REF TV55-50FRT IVD in Vitro Diagnostik kullanım için RotorGene 3000/6000 (Corbett Research), SmartCycler (Cepheid), iq icycler ve iq5 (Biorad), Applied Biosystems 7300/7500 Real Time PCR Systems (Applera), MX3000P ve MX3005P (Stratagene) ile kullanılan Swine Influenza Virus A/H1 Real-TM Kullanılan Semboller Liste Numarası in Vitro Diagnostik Kullanım için Sıcaklık koşulları Dikkat! Lot Numarası Son Kullanma Tarihi VER Versiyon Kullanım Bilgileri Reaktif İçerir Üretici İSİM Swine Influenza Virus A/H1 Real-TM GİRİŞ Domuz İnfluenza Virus (SIV) H1N1 ( domuz gribi olarak adlandırdı) insanlarda hastalığa neden olan yeni bir grip virüsüdür. Bu yeni virüs ilk olarak Nisan 2009 yılında Meksika, Amerika Birleşik Devletleri ve Kanada'da insanlarda tespit edildi. Birçok Avrupa ülkesi dahil başka ülkelerde bu yeni virüse sahip hasta insanlar bildirildi. Bu virüs insandan insana yayılır ve mevsimler H1N1 virüsünden farklıdır. Influenza A,B Real-TM (Sacace, ref. TV36-50FRT) ile influenza A virüsü için Real-time RT-PCR test bütün şüpheli domuz İnfluenza A (H1N1) virüsü vakaları için tarama testi olarak önerilir. Domuzkaynaklı influenza A (H1N1) virüsünün doğrulanması Swine Influenza Virus A/H1 Real-TM Real- Time RT-PCR test ile yapılmalıdır. Domuz influenza A (H1N1) virüslü insan enfeksiyonunun izlenimleri için Dünya Sağlık Örgütü (WHO) rehberliğinde domuz influenza A virüsü için doğrulama testi olarak SIV primerleri ile real-time RT-PCR testi yapılır. KULLANIM AMACI Swine Influenza Virus A/H1 Real-TM klinik örneklerde Swine Influenza Virus A/H1 RNA nın kantitatif tespiti için Real Time amplifikasyon testidir.
TEST PRENSİBİ Swine Influenza Virus A/H1 Real-TM Test üç temel aşamaya dayanır: örneklerden virus RNA izolasyonu, RNA nın reverse transkripsiyonu ve cdna nın Real Time amplifikasyonu. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) tarafından tespit edilen Influenza virus A/H1-swine spesifik primerler kullanılarak spesifik alanda patojenik genomun amplifikasyonuna ve flüoresans boya ile tespite dayalıdır. Bu boyalar özellikle güçlendirilmiş ürüne bağlı olan oligonükleotitlerin problarına bağlıdır. Flüoresan yoğunluğunun real-time PCR izlemesi PCR çalıştırıldıktan sonra reaksiyon tüplerini yeniden kapatmadan biriktirilen ürünün tespitini sağlar. Swine Influenza Virus A/H1 Real-TM PCR kit internal Kontrol (IC) içeren bir kalitatif testtir. Her biri tek tek işlenen örneğin ekstraksiyonun kontrolünü ve olası reaksiyon inhibisyonu tanımlanmasını sağlamak için izolasyon prosedürlerinde kullanılır. KİT İÇERİĞİ Part N 1 Ribo-Sorb : klinik örneklerden RNA izolasyonu; Part N 2 Reverta-L : RNA nın reverse transkripsiyonu; Part N 3 SIV A/H1 : Real Time amplifikasyon kit; Part N 1 Ribo-Sorb : Lizis Solüsyonu, 22,5 ml; Yıkama Solüsyonu, 20 ml; Sorbent, 1,25 ml. RNA-eluent, 5 x 0,5ml; 50 test için gerekli reaktifler içerir. Part N 2 Reverta-L : RT-G-mix-1, 5 x 0,01 ml; RT-mix, 5 x 0,125 ml; Reverse transcriptaz (M-MLV), 0,03 ml; TE-buffer, 1,2 ml. 60 test için gerekli reaktifler içerir. Part N 3 SIV A/H1 : PCR-mix-1, 5 x 0,12 ml; PCR-mix-2-FRT, 0,3 ml; TaqF Polymerase, 0,03 ml; SIV cdna H1 C+, 0,1 ml; Negatif Kontrol, 1,2 ml; Internal Kontrol (IC) RNA, 5 x 0,12 ml; Internal Kontrol (IC) DNA, 0,1 ml; DNA buffer, 0,5 ml; 55 test için gerekli reaktifler içerir. KİT İÇERİĞİNDE BULUNMAYAN GEREKLİ MATERYALLER Zone 1: örnek hazırlama: Biyolojik kabin eppendorf tipi tüpler için masa mikrosantrifüj (RCF max. 16,000 x g); Eppendorf 5415D ya da benzeri 60 C ± 2 C kuru ısı bloğu Vorteks mikser Aerosol bariyerli pipetörler 1,5 ml polipropilen steril tüpler (Sarstedt, QSP, Eppendorf) Tek kullanımlık eldiven, pudrasız Tüp raklar 70% Etanol (% 96 etanol ve saf su ile reaktifin taze hazırlanan karışım) Aseton
