Monolisa TM HCV Ag-Ab ULTRA 1 plaka - 96 test 72556 5 plaka - 480 test 72558 HCV ENFEKİSYONUNU İNSAN SERUMU VEYA PLAZMASINDA İMMÜNO ENZİMATİK TEKNİKLE ALGILAMA KİTİ İmalatçı kalite kontrolü Bio-Rad şirketi tarafından imal edilen ve pazarlanan tüm ürünler, hammaddelerin teslim alınmasından nihai ürünlerin pazarlanmasına kadar bir kalite güvence sistemi kontrolündedir. Her nihai ürün partisi kalite kontrole tabi tutulur ve ancak kabul kriterlerine uyduğu takdirde pazarlanır. Her partinin üretim ve kontrol dokümantasyonu şirketimiz tarafından muhafaza edilir.
İÇİNDEKİLER 1 - DOZAJIN AMACI 2 - TEST PRENSİBİ 3 - KİTİN İÇİNDEKİLER 4 - GEREKLİ OLAN ANCAK ÜRÜNLE BİRLİKTE VERİLMEYEN MALZEMELER 5 - HİJYEN VE GÜVENLİK TALİMATLARI 6 - ÖNLEMLER 7 - NUMUNELER 8 - REAKTİFLERİN YENİDEN OLUŞTURULMASI- SON KULLANIM TARİHİ - SAKLAMA 9 - ÇALIŞMA ŞARTLARI 10 - SİSTEM ADAPTASYONU 11 - HESAPLAMALAR VE SONUÇLARIN DEĞERLENDİRİLMESİ 12 - NUMUNE VE KONJUGAT İLAVELERİNİN SPEKTROFOTOMETRİK YÖNTEMLE KONTROL EDİLMESİ 13 - TESTİN PERFORMANSI 14 - TEST LİMİTLERİ 15 - KAYNAKÇA 2
1 - DOZAJIN AMACI Monolisa TM HCV Ag-Ab ULTRA insan serumu veya plazmasında hepatit C virüs enfeksonu ile ilintili antikorların ve kapsid antijeninin algılanmasına dayanan, HCV enfeksiyonunun ortaya çıkarılmasına yönelik immünoenzimatik bir testtir. 2 - TEST PRENSİBİ Mikroplaka aşağıdaki malzemeler ile duyarlılaştırılmıştır: Hepatit C kapsidine yönelik monoklonal bir antikor. NS3 bölgesine tekabül eden 2 rekombinant protein: Genotip 1 ve 3a. NS4 bölgesine tekabül eden bir rekombinant protein. Hepatit C kapsid bölgesine tekabül eden mutasyona uğramış bir peptid. Kullanılan konjugatlar şunlardır: Konjugat 1 (R6): Hepatit C kapsidine yönelik monoklonal biyotinli bir murin antikoru. Bu monoklonal antikor solid fazda kullanılan mutasyonlu kapsid peptidine karşı reaksiyon göstermez. Konjugat 2 (R7): Konjugat 2, peroksidaz ile işaretlenmiş insan anti-igg murin antikorları ile peroksidaz ile işaretlenmiş streptavidinden oluşan bir karışımdır Testin uygulanması aşağıdaki reaksiyonel aşamaları içerir: 1) Konjugat 1, ardından incelemeye tabi tutulacak numuneler ve kontrol serumları mikroplaka haznelerine dağıtılır. Anti-HCV antikorları var ise, solid faza sabitlenen antijenlere bağlanır. Hepatit C kapsid antijenleri mevcut ise, bu antijenler solid faz monoklonal antikorları ve konjugat 1 biyotinli monoklonal antikorları tarafından bağlanır. 2) 37 C sıcaklıkta 90 dakikalık bir inkübasyon ve bir yıkama aşamasından sonra, peroksidaz ile işaretlenmiş insan anti-igg antikorları ve peroksidaz ile işaretlenmiş streptavidin içeren konjugat 2 mikroplakanın her haznesine ilave edilir. Solid faz ile reaksiyona giren insan IgG'leri bulunması durumunda, insan anti-igg konjugatı insan antikorlarına bağlanır. Numunede hepatit C virüsü kapsid antijeni bulunması durumunda, peroksidaz /streptavidin konjugatı konjugat 1'deki biyotine sabitlenir. 3) 37 C sıcaklıkta 30 dakikalık bir inkübasyon ve bağlı olmayan enzimatik konjugatların yıkama yoluyla atılmasından sonra, antijen-antikor-peroksidaz kompleksleri substrat ilave edilerek ortaya çıkarılır. 4) Laboratuar sıcaklığında gerçekleşen 30 dakikalık inkübasyon ve reaksiyonun durmasından sonra, okuma spektrofotometre ile 450/620-700 nm'de yapılır. Bir numune için ölçülen absorbans teste tabi tutulan numunede anti-hcv antikoru ve/veya hepatit C kapsid antijeni bulunup bulunmadığının belirlenmesini sağlar. Renk yoğunluğu solid faza bağlanmış anti-hcv antikoru ve/veya hepatit C kapsid antijeni miktarı ile oranıtlıdır. 3
3 - KİTİN İÇİNDEKİLER ETİKETLEME R1 R2 R3 R4 R5a R5b R6 R7 R8 R9 R10 REAKTİFLERİN NİTELİĞİ MİKROPLAKA Bir HCV anti-kapsid monoklonal antikoru ve saflaştırılmış rekombinant antijenler (NS3, NS4) ve HCV kapsid bölgesinin mutasyonlu bir peptidi ile duyarlılaştırılmış 12 şerit KONSANTRE YIKAMA SOLÜSYONU (20X) NaCl ph 7,4 Tris Tamponu Koruyucu: Proclin TM 300 (%0,04) NEGATİF KONTROL SAB içeren HCl Tris Tamponu; Koruyucu: Proclin TM 300 (%0,1) POZİTİF KONTROL Anti-HCV antikorları içeren, HBs antijeni ve anti-hiv1 ve anti- HIV2 antikorları açısından negatif, fotokimyasal olarak etkisiz hale getirilmiş S.A.B. içeren bir HCL Tris tamponunda sulandırılmış insan serumu Koruyucu: Proclin TM 300 (%0,1) POZİTİF ANTİJEN KONTROLÜ Liyofilize bir kapsid peptidi içeren sentetik kontrol pozitif antijeni ANTİJEN KONTROL SULANDIRICISI R5a sulandırıcısı. Bir koruyucu içeren su: Proclin TM 300 (% 0,5) KONJUGAT 1 HCV kapsidine yönelik, biyotin ile işaretlenmiş murin monoklonal antikoru. Menekşe rengine boyanmıştır. Koruyucu: Sodyum azid (<%0,1), Cosmocil %0,025 KONJUGAT 2 Peroksidaz ile işaretlenmiş insan anti-igg murin antikorları ve peroksidaz ile işaretlemiş streptavidin Yeşile boyanmıştır. Koruyucu: Proclin TM 300 (%0,5) PEROKSİDAZ SUBSTRAT TAMPONU % 0,015 H2O2 ve % 4 dimetilsülfoksit (DMSO) içeren sitrik asit ve sodyum asetat ph 4,0 solüsyonu KROMOJEN Tetrametil benzidin (TMB) içeren solüsyon DURDURMA SOLÜSYONU 1 N sülfürik asit solüsyonu Sunum 1 plaka 5 plaka 1 5 70 ml 1 ml 1,5 ml yeterli miktar 1 ml 1 ml 15 ml 15 ml 60 ml 5 ml 28 ml 235 ml 1 ml 3 ml yeterli miktar 1 ml 1 ml 2 şişe 2 x 30 ml 2 şişe 2 x 30 ml 2 şişe 2 x 60 ml 2 şişe 2 x 5 ml 3 şişe 3 x 28 ml 4
