CMV R-gene REF REF B

CMV R-gene REF 69-003 REF 69-003B İnhibisyon kontrolü için yorum modifikasyonu (Konu 13.2 bakın) REF 69-003 BİLEŞİM DNA EKSTRAKSİYON KIT REF 67-000 Amplifikasyon kit, CMV R-gene TM REF 67-003B 1. Kit Tanımı 2 2. Kullanım amacı 2 3. Test Prensibi 3 4. Kit içeriği ve saklama koşulları 5 5. Kit içeriğinde bulunmayan fakat gerekli reaktif ve materyaller 6 6. Reaktiflerin rekonstitüsyonu 6 7. Uyarı ve Önlemler 7 8. Standartlar ve kontrollerin internal kantifikasyonu 8 9. Örneğin işlenmesi ve taşınması 10 10. Ekstraksiyon protokolü 10 11. Tespit ve Real Time PCR kantifikasyon protokol 13 12. Data analzileri 14 13. Sonuçların hesaplanması ve yorumlanması 16 14. Arıza giderme Kılavuzu 17 15. Test performansı 20 16. Referanslar 31 17. İlgili ürünler 32

1. Kit Tanımı CMV, insanda hastalığın geniş bir spektrumundan sorumlu bir Herpes virüstür. Primer enfeksiyon çocukluk döneminde oluşur. Virüs, nadiren ve iyi huylu kalır ve klinik bulguları provoke ederek kan yoluyla yayılır. Virüs daha sonra konakçıda latent durumunda kalır ve bir immunsupresyon sırasında yeniden aktive olabilir. Oluşan hastalığın şiddeti esas olarak hastanın bağışıklık durumu ile tespit edilir. Hassas bireyler genelde organ veya kemik iliği alınan hastalar ve AIDS li hastalardır. CMV, bu hastalarda immunsupresyonun şiddetine, pneumopathie ve nörolojik hasara neden olduğu bilinmektedir. CMV R-gene kit eğer sonrası için spesifik 2 aşamalı protokol varsa, tam kan, plazma, serum, beyin omurilik sıvısı (CSF), idrar, biyopsiler, bronko alveolal sıvı (BAL) ve amniyotik sıvıda tespit edilerek CMV nin genomunu sağlar. Nitekim, yüksek viral yükleme CMV de olumlu olduğunda, genellikle amniyotik sıvıda bulunur. Klinik çalışmalar sonrasında, bazı konsantrasyonlar sonuçlarının tam yorumlanmasını sağlamak için numunenin bu tipi için spesifik iki aşamalı strateji tanımlamaya yardımcı olur. Böylece, amniyotik sıvının aynı örneği iki kez test edilmelidir: saf örnek içeren bir tüp ve aynı örnek içeren başka bir tüp ama 1/100th oranında seyreltilmiştir. Bu test sonunda, pozitif veya negatif bir kalitatif tepki verilebilir. Diğer yandan, eğer numune pozitif bulunacaksa ve inhibe edilecekse, numuneden alınan ekstre edilmiş DNA ilk sonuçlara göre daha büyük bir dilüsyon ile tekrar test edilmelidir. CMV R-gene kiti CMV genomunun kantifikasyonunu sağlayabilir. CMV DNA izolasyonu sonrası, kantifikasyon CMV R-gene real time PCR testi kullanılarak yapılır. Kullanıcı dostu ve komplet, CMV R- gene kit her laboratuvar için uygundur. Numunenin ve çok sayıda DNA saflaştırma sistemlerinin çoğu türleri (otomatik ve manuel) kit ile doğrulanmıştır. Ekstre edilmiş DNA sonra uygun ortak platformlar ile amplifiye edilir ve tespit edilir. R-gene ürünlerinin tam aralığı ile genel bir amplifikasyon programı sayesinde, numune analizi aynı anda aşağıdaki diğer hedefler ile:hsv1 HSV2 VZV R-gene kit (Ref: 69-004B) ile HSV1, HSV2, VZV, EBV R-gene kit (ref : 69-002B), CMV, HHV-6, HHV-7 ile EBV ve CMV HHV6,7,8 R-gene kit (ref : 69-100B) ile HHV-8, ve Adenovirus R-gene (ref : 69-010B) ile Adenovirus analiz edilir. Sonuçlar kit ile sağlanan bir ekstraksiyon kontrolü dahil olmak üzere çeşitli kontroller ile onaylanmıştır. 2. Kullanım amacı İnsan sitomegalovirüsü (HCMV), Herpesviridae ailesine dahil olan çift sarmal DNA ya sarılmış bir virüstür. Sosyoekonomik koşulların düşük olduğu ülkelerde yayılma daha fazladır (50 ile 100 %). Primer enfeksiyon sonrası, HCMV konakçıda latent durumunda kalır ve kronik veya geçici immunsupresyon sırasında veya yeni bir strain ile tekrar eden enfeksiyon veya endojen genomun aktifleşmesi ile ikincil tekrarlayan enfeksiyonlara neden olabilir. HCMV enfeksiyon sonuçları genelde bireylerin hücre bağışıklığına bağlıdır. Çoğu kez sağlıklı bireylerde asemptomatik durumda immunosuppressed hastalarda ve rahimdeki iletim sonrası fetüsta veya yeni doğan çocukta ciddi hasara neden olabilir. Organ veya ilik allogreft sonrası HCMV sahip enfeksiyon: HCMV kemik iliği allogreft ve organ nakli sonrasında ana bulaşıcı ajandır. HCMV enfeksiyonu nakil tipine bakılmaksızın ortalama olarak tüm alıcıların üçte ikisinde görülmektedir. Enfeksiyon nakil sonrası 1. ve 4. aylar arasında profilaktik tedavinin yokluğunu ortaya çıkar. Birincil enfeksiyon vakalarının üçte ikisinde, yeniden enfeksiyon vakalarının 40 % da ve tekrar aktivasyonların 20 % siniden daha azında semptomatiktir. Uzun süreli ateş, enfeksiyonun klinik belirtileri veya trombo -lökopeni, sitolitik hepatit, mide bozuklukları veya sistit den oluşan komplikasyonlardan meydana gelebilir. Koryoretinit nadir görülür. Interstisyel pnömonisi bir ilik naklinin önemli bir komplikasyonudur. Tüm alıcıların yaklaşık 20 % sinde oluşur ve gelişimi tedavi olmadan tehlikelidir (% 90 mortalite). Ayrıca, HCMV enfeksiyonu tetikleyen veya rejeksiyonu veya GVH hızlandıran