Buzdolabı Dondurucu Zone 2: RT ve amplifikasyon: Real Time Termalcycler Workstation Aerosol bariyerli pipetörler (0,5-10 μl; 5-40 μl) Tüp rakları UYARILAR VE ÖNLEMLER 1. Lizis Solusyonu, guanidine tiyosiyanat içerir. Guanidine tiyosiyanat solunursa, deri ile temas ederse ya da yutulursa zararlıdır. Asitler ile teması toksik gaz oluşumuna neden olur. (Xn; R: 20/21/22-36/37/38; S: 36/37/39). 2.Şüpheli influenza A (H1N1) vakasından alınan klinik örnekler BSL3 uygulamalı bir BSL2 laboratuvarda yapılmalıdır (geliştirilmiş BSL2 şartları). 3. Örnekler ve reaktifler ile çalışırken tek kullanımlık eldivenler, laboratuar giysisi ve göz koruyucu kullanın. Çalışmalardan sonra ellerinizi yıkayın. 4.Solunum koruma için N95 solunum ya da daha yüksek koruma seviyesinin test edilmesi önerilir. 5. Ağızla pipetleme yapmayın. 6. Laboratuar çalışma alanında yemek yemeyin, bir şey içmeyin, kozmetik uygulamayın ya da kontak lenslerini ellemeyin. 7. Son kullanma tarihi geçmiş kitleri kullanmayın. 8. Tüm örnekleri ve kullanılmayan reaktifleri yasal düzenlemelere göre yok edin. 9. Dökülen tüm örnekler ya da reaktifleri 0,5% sodyum hipoklorit ya da uygun diğer dezenfektanlar ile temizleyin. 10. Örnekler ve reaktiflerin deri, gözler ve mukoz membranlar ile temasından kaçının. Eğer bu solüsyonlar ile temas ederse bol su ile yıkayın ve doktorunuza başvurun. 11. Material Safety Data Sheets (MSDS) istenildiğinde verilebilir. 12. Bu kit Ribo-Sorb ekstraksiyon kiti ile kullanılmak için dizayn edilmiştir. Eğer başka bir kit ile RNA ekstraksiyonu yapılıyorsa bu kullanıcı sorumluluğundadır. 13. Bu kiti ancak DNA amplifikasyon tekniği bilgisi olan kişiler kullanmalıdır. 14. Laboratuardaki iş akışı Ekstraksiyon alanından başlayıp Amplifikasyon ve Belirleme alanlarına doğru tek bir kişinin yönetiminde olmalıdır. Örnekleri, ekipmanları ve reaktifleri bir önceki çalışma alanına geri götürmeyin. SAKLAMA KOŞULLARI Swine Influenza Virus A/H1 Real-TM +2-8 C de saklanmalıdır ( Reverta-L, PCR-mix-1, PCR-mix-2- FRT, TaqF Polymerase -20 C de saklanmalıdır). Kit 3-4 boyunca 2-8 C de taşınabilir fakat 2-8 C de ve - 20 C de saklanmalıdır. KARARLILIK Swine Influenza Virus A/H1 Real-TM Test kit etiketi üzerinde belirtilen son kullanma tarihine kadar stabil kalır. Ürünün performansı etiket üzerinde yazılı kontrol tarihi ile sağlanacaktır. Işık, ısı ya da neme maruz kalmak bazı kit bileşenlerin raf ömrünü etkileyebilir. Tekrarlanan çözdürme ve bu reaktiflerin dondurulması duyarlılığı azaltabildiği için bu durumdan kaçınılmalıdır. ÖRNEK SAKLAMA, TOPLAMA VE TRANSPORT Swine Influenza Virus A/H1 Real-TM aşağıdaki materyallerden Ribo-Sorb (REF K-2-1) ile ekstre edilmiş RNA lar ile analiz edilebilir: nazofarengeal swablar: swab alın ve 0,5 ml tuzlu su yada PBS sterilli Eppendorf tüp içine koyun (Sacace Transport medium önerilir). Kuvvetlice sallayın. Swabı tekrar edin ve aynı tüp içinde sallayın. 1000g/min de 5 dakika boyunca santrifüj edin. Süpernatantı atın ve RNA ekstraksiyonu için yaklaşık 100 µl solüsyon ayırın.