4 - GEREKLİ OLAN ANCAK ÜRÜNLE BİRLİKTE VERİLMEYEN MALZEMELER Damıtık veya tamamen demineralize su. Çamaşır suyu ve sodyum bikarbonat. Emici kâğıt. Tek kullanımlık eldivenler. Koruyucu gözlükler. Tek kullanımlık tüpler. 50 µl, 80 µl, 100 µl, 200 µl ve 1 ml'lik hacimler dağıtabilen ayarlanabilir veya sabit, otomatik veya yarı otomatik pipetler 10 ml, 200 ml ve 1.000 ml dereceli deney tüpleri. Vorteks tipi çalkalayıcı. Mikroplakalar için otomatik*, yarı otomatik* veya manüel yıkama sistemi 37 C ± 1 C* termostatlı ben mari veya kuru inkübatör* Kontamine atık konteyneri (490, 620, 450/620-700 nm filtrelerle donatılmış) mikroplaka okuma cihazı*. (*) Teknik servislerimiz tarafından onaylanan cihazlar konusunda tam bilgi edinmek için bize danışınız. 5 - HİJYEN VE GÜVENLİK TALİMATLARI Kitteki tüm reaktifler "in vitro" teþhis amacıyla kullanılmaya yöneliktir ve profosyonel kullanım içindir. Bu test kiti sadece, laboratuvar prosedürlerini ve potansiyel tehlikelerini bilen, eğitimli ve kalifiye personel tarafından kullanılmalıdır. Uygun koruyucu giysiler; laboratuvar önlüğü, göz ve yüz koruma için gözlük, tek kullanımlık eldiven ( sentetik, lateks olmayan eldivenler önerilir) kullanılmalıdır ve reaktifler ve hasta numunelerini kullanmak iyi bir laboratuvar pratiği gerektirir. Testi çalıştıktan sonra eller iyice yıkanmalı. Ağzınızla pipetlemeyin. Pozitif kontrol R4 fotokimyasal yöntemlerle etkisiz hale getirilmiştir. Pozitif kontrolün hazırlanmasında kullanılan insan kaynaklı malzeme (R4) teste tabi tutulmuş ve hepatit B virüsü yüzey antijeni (Ag HBs) ve insan immünyetmezlik virüsüne yönelik antikorlar (anti- HIV-1 ve anti-hiv-2) açısından reaktif bulunmamıştır. Bilinen hiçbir test yöntemi bulaşıcı ajan bulunmadığını kesin bir şekilde garanti edemediği için, reaktifleri ve hastalardan alınan tüm numuneleri bulaştırma potansiyeli olan maddeler addederek alışıldık önlemler ile kullanın. Numuneler ve insan kaynaklı reaktifler ile doğrudan temas eden malzemeyi ve ayrıca yıkama solüsyonlarını kontamine ürünler addedin. Numunelerin veya bunları içeren solüsyonların sıçramasına engel olun. Kirlenen yüzeyler % 10 sulandırılmış çamaşır suyu ile temizlenecektir. Bulaşan sıvı bir asit ise, kirlenen yüzeyler önceden sodyum bikarbonat ile nötrleştirilecek, ardından çamaşır suyu ile temizlenecek ve emici kâğıt ile kurutulacaktır. Temizleme işleminde kullanılan malzeme kontamine atıklar için öngörülmüş özel bir konteynere atılmalıdır. İnsan kaynaklı numunler ve reaktifler ve kontamine malzeme ve ürünler, bulaşıcı özellikleri giderildikten sonra atılacaktır Bu işlem ya % 5 sodyum hipoklorit son konsantrasyonlu çamaşır suyuna 30 dakika boyunca batırılarak, Ya da minimum 2 saat boyunca 121 C'de otoklavlama vasıtasıyla gerçekleştirilir. DİKKAT: Sodyum hipoklorit içeren solüsyonları otoklavın içine sokmayın. Substrat tamponunun, kromojenin ve durdurma solüsyonunun cilt ve mukozalar ile hiçbir şekilde temas etmesine izin vermeyin. Güvenlik veri fişleri talep üzerine verilmektedir. Solüsyonları veya yıkama atık sıvılarını veya biyolojik numuneler içeren herhangi bir sıvıyı lavaboya atmadan önce, nötrleştirmeyi ve/veya otoklavlamayı unutmayın. Bazı reaktifler sodyum azid içerir. Bu bileşik kurşun veya bakır kanalizasyonlar ile birlikte son derece patlayıcı özelliklere haiz metal azotürler oluşturabilir. Bu tür azotürlerin kanalizasyonlarda birikmesine engel olmak için, bu reaktifleri lavaboya atarken nötrleştirin ve lavaboyu bol miktarda su ile yıkayın. Bazı reaktifler ProClin TM 300 (% 0,04, % 0,1 ve/veya % 0,5) içerir Xi: TAHRİŞ EDİCİ MADDE R43: Cilt ile temas etmesi halinde duyarlılaşmaya yol açabilir S28-37: Cildinizle temas ettikten sonra, derhal su ve sabun ile bol bol yıkanın. Uygun eldivenler takın. Güvenlik verileri fişi talep üzerine verilmektedir. 5
