REF V-34-50R VER 04.03.08 Avian Flu Screening&Typing H5, H7 Kullanılan Semboller REF Liste Numarası 2-8 C/ -20 C de saklayın RUO Sadece Araştırma Kullanımı için Dikkat! LOT Lot Numarası VER Versiyon Son Kullanma Tarihi Negatif Kontrol Reaktif İçerir Kullanım Bilgileri Pozitif Kontrol Üretici İSİM Avian Flu Screening &Typing H5, H7 GİRİŞ Avian influenza (Kuş gribi) influenza virüsünün tip A suşlarının neden olduğu kuşlardan kaynaklanan bulaşıcı bir hastalıktır. İlk olarak İtalya da 100 yıl önce tespit edilen hastalık bu dönemlerde dünya çapına yayılmaya başladı. Bazı türleri diğerlerinden farklı olarak enfeksiyona daha dirençli olmasına rağmen, bütün kuşların kuş gribi enfeksiyona duyarlı olduğu düşünülmektedir. Kuşlarda belirtiler geniş bir spektrumda enfeksiyona neden olur, son derece bulaşıcıdır ve ciddi salgınlarda hastalık hızlı ölümlerle sonuçlanır. Bu grip "yüksek derecede patojenik kuş gribi "olarak bilinir. Kuş gribinin bu formu hızlı ölüm ve ciddi hastalıklarla yaklaşık % 100 ölüm oranına sahiptir. Influenza virüsünün on beş alt tipinin enfekte kuşlar olduğu bilinmektedir, böylece kuş popülasyonunda influenza virüsünün sirkülasyonu potansiyel olarak geniş bir rezervuar sağlar. Bugüne kadar, yüksek derecede patojenik form salgınları influenza A H5 ve H7 alt tiplerinden kaynaklanmaktadır. KULLANIM AMACI Avian Flu Screening &Typing H5, H7 H5 veh7 tipleri için pozitif örneklerin genotiplemesi ve klinik örneklerde Avian influenza A virus RNA taraması için bir in vitro nukleik asit amplifikasyon testidir. TEST PRENSİBİ Avian Flu Screening &Typing H5, H7 Test dört temel aşamaya dayanır: örneklerden Avian influenza A virus RNA izolasyonu, RNA nın reverse transkripsiyonu, Н5 & Н7 alt tiplerin sonraki tanımlanması ile Avian influenza A virüsünün cdna amplifikasyonu ve amplifiye ürünlerin agaroz jelde belirlenmesi. KİT İÇERİĞİ Part N 1 Reverta-L : RNA nın reverse transkripsiyonu Part N 2 AvianA H5/H7 :amplifikasyon kiti;
Part N 3 Controls : Kontrol kit Part N 1 Reverta-R : DTT, 5 tubes; RT-mix, 5 x 0,125 ml; Reverse transcriptase (M-MLV), 0,03 ml; TE-buffer, 1,0 ml. 60 test için gerekli reaktif içerir. Part N 2 Avian A H5/H7 : PCR-mix-1 Avian A, 55 kullanıma hazır tek-doz test tüpleri PCR-mix-1 H5, 55 kullanıma hazır tek-doz test tüpleri PCR-mix-1 H7, 55 kullanıma hazır tek-doz test tüpleri PCR-mix-2, 2 x 1,2 ml; Mineral Oil, 8,0 ml; 55 test için gerekli reaktif içerir. Part N 3 Kontroller : Pozitif Kontrol cdna C+ Avian A, 0,1 ml; Pozitif Kontrol cdna H5 C+, 0,1 ml; Pozitif Kontrol cdna H7 C+, 0,1 ml; Negatif Kontrol C-, 1,2 ml; DNA buffer, 0,5 ml; *ekstraksiyonun Negatif Kontrolü olarak izolasyon prosedüründe kullanılabilir. KİT İÇERİĞİNDE BULUNMAYAN GEREKLİ MATERYALLER Thermalcycler Workstation Aerosol bariyerli pipetörler (0,5-10 μl; 5-40 μl) Tüp rackları Sağlanmayan Reaktifler RNA ekstraksiyon kiti (önerilen nükleik asit ekstraksiyon kiti: Ribo-Sorb (Sacace, REF K-2-1) Ribo Virus spin kolon ekstraksiyon kit (Sacace, REF K-2/C) Belirleme agaroz kiti UYARILAR VE ÖNLEMLER 1. Bu kitin bazı komponentleri koruyucu olarak Sodyum Azid içerir. Reaktif transferi için metal boru kullanmayın. 2. Örnekler ve reaktifler ile çalışırken tek kullanımlık eldivenler, laboratuar giysisi ve göz koruyucu kullanın. Çalışmalardan sonra ellerinizi yıkayın. 3. Ağızla pipetleme yapmayın. 4. Laboratuar çalışma alanında yemek yemeyin, bir şey içmeyin, kozmetik uygulamayın ya da kontak lenslerini ellemeyin. 5. Son kullanma tarihi geçmiş kitleri kullanmayın. 6. Tüm örnekleri ve kullanılmayan reaktifleri yasal düzenlemelere göre yok edin. 7. Örnekler potansiyel enfeksiyon ajanı olarak kabul edilmeli ve Sınıf II biyolojik kabinlerde Biyogüvenlik Seviye 3 ya da diğer uygun biyogüvenlik pratiklerine göre çalışılmalıdır. 8. Dökülen tüm örnekler ya da reaktifleri 0,5% sodyum hipoklorit ya da uygun diğer dezenfektanlar ile temizleyin. 9. Örnekler ve reaktiflerin deri, gözler ve mukoz membranlar ile temasından kaçının. Eğer bu solüsyonlar ile temas ederse bol su ile yıkayın ve doktorunuza başvurun. 10. Material Safety Data Sheets (MSDS) istenildiğinde verilebilir. 11. Bu kit Ribo-Sorb ekstraksiyon kiti ile kullanılmak için dizayn edilmiştir. Eğer Ribo-Sorb dan başka bir kit ile RNA ekstraksiyonu yapılıyorsa bu kullanıcı sorumluluğundadır.