aspirat, bronşiyal lavaj, nazal yıkama: 2000 g/dk da 10-15 dakika boyunca santrifüj edin. Eğer pellet görünmezse, 10 ml sıvı ekleyin ve tekrar santrifüj edin. Süpernatantı alın ve atın. 100 µl saline su içinde pelleti tekrar suspense edin. doku: cam çubuklar, teflon tokmak, skalpel ya da mekanik homojenizör ile homojenize edilmiş ve 1,0 ml tuzlu su ya da PBS sterilde çözülmüş 1,0 gr (parenchimatous organları, trakea, akciğer, beyin). Kuvvetlice vorteksleyin ve oda ısısında 30 dakika inkübe edin. Supernatantı yeni 1,5 ml tüpe aktarın; 12 saatten daha uzun olmamak kaydıyla örnekleri +2-8 C de ya da daha uzun saklamak için 20/80 C de saklayın. Klinik örneklerin transportu, etiyolojik ajanların transportu için ülkesel, federal, lokal ve yasal düzenlemelere göre yapılmalıdır. ÖRNEK VE REAKTİF HAZIRLAMA 1. Lizis Solüsyonu ve Yıkama Solüsyonu (diğerleri +2-8 C de saklanmasına rağmen) buz kristalleri çözülene kadar 60 65 C ye kadar ısıtılır. Negatif Kontrol Ekstraksiyonu için bir tüp içeren 1,5 ml polipropilen tüplere gerekli miktarda hazırlayın. 2. Her bir tüpe 450 μl Lizis Solüsyonu ve 10 µl Internal Kontrol (IC RNA) ekleyin. Pipetleyerek karıştırın ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. 3. Lizis Solüsyonu ve IC uygun tüplere 100 μl örnek ekleyin. 4. Aşağıdaki gibi Kontrolleri hazırlayın: Cneg işaretli tüpe 100 μl C Negatif Kontrol ekleyin. 5.Tüpleri vorteksleyin ve 5000g de 5 sn santrifüj edin. Eğer örnek tamamen çözülmezse, maksimum hızda (12000-16000 g.) 1 dakika tüpleri tekrar santirifüj edin ve RNA ekstraksiyonu için yeni bir tüp içine supernatantı aktarın. 6. Sorbenti şiddetlice vorteksleyin ve her bir tüpe 25 μl ekleyin. 7. 5-7 saniye vorteksleyin ve tüm tüpleri oda ısısında 10 dakika inkübe edin. Periyodik olarak vorteksleyin. 8. Tüm tüpleri 10000g de 1 dk santrifüj edin ve aerosol bariyerli mikropipet kullanarak pellete zarar vermeden her bir tüpten dikkatlice supernatantı atın. Yeni bir tüpe geçerken pipet ucunu değiştirin. 9. Her bir tüpe 400 μl Yıkama Solusyonu ekleyin. Şiddetlice vorteksleyin ve 10000g de 1 dakika santrifüjleyin ve tıpalı bir aerosol bariyerli uçlu mikropipet kullanarak pellete zarar vermeden her bir tüpten dikkatlice supernatantı atın. Yeni bir tüpe geçerken pipet ucunu değiştirin. 10. Her bir tüpe 500 μl 70% Etanol ekleyin. Şiddetlice vorteksleyin ve 10000g de 1 dakika santrifüjleyin ve tıpalı bir aerosol bariyerli uçlu mikropipet kullanarak pellete zarar vermeden her bir tüpten dikkatlice supernatantı atın. Yeni bir tüpe geçerken pipet ucunu değiştirin. 11. Adım 10 tekrar edin. 12.Her bir tüpe 400 µl Aseton ekleyin. Şiddetlice vorteksleyin ve 10000g de 1 dakika santrifüjleyin ve tıpalı bir aerosol bariyerli uçlu mikropipet kullanarak pellete zarar vermeden her bir tüpten dikkatlice supernatantı atın. Yeni bir tüpe geçerken pipet ucunu değiştirin. 