6 - ÖNLEMLER Elde edilecek sonuçların kalitesi aşağıdaki laboratuar uygulamalarına tam olarak uyulmasına bağlıdır: Son kullanma tarihi geçen reaktifleri kullanmayın. Aynı deney sırasında farklı partilere ait reaktifleri birbirine karıştırmayın. Test ismi ve test özel tanıtım numarası her mikroplaka çerçevesinin üzerinde belirtilmiştir. Bu özel tanıtım numarası her şeridin üzerinde de yer alır. Monolisa TM HCV Ag-Ab ULTRA: Özel Tanıtım Numarası = 55 Bu tanıtım numarası her kullanımdan önce kontrol edilmelidir. Test numarası bulunmayan veya gerçekleştirilen testin numarasından farklı olan hiçbir şerit, kullanılmamalıdır. NOT: Aynı deney boyunca hep aynı partiyi kullanmak kaydıyla, kitte teslim edilenlerden farklı yıkama solüsyonu (etiketin üzerindeki yeşil 20X ibaresi ile tanıtılan, R2), substrat tamponu (mavi TMB buf. ibaresi ile tanıtılan, R8), kromojen (menekşe rengi TMB 11X. ibaresi ile tanıtılan, R9) ve durdurma solüsyonu (kırmızı 1N ibaresi ile tanıtılan, R10) partileri kullanmak mümkündür. Bu reaktifler şirketimizin diğer ürünleri ile birlikte kullanılabilir. Ayrıca, belli bir deneyde bir tek karışımın kullanılması kaydıyla, yıkama solüsyonu (etiketin üzerindeki yeşil 20X ibaresi ile tanıtılan, R2) düzgün bir şekilde yeniden oluşturulan farklı Bio-Rad reaktif kitlerine dahil edilmiş diğer iki yıkama solüsyonundan biri ile (etiketin üzerindeki mavi bir 10X veya turuncu bir 10X ibaresi ile tanıtılan, R2) karıştırılabilir. Ayrıntılı bilgi edinmek için teknik servislerimizle irtibat kurunuz. Reaktiflerin ortam sıcaklığında dengelenmesi için, kullanımdan önce 30 dakika bekleyin. Her türlü kontaminasyonu önleyerek, reaktifleri özenle tekrar oluşturun Konjugatların enzimatik faaliyetini bozabilecek reaktif buharlar (asitler, alkaliler, aldehitler) veya tozlar mevcut iken test yapmayın. Damıtık su ile mükemmel bir şekilde yıkanmış cam aletler veya tercihen tek kullanımlık donanım kullanın. Yıkama işleminin sonu ile reaktiflerin dağıtımı arasında geçen sürede mikroplakanın kurumasına izin vermeyin. Enzimatik reaksiyon tüm metallere veya metal iyonlarına karşı çok duyarlıdır. Dolayısıyla, hiçbir metal unsur, konjugatı veya substrat solüsyonunu içeren farklı solüsyonlar ile temas etmemelidir. Developman solüsyonu (substrat tamponu+ kromojen) pembe renkte olmalıdır. Yeniden oluşturma işlemini izleyen dakikalarda, başka bir rengin ortaya çıkması reaktifin kullanılamaz durumda olduğunu ve değiştirilmesi gerektiğini gösterir Bu preparat için tercihen, tek kullanımlık kaplar ve plastik dağıtım malzemeleri veya önceden 1 N hidroklorik asit, ardından damıtık su ile yıkanmış ve kurutulmuş cam kaplar kullanın. Bu solüsyonu güneş ışınlarına maruz bırakmayın. Her serum için yeni bir dağıtım konisi kullanın. Kapların yıkanması, yapılan işlemler açısından önemli bir aşama teşkil eder: tavsiye edilen yıkama döngülerine uyun ve tüm kapların tamamen doldurulup, ardından tamamen boşaltılmasına özen gösterin. Kötü bir yıkama işlemi yanlış sonuçlar elde edilmesine yol açar. Konjugatı ve developman solüsyonunu dağıtmak için asla aynı kabı kullanmayın 7 - NUMUNELER Olağan uygulama yöntemleriyle bir kan numunesi alın. Testler sulandırılmamış serum veya plazma numuneleri üzerinde yapılacaktır (numuneler EDTA, sitrat ve ACD gibi antikoagülanlar ile alınır). Agrega içeren numuneler testten önce santrifugasyon ile arıtılmalıdır. Süspansiyon halindeki partiküller veya fibrin agregaları yanlış pozitif sonuçlar elde edilmesine yol açabilir. Tarama 7 gün içinde yapılır ise, numuneler + 2-8 C sıcaklıkta saklanacaktır veya -20 C sıcaklıkta dondurulmuş olarak saklanabilecektir. Dondurma/Çözdürme işlemlerini tekrarlamaktan kaçının. Eğer numuneler taşınacak ise, bunları etyolojik ajanların taşınması ile ilgili yürürlükteki mevzuata uygun şekilde ambalajlayın ve tercihen dondurulmuş olarak taşıyın. KONTAMİNE, HİPERLİPEMİK VEYA HİPERHEMOLİZE TABİ TUTULMUŞ SERUMLAR KULLANMAYIN. NOT: 90 gr/l'ye kadar albumin, 50 µg/l'ye kadar biyotin ve 100 mg/l'ye kadar bilirubin içeren numunelerde ve ayrıca 36 gr/l'ye kadar trigliserit içeren lipemik numunelerde ve 87 gr/l'ye kadar hemoglobin içeren hemolize tabi tutulmuş numunelerde hiçbir etkileşim ispatlanamamıştır. Anti HCV antikorları veya HCV antijeni bulunup bulunmadığını belirlemek için negatif ve pozitif numuneler, 56 sıcaklıkta 30 dakika boyunca işleme tabi tutulduktan önce ve sonra ve ayrıca 3 dondurma çözdürme döngüsünden sonra teste tabi tutulmuştur. Bu işlemlerden hiçbiri antikorların algılanmasını etkilemez. Bununla birlikte ısıl işlem, Monolisa TM HCV Ag-Ab ULTRA kiti için HCV antijeninin algılanmasına yönelik yanıtı büyük ölçüde azaltır. 6