bir etkendir (konakçı karşıtı nakil reaksiyonu). Ayrıca, immünsupresyon ve süper enfeksiyonları şiddetlendirir. AIDS sırasında HCMV Enfeksiyonu: HCMV ile enfeksiyonların sıklığı en az kısmi bağışıklık restorasyonda sağlanan son derece etkin anti-retroviral tedavinin başından dolayı % 80 oranında azalmıştır. Klinik belirtileri, 50/mm altında CD4+ T lenfositlerin ortalama sayısı ile karakterize olan immunsupresyonun önemli bir adımında oluşur. Retinitler hastaların yaklaşık % 15 ile 35 de, en yaygın klinik belirtileri görünür. Peptik ülser klinik belirtilere neden olan ikincildir. Hastalığın görülme oranı kanıtlanmamış olmasına rağmen nörolojik hasarın çoklu tiplerinden bahsetmektedir. Pnömopati nadir görülür. Hamilelik sırasında, annede birincil enfeksiyonun ortaya çıkması oluşan nörolojik bozukluklar ile fetal enfeksiyon vakalarının % 50 sinde komplikasyonları artırır. HCMV ile aktif enfeksiyonunun tanısında kullanılan teknikler şunlardır: sitopatojenik etkisi için hücre kültürü arama (6 hafta, «benchmark yöntemi»), anti- IEA tipi (24 ile 48h), lökosit antigenemia ppul83 (2 ile 3h) monoklonal antikor kullanarak immunositokimya tarafından tespit ile hızlı kültür. Bu yöntemler viral antijenler ürettiği için etkin bir enfeksiyon göstermektedir. PCR (geleneksel ve gerçek zamanlı) her laboratuvar için spesifik yöntemler ile de kullanılır. Bu çeşitli yöntemler kantitatif sonuçların iyi karşılaştırılmasını engeller. Ayrıca, Avrupa ve Amerika düzenlemeleri geliştirme ve üretimde doğrulama ve kontrolün gerekli aşamaları ile bu «kurum içi» testlerin kullanımını sınırlamak eğilimindedir. Teşhis kullanımı için çok gerekli işletme lisansı olmadan tüm düzenlemelere uyulduğunda bile teşhis testinin bu türünü geliştirmek çok zordur. Bir çok standart ticari kit CMV R-gene gibi en katı standartlara göre geliştirilmiştir ve laboratuarların çoğunluğu için test kullanılabilir hale getirilir ve sonuçlar bir laboratuvardan diğerine aktarılabilir ve belgelenir. CMV R-gen kiti tanı yöntemleri kullanılarak elde edilen değerleri beraber planlayarak sitomegalovirus enfeksiyonu izlemesine ve tanısına yardımcı bir hızlı testtir. Amaç her hastanın klinik kapsamında tanı (hücre kültürü, antigenemia) yöntemleri ile dikkatle hazırlanan kendi tedavi reflekslerini kullanmasına uzmanların izin vermesidir. CMV R-gene kitinde, kitte bulunan bir internal kontrol, bir inhibisyon kontrolü ve bir negatif kontrol ile CMV viral yük hızlıca belirlenir. Sonuçlar numunenin milliltre başına kopya sayısı olarak ifade edilir. Viral yükün ölçümü, kronik viral enfeksiyonların gelişiminin izlenmesini sağlar ve böylece adapte edilen tedaviye başlayıp başlamaması için yada kendi etkinliğini değerlendirip değerlendirmemesi için hızlı bir şekilde karar verir. İlgili hasta türleri nakil alıcıları (organ ya da ilik), AIDS hastaları ve genel olarak immunosüpresif olanlardır. Bu kitin çok yüksek duyarlılığı ve doğruluğu bir kemik iliği allogreft alıcılarında CMV tespiti için kullanılmasını sağlar. Pozitif ve negatif prediktif değerleri ( negatif veya pozitif testing tamamlanması üzerine CMV hastalığının oluşmaması veya ortaya çıkma olasılığı) viral miktar için klinik eşik değerlerini belirlemek için profilaktik ve tedavi stratejileri kapsamında kullanıcı tarafından belirlenecektir. CMV R-gene kit tam kan, plazma, serum, CSF, idrar, BAL, biyopsiler ve amniyotik sıvıda ölçülecek CMV virüsünün viral yükünü verir. Hastanın viral durumunu tanımlamak için diğer tanı araştırma yöntemlerinde CMV R-gene kiti ile elde edilen sonuçları kesinlikle karşılaştırmak gerekir. CMV R- gene kit bulunan CMV nin miktar tayini EBV R-gene kit (Argene, ref.: 69-002) kullanarak EBV viral yük ölçümü, HSV1 HSV2 VZV R-gene kit (Argene, ref.: 69-004) kullanarak HSV-1, HSV-2, VZV viral yük ölçümü, CMV HHV6,7,8 R-gene kit (Argene, ref. : 69-100) kullanarak CMV, HHV-6, HHV-7, HHV- 8 viral yük ölçümü ve Adenovirus R-gene (Argene, ref. : 69-010) kullanarak Adenovirüs viral yük ölçümü ile eş zamanlı gerçekleşebilir. Tüm Argene RealTime PCR kitlerinde aynı amplifikasyon prosedürü izlenir ve böylece aynı anda aynı deneyde kullanılabilir. 3. Test prensibi 3.1 NUMUNE TİPİ CMV R-gene TM, spesifik bir protokol şartlarına bağlı tam kan örnekleri, beyin omurilik sıvısı (CSF), plazma, serum, bronkoalveoler sıvı (BAL), idrar, biyopsiler ve amniyotik sıvıda CMV in viral yükü ölçülür.