13. 60 C de 10 dakika açık kapakla bütün tüpleri inkübe edin. 14. Pelleti 40 μl RNA-eluent içinde yeniden suspense edin. 60 C de 10 dakika inkübe edin ve periyodik olarak vorteksleyin. Maksimum hızda (12000-16000 g) 2 dakika boyunca tüpleri santrifüjleyin. 15.Supernatant amplifikasyon için hazır RNA içerir. RT-PCR ile aynı günde yapılmalıdır. Eğer çalışılmayacaksa, RNA çökeltisini -80 C de bir aya kadar saklayabilirsiniz. RT VE AMPLİFİKASYON Reverse Transkripsiyon: 1) Reaktif Miks hazırlayın: 12 reaksiyon için, RT-mix içeren tüplere 5,0 μl RT-G-mix-1 ekleyin ve en az 5-10 saniye vorteksleyin, kısa süre santrifüjleyin. Bu karışım -20 C de 1 ay boyunca stabildir. Reaksiyon Miks olan tüplere 6 μl M-MLV ekleyin, pipetle karıştırın,3 saniye vorteksleyin, 5-7 saniye santrifüj edin (hazırlandıktan sonra hemen kullanılmalıdır). (Eğer 12 örnekten daha az test gerekirse, steril bir tüp içine RT-mix ile 10*N μl RT-G-mix-1 ve 0,5*N μl M-MLV her bir numune için ekleyin) 2)Her bir örnek tüpüne 10 μl Reaksiyon Mix ekleyin. 3) Uygun tüplere 10 μl RNA örneği ekleyin (Eğer Ribo-Sorb izolasyon kit RNA ekstraksiyon kiti olarak kullanırsa, ekstre RNA ile bütün tüpleri 2 dakika boyunca maksimum hızda (12000-16000 g) tekrar
santrifüj edin ve supernatantı dikkatlice alın. Reaksiyonla inhibe olan sorbent pellete dokunmayın ). Pipet kullanarak dikkatlice karıştırın. 4) Tüpleri termocycler içine yerleştirin ve 37 o С de 30 dakika inkübe edin. 5) Herbir cdna örneğini TE-Buffer ile 1: 2 seyreltin (her bir tüpe 20 μl TE-buffer ekleyin). cdna örnekleri -20 o С de 1 hafta ya da -70 o С de bir yıl saklanabilir. PCR Reaktifleri hazırlama Reaksiyon Mix 25 µl 1. Gerekli miktarlarda PCR plaka yada tüp hazırlayın. 2. Her bir örnek için 10*N µl PCR-mix-1, 5*N µl PCR-mix-2-FRT ve 0,5*N TaqF Polimeraz steril bir tüpe hazırlayın. 3. Her bir tüpe 15 µl Reaksiyon Mix ekleyin. 4. Reaksiyon mix'li uygun tüplere 10 μl cdna örneği ekleyin. 5. Her bir panel için 3 kontrol hazırlayın: PCR Negatif Kontrol işaretli tüpe 10 µl DNA-buffer ekleyin; C pos işaretli tüpe 10 µl cdna SIV H1 C+ ekleyin; IC DNA poz işaretli tüpe 10 µl IC DNA ekleyin. Rotor-Gene 3000/6000 ile Real Time Amplifikasyonu 1. Tüpleri kapatın ve Rotor-Gene 3000/6000 içine yerleştirin. 2. Rotor-Gene 3000/6000 aşağıdaki gibi programlayın. Reaksiyon Hacmi (μl): 25 Karusel: 36-kuyu Sıcaklık Profili: 1. Bekleme: 95 C 15 dk 2. Döngü 1 95 C 10 sn 54 C 20 sn 72 C 10 sn Döngü tekrarı 10 kez 3. Döngü 2 95 C 10 sn 54 C 20 sn - Fam (Green) ve Joe (Yellow) kanalında flüoresans tespit 72 C 10 sn Döngü tekrarı 35 kez Not: Eğer SIV için şüpheli klinik örneklerin acil analizini gerçekleştirmek gerekli ise, Influenza A,B Real-TM (Sacace, ref. TV36-50FRT) ile tarama testi ve Swine Influenza Virus A/H1 Real-TM ile doğrulama testi Influenza A,B Real-TM kitin manuelinde yazılmış protokol kullanılarak aynı zamanda yapılabilir. 