel yağlardan en yüksek aktiviteyi veren susam yağı, soya yağı ve mısır yağının ayrıca %0.5 ve %1.5 derişimlerinin de aktiviteye etkisi incelenmiştir. Daha sonra yağları oluşturan yağ asitleri ve esterlerinin lipolitik aktiviteye etkisi araştırılmıştır. Bu amaçla; kısa zincirli bir karboksilik asit olan asetik asit, doymuş yağ asitlerinden palmitik asit ve stearik asit, doymamışlardan tek çift bağ içeren oleik asit, doymamışlardan iki çift bağ içeren linoleik asit, yağ asidi esterlerinden triasetin, tripalmitin, tristearin ve trioleinin %1 derişimleri ile doymuş yağ asitlerinden palmitik ve stearik asit ile esteri tristearinin %0.5 derişimleri denenmiştir. Ayrıca glukozun ve iyonların hücre çoğalması ve aktiviteye etkisi incelenmiş, bu amaçla çoğalmaya etkisi, katı ve önçoğalma ortamlarına %1 glukoz, %1 glukoz ile birlikte %0.1 KH 2 PO 4 ve %0.05 MgSO 4.7H 2 O eklenerek; aktiviteye etkisi ise üretim ortamına yüksek aktivite veren yağlardan biri olan mısır özü yağı ile farklı derişimlerde (%0.25, %0.5 ve %1) glukoz eklenerek incelenmiştir. 2.4. Örnek Alma ve Analizler 2.4.1. Örnek Alma Üretim ortamından t=0 anından itibaren belirli zaman aralıklarıyla örnekler alınarak aktivite, protein ve hücre derişimleri tayin edilmiştir. Örnekler, 4 o C ta 10000 rpm de 10 dakika santrifüj edilerek mikroorganizmalar çöktürülmüş, sıvı kısım analizlenmek üzere ayrılmıştır. 2.4.2. Analizler 2.4.2.1. Lipolitik Aktivitenin Belirlenmesi Lipolitik aktivite, substrat olarak p-nitrofenil palmitatın kullanıldığı spektrofotometrik bir yöntem ile tayin edilmiştir. Reaksiyon oda sıcaklığında 5 dakika süreyle gerçekleştirilerek 404 nm de absorbanslar okunmuştur. Absorbanstaki değişim, p-nitrofenil palmitatın enzimatik hidrolizi sonucunda p-nitrofenol oluşumuna dayanır. Aktivite 1 dakikada 1 µmol p-nitrofenol açığa çıkaran enzim miktarı olarak tanımlanmıştır [3]. 2.4.2.2. Protein Derişiminin Belirlenmesi Protein tayini için Bradford yöntemi kullanılmıştır [4]. Absorbanslar 595 nm de okunmuştur. Derişimler, BSA kullanılarak hazırlanmış olan kalibrasyon doğrusu yardımı ile belirlenmiştir. 2.1.2.3. Hücre Derişiminin Belirlenmesi Hücrelerin 600 nm deki absorbansları okunmuş ve önceden bu dalga boyunda hazırlanmış hücre kalibrasyonu yardımıyla derişimler belirlenerek hücre çoğalma eğrileri oluşturulmuştur. Farklı ortamlar için mikroorganizmanın özgül çoğalma hızları da belirlenmiştir. Özgül çoğalma hızları, (1) nolu denklem yardımıyla hesaplanmıştır. ln (Cx/Cxo) =µt (1)
3. SONUÇLAR 3.1. Katı ve Önçoğalma Ortamlarına Eklenen Glukoz ve İyonların Hücre Çoğalmasına Etkisi Bu deney setinde, katı ve önçoğalma ortamlarına %1 glukoz, %1 glukoz ile birlikte %0.1 KH 2 PO 4 ve %0.05 MgSO 4.7H 2 O eklenmiş ve önçoğalma ortamına aktarıldıktan 24 saat sonra hücre derişimlerine bakılmıştır. Katı ortamda glukoz varken çoğalmanın daha iyi gerçekleştiği gözlenebilmiştir. Önçoğalma ortamında ise, mikroorganizmalar en fazla glukoz ve iyonları birlikte içeren ortamda çoğalmıştır. Bunu glukoz içeren ortam izlemektedir. Bu deney setinden elde edilen sonuç, katı agar ortamının glukoz ile desteklenmesi gerektiğidir. İyonların kullanımıyla çoğalma artmakla beraber iyonsuz ortamla karşılaştırıldığında çok fazla bir fark görülmemiştir. Sonuçlar Çizelge 1 de verilmektedir. Çizelge 1. Farklı bileşimde önçoğalma ortamlarının 24 st sonunda