8 - REAKTİFLERİN YENİDEN OLUŞTURULMASI- SON KULLANMA TARİHİ - SAKLAMA Monolisa TM HCV Ag-Ab ULTRA kitindeki reaktifleri kullanmadan önce, 30 dakika boyunca ortam sıcaklığında dengelenmeye bırakın 1) Kullanıma hazır reaktifler Mikroplaka (R1) 12 şerit içeren her taşıyıcı çerçeve kapalı alüminyum poşet içine konulmuştur. Poşeti makas veya bıçak ile birleşme noktasının 0,5 ila 1 cm üzerinde kesin. Poşeti açın ve çerçeveyi poşetten çıkarın. Kullanılmayan şeritleri tekrar poşetin içine yerleştirin. Poşeti özenle kapatın ve yeniden +2-8 C sıcaklıkta muhafaza edin. Konjugat 1 kullanıma hazırdır (R6) Kullanımdan önce ters çevirerek homojenleştirin. Konjugat 2 kullanıma hazırdır (R7) Kullanımdan önce ters çevirerek homojenleştirin. 2) Yeniden oluşturulacak reaktifler Yıkama solüsyonu R2 (20X) Solüsyonu damıtık su ile 20 kez sulandırın.. Bu şekilde, kullanıma hazır yıkama solüsyonu elde edilir. 12 şeritten oluşan bir plaka için 800 ml hazırlayın. Enzimatik developman solüsyonu (R8 + R9) Reaktif R9'u reaktif R8'in içinde 1/11 oranında sulandırın (Örnek: 1 ml reaktif R9, 10 ml reaktif R8 içinde sulandırılır); 12 şeridi işlemden geçirmek için 10 ml gerekli ve yeterlidir. Homojenleştirin. Pozitif kontrol antijeni (R5a + R5b): Çalışma solüsyonu: R5a şişesine R5b şişesindeki solüsyonun tamamını doldurun. Kapağını tekrar kapatıp laboratuar sıcaklığında 10 dakika bekleyin ve zaman zaman şişeyi ters çevirerek çalkalayın. 3) Son Kullanma Tarihi Kit +2-8 C sıcaklıkta saklanmalıdır. +2-8 C sıcaklıkta saklanan kitteki her unsur kutunun üzerinde belirtilen son kullanma tarihine kadar kullanılabilir (özel bir uyarı bulunmadığı takdirde). R1: Vakumlu poşetin açılmasından sonra, +2-8 C sıcaklıkta muhafaza edilen ve özenle kapatılan orijinal ambalajlarındaki şeritler 1 ay dayanabilir. R2: Sulandırılmış yıkama solüsyonu +2-30 C sıcaklıkta 2 hafta saklanabilir. Konsantre yıkama solüsyonu (R2) +2-30 C sıcaklıkta muhafaza edilebilir. R5a + R5b: Pozitif kontrol antijeni çalışma solüsyonu +2-8 C sıcaklıkta 1 ay ve -20 C sıcaklıkta 2 ay saklanabilir (-20 C'de dondurulduktan sonra 5 dondurma/çözdürme döngüsüne kadar). R8 + R9: Yeniden oluşturulduktan sonra, karanlıkta saklanan reaktifler ortam sıcaklığında (18-30 C) 6 saat boyunca kullanılabilir. 9 - ÇALIŞMA ŞARTLARI Önerilen protokole kesinlikle uyun. Testin kalitesini doğrulamak için, test her uygulandığında negatif ve pozitif kontrol serumlarını kullanın. Doğru laboratuar uygulamalarını kullanın. Protokol 1) Numune dağıtım ve tanıtım planını özenle hazırlayın. 2) R2 sulandırılmış yıkama solüsyonunu ve pozitif kontrol antijen çalışma solüsyonunu hazırlayın (R5a + R5b). 3) Taşıyıcı çerçeveyi ve şeritleri (R1) koruyucu ambalajdan çıkarın. 4) Plakayı ön yıkamaya tabi tutmadan doğrudan, art arda şunları ilave edin: 4.1 Her kaba 100 µl konjugat 1 (R6) 4.2 A1'e 50 µl negatif kontrol (R3), B1, C1, D1'e 50 µl pozitif kontrol (R4), E1'e 50 µl pozitif kontrol antijeni çalışma solüsyonu (R5a + R5b), F1'e ilk numuneden 50 µl, G1'e ikinci numuneden 50 µl, vs. Karışımı en az 3 defa çekerek veya bir mikroplaka çalkalayıcısı yardımıyla 5 saniye boyunca homojenleştirin. Eğer numune dağıtımı 10 dakikadan uzun sürerse, negatif ve pozitif kontrollerin teste tabi tutulacak numunelerden sonra dağıtılması tavsiye edilir. 7
Kullanılan sisteme bağlı olarak, kontrollerin konumu veya dağıtım sırası değiştirilebilir. Not: Numune ilave edildikten sonra, numune (veya kontroller) + konjugat 1'i içeren haznenin rengi menekşe renginden maviye döner. Kaplarda numune bulunup bulunmadığı 620 nm'de yapılan spektrofotometrik bir okuma ile kontrol edilebilir (bkz. bölüm 12: NUMUNE VE KONJUGAT İLAVELERİNİN SPEKTROFOTOMETRİ İLE KONTROL EDİLMESİ). 5) Sızdırmazlık sağlamak için, mümkünse üstünü yapışkan bir film ile örterek, tüm yüzeyin üzerine iyice basın. 6) Mikroplakayı 90 ± 5 dakika boyunca 37 C ± 1 C sıcaklıkta, termostatlı benmari veya kuru mikroplaka inkübatöründe inkübe edin. 7) Yapışkan filmi çıkarın. Tüm kapların içeriğini kontamine atıklar için öngörülmüş (sodyum hipoklorit içeren) bir konteynere çekin ve kaplardan her birinin içine minimum 0,370 ml yıkama solüsyonu ilave edin. Yeniden çekin. Yıkama işlemini 4 kez tekrarlayın (minimum 5 yıkama). Artık hacim 10 µl'den az olmalıdır (gerekirse plakayı emici bir kâğıt üzerinde ters çevirerek kurutun). Otomatik bir yıkayıcınız var ise, aynı işlem döngüsünü uygulayın. 8) Tüm kaplara konjugat 2 solüsyonundan (R7) hızlı bir şekilde 100 µl dağıtın. Konjugat kullanımdan önce çalkalanmalıdır. Mümkünse yeni bir filmle kaplayın ve 37 C ± 1 C sıcaklıkta 30 ± 5 dakika inkübe edin. Not: Konjugatın rengi yeşildir. Kaplarda konjugat bulunup bulunmadığı 620 nm'de yapılan spektrofotometrik bir okuma ile kontrol edilebilir (bkz. bölüm 12: NUMUNE VE KONJUGAT İLAVELERİNİN SPEKTROFOTOMETRİK YÖNTEMLE KONTROL EDİLMESİ. 