12. Bu kiti ancak DNA amplifikasyon tekniği bilgisi olan kişiler kullanmalıdır. 13. Laboratuardaki iş akışı Ekstraksiyon alaından başlayıp Amplifikasyon ve Belirleme alanlarına doğru tek bir kişinin yönetiminde olmalıdır. Örnekleri, ekipmanları ve reaktifleri bir önceki çalışma alanına geri götürmeyin. SAKLAMA KOŞULLARI Avian Flu Screening &Typing (H5, H7) Test 2-8 C de saklanmalıdır. Part N 2 Reverta-R -20 C de saklanmalıdır. KARARLILIK Avian Flu Screening &Typing (H5, H7) kit etiketi üzerinde belirtilen son kullanma tarihine kadar stabil kalır. ÖRNEK SAKLAMA, TOPLAMA VE TRANSPORT Avian Flu Screening &Typing (H5, H7) aşağıdaki materyallerden Ribo-Sorb (REF K-2-1) ekstre edilmiş RNA lar ile analiz edilebilir: Mukozal swablar (burun, oral): swab alanında ve 0,5 ml PBS steril veya saline sulu Eppendorf tüpüne koyun. İyice vorteksleyin. Swabı tekrar alın ve aynı tüpte sallayın. 1000 g/min de 5 dakika santrifüj edin. Supernatantı alın ve atın. Pelleti 100 μl saline suda yeniden suspense edin. 12 saatten daha uzun olmamak kaydıyla örnekleri 2 8 C de ya da 20/80 C de dondurarak saklayın. Klinik örneklerin transportu, etiyolojik faktörlerin transportu için ülkesel, federal, lokal ve yasal düzenlemelere göre yapılmalıdır. RT VE AMPLİFİKASYON Reverse Transkripsiyon: 1) Reaktif Miks hazırlayın: 12 reaksiyon için, DTT liyofilize içeren tüp içine 125 μl RT-mix ekleyin ve en az 5-10 saniye vorteksleyin. 2) Reaksiyon Miks olan tüplere 6 μl M-MLV ekleyin, 3 saniye vorteksleyin, 5-7 saniye santrifüj edin ve her tüpe 10 μl dağıtın. 3) Uygun tüplere 10 μl RNA örneği ekleyin (DİKKAT:Sorbent tüpte bulunmamalıdır). Pipet kullanarak dikkatlice karıştırın. 4) Tüpleri termocycler içine yerleştirin ve 37 o С de 30 dakika inkübe edin. 5) Herbir cdna örneğini TE-Buffer ile 1: 2 seyreltin (her bir tüpe 20 μl TE-buffer ekleyin). cdna örnekleri -20 o С de 1 hafta ya da -70 o С de bir yıl saklanabilir. Amplifikasyon: 1) İki ek tüp içeren-bir tüp Amplifikasyonun Negatif Kontrolü ve bir tüp Amplifikasyonun Pozitif Kontrolü- gereken miktarda PCR-mix-1 Avian A tüpleri hazırlayın. 2) Her bir tüpe 10 μl PCR-mix-2 ekleyin ve Mineral yağ (yaklaşık 25 μl) damlatın. 3) Reverse transkripsiyon adımından sonra elde edilen 10 μl cdna örneği uygun tüplere ekleyin. 4) Amplifikasyonun Negatif Kontrolü için tüplere 10 μl DNA-buffer ekleyin. 5) Amplifikasyonun Pozitif Kontrolü için tüplere 10 μl Positive Control cdna Avian A ekleyin. 6) PCR-mix-1 tüplerini kapatın ve ısısı 95 C ye yükselen termalcyclera koyun ve aşağıdaki programı başlatın: Research) ve diğerleri Termocyclerlar GeneAm p PCR System 2700 Gradient Palm Cycler (Corbett Research), Blok ısı düzenlemeleri ile Termocyclerlar: icycler (BioRad) Adım t C Zaman Döngü t C Zaman Döngü t C Zaman Döngü 1 95 о С 5 dk 1 95 о С 5 dk 1 95 о С 5 dk 1 2 95 о С 10 sn 42 95 о С 15 sn 42 95 о С 1 dk 42