belirlenen hücre derişimleri Ortam Hücre Derişimi (mg/ml) Glukoz ve iyon içermeyen 1.54 %1 Glukoz içeren 7.70 %1 Glukoz + %0.1 KH 2 PO 4 + %0.05 MgSO 4.7H 2 O 10.08 3.2. Üretim Ortamlarına Farklı Derişimlerde Eklenen Glukozun Lipolitik Aktiviteye Etkisi Hücre çoğalmasında gerekli görülen glukozun lipolitik aktiviteye etkisi üretim ortamına farklı derişimlerde (%0, %0.25, %0,5, %1) glukoz konularak incelenmiştir. Üretim ortamında glukoz derişimi arttıkça aktivitelerde azalma görülmektedir. Karbon kaynağı olarak mısır yağını desteklemek amacıyla kullanılan glukoz, yüksek derişimlerde substrat inhibisyonuna yol açmaktadır. Ayrıca, önçoğalma ve katı ortamda glukoz kullanımı, üretim ortamında lipazın maksimum aktivite gösterme süresini kısaltmıştır. Glukozun farklı derişimleri için zamana karşı bağıl aktivitelerin değişimi Şekil 1 de verilmektedir. 120 100 Bağıl Aktivite, % 80 60 40 20 0 0 10 20 30 40 50 60 70 Zaman, st %0 glukoz %0.25 glukoz %0.50 glukoz %1 glukoz Şekil 1. Glukozun farklı derişimleri için zaman ile bağıl aktivitenin değişimi 3.3. Farklı Tür ve Derişimdeki Bitkisel Yağların Lipolitik Aktiviteye Etkisi Bitkisel yağların lipolitik aktiviteye etkisinin incelendiğinde genel olarak çoklu doymamış yağlar kullanıldığında daha iyi sonuçlar elde edildiği görülmektedir. Bununla birlikte yağları sadece doymuşluk ve doymamışlıklarına göre değerlendirmek yanıltıcı olabilir.
Yağların %1 derişimleri daha iyi sonuç vermiş olup, %1.5 derişimler inhibisyon yaratmıştır. %0.5 lik derişimler ise aktivite için yetersiz kalmaktadır. En iyi aktiviteyi %1 derişimde soya yağı içeren ortam vermiştir. Soya yağı içeren ortamın yüksek aktivite vermesi lezitin içermesi, protein ve vitamince zengin oluşuyla açıklanabilir. Bitkisel yağlar için maksimum bağıl aktiviteler ve özgül çoğalma hızları Şekil 2 de verilmiştir. Şekil 2. Bitkisel yağlar için maksimum bağıl aktiviteler ve özgül çoğalma hızları 3.4. Farklı Yağ Asitlerinin Lipolitik Aktiviteye Etkisi Mikroorganizma, %1 derişimde doymuş yağ asitlerinde karbon sayısı fazla olanları tercih etmekle beraber, palmitik asit, stearik asitten daha iyi sonuç vermiştir. Bunun sebebi olarak stearik asidi parçalamasının daha zor olması gösterilebilir. Stearik asitin %1 lik derişiminde inhibisyon gözlenmekte, palmitik asitin ise %0.5 derişimi yetersiz kalmaktadır. Doymamış yağ asitlerinde çift bağ sayısı arttıkça aktivite ve özgül çoğalma hızları azalmaktadır.
Şekil 3. Yağ asitleri için maksimum bağıl aktivite ve özgül çoğalma hızları 3.5. Farklı Yağ Asidi Esterlerinin Lipolitik Aktiviteye Etkisi Mikroorganizma yağ asidi esterlerinde karbon sayısı yüksek olanları daha iyi kullanmaktadır. Doymuş yağ asitlerini içeren esterler, doymamış yağ asitlerini içeren esterlerden daha iyi sonuç vermiştir. Bununla birlikte yağ asidi esterleri içeren ortamda, yağ asitleri içeren ortamlara kıyasla genellikle daha az aktivite gözlenmiştir. Şekil 4. Yağ asidi esterleri için maksimum bağıl aktivite ve özgül çoğalma hızları KAYNAKLAR [1] Sharma, R., Chisti, Y. and Banerjee, U.C., 2001. Biotechnology Advances, 19, 627-662. [2] Saxena, R.K., Ghosh, P.K., Gupta, R., Davidson, W.S., Bradoo, S. and Gulati, R., 1999. Curr. Sci., 77, 101-115. [3] Hung, T., Gridhar, R., Chiou, S., Wu., W., 2003. J. Mol. Catal. B:Enzymatic 26, 69-78. [4] Bradford, M.M., 1976. Anal. Biochem, 72, 248-254.