9) Yapışkan filmi çıkarın; içindekileri çekerek tüm kapları boşaltın ve daha önce olduğu gibi 5 kez yıkayın 10) Developman solüsyonunu hazırlayın (bkz. bölüm 8, reaktif R8 + R9). 11) Önceden hazırlanmış 80 µl'lik enzimatik faaliyet developman solüsyonunu (R8+R9) tüm kaplara hızla dağıtın. Reaksiyonun ortam sıcaklığında (18 ila 30 C) 30 ± 5 dakika boyunca karanlıkta gerçekleşmesini sağlayın. Bu inkübasyon sırasında, yapışkan film kullanmayın. Not: Pembe renkte olan developman solüsyonunun dağıtılması, işlemlerin bu aşamasında görsel olarak kontrol edilebilir. Boş bir kap ile pembemsi renkteki developman solüsyonunu içeren bir kap arasında önemli bir renk farkı vardır. (otomatik kontrol için paragraf 12'ye başvurun: NUMUNE VE REAKTİF İLAVELERİNİN SPEKTROFOTOMETRİ İLE KONTROL EDİLMESİ). 12) Developman solüsyonu ile aynı sıra ve dağıtım temposunu kullanarak 100 µl durdurma solüsyonu (R10) ilave edin. Not: Renksiz olan durdurma solüsyonunun dağıtılması, işlemlerin bu aşamasında görsel olarak kontrol edilebilir. Substratın pembemsi (negatif numuneler için) veya mavi (pozitif numuneler için) olan rengi, durdurma solüsyonu ilave edildikten sonra renksiz hale gelen (negatif numuneler için) veya rengi sarıya dönen (pozitif numuneler için) kaplardan kaybolur. 13) Plakaların altını özenle silin. Durdurma solüsyonunun dağıtılmasından sonra en az dört dakika bekleyin ve reaksiyonun sona ermesini takip eden 30 dakika içinde, bir plaka okuyucusu yardımıyla 450/620-700 nm'de optik yoğunluğu okuyun. 14) Sonuçları kayda geçirmeden önce, okuma işlemi ile plaka ve numune dağıtım ve tanıtım planının birbirleriyle uyumlu olduğunu kontrol edin. 10 - SİSTEM ADAPTASYONU YIKAMA: Testten azami performans elde etmek için, yıkama prosedürlerine mutlaka uyulması gerekir. Bazı cihazlarda, kabul edilebilir bir arka plan gürültüsüne ulaşmak amacıyla yıkama döngüsü sayısını artırmak gerekebilir. 8
11 - HESAPLAMALAR VE SONUÇLARIN DEĞERLENDİRİLMESİ Anti-HCV antikorları ve/veya HCV kapsidi antijeninin var olup olmadığı, her numunede kaydedilen aborbansın hesaplanan eşik değer ile karşılaştırılması suretiyle belirlenir. 1) Pozitif kontrol R4 için ölçülen absorbansların ortalamasını hesaplayınörnek: Pozitif Kontrol R4 Numune Optik yoğunluk B1 1,636 C1 1,704 D1 1,650 Toplam 4,990 Toplam optik yoğunluk 4,990 OPTİK YOĞUNLUK R4 = --------------------------------= ----------- = 1,663 3 3 2) Eşik Değerin (Vs) Hesaplanması Ortalama Optik Yoğunluk R4 Vs = --------------------------------------- 4 Örnek: Ortalama Optik Yoğunluk R4 = 1,663 1,663 Vs = ----------= 0,415 4 3) Testi geçerli ilan etme kriterleri şunlardır a) Negatif Kontrol R3 için: Ölçülen absorbans, eşik değer optik yoğunluğunun 0,6 ile çarpılan değerinin altında olmalıdır. b) Pozitif Kontrol R4 için: Ölçülen absorbansların ortalaması 0,800 değerine eşit veya bu değerin üzerinde ve 2,400 değerine eşit veya bu değerin altında olmalıdır. Pozitif kontrol değerlerinden biri ortalamaya göre %30'un üzerinde bir sapma gösterirse, geri kalan iki pozitif kontrol değeri ile yeni bir hesaplama yapın. c) Pozitif kontrol antijeni çalışma solüsyonu için (R5a + R5b). Ölçülen optik yoğunluk 0,500 değerinin üzerinde olmalıdır. Negatif kontrol R3, pozitif kontrol antijeni çalışma solüsyonu (R5a + R5b), pozitif kontrol antijeni çalışma solüsyonu (R5a + R5b) ve/veya pozitif kontrol R4'ün birden fazla değeri yukarıdaki değer aralığının dışında kalırsa test geçersiz ilan edilir. 4) Sonuçların Yorumlanması Optik yoğunluğu eşik değerin altında olan numuneler Monolisa TM HCV Ag-Ab ULTRA testine göre negatif addedilir. Bununla birlikte, eşik değerin hemen altındaki sonuçlar (ED-%10<OY<ED) ihtiyatla yorumlanmalıdır ve kullanılan sistemler ve laboratuar prosedürleri buna imkân tanıdığında ilgili numunelerin çift kopyalar halinde yeniden teste tabi tutulması tavsiye edilir. Optik yoğunluğu eşik değere eşit veya bu değerin üzerinde olan numuneler başlangıçta pozitif kabul edilir ve son değerlendirmeden önce, çift kopya halinde teste tabi tutulmalıdır. Testin tekrarlanmasından sonra, ikinci ve/veya üçüncü ölçüm pozitif ise, yani eşik değere eşit veya bu değerin üzerinde ise, numune Monolisa TM HCV Ag-Ab ULTRA testine göre pozitif addedilir. Bu iki değer eşik değerin altında bulunur ise, numune negatif addedilir. 9