3. Flüoresan kanal duyarlılık düzenlemesi yapın: Kanal Kurulum Kalibrasyon (RG6000 için optimizasyon sağlayın) Perform Kalibrasyon seçin (Optimizasyon) 1. devralmadan önce. Kanal Kurulum penceresinde her bir kanal için Min Reading 5, Max Reading 10. Tüp pozisyon kolonunda Rotor-Gene 3000/6000 karüselinde tüp pozisyonunu programlayın (1ci pozisyon reaktifli reaksiyon tüpü içermelidir.) Otomatik Kalibrasyon Ayarı Kurulumu penceresini kapatın. SONUÇ ANALİZİ 1. Sonuçlar, eşik çizgisi ile floresan eğrisinin kesiştiği noktadan Rotor-Gene 3000/6000 software ile yorumlanabilir. Swine Influenza Virüsün cdna, JOE (Sarı) kanalında ve IC, FAM (Yeşil) kanalında tespit edilir. 2. Analize bastıktan sonra Quantitation (Kantitasyon) butonunu seçin. Fam (RG6000C için cycling A FAM yada Cycling A. Green for RG6000) ve Joe (Cycling A JOE yada Cycling A. Yellow) kanalı için işlemi gerçekleştirin. 3. More Setting ( Rotor-Gene 6000 için Outlier Removal ) menü penceresinde Fam (Yeşil) kanalı için 0% ve Joe (Sarı) ve Rox kanalı için 10% NTC Threshold a ayarlayın. 4. Threshold: 0,1 seçin.
5. Sonuç (Quantitation Analisis) tablosunda Ct (Threshold cycle) in değeri görünür. 6. Eğer Joe (Yellow) kanalında Ct değeri sıfırdan farklı ise, SIV için pozitiftir. 7. Eğer Joe (Yellow) kanalında değeri belirlenmezse (flüoresans eğrisi eşik çizgisi ile çakışmazsa) ve sonuç tablosunda Fam (Green) kanalında Ct değeri 37 den daha düşükse, SIV için örnek negatiftir. Tablo 2. Kontroller için sonuçlar Kontrol Kontrol adımı Ct kanal Fam (Green) Ct kanal Joe (Yellow) Yorumlama NCS RNA izolasyonu Poz (< 37) Neg Geçerli sonuç DNA-buffer Amplifikasyon Neg Neg Geçerli sonuç cdna SIV C+ Amplifikasyon Neg Poz (< 37) Geçerli sonuç IC DNA Amplifikasyon Poz (< 37) Neg Geçerli sonuç iq icycler ve iq5 (Bio-Rad) ile Real Time Amplifikasyonu 1. Workshop ün Edit Plate Setup modül penceresinde Fam ve Hex(Joe) kanallarında bütün tüplerdeki flüoresans sinyal tespitini ve tüp pozisyonlarını programlayın. Run with selected protocol (Seçilmiş protokol ile çalışma) düğmesini etkinleştirerek bu şemayı kullanın ve kaydedin. Not: Cihazı deneye başlamadan önce en az 30 dakika önce açın. iq5 cihazı için Whole Plate loading (Tüm plakaları yükleme) sisteminde şemayı düzenleyin. Sample Volume 25: μl, Seal Type: Domed Cap, Vessel Type: Tubes seçin. Save &Exit Plate Editing (Kayıt ve çıkış plaka düzenleme) düğmesini tıklayın. 2. iqicycler ya da iq5 da program SIV A/H1 başlatın, View Protocols (protokol görüntüleme) modülünde programı seçin veya oluşturun ve Run with selected plate setup (Seçilen plaka ayarı ile çalıştırma) düğmesini etkinleştirerek başlatın. Döngü Sıcaklık, C Zaman Flüoresans tespit Tekrar Döngü 1 95 15 min 1 95 10 s Döngü 2 54 25 s 10 72 25 s 95 10 s Döngü 3 54 25 s Real-time 35 72 25 s 2ci adımda flüoresans tespit (54 C) 3. Önceden oluşturulmuş modele göre termalcycler içine tüpleri transfer edin. 4. Select well factor source çizgisi altında Experimental Plate seçin ve reaksiyon hacmini 25 µl olarak tercih edin (iq icycler için). 