CMV için miktar aralığı 10 kopya /PCR ile 200 000 kopya /PCR gibi 500 kopya/ml ile 107 kopya/ml arasında lineerdir. Sonuçlar numunenin kopya/ml sinde bildirilir. Sonuçlar CMV R-gene kitte sağlanan bir ekstraksiyon, inhibisyon, pozitif ve negatif kontrol ile doğrulanır. CMV R-gene kit 81 numuneyi analiz etmek için tüm reaktifler sağlar. 3.2 DNA SAFLAŞTIRMA Aşağıdaki DNA ekstraksiyon yöntemleri CMV R-gene kit ref. : 69-003B kiti ile doğrulanır: - MagNA Pure Compact Instrument (Roche Diagnostics Ref.: 03 731 146 001), MagNA Pure LC System (Roche Diagnostics Ref.: 12 236 931 001). - NucliSENS easy MAG (Biomérieux Ref.: 280110). - QIAamp DNA Mini kit (QIAGEN ; Ref.: 51 304 / 51 306). - DNA EXTRACTION KIT (Ref.: 67-000). - QIAcube (QIAGEN Ref. : 9001292/9001293). - m2000sp (Abbott Ref. 9K1401). - Versant kpcr Molecular System SP (SIEMENS Ref.: 06635740). Numune ve ekstraksiyon + inhibisyon kontrolü (IC2) içinde bulunan hedef DNA yukarıda ekstraksiyon yöntemleri kullanılarak elde edilir. DNA EXTRACTION KIT (Ref.: 67-000) ile kullanılan teknik, bir mikrosentrifujasyon hızı ile silika jellerin seçici bağlayıcı özellikleri ile ilişkilidir. Numune ve internal kontrol (IC2) membran üzerinde DNA bağlayıcı kapasitelerini optimize etmek için ilk proteaz ile ilk kez parçalanır. Silika kolonunun kullanımı, DNA kaplama sonrası, kontaminasyonu elimine etmek için numunenin verimli yıkmasını sağlar. Elüsyon sonrası, DNA amplifikasyon tekniklerini direk kullanmak için uygundur. 3.3 REAL-TIME AMPLIFIKASYONU VE KANTİFİKASYONU Amplifikasyon, 5 'nükleaz TaqMan teknolojisi (patent n : 5210015, 5487972) kullanılarak yapılır ve hidroliz probları olarak da adlandırılır. Kullanıma hazır amplifikasyon karışımı içerir: bütün ekstraksiyon prosedürü de (lizis dahil) yapılan internal kontrol (IC2) için primerler ve spesifik problar yanında primerler, dntps, amplifikasyon bufferı, Hot StarTaq Polimeraz (QIAGEN), spesifik CMV primerler ve probe içerir. Real Time PCR platformların aşağıdaki aralığı CMV R-gene kit ref.: 69-003B ile doğrulanır: - LightCycler (LC480, System II içerir). - ABI (ABI StepOne ve ABI Fast içerir). - Rotor-Gene. - Stratagene, Versant kpcr Molecular Sistem AD. - Opticon. - i.cycler. Ekstre edilmiş numuneler aynı zamanda amplifiye edilir ve tespit edilir. CMV genomları real time amplifikasyon ile miktarı tayin edilir. CMV için amplifiye edilmiş gen ppul83 protein için kodlama genidir. Amplifiye edilmiş parçanın boyutu: 283 baz çiftidir. 4 kantifikasyon standartın aralığı CMV R-gene kit (QS1, QS2, QS3, QS4) sağlanmıştır. Her kantifikasyon standardı CMV için spesifik bir plazmit içerir. Kantifikasyon standartları PCR başına her plazmitin 50 kopya ile 50 000 kopya ya da 5000 kopya / μl (QS1) ile 5 kopya / μl (QS4) arasındadır. QS3, PCR başına 500 kopya plazmit DNA içeren bir kantifikasyon standarttır. Bu standart, daha önce oluşturulan standart eğri vermek için kullanılabilir. Bu yöntem her zaman bir kantifikasyon deneyi başlatılırsa 4 kantifikasyon standartlarını test etmeyi önler (bkz: 8.2 bölümü).

SC, 10 kopya/pcr a karşılık gelen μl başına 1 kopya plazmit DNA içeren bir duyarlılık kontrolüdür. Bu kontrol (SC) testin performansını doğrular ve bir çalışma-kontrolü olarak kabul edilmelidir. Bir ekstraksiyon ve inhibisyon kontrolü (IC2) eğer numune iyi ekstre edilmişse ve numunede amplifikasyon inhibitörlerinin varlığı doğrulanmışsa, lizis adımını kontrol etmek için CMV R-gene kitinde bulunur. UYARI: CMV R-gene kit açıklanan performansları sadece önerilen ekstraksiyon sistemleri ve PCR cihazları için garanti edilebilir. Hasta takibi sırasında, aynı protokolü kullanmak ve aynı ekstraksiyon ve amplifikasyon cihazı kullanmak zorunludur. 4. Kit içeriği ve saklama koşulları 4.1 DNA EKSTRAKSİYON KIT 67-000 Kit başına ekstrasksiyon sayısı: 50 o A QIAamp mini column 5 x 10 o B Toplama tüpleri (2 ml) 2 x 50 o C AL tampon Xn HARMFUL 12 ml o D AW1 tampon (konsantre) Xn HARMFUL 19 ml o E AW2 tampon (konsantre) 13 ml o F AE tampon 12 ml o G QIAGEN proteaz Xn - HARMFUL 24 mg o H Proteaz çözücü 1.2 ml Bu kit kutu üzerinde yazılı son kullanım tarihine kadar +2 C/+8 C de açılmadan önce ve açıldıktan sonra saklanabilir. Yüksek sıcaklıkta saklamadan kaçının. Çözündürülmüş QIAGEN proteaz tekrarlanan donma/çözündürmeyi önlemek için -18 C/-22 C 'de eşit miktarlarda saklanabilir. 4.2 KANTİFİKASYON KİT CMV HHV6,7,8 R-GENE 69-100B Test sayısı: 90 W0 Ekstraksiyon için su (molecular grade) IC2 Internal Kontrol 2 R0 Amplifikasyon için su (molecular grade) QS1 Kantifikayson standardı 1 CMV (5000 kopya*/μl) QS2 Kantifikayson standardı 2 CMV (500 kopya*/μl) QS3 Kantifikayson standardı 3 CMV (50 kopya*/μl) QS4 Kantifikayson standardı 4 CMV (5 kopya*/μl) SC Duyarlılık kontrolü CMV (1 kopya*/μl) R5 CMV ve IC2 Amplifikasyon premiks *CMV için plazmit kopyasının miktarına karşılık gelir. 2x1.8 ml 1 ml 0.3 ml 0.3 ml 0,3 ml 0.3 ml 0.3 ml 0.3 ml 3x0.450 ml Kiti (ref. 69-003B), kutu üzerinde yazılı son kullanım tarihine kadar -18 C/-22 C de donmuş olarak açıldıktan sonra ve önce tutun. Kiti (ref. 69-003B) açılmadan önce ve açıldıktan sonra, internal kontrol 2 (IC2), reaktif (W0), kantifikasyon standartları (QS1, QS2, QS3, QS4) ve duyarlılık kontrolü (SC) -18 C/-22 C de ekstraksiyon odasında saklanmalıdır. Reaktifler R0, ve R5-18 C/-22 C de premiksin hazırlanması için ayrı odada saklanmalıdır.