12 - NUMUNE VE KONJUGAT İLAVELERİNİN SPEKTROFOTOMETRİK YÖNTEMLE KONTROL EDİLMESİ: (OPSİYONEL) İLK AŞAMADA KONJUGAT 1 (R6) VE NUMUNE İLAVELERİNİN KONTROL EDİLMESİ Konjugat 1 (R6) ve numunenin (veya kontrolün) eşzamanlı olarak mevcut olduğu 620 nm'de yapılan spektrofotometrik bir okuma ile kontrol edilebilir: Eşzamanlı olarak, konjugat 1 (R6) ile bir numune (veya kontrol) içeren her haznenin optik yoğunluğu 0,800'ün üzerinde olmalıdır. NOT: Numuneyi ilave ettikten sonra, konjugat 1'in (R6) rengi menekşe renginden maviye dönecektir. 10 İKİNCİ AŞAMADA KONJUGAT 2 (R7) İLAVESİNİN KONTROL EDİLMESİ Not: Konjugat 2'nin (R7) rengi yeşildir. Konjugat 2'nin (R7) kaplarda mevcut olduğu 620 nm'de yapılan spektrofotometrik bir okuma ile kontrol edilebilir: Her kap için ölçülen OPTİK YOĞUNLUK değeri 0,300 değerinin üzerinde olmalıdır (bu standardın altındaki bir değer, konjugatın iyi dağıtılmadığını gösterir). DEVELOPMAN SOLÜSYONU İLAVESİNİN KONTROL EDİLMESİ 490 nm'de yapılan otomatik bir okuma ile pembemsi developman solüsyonunun mevcut olup olmadığı kontrol edilebilir: Developman solüsyonunu içeren bir kabın optik yoğunluğu 0,100 değerinin üzerinde olmalıdır (daha düşük bir optik yoğunluk developman solüsyonunun iyi dağıtılmadığını gösterir). Boş bir kap ile pembemsi renkteki developman solüsyonunu içeren bir kap arasında önemli bir renk farkı vardır. 13 - TESTİN PERFORMANSI A - ÖZGÜLLÜK İNCELEMESİ Bu testin özgüllüğünü belirlemek için, kan donörlerinden ve hastalardan alınan numuneler Monolisa TM HCV Ag-Ab ULTRA kiti yardımıyla, farklı kuruluşlarda rutin olarak kullanılan testle karşılaştırılmak üzere teste tabi tutulmuştur. Bir kan donörü popülasyonunda özgüllük. İnceleme 3 farklı kuruluşta, olağan veya yeni donörler üzerinde yürütülmüştür. Kuruluşlar EFS Rungis Fransa EFS Bordeaux Fransa Montpellier Donörleri Fransa Toplam Teste tabi tutulan numune sayısı 2410 2503 2248 7161 Aynı koşullarda tekrarlanabilir 5 3 4 12 pozitif numune sayısı Teste tabi tutulan 7161 kan donörü numunesinden, 12 tanesi Monolisa TM HCV Ag-Ab ULTRA kiti ile tekrarlanabilir pozitif bir sonuç vermiştir, ancak bu numunelerin pozitifliği genomik teşhis (PCR) veya Immunoblot HCV PLUS Deciscan TM ile doğrulanmamıştır. Bu donör popülasyonundaki özgüllük %99,83'tür (%95'teki bir güven aralığı için %99,71 ila %99,91). Hastaneye yatırılmış hastalardan oluşan bir popülasyonda özgüllük İki farklı hastaneden alınan 469 numune üzerinde bir kohort çalışması gerçekleştirilimiştir. Monolisa TM HCV Ag-Ab ULTRA testi ve rutin olarak kullanılan test ile teste tabi tutulan 469 numuneden 440'ı negatif sonuç vermiştir; 22 numune bu iki testle pozitif bulunmuş, bunlardan 21'inin pozitif olduğu Immunoblot HCV PLUS Deciscan TMTM testi ile doğrulanmış ve biri de muhtemel pozitif bulunmuştur. 7 numunede Monolisa TM HCV Ag-Ab ULTRA kiti ve immunoblot HCV PLUS Deciscan TM ve PCR ile birbirini tutmayan sonuçlar elde edilmiştir. Bu 7 numune için elde edilen sonuçlar şöyledir: 2 numune rutin olarak kullanılan testle pozitif ve Monolisa TM HCV Ag- Ab ULTRA testi ve PCR ve immunoblot HCV PLUS Deciscan TM ile negatif bulunmuştur. Bu numuneler rutin test için muhtemel yanlış pozitifler addedilebilir. PCR testinin sonuçları yorumlanamayacak durumda olduğu için, 2 numune ile ilgili hiçbir sonuca varılamamıştır. Bu numuneler özgüllük hesaplamasından çıkarılmıştır. Bir numune rutin test ile pozitif, Monolisa TM HCV Ag-Ab ULTRA testi ile negatif, immunoblot HCV PLUS Deciscan TM ile belirsiz ve PCR testi ile negatif bulunmuştur. Sadece Monolisa TM HCV Ag-Ab ULTRA testi (oran 1,7'nin altında) ve laboratuarın kullandığı rutin test ile hafif pozitif olan iki numune PCR testi ile negatif, immunoblot HCV PLUS Deciscan TM testi ile belirsiz sonuç vermiştir (NS4'te zayıf bant). Bu inceleme ile hesaplanan özgüllük, son iki numune yanlış pozitif kabul edilir ise %99,5 (443/445) ve eski bir enfeksiyon sonucu mevcut artık antikorlar nedeniyle gerçek pozitif kabul edilir ise (immunoblot ile
belirsiz) %100'dür. Girişimlere neden olabilecek numunelerde özgüllük Anti HCV antikor algılama testi için çapraz reaksiyonlara yol açabilecek 429 numune Monolisa TM HCV Ag-Ab ULTRA kiti ile teste tabi tutulmuştur. Teste tabi tutulan numuneler aşağıdaki kişilerden alınmıştır: Hepatit B, hepatit A, kızamıkçık, toksoplazmoz, kabakulak, kızamık, CMV, VHS, VEB, VZV, HTLV I, VIH, Chagas, Flavivirus enfeksiyonuna yakalanmış hastalar, grip aşısı olmuş hastalar. Romatoid faktör açısından pozitif hastalar. Miyelom, HAMA ve ANA bulunan, otoimmün (SLE tipi) hastalıklara yakalanmış hastalar. Hamile kadınlar, siroz hastaları, diyaliz hastaları, böbrek yetmezliğinden muzdarip hastalar. Bu 429 numuneden sadece biri Monolisa TM HCV Ag-Ab ULTRA ve anti HCV antikor algılama rutin testi ile pozitif bulunmuştur. CE kayıtlı. Dolayısıyla elde edilen özgüllük oranı bu popülasyonda %100'dür (428/428) B - DUYARLILIK İNCELEMESİ Duyarlılık HCV bulaşmış hastalardan alınan geniş bir pozitif numune dizisi üzerinde değerlendirilmiştir; bunların arasında ticari serokonversiyon panelleri, uzman kuruluşlardan alınan numuneler ve Bio- Rad'dan gönderilen numuneler bulunur Teste tabi tutulan numuneler aşağıda sunulmaktadır. HCV enfeksiyonu için pozitif olduğu doğrulanan numunelerde duyarlılık Çoğu kronik HCV enfeksiyon kaynaklı toplam 646 numune teste tabi tutulmuştur (anti HCV antikorlarının bulunması). 