5. Run düğmesine basın. ANALİZ VERİLERİ Sonuçlar, eşik çizgisi ile flüoresan eğrisinin kesiştiği noktada iq icycler ya da iq5 software ile yorumlanır. Swine Influenza Virüsün cdna, Joe-530 (HEX) kanalında ve IC, FAM (Yeşil) kanalında tespit edilir. Fam ve Hex kanalları için Log View düğmesi etkinleşir. Flüoresans eğrisinin doğrusal olduğu düzeylerde eşik çizgisine (farenin sol tuşu ile) yerleştirin. Eğer HEX kanalında Ct değeri sıfırdan farklı ise, SIV için pozitiftir. Eğer HEX kanalında değeri belirlenmezse (flüoresans eğrisi eşik çizgisi ile çakışmazsa) ve sonuç tablosunda Fam (Green) kanalında Ct değeri 37 den daha düşükse, SIV için örnek negatiftir. Tablo 2. Kontroller için sonuçlar Kontrol Kontrol adımı Ct kanal Fam (Green) Ct kanal Joe (Yellow) Yorumlama NCS RNA izolasyonu Poz (< 37) Neg Geçerli sonuç DNA-buffer Amplifikasyon Neg Neg Geçerli sonuç cdna SIV C+ Amplifikasyon Neg Poz (< 37) Geçerli sonuç IC DNA Amplifikasyon Poz (< 37) Neg Geçerli sonuç
SmartCycleri aşağıdaki gibi programlayın: 1. Ana menüde Define Protocols (Protokoller tanımla) seçin ve sol alt köşedeki New Protocol (Yeni protokol) seçeneğini seçin. Protokol için bir isim belirleyin ve aşağıdaki parametreleri ayarlayın: 2. Aşama Sıcaklık Saniye Optikler Tekrar Aşama 1. Bekleme 95 C 900 Kapalı 1 Bekleme 2 95 C 15 Kapalı 54 C 25 Açık (FAM, Cy3) 42 3-Sıcaklık Döngüsü 72 C 25 Kapalı 3. Save Protocol (Protokol kaydet) seçin. 4. Ana menüden Create Run (Çalışma Oluştur) seçeneğini seçin ve sonra Dye Set (Boya Ayarı) düğmesini tıklayın ve FCTC25 seçin. 5. Add/Remove Sites (Ekle/Çıkar Site) seçin ve analiz için yeni bir pencerede Protokol ve Sites seçin. OK tıklayın. 6. Start Run (Çalışmayı başlat) seçin ve deney için bir isim girin. 7. Sample Type UNKN kolonuna örnekleri girin. 8. Flüoresans, SIV için Cy3 kanalında ve Internal Kontrol için FAM kanalında Real Time da görünür. SONUÇ ANALİZİ 1. Analysis settings (Analiz ayarları) basın ve Manual Thresh Fluor Units kolonunda flüoresansın eğrisinin lineer olduğu düzeyde threshold (eşik) çizgisinin değerini ayarlayın. Update Analysis (Analiz güncelleme) tıklayın. 2. Results Table (Sonuç Tablosu) tablosunda Fam (IC) ve Cy3 (SIV) kanalları için Ct değeri görünür. Fam kanalı için Ct değeri 37 olmalıdır. Eğer IC'in Ct değeri 37 dan daha yüksekse, örneğin tekrar test edilmesi gereklidir. Cy3 kanalında Ct < 37 değerli örnek SIV için pozitif olarak yorumlanır. MX3000P ve MX3005P (Stratagene) programı aşağıdaki gibidir: 1. Programı açın, Quantitative PCR (Multiple Standarts) seçin ve OK tıklayın. 2. Pencerenin üst kısmındaki Plate Setup seçin. 3. Well type penceresinde örnekler için Unknown ve kalibratörler tanımlamak için Standard ayarlayın. 4. Pencerede Collect fluorescence data Fam ve Joe kanalında tüm örnekler için seçin. 5. Pencerenin sağ üst kısmındaki Thermal Profile Setup düğmesini seçin. 6. Amplifikasyonun aşağıdaki parametrelerini ayarlayın:
1 95 C 15:00 1 2 95 C 0:10 54 C 0:25 72 C 0:25 3 95 C 0:10 54 C 0:25* 72 C 0:25 10 35 7. Flüoresans 54 C de ölçülür. Bunu yapmak için, Endpoints işaretli Termal Profile grafik ayarlanır. 8. Run düğmesini tıklayın, deney için bir isim girin ve kaydedin. ANALİZ SONUÇLARI 1. Ampifikasyon bittikten sonra, pencerenin sol üst kısmındaki Analysis düğmesini seçin. 2. Results düğmesini seçin. 3. Area to analyze penceresinin sağ açı kısmında Amplification plots seçin. 4. Threshold fluorescence otomatik olarak ayarlayın. 5. Text report penceresinde Ct değeri, DNA IC ve kopya SIV'in deneysel değeri her bir örnek için görünür. 6. Eğer Joe (Yellow) kanalında Ct değeri sıfırdan farklı ise, SIV için pozitiftir. 7. Eğer Joe (Yellow) kanalında değeri belirlenmezse (flüoresans eğrisi eşik çizgisi ile çakışmazsa) ve sonuç tablosunda Fam (Green) kanalında Ct değeri 37 den daha düşükse, SIV için örnek negatiftir. 7300/7500 Real Time PCR System Programı aşağıdaki gibidir: 1. Ana menü seçeneğinde New (Yeni) seçeneğini seçin ve yeni belgenin verilerini ayarlayın: Assay (Test) penceresinde Absolute Quantitation (Mutlak kantitasyonu) seçeneğini, Template (Kalıp) penceresinde Blank Document (Boş Belge) seçeneğini seçin. OK tuşuna basın. 2. Tools (Araçlar) menüsündeki yeni pencerede Detector Manager (Dedektör Yöneticisi) düğmesini tıklayın. 3. Pencerenin sol alt köşesindeki File (Dosya) tıklayın ve New (yeni) seçin. New detector (Yeni dedektör) penceresinde probların özelliklerini ayarlayın: SIV tespiti: Name (isim) ve Description (açıklama) çizgileri SIV gösterir; Reporter Dye Rox ve Quencher Dye None çizgisinde. Color (renk) (örneğin kırmızı) seçin. Create Another (Başka oluşturma) düğmesini tıklayın. New detector (Yeni dedektör) penceresine karşı açıldı. İnternal Kontrol için aşağıdaki parametreleri ayarlayın: Name (isim) ve Description (açıklama) çizgileri IC gösterir; Reporter Dye Fam ve Quencher Dye None çizgisinde. Color (renk) (örneğin mavi) seçin. OK tuşuna basın. 4. Prob bilgileri ile Detector manager (Dedektör yöneticisi) penceresini kapatın. 5. Instrument (Cihaz) penceresini seçin. 6. Thermal profile (Termal profil) aktif edin ve aşağıdaki amplifikasyon programını ayarlayın: 1 95 C 15:00 1 2 95 C 0:15 54 C 0:25* 72 C 0:25 *Fam ve Joe kanalında flüoresans belirlenir. 42 7. Reaksiyon hacmini 25 μl olarak seçin. 8. Passive Reference (Pasif Referans) çizgisinde pencerenin sağ alt köşesinde none (hiçbiri) ayarlayın. 9. Sample Name (Örnek ismi) alanına örneklerin isimlerini ekleyin.
ANALİZ SONUÇLARI 1. Sonuçlar, eşik çizgisi ile flüoresan eğrisinin kesiştiği noktada Applied Biosystems 7300/7500 Real Time PCR Systems software ile yorumlanır. Swine Influenza Virüsün cdna, JOE (Sarı) kanalında ve IC, FAM (Yeşil) kanalında tespit edilir. 2. Eğer Joe (Yellow) kanalında Ct değeri sıfırdan farklı ise, SIV için pozitiftir. 3. Eğer Joe (Yellow) kanalında değeri belirlenmezse (flüoresans eğrisi eşik çizgisi ile çakışmazsa) ve sonuç tablosunda Fam (Green) kanalında Ct değeri 37 den daha düşükse, SIV için örnek negatiftir. PERFORMANS ÖZELLİKLERİ Kit Swine Influenza Virus H1 Real-TM, 500 kopya/ ml den az olmayan bir % 100 duyarlılıkla testlerin SIV A/H1 tespitini sağlar. SORUN GİDERME 1. Ekstraksiyonun Negatif Kontrolu için IC (Fam (Green) kanal) sinyal vermez ya da zayıf verir: Örneğin tekrar test edilmesi gereklidir. PCR inhibe olur. Size önerilen RNA ekstraksiyon yöntemini kullandığınızdan ve üreticinin talimatlarını izlediğinizden emin olun. Ekstre edilmiş RNA pipetlenmeden önce maksimum hızda (12000-16000 g) 2 dakika boyunca bütün tüpleri tekrar santrifüj edin ve dikkatlice süpernatantı alın. Reaksiyonda inhibe olan sorbent pellete dokunmayın. Reaktif saklama koşulları talimatlara uygun değildir. Saklama koşullarını kontrol edin. PCR koşulları talimatlara uygun değildir. PCR şartlarını ve protokolde rapor edilmiş flüoresans kanalını IC tespit için seçin. Reaktifleri pipetleme işlemi sırasında örneğe IC eklenmedi. RNA ekstraksiyon prosedürü sırasında dikkat edin. 2. Joe (Yellow)/Cy3/HEX kanalında zayıf sinyal (Ct > 37) verir: Örneğin tekrar test edilmesi gereklidir. 3. Negatif Kontrol ekstraksiyonu ile Joe (Yellow)/Cy3/HEX sinyal verir. RNA ekstraksiyon prosedürü sırasında kontaminasyon olabilir. Tüm örneklerin sonuçları geçersizdir. Sodyum hipoklorit ve etanol ile cihazın tüm yüzeyleri dekontamine edin. Ekstraksiyon prosedürü sırasında sadece filtre uçları kullanın. Tüpler arası geçişte uçları değiştirin. Reaktiflerin yeni bir seti ile RNA ekstraksiyonunu tekrar edin. 4. PCR Negatif Kontrolu ile herhangi bir sinyal verir. PCR hazırlık işlemi sırasında kontaminasyon olabilir. Tüm örneklerin sonuçları geçersizdir. Sodyum hipoklorit ve etanol veya özel DNA dekontaminasyon reaktifleri ile cihazın tüm yüzeyleri dekontamine edin. Sonunda Pozitif kontrolü pipetleyin. Reaktiflerin yeni bir seti ile PCR hazırlanmasını tekrar edin.
*icycler and iq5 are trademarks of Bio-Rad Laboratories * Rotor-Gene Technology is a registered trademark of Corbett Research *MX3000P and MX3005P are trademarks of Stratagene *Applied Biosystems is trademarks of Applera Corporation * SmartCycler is a registered trademark of Cepheid Sacace Biotechnologies Srl 18 San Carlo str., 81100 Caserta, Italy *PCR: The Polymerase Chain Reaction (PCR) process is covered by patents owned by Hoffmann-La Roche and applicable in certain countries. Sacace does not encourage or support the unauthorized or unlicensed use of the PCR process. Use of this kit is recommended for persons that either have a license to perform PCR or are not required to obtain a license