5. Kit içeriğinde bulunmayan fakat gerekli reaktif ve materyaller 5.1 NUMUNE EKSTRAKSİYONU İÇİN DNA EXTRACTION KIT ile ref. : 67-000 Etanol 96-100%. Santrifüj (6 000xg. 12 000xg). Vorteks. Test tüpleri (1.5 ml, 2 ml).. +56 C su banyosu. Pozitif boşluklu veya aerosol bariyer tıkalı steril mikropipetler. Tek kullanımlık lateks veya benzeri eldivenler. CMV R-gene ref. : 69-003B ile doğrulanan diğer ekstraksiyon yöntemi Kitler QIAamp DNA Mini kit Ref.: 51 304 / 51 306 MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I Ref. : 03 003 990 001 MagNA Pure Compact Nucleic Acid Isolation Kit Ref. : 03 730 964 001 NucliSENS easymag Magnetik ekstraksiyon reaktifleri Sample Preparation System DNA Ref. : 06K12-24 Versant Sample Preparation 1.0 Ref. : 06496457/06496465 EKSTRAKSİYON CİHAZLARI QIAcube Üreticinin talimatlarını izleyin. MagNA Pure LC Instrument Üreticinin talimatlarını izleyin. MagNA Pure Compact Instrument Üreticinin talimatlarını izleyin. NucliSENS easymag Üreticinin talimatlarını izleyin. m2000sp Üreticinin talimatlarını izleyin. Versant kpcr Molecular System SP Üreticinin talimatlarını izleyin. 5.2 CMV R-gene KANTİFİKASYON KİT 69-003B Aerosol bariyer tıkalı veya pozitif boşluk uçlu steril mikropipetler. LightCycler, ABI, Rotor-Gene, Opticon, i.cycler, ya da Stratagene, Versant kpcr Molekülar Sistem AD, Opticon, i.cycler. LightCycler için LC Karusel Santrifüj veya 2mL reaksiyon tüplerine uygun tezgâh üstü mikrosantrifüj veya ABI ve Stratagene, Versant kpcr Molecular System AD için plaka santrifüj. Tek kullanımlık lateks veya benzeri eldivenler. CMV R-gene için doğrulanmış real time PCR platformlar için kapileriler, tüpler ve mikroplakalar. Tercih edilen termocyler için uygun soğutma bloğu. U.V Light. Örnekler ve premiks dağıtımı için iş İstasyonu veya pleksiglas ekran. LightCycler 2.0 sonuç yorumu için renk kompansasyon r-gene (Argene Ref.: 71-103). LightCycler 1.0 de bir ekstraksiyon + inhibisyon kontrol elde etmek için DICO Extra r-gene (Argene ref. : 71-101) in DP2 premiksi. 6. Reaktiflerin çözündürülmesi DNA EKSTRAKSİYON KIT ref. : 67-000, ekstraksiyon kiti ile sağlanan reaktifleri SADECE çözündürün. 6.1. Proteaz stok solüsyon hazırlama 24 mg liyofilize proteaz (G) e 1.2 ml proteaz çözücü (H) ekleyin. -18 C/-22 C de aynı hacimlerde saklayın (tekrar çözündürme ve dondurmadan kaçının).

6.2. AL buffer (C) hazırlama Kullanım öncesi çalkalayarak AL tampon (C) iyice karıştırın. AL buffer (C) e direk olarak proteaz eklemeyin. Eğer çökelti AL tamponunda (C) görünürse, çökelti çözünene kadar +70 C de ısıtın. +2 C / +8 C de saklayın. 6.3. AW1 tampon (D) hazırlama +2 C / +8 C de saklayın. AW1 tampon (D) bir konsantre olarak verildi. İlk kullanım öncesi, 19 ml konsantre edilmiş tampona 25 ml etanol (96-100%) ekleyin. 6.4. AW2 buffer (E) hazırlama +2 C / +8 C de saklayın. AW2 tampon (E) bir konsantre olarak verildi. İlk kullanım öncesi, 13 ml konsantre edilmiş tampona 30 ml etanol (96-100%) ekleyin. 7. Uyarılar ve önlemler 7.1. Moleküler biyoloji işlemleri için uyarılar ve önlemler Amplifikasyon prosedürleri numunenin kontaminasyon riskini önlemek için yüksek yetenekli teknik gerektirir: o Numune hazırlama ve amplifikasyon reaksiyonu için ayrı çalışma alanları kullanın. Laboratuvarda hareket sadece reaktif hazırlık alanından amplifikasyon alanı yönünde olmalıdır. Her alan için pipetler ve laboratuar önlüklerini ayarlayın. Reaktif yada numune hazırlama alanında amplifiye bir ürünü asla başlatmayın. o Kullanılan örnekler sadece bu analiz için ayrılmalıdır. o Numuneler biyolojik güvenlik kabini altında hazırlanmalıdır. Farklı örnek tüpleri aynı zamanda asla açılmalıdır. o Örnekleri işlemek için kullanılacak pipetler sadece bu amaçla ayrılmalıdır. Bu pipetler filtre uçlu pozitif boşluklu pipetler veya hazırlanmış pipetler olmalıdır. Kullanılan uçların farklı türleri steril olmalıdır. o Eşit miktarlardaki reaktifler için kullanılan pipetler sadece bu amaçla ayrılmalıdır. Amplifikasyon için gerekli reaktifler tek bir deney sırasında kullanılmak üzere eşit miktarlarda ayrılmıştır. 7.2. Genel uyarılar ve önlemler o Potansiyel enfeksiyöz olan tüm örnekler ve malzemeleri işlemeyin yada atmayın. Kullandıktan sonra: malzeme, reaktifler ve atığın potansiyel olarak enfeksiyöz olarak ele alınması gerekir. o Bu testi gerçekleştirmeden önce tüm talimatları okuyun. o Son kullanım tarihinden sonra reaktifleri kullanmayın (etiket basılmış). o Yalnızca kitte bulunan reaktifleri kullanın. o Diğer üreticilerin yada farklı lot numaralı kitlerin reaktiflerini değiştirmeyin. o Ağız ile asla pipetlemeyin. o Özel çalışma alanlarında sigara veya içecek içmeyin, yemek yemeyin. AL (C) tampon ve AW1 tampon (D) guanidinyum klorür içerir (kaotropik tuz) R22: Yutulursa zararlıdır. R36/38: Göz ve cilt için zararlıdır. S13: Hayvan yemi, yiyecek ve içeceklerden uzak tutun.