405 numune genotiplidir. Bu 646 numunenin tamamı Monolisa TM HCV Ag-Ab ULTRA kiti ile reaktiftir. Dolayısıyla hesaplanan duyarlılık bu popülasyonda %100'dür. 25 ek taze pozitif numune (kan alınmasından sonraki 1 gün içinde) test edildi ve tamamı pozitif bulundu. HCV pozitif genotipli numunelerde duyarlılık Toplam 405 genotipli numune teste tabi tutulmuştur; bunlardan 133'ü farklı kaynaklardan alınmış olup, 272 numune hastane laboratuarlarından gönderilmiştir Teste tabi tutulan genotiplerin dağılımı şöyledir: Genotip 1a 1b 1c 1d 1a/b 2 2a 2b 2c 2i 2a/c 3 3a 3b Sayı 53 83 2 3 3 31 7 18 4 1 17 25 77 1 Genotip 3a/b 4 4a 4c 4d 4h 4k 4f 4c/d 5a 6a 6d 1b, 1a/b, 2a/2 2a/c Toplam Sayı 2 10 21 6 5 2 2 3 1 24 1 1 1 1 405 Tüm numuneler pozitif bulunmuştur: % 100 duyarlılık. Akut enfeksiyon kaynaklı numunelerde duyarlılık Duyarlılık HCV enfeksiyonunun akut safhasında (engeksiyonun başlangıç safhası) alınan numunelerde değerlendirmeye tabi tutulmuştur. 421 numuneye tekabül eden toplam 53 seronkonversiyon paneli Monolisa TM HCV Ag-Ab ULTRA kiti ile teste tabi tutulmuş ve CE kayıtlı bir anti-hcv antikor algılama kiti ile karşılaştırılmıştır. Monolisa TM HCV Ag-Ab ULTRA kiti enfeksiyonu hemen hemen tüm panellerde daha erken algılamaktadır: Anti-HCV antikor algılama kitine (anti-hcv kiti) kıyasla 119 ilave numune algılanmıştır. 53 serokonversiyon paneli Anti-HCV kiti Monolisa TM HCV Ag-Ab ULTRA (421 numune) Pozitif numune sayısı 152 271 Bu serokonversiyon panellerinden 11'i viremik olmayan bir numune ile başlamaktadır; bu durum, serolojik pencerenin (anti-hcv antikorları negatif safhası) daha doğru olarak belirlenmesine olanak tanımaktadır. 11
Panel Genotip İlk numunenin alınmasından itibaren pozitifliğin ortaya çıkma süresi (gün olarak) ARN HCV ** Anti-HCV kiti Monolisa TM HCV Ag- Ab ULTRA Anti-HCV kiti ile Monolisa TM HCV Ag-Ab ULTRA arasındaki fark (gün) BCP-6211 1a 140 186 140 46 BCP-6213 1a 11 43 30 13 BCP-6222 1a 17 40 17 23 BCP-6225 1a 45 78 45 33 BCP-6227 1a 42 74 46 28 BCP-9041 1a 24 62 24 38 BBI-PHV919 1a 25 28 28 0 BCP-9054 3a 52 60 52 8 BCP-9055 NG* 31 68 33 35 BCP-6216 NG* 23 23 23 0 NABI-SC90 NG* 10 52 10 42 Gün olarak ortalama 38.2 64.9 40.7 24.2 * Genotipli değil ** RNA testlerinin sonuçları panel tedarikçileri tarafından belirtilenlerdir. Bu 11 panel arasında, Monolisa TM HCV Ag-Ab ULTRA kiti HCV enfeksiyonunu bir anti-hcv kitine kıyasla ortalama 24 gün daha erken algılamaktadır. Bu avantaj özellikle Monolisa TM HCV Ag-Ab ULTRA kitinde kullanılan HCV kapsid antijeninin algılanmasından kaynaklanmaktadır. Antijen Duyarlılığı Antijen duyarlılık miktarı ticari serokonversiyon panellerinde, mesela BBI 917 panelinde ortaya konulabilir. Bu eğride Monolisa TM HCV Ag-Ab ULTRA kitinin duyarlılığı, bir anti HCV antikor algılama testi ile karşılaştırılabilir. Erreur! Source du renvoi introuvable. Oran: Numune Optik Yoğunluğu/Eşik Değer Optik Yoğunluğu 12
Hassasiyet Monolisa TM HCV Ag-Ab ULTRA testinin hassasiyeti 7 numune incelenerek belirlenmiştir: 1 numune HCV antikorları açısından negatif, 3 numune anti HCV antikorları açısından pozitif ve 3 numune HCV Ag açısından pozitif bulunmuştur. Tekrarlanabilirlik (test içi) bu 7 numunenin incelenmesi ile belirlenmiştir; numuneler aynı işlem sırasında 30 kez teste tabi tutulmuştur. Tekrarlanabilirlik (testler arası) bu 7 numunenin incelenmesi ile belirlenmiştir; numuneler 20 gün boyunca çift kopya olarak ve her gün birbirinden bağımsız iki test yapılarak teste tabi tutulmuştur (NCCLS EP5 prosedürü). Sonuçlar aşağıdaki tablolarda toplu olarak verilmiştir: Tablo 1: Test İçi Tekrarlanabilirlik Numune Ortalama oran DS CV% Ag-Ac HCV Negatif 0,14 0,01 6,1 Ac HCV zayıf pozitif 1,12 0,04 3,65 Ac HCV orta pozitif 2,39 0,08 3,39 Ac HCV güçlü pozitif 4,88 0,18 3,7 Ag HCV zayıf pozitif 1,14 0,03 3,04 Ag HCV orta pozitif 1,97 0,06 3,02 Ag HCV güçlü pozitif 5,86 0,14 2,38 6 pozitif numune için elde edilen CV değerleri %10'un altındadır. Tablo 2: Testler Arası Tekrarlanabilirlik Numune Ortalama oran DS CV% Ag-Ac HCV Negatif 0,16 0,02 12,4 Ac HCV zayıf pozitif 1,2 0,08 6,65 Ac HCV orta pozitif 2,39 0,13 5,38 Ac HCV güçlü pozitif 4,77 0,17 3,58 Ag HCV zayıf pozitif 1,13 0,09 7,97 Ag HCV orta pozitif 2,0 0,15 7,73 Ag HCV güçlü pozitif 5,99 0,37 6.2 6 pozitif numune için elde edilen Varyasyon Katsayısı değerleri %15'in altındadır. 14 - TEST LİMİTLERİ Hepatit C virüsünün bulaştığı hastaların immünolojik yanıtlarındaki çeşitililk nedeniyle (özellikle serokonversiyonlar sırasında), kullanılan antijenik proteinlerin niteliğine bağlı olarak testler arasında algılama farklılıkları gözlemlenebilir. Bir tarama testi sırasında elde edilen negatif bir inceleme sonucu, hepatit C virüsüne veya hepatit C virüs enfeksiyonuna maruz kalma olasılığını ortadan kaldırmaz. Her türlü ELISA tekniği yanlış pozitif sonuçlara yol açabilir. Tekrarlanabilir pozitif bulunan her türlü numune için reaksiyon özgüllüğünün, Monolisa TM HCV Ag-Ab ULTRA kiti yorumlama kriterlerine göre uygun bir yöntemle kontrol edilmesi tavsiye edilir: Anti-HCV antikor tarama ELISA testinin tek başına kullanılması veya anti-hcv antikorlarının varlığını kanıtlamak için bir immünoblot testi kullanılması. Gerekirse, bir HCV viral genom araştırma testi veya özel bir HCV antijen tarama testi, ardından bir nötrleştirme testi kullanın. Numune ve/veya konjugat ve/veya developman solüsyonu ilavelerini kolorimetri ile doğrulama yöntemi dağıtılan hacimlerin doğruluğunun kontrol edilmesini sağlamaz, sadece numune ve/veya konjugat ve/veya developman solüsyonunun ortamda mevcut olduğunu gösterir. Bu yöntemle elde edilen hatalı yanıt oranı kullanılan sistemin hassasiyetine bağlıdır (%10'un üzerindeki kümülatif pipetleme ve okuma varyasyon katsayısı değerleri bu kontrolün kalitesini büyük ölçüde azaltabilir). 13
15 - KAYNAKÇA Busch MP, Kleinman SH. Committee report: nucleic acid amplification testing of blood donors for transfusion-transmitted infectious diseases. Report of the Interorganizational Task Force on Nucleic Acid Amplification Testing on Blood Donors. Transfusion. 2000, 40: 143-1 59. Busch MP, Kleinman, SH, Nemo GJ. Current and emerging infectious risks of blood transfusions. JAMA. 2003, 289: 959-962. Bouvier-Alias M, Patel K, Dahari H, Beaucourt S, Larderie P, Blatt L, Hezode C, Picchio G et al. Clinical utility of total core HCV core antigen quantification: a new indirect marker of HCV replication. Hepatology. 2002, vol 36: 211-218. Jackson BR, Busch MP, Stramer SL, AuBuchon JP. The cost-effectiveness of NAT fot HIV, HCV and HBV in whole blood donations. Transfusion. 2003, 43: 721-729. Lambert N, Vermet L, Bordier M, Clément A, Costaille M, Prigent V, Flecheux O, Sanjuan A et al. Performance features of the new Bio-Rad HCV antigen and antibody assay: MonolisaTM HCV Ag- Ab ULTRA. Vox sanguinis. 2004, 87 (suppl 3): 61-62. Laperche S, Le Marrec N, Simon N, Bouchardeau F, Defer C, Maniez-Montreuil M, Levayer T, Zappitelli JP, Lefrère JJ. A new HCV core antigen assay based on disassociation of immune complexes: an alternative to molecular biology in the diagnosis of early HCV Infection. Transfusion. 2003, 43: 958-962. Nübling CM, Unger G, Chudy M, Raia S, Löwer J. Sensitivity of HCV core antigen and HCV RNA detection in the early infection phase. Transfusion. 2002. 42: 1037-1 045. Masalova OV, Atanadze SN, Samokhvalov EI, Petrakova NV, Kalinina TI, Smirnov VD, Khudyakov YE, Fields HA, Kushch AA. Detection of hepatitis C virus core protein circulating within different virus particle populations. Journal of Medical Virology. 1998, 55: 1-6. Pawlotsky JM. Use and interpretation of virological tests for hepatitis C. Hepatology. 2002, 36: 565-573. Pillonel J, Laperche S, Saura C, Desenclos JC, Couroucé AM et al.. Trends in residual risk of transfusion-transmitted viral infections in France between 1992 and 2000. Transfusion. 2002, 42: 980-988. Simmonds P. HCV heterogeneity: the science and the practice. In Hepatitis C. 1998. Yanamouchi Europe BV Ed. p 3-10. Strader DB, Wright T, Thomas DL, Seeff LB. Diagnosis, management and treatment of Hepatitis C. AASLD Practice Guideline. Hepatology. 2004, 39: 1147-1171. Centers for Disease Control. Guidelines for Laboratory testing and result reporting of antibody to hepatitis C virus. MMWR 2003, 52: RR-3. EASL International Consensus Conference on Hepatitis C. Consensus Statement. Journal of Hepatology. 1999, 30: 956-961. NIH Consensus Statement on Management of hepatitis C: 2002. NIH Consensus and State-ofthe- Science Statements. 2002, 19 N 3. 46p. 14
Bio-Rad 3, bd Raymond Poincaré 92430 Marnes-la-Coquette Fransa Tel.: +33 1 47 95 60 00 11/2010 Faks: +33 1 47 41 91 33 Kod : 883607