63 о С 10 sn 63 о С 25 sn 63 о С 1 dk 72 о С 10 sn 72 о С 25 sn 72 о С 1 dk SONUÇ ANALİZİ PCR sonuçlarının analizi, agaroz jelde (2%) amplifiye cdnanın spesifik bantlarının görülmesi ya da görülmemesine dayanır. Spesifik amplifiye cdna fragmanlarının uzunluğu: Avian influenza A virus 270 bp SONUÇ YORUMLAMA Tablo 2. Kontroller için sonuçlar Kontrol Testin kontrol edilen jel 365 bp de spesifik Yorumlama aşaması bantlar NCS RNA izolasyonu Yok Geçerli sonuç DNA-buffer Amplifikasyon Yok Geçerli sonuç cdna Pos Amplifikasyon Var Geçerli sonuç Çalışma için Negatif Kontrollerin (NCS ve DNA-buffer) değerlerinin geçerli olduğundan emin olun. Eğer test geçersiz ise (kontaminasyon 365 bp bant belirlenmesi), tüm test protokolü (örnek hazırlama, amplifikasyon ve belirleme) tekrar edilmelidir. Şüpheli olan tüm reaktifleri atın. Eğer agaroz jelde 365 bp bandı görülürse, örnek Avian influenza A virus RNA için pozitiftir. AVIAN INFLUENZA A VIRUS RNA ÖRNEK İÇİN POZİTİF GENOTİPLEME Amplifikasyon (Genotip kit): 1) Üç ek tüp içeren-bir tüp Amplifikasyonun Negatif Kontrolü ve iki tüp Amplifikasyonun Pozitif Kontrolü- gereken miktarlarda PCR-mix-1 H5 ve PCR-mix-1 H7 tüpleri hazırlayın. 2) Her bir tüpe 10 μl PCR-mix-2 ekleyin ve Mineral yağ (yaklaşık 25 μl) damlatın. 3) Reverse transkripsiyon adımından sonra elde edilen 10 μl cdna örneği uygun tüplere ekleyin. 4) Amplifikasyonun Negatif Kontrolü için tüplere 10 μl DNA-buffer ekleyin. 5) C H5pos işaretli tüplere 10 μl Positive Control cdna Avian A H5 ve C H7pos işaretli tüplere 10 μl Positive Control cdna H7 ekleyin. 6) PCR-mix-1 tüplerini kapatın ve ısısı 95 C ye yükselen termalcyclera koyun ve Avian H5 genotype Virus için aşağıdaki programı başlatın: Research) ve diğerleri Termocyclerlar GeneAm p PCR System 2700 Gradient Palm Cycler (Corbett Research), Blok ısı düzenlemeleri ile Termocyclerlar: icycler (BioRad) Adım t C Zaman Döngü t C Zaman Döngü t C Zaman Döngü 1 95 о С 5 dk 1 95 о С 5 dk 1 95 о С 5 dk 1 95 о С 10 sn 95 о С 15 sn 95 о С 1 dk 2 58 о С 10 sn 42 58 о С 25 sn 42 58 о С 1 dk 72 о С 10 sn 72 о С 25 sn 72 о С 1 dk 7) Avian H7 genotype Virus için Termocycler aşağıdaki PCR programını başlatın: 42
Research) and oth Termocyclerlar GeneAmp PCR System 2700 (Applied Biosystems), Gradient Palm Cycler (Corbett Research), icycler (BioRad) t C Zaman Döngü Blok ısı düzenlemeleri ile Termocyclerlar: t C Zama Adım t C Zaman Döngü n 1 95 о С 5 dk 1 95 о С 5 dk 1 95 о С 5dk 1 95 о С 10 sn 95 о С 15 sn 95 о С 1 dk 2 61 о С 10 sn 42 61 о С 25 sn 42 61 о С 1 dk 72 о С 10 sn 72 о С 25 sn 72 о С 1 dk Döngü SONUÇ ANALİZİ PCR sonuçlarının analizi, agaroz jelde (2%) amplifiye cdnanın spesifik bantlarının görülmesi ya da görülmemesine dayanır. Spesifik amplifiye cdna fragmanlarının uzunluğu: Avian influenza H5 virus 235 bp Avian influenza H7 virus 360 bp 42 Sacace Biotechnologies Srl 18 San Carlo str., 81100 Caserta, Italy