S26: Göz ile temas halinde, derhal bol su ile yıkayınız ve tıbbi yardım isteyiniz. S36: Uygun koruyucu önlük giyin. S46: Yutulduğunda derhal tıbbi yardım alınız ve bu konteynırı veya etiketi gösterin. Bu bileşen çamaşır suyu içeren dezenfeksiyon ajanlar ile kullanılmamalıdır. AW2 tampon (E) ve proteaz çözücü (H) koruyucu olarak % 0.04 Sodyum Azide içerir. Proteaz (G) subtilisin içerir. R37/38: Deri ve solunum sistemini tahriş edicidir. R41: Göze ciddi hasar riski. R42: Solunduğunda hassasiyete neden olabilir. S22: Tozlarını solumayın. S24: Cilt ile temasından sakının. S26: Göz ile temasında derhal bol su ile yıkayın ve doktora başvurun. S36/37/39: Çalışırken uygun koruyucu giysi, koruyucu eldiven, koruyucu gözlük / maske kullanın. S46: Yutulması halinde hemen bir doktora başvurun, kabı veya etiketi gösterin. Reaktiflerin cilde temasından kaçının. Eğer temas olursa bol miktarda su ile hemen yıkayın. Reaktifler kullanıldığında eldiven giyin. 8. Internal kantifikasyon standartlar ve kontroller Not 1 : 530 nm = ABI, Stratagene ve Versant kpcr Moleküler Sistemi AD platformları üzerindeki "FAM" okuma kanalına karşılık gelir, oysa Rotor-Gene e "Yeşil" karşılık gelir. Şu ana kadar sadece terim 530 nm kullanılacaktır. 560 nm = ABI platformlarına VIC okuma kanalına, Rotor-Gene Yellow okuma kanalına, Stratagene ve Versant kpcr Moleküler Sistemi AD platformları «Hex» okuma kanalına karşılık gelir. Şu ana kadar sadece terim 560 nm kullanılacaktır. Not 2 : CT = ABI, Rotor-Gen ve Stratagene ve Versant kpcr Moleküler Sistemi AD platformlar için Crossing Threshold. Bu terim LightCycler platformları için CP (Crossing Point) e karşılık gelir. Şu ana kadar sadece terim CT veri sayfası ile kullanılacaktır. UYARI: Numuneler ve kontrolleri eklemek için sıra takip edilmelidir (konu 11.2 bakın). 8.1 INTERNAL KANTİFİKASYON STANDARTLARI (QS1, QS2, QS3, QS4) İnternal kantifikasyon standart aralığının kullanımı numune kantifikasyonu için zorunludur. Kantifikasyon standartlar (QS1-4) termocyler ile sağlanan yazılımda standart bir eğri üretmek için kullanılır. Her kantifikasyon standartları 5 000 copies/μl (QS1) ile 5 copies/μl (QS4) aralığındadır. Kantifikasyon standartları standart olarak belirlenmiştir ve onların değerleri örnek analiz yazılım tablosunda tanımlandığında girilmelidir. 8.2 KANTİFİKASYON STANDART (QS3) Kantifikasyon standart QS3 ilk çalışmada oluşturulan standart eğrinin alımını sağlar. Böylece, CMV viral yükünü ölçmek için yeni bir çalışma yapıldığında her zaman kantifikasyon standart (QS3) kullanarak sadece yeni bir standart eğri üretebilirsiniz. Standart eğrisinin alımı AYNI lotlu reaktifler ile çalışmadan çalışmaya sadece kullanılacak bir kantifikasyon yöntemidir. Dört kantifikasyon standartları ile standart eğri tanımlanan çalışmalar arasındaki periyot ve alınmış standart eğri kullanılarak yapılan çalışma 3 aydan fazla olmamalıdır.

ABI, Stratagene ve Versant kpcr Moleküler Sistemi AD real time PCR cihazları standart eğrisinin dışalımına izin vermez. 8.3 DUYARLILIK KONTROLÜ (SC) Duyarlılık kontrolü (SC) testin performansını doğrular ve bir çalışma-kontrolü olarak kabul edilmelidir. Duyarlılık kontrolü (SC) R5 amplifikasyon premiks ile amplifiye edilir. Sistematik olarak test edilmiş olan duyarlılık kontrolü (SC) zayıf bir negatif örnek ile eşdeğerdir. Bu nedenle, zaman zaman negatif olarak görünebilir. 8.4 EKSTRAKSİYON+ INHİBİSYON KONTROL 8.4.1 Numune ekstraksiyon+inhibasyon kontrol (IC2 numune) Bir internal kontrol (IC2) den oluşan bu kontrol ekstraksiyon öncesi örneğe eklenmelidir ve hem ekstraksiyonun etkinliğini hem de olası inhibitörlerin varlığını tespit edilmesini kontrol eder. IC2 numunesinin sinyal okuması 560 nm dir. 8.4.2 Referans ekstraksiyon+inhibasyon kontrol (IC2W0) Bu kontrol, negatif ekstraksiyon kontrolü (W0) eklenecek iç kontrolden (IC2) oluşur ve bir referans (IC2W0) elde etmek için hasta örnekleri ile aynı zamanda amplifiye edebilir ve ekstre edebilir. Sonuçlar hasta numunelerinin (IC2sample) ekstraksiyon+inhibisyon kontrolü ile karşılaştırılmalıdır. IC2W0 sinyal okuması 560 nm dir. 560 nm de hem IC2W0 hem de IC2 numune kontrollerin CT (Crossing Eşiği) değerlerinin karşılaştırılması ekstraksiyon etkinliğini değerlendirmek için ve olası bir inhibitörlerinin varlığını tespit etmek için kullanılır. 8.5 NEGATIF KONTROLLER 8.5.1 Negatif ekstrasksiyon+ amplifikasyon kontrol (IC2W0) Bu bir 8.4.2 de açıklandığı gibi tam olarak aynı tüptedir (referans ekstraksiyon + inhibisyon kontrolü). Ancak, 530 nm de analiz edildiğinde bu kontrol ekstraksiyon ve amplifikasyon sırasında kontaminasyonun yokluğunu gösterir. Negatif ekstraksiyon+amplifikasyon numunenin sinyal okuması 530 nm dir. 8.5.2 Negatif amplifikasyon kontrolü Negatif amplifikasyon kontrol viral amplifikasyon premiksde (R5) amplifiye edilmiş reaktifden (R0) oluşur. Bu kontrol amplifikasyon sırasında olası bir kontaminasyonu gösterir. Bu kontrol opsiyoneldir. 530 nm de hem R0 hem de IC2W0 kontrol CT (Crossing Eşiği) değerleri olası kontaminasyondan için sorumlu deney adımını belirlemek için karşılaştırılır.

9. Örneklerin alınması ve taşınması 9.1 NUMUNE TAŞIMA Taşınacak numuneler için, zararlı ve bulaşıcı malzemenin taşınması için yerel mevzuatı kontrol edin. Örnekler sevk edilmeli ve olası en kısa sürede (tercihen 24 saat içinde) laboratuarda çalışılmalıdır. 9.2 NUMUNE TOPLAMA Örnekler laboratuvar talimatları izlenerek toplanmalı ve taşınmalıdır. 9.2.1 Kan numuneleri UYARI: Heparinize tüplerin kullanımı genik amplifikasyon analizine uyum sağlamaz. Sitrat içeren kan toplama tüpleri amplifiye edilmiş ürünlerin tespiti sırasında azalan sinyalden sorumlu olabilir. Kan EDTA tüplerinde toplanmalıdır. Laboratuvarda kan toplama ve çalışma arasındaki süre 24 saati aşmamalıdır. Kan numuneleri oda sıcaklığında (+18 C/+25 C) laboratuvara gönderilmelidir. 9.2.2 Plazma numuneleri Kan EDTA içeren bir tüpte ya da kuru bir tüpte toplamalıdır. 20 C de 10 dakika 1200xg de tüpü santrifüj edin. Maksimum 2 ml (en az 200μL) plazmayı soğuk tüplerde biyolojik güvenlik kabini altında boşaltın. Plazma oda sıcaklığında (18 C/25 C) veya +2 C/+8 C de tercihen laboratuvara gönderilmelidir. Plazma maksimum bir hafta +2 C/+8 C de saklanmalıdır. Bir haftayı aşan gecikmede, -18 C/- 22 C'deplazma saklayın. Eğer plazma örnekleri kuru buz üzerinde laboratuvara gönderilirse, örnekler daha sonra -18 C/-22 C veya tercihen -78 C/-82 C de saklanmalıdır. 9.2.3 CSF numuneleri CSF lomber ponksiyon klasik koşulları izlenerek elde edilir. Kuru buzda gönderilen CSF,-18 C/-22 C veya tercihen -78 C/-82 C de saklanmalıdır. 9.3 NUMUNENİN KULLANIMI Ekstraksiyon adımı öncesi, otomatik bir çalkalayıcı ile 10 dakika boyunca örnek tüpleri döndürerek kan örneğini homojen hale getirin. Küçük miktarlarda her kan örneği (örn: 500 μl) bir biyolojik güvenlik kabini altında eşit şekilde bölün. Bu bölünen miktarlar -78 C/-82 C de saklanmalıdır. 10. Ekstraksiyon protokolü UYARI: Ekstraksiyon prosedürüne başlamadan önce, numune ve reaktifler IC2 ve W0 homojen olduğundan emin olun. Amniyotik sıvı örneği iki kez ekstre edilmelidir: dilüsyon edilmemiş numuneden bir ekstraksiyon ve su içinde 1:100 oranında dilüsyon edilmiş numuneden alınan bir ekstraksiyon (moleküler aşama). 2 tüpün her biri ekstraksiyon ve amplifikasyon protokolünde bir numune olarak kabul edilir.

10.1 DNA EKSTRAKSİYON KİTİ İLE (ref. : 67-000 + IC2 +W0) Örnek ekstraksiyonu için ayrılmış odada +18 C/+25 C oda sıcaklığına IC2 ve W0 örnekleri dengeleyin. +18 C/+25 C oda sıcaklığına AE buffer (F) dengeleyin. AW1 tamponu (D), AW2 tampon (E) ve çözündürülmüş proteazı solüsyonunu kılavuzda verilen bölüm 6 "Reaktifleri rekonstitüsyon a göre hazırlayın. Gerekirse +70 C 'de ısıtarak AL tampon (C) daki çökeltiyi tekrar çözün ve kullanmadan önce oda sıcaklığında soğutun. Tüm santrifüj adımları oda sıcaklığında gerçekleştirilmelidir. 10.1.1. Lizis Analiz edilecek numune için 1,5 ml Microcentrifuge tüplerinden eşit sayıda belirleyin (kapakta) ve hazırlayın. Ekstre edilecek (W0+IC2) karışımı BİR tüpe ekleyin. +56 C ye termocylere ya da su banyosunu ısıtın. 1.5 ml bir mikrosantrifüj tüp içine 200 µl AL buffer (C) pipetleyin. 20 μl proteaz pipetleyin. 10µL internal kontrolü (IC2) ekleyin. W0+IC2 karışım için belirlenen tüp içine 200 µl W0 ekleyin. Numune ekstraksiyonu için belirlenen tüp içine 200 μl numune ekleyin. Numune hacmi 200 μl den az ise, PBS numuneye ekleyin. Elde edilen sonuçlar bu durumda sadece kalitatif olacaktır. 15 dakika boyunca titreşimle-vorteksleyerek karıştırın. Verimli lizis sağlamak için, örnek homojen bir solüsyon verene kadar iyice karıştırılır. +56 C de 10 dakika boyunca inkübasyon edin. Lizisin 10 dakika sonra inkübasyonu tamamlanır. Uzun inkübasyon süresinin saflaştırılmış DNA nın kalitesi veya verimi üzerinde etkisi yoktur. Potansiyel olarak enfeksiyöz ajanlar lizis adımdan sonra numune 95 C'de 15 dakika inkübe edilerek inaktive olabilir. Ancak uzayan bu inkübasyon DNA nın bozulmasına neden olur. Kapağın içindeki damlaları uzaklaştırmak için 1,5 ml mikrosantrifüj tüpünü kısa süre santrifüjleyin. 10.1.2. Yükleme adımı Numuneye 200 μl 96-100% lik etanol ekleyin ve 15 dakika boyunca pulse-vorteksleyerek karıştırın. Kısa süre santrifüjleyin. Test edilecek örnekler ile spin kolonu aynı sayıda belirleyin ve hazırlayın. Kenarlarını ıslatmadan spin kolonuna (2 ml toplama tüpünde) yukarıdaki karışımı dikkatle uygulayın. 6000xg de 1 dakika santrifüjleme ve santrifüj sırasında aerosol oluşumunu önlemek için her spin kolonunu kapatın. Eğer lizisat santrifüj sonrası kolon üzerinden tamamen geçerse, spin kolonu boşalana kadar daha yüksek hızda tekrar santrifüjleyin. Temiz bir 2 ml toplama tüp içine spin kolonu yerleştirin ve süzüntü içeren tüpü alın. 10.1.3. Yıkama Spin kolonunu dikkatlice açın ve kenarlarını ıslatmadan 500 μl AW1 tampon (D) ekleyin. Kapağı kapatın ve 6000xg de 1 dakika santrifüjleyin. Temiz bir 2 ml toplama tüp içine spin kolonu yerleştirin ve süzüntü içeren tüpü alın. Spin kolonunu dikkatlice açın ve kenarlarını ıslatmadan 500 μl AW2 tampon (E) ekleyin. Kapağı kapatın ve full hızda (12000xg) 3 dakika santrifüjleyin. Temiz bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüp içine spin kolonu yerleştirin, süzüntülü eski toplama tüpünü alın. Elüsyon öncesi full hızda (12000xg) 3 dakika santrifüjleyin. Bu adım AW2 tampon (E) etkisini ortadan kaldırır. 10.1.4.Elüsyon Spin kolonunu dikkatlice açın. UYARI : Elüsyon miktarları örneklerin içeriğine göre değişir: - Tam kan ve amniyotik sıvı örnekleri için, oda sıcaklığında dengelenmiş elüsyon tampon AE (F) ın 100 μl sini ekleyin.

- Serum, plazma veya CSF örnekleri için oda sıcaklığında dengelenmiş elüsyon tampon AE (F) ın 50 μl sini ekleyin. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inkübe edin. 6000xg de 1 dakika santrifüjleyin. Ekstre edilmiş DNA -18 C/-22 C de saklandığında bir yıla kadar stabildir. 10.2 CMV R-gene İLE DOĞRULANMIŞ EKSTRAKSİYON CİHAZI Bu ekstraksiyon cihazları nitelikli ve eğitimli personel tarafından üreticisinin önerdiği şekilde düzenli olarak çalışılmalıdır. CİHAZLAR : Kit Numune + IC2 Miktarı Numune Tipi Protokol Elüsyon miktarı Tam kan, amniyotik sıvısı 100 µl QIAcube MagNA Pure Compact MagNA Pure LC System NucliSENS easymag m2000sp Versant kpcr Molecular Sistem SP QIAamp DNA Kan Mini kit Ref: 51 104 / 51 106 MagNA Pure Compact Nükleik Asit İzolasyon Kit I Ref. 03 730 964 001 32 izolasyonlar 200 µl da amostra + 10 µl IC2 Plazma, serum, CSF Tam kan, amniyotik sıvısı Plazma, serum, CSF 50 µl Kan ve vücut sıvısı spin 100 µl protokolü V3 50 µl Tam kan DNA_Blood_100_400 100 µl Amniyotik sıvısı Toplam_NA_Plazma_100 100 µl Plazma, serum, _400 CSF 50 µl DNA I Kan_Cell Tam kan MagNA Pure DNA High Performance 100 µl İzolasyon Kit I Ref. 03 003 990 001 Amniyotik sıvısı Toplam_NA_Serum_plaz 100 µl 192 izolasyonlar Plazma, serum, ma_kan CSF 50 µl 140 µl silika ve 2 ml lizis NucliSens Tam kan tampon ile Üreticinin 50 µl Magnetik ekstraksiyon Spesifik B protokolü reaktifleri Plazma, CSF Generik/Spesifik B 50 µl Numune Hazırlama Sistemi DNA Ref. 06K12-24 Versant Numune Hazırlama 1.0 Ref. : 06496457/06496465 800 µl numune + 10 µl IC2* (ekstrat 300 µl) 400 µl numune + 10 µl IC2** (ekstrat 250 µl) Tam kan, plazma, BAL, idrar, biopises, amniotik sıvısı Plazma DNA-Kan-LL-300-150 v081507 Numune hazırlama protokolü 5 250µL (eluate 150µL) 65µL (eluate 50µL) * 800μL den daha yüksek başlangıç miktar örneklerini ekstre etmek için, IC2 reaktife aşağıdaki miktarları ekleyin: 1 başlangıç örnek miktarı için, IC2 reaktiften 1/80 th oranında ekleyin (örneğin: 1mL numune ekstre etmek için, 12.5µL IC2 reaktif ekleyin). ** 400μL den daha yüksek başlangıç miktar örneklerini ekstre etmek için, IC2 reaktife aşağıdaki miktarları ekleyin: 1 başlangıç örnek miktarı için, IC2 reaktiften 1/40 th oranında ekleyin (örneğin: 600µL numune ekstre etmek için, 15µL IC2 reaktif ekleyin).

11. Tespit ve Real Time PCR kantifikasyon protokol Not: Talimatları basitleştirmek amacıyla, amplifikasyon reaksiyon karışımı veren cihaz bir "tüp" olarak adlandırılır. UYARILAR: Hasta takibi sırasında, aynı protokolü kullanmak ve aynı ekstraksiyon ve amplifikasyon cihazı kullanmak zorunludur. Amniyotik sıvı her örneği iki kez test edilmeli: dilüe edilmemiş numuneden 1 ekstrat ve moleküler grubu suda 1:100 oranında dilüe edilmemiş numuneden 1 ekstrat (Konu 1 bakın). Tüp sayılarını belirlemek için, kontrol edin : - eğer deneyde standart eğrinin oluşumu gerekirse, (bölüm 8.2 bakın). Plan: 1\ 2 tüp \tüpler Numune başına. Amniyotik sıvı başına numune. 1 yada 4 tüp(ler) Alınmış\oluşturulmuş CMV için kantafikasyon standart eğri başına. 1 tüp CMV duyarlılık kontrolü (SC) başına. 1 tüp Referans ekstraksiyon+inhibasyon kontrol ve CMV negatif ekstraksiyon+amplifikasyon kontrol (IC2W0) için. LightCycler 1.0 için NOT: LightCycler 1.0 aynı kapilleride 2 farklı dalga boyunda tespit mümkün değildir. Bu nedenle, inhibisyon kontrol ölçümünü etkinleştirmek için, ek bir kapiller her bir örnek ile kullanılmalıdır. Bu ek kapiller aşağıdaki reaktifleri içermelidir: 10 µl ekstre edilmiş numune + IC2, 15µL DP2 premiks (DICO Extra r-gene kit, Argene, ref.: 71-101 de bulunan) ve 0.1µL Taq polimeraz (sağlanmayan). Örnek 1: LightCycler 2.0 yada Rotor-Gene kullanılarak 2 kan numunede CMV için kantitatif arama. CMV için standart eğri alınır. Amplifikasyon planı: Numune analizi için 2 tüp: 2 (numuneler+r5). CMV in kantifikasyon standart eğrisini almak için 1 tüp (QS3+R5). CMV in duyarlılık kontrolü için 1 tüp (SC+R5). CMV referans ekstraksiyon+inhibisyon kontrolü için ve CMV negatif ekstraksiyon+amplifikasyon kontrolü için 1 tüp (IC2W0+R5). Örnek 2: LightCycler 2.0 yada Rotor-Gene kullanılarak 2 amniyotik sıvı CMV için kantitatif arama. CMV için standart eğri alınır. Amplifikasyon planı: Numune analizi için 4 tüp: 2 tüp (dilüsyon edilmemiş numune+r5) ve 2 tüp (1:100th ekstre edilmiş numune + R5) CMV in kantifikasyon standart eğrisini almak için 1 tüp (QS3+R5). CMV in duyarlılık kontrolü için 1 tüp (SC+R5). CMV referans ekstraksiyon+inhibisyon kontrolü için ve CMV negatif ekstraksiyon+amplifikasyon kontrolü için 1 tüp (IC2W0+R5).

11.1 AMPLIFIKASYON PROGRAMI Real time PCR platformu kullanılır yada kullanılmazsa, amplifikasyon programı aynı kalır. Amplifikasyon programı aşağıdaki tabloda açıklanmıştır. Adımlar Zaman Sıcaklık Döngü LC1 LC2, LC480 Floresan kazanımı ABI Rotor- Gene Stratagene Versant kpcr Molecular System AD Hot Start Taq Polimeraz Aktivasyonu 15 min. 95 C 1 - - - - - Denatürasyon 10 sec. 95 C - - - - - FAM- Green- Amplifikasyon Hibridizasyon 45 530 530-560 FAM-HEX 40 sec. 60 C VIC Yellow Annealing annealing sonu Not 1: Sıcaklık geçiş oranı/eğimi 20 C/sn yada 100% kadar önceden tanımlanmıştır. Not 2 : LightCycler üzerinde, PCR ın sonunda soğutma adım: 30 sn / 40 C / 1 devir ekleyiniz Not 3: LightCycler üzerinde, programlamada 60 C a seek temperature parameter ayarlayın. Not 4: LightCycler 2 üzerinde, bir renk kompensasyon dosyanın kullanımı sonuçlarını yorumlamak için ŞART tır. Bu Colour Compensation kit r-gene (Argene ref.: 71-103) kullanılarak LightCycler 2.0 için yönetim yazılımında oluşturuldu ve kaydedildi. Not 5: LightCycler 480 üzerinde, iki optikal sistem vardır: sadece "Sistemi II" CMV R-gene kite uyumludur. "Sistemi II" yazılımda otomatik renk kompensasyon içerir. Not 6: ABI üzerinde, passive reference içinde none seçin. Not 7: Rotor-Gene üzerinde, "gain optimisation" tıklayarak sinyal kalibre edin. Not 8: Stratagene ya da Versant kpcr Molecular System AD de "referans Dye içinde "none" seçin. Her real time PCR platformu için programlama ayrıntıları istenildiği zaman mevcuttur. 11.2 AMPLİFİKASYON HAZIRLAMA Deneye başlamadan önce: - Vorteksleyerek veya pipetleyerek çözündürülmüş reaktifleri homojenize edin, sonra kısa bir süre santrifüjleyin. - Soğutma bloğu (LightCycler Santrifüj Adaptörleri) 30 dakika U.V. light altında dekontamine edildiğinden emin olun. - Soğutma bloğu (LightCycler Santrifüj Adaptörleri) +2/ +8 C de önceden soğutulduğundan emin olun. UYARI: Mümkün olduğunca kontaminasyonu önlemek için dağıtım tamamlandığında tüpleri kapatın. -18 C/-22 C'de kullanımdan sonra hemen amplifikasyon premiksi (R5) değiştirin. Tüm tüplere aynı hacimde dağıtmak için pipet ile hafifçe homojenizasyon yaparak 15 μl amplifikasyon premiks toplayın. Tüm tüplere 15 μl amplifikasyon premiks dağıtın UYARI : Numuneler ve kontrolleri eklemek için sıra takip edilmelidir. Her amplifikasyon çalışması için, ekleyin: o İlgili tüpte ekstre edilmiş numunenin 10 μl sini ekleyin. o İlgili tüplerde duyarlılık kontrolünün (SC) 10 μl sini ekleyin (bölüm 8 bakın).

o İlgili tüplerde her standardın (QS4 den QS1 e) 10 μl sini ekleyin (bölüm 8 bakın). o İlgili tüplerde ekstre edilmiş miks IC2+W0 in 10 μl sini ekleyin. Bu kontrol IC2W0 kontroldür (bölüm 8 bakın). İlgili cihazla tüpleri santrifüj edin ve sonra tüpleri termocyclera aktarın. LightCycler 1.0 için NOT: LightCycler 1,0 kullanarak yapılan bir deney için, ayrıca eklenecekler: - Numunenin(IC2sample) ekstraksiyon+inhibisyon kontrolünü oluşturmak için DICO Extra r- gene (DP2) premiksini içeren 1 tüp içine her numunenin 10 µl si eklenecek. - Referans ekstraksiyon+inhibisyon kontrolü oluşturmak için DICO Extra r-gene (DP2) premiksini içeren 1 tüp içine 10 µl (IC2W0) ekleyin. 11.3 PROGRAMI ÇALIŞTIRMA Amplifikasyon programını çalıştırın (bölüm 11.1 de açıklanan talimatlara göre saklandı) Aşağıdaki tabloya göre kontroller ve numuneler belirlenmiştir: LightCycler ABI Rotor-Gene Stratagene Mx3000PVersant kpcr Molecular System AD QS1, QS2, QS3, QS4 Standart Standart Standart Standart Numune Bilinmeyen Bilinmeyen Bilinmeyen Bilinmeyen 560 nm de IC2W0 Pozitif kontrol Bilinmeyen Bilinmeyen Bilinmeyen SC Bilinmeyen Bilinmeyen Bilinmeyen Bilinmeyen 530 nm de C2W0 Negatif kontrol NTC Bilinmeyen NTC CMV kantifikasyon için, aşağıdaki değerleri kantifikasyon standartları için girin (kopya/ml): Ekstraksiyon 200µL 50µL de elüsyon (kopya/ml) Kantifikasyon (Tam kan, plazma, serum, CSF, BAL, idrar, biyopsi, amniyotik sıvı) Ekstraksiyon 200µL 100µL de elüsyon (kopya/ml) m2000sp Ekstraksiyon 300µL 250µL de elüsyon (kopya/ml) Versant kpcr Molecular System SP Ekstraksiyon 250 µl 65µL de elüsyon (kopya/ml) QS1 1 250 000 2 500 000 4 000 000 1 250 000 QS2 125 000 250 000 400 000 125 000 QS3 12 500 25 000 40 000 12 500 QS4 1 250 2 500 4 000 1 250 12. Data Analizleri Not 1: Cihazların türleri ile sonuçların kullanımına ilişkin istenen detaylar mevcuttur. Not 2: 530 nm = ABI, Stratagene ve Versant kpcr Moleküler Sistemi AD platformları üzerindeki "FAM" okuma kanalına karşılık gelir, oysa Rotor-Gene e "Yeşil" karşılık gelir. Şu andan itibaren sadece terim 530 nm kullanılacaktır. 560 nm = ABI platformlarına VIC okuma kanalına, Rotor-Gene Yellow okuma kanalına, Stratagene ve Versant kpcr Moleküler Sistemi AD platformları «Hex» okuma kanalına karşılık gelir. Şu andan itibaren sadece terim 560nm kullanılacaktır.

12.1 LIGHTCYCLER 1.0 İLE 2 ölçüm noktasında Arithmetic modda Fit Points yöntemini kullanın. Threshold line (kırmızı) taşıyın, böylece arka plan gürültüsünün yukarısında bulunan lineer parçasında her floresan eğrisi çaprazlanır. NOT: Eğer bir düz çizgi aynı anda, kendi doğrusal kısmında bütün eğrileri çaprazlamazsa, her numune için bir CP elde etmek için gerektiği kadar çalışmayı tekrar edin. Her bir örnek için, bir CP Crossing Point 530 nm de hesaplanır. Örnekleri ölçmek için, Arithmetic modda "Second Derivative maximum" yöntemini kullanın. CMV veya HHV-6 için hesaplanan konsantrasyonu Calculated sütununda görünür (kopya/ml). 12.2 LIGHTCYCLER 2.0 İLE Viral hedef analizi Absolute Quantification modunda 530 nm de yapılmalıdır. Ekstraksiyon + inhibisyon testi Absolute Quantification modunda 560 nm de aktivasyon (Colour Compensation tab) sonunda analiz edilmelidir sonra renk kompensasyonu dosyası ile önceden oluşturulmuş uygun dosyayı seçin (Argene Colour Compensation r-gene ref: 71-103). Fit Points yöntemini kullanın. Threshold line taşıyın, böylece arka plan gürültüsünün yukarısında bulunan lineer parçasında her floresan eğrisi çaprazlanır. NOT: Eğer bir düz çizgi aynı anda, kendi doğrusal kısmında bütün eğrileri çaprazlamazsa, her numune için bir CP elde etmek için gerektiği kadar operasyonu tekrar edin. Her bir örnek için, bir CP Crossing Point 530 nm de hesaplanır. Örnekleri ölçmek için, Automated F max modu seçin (ikinci derivatif yöntem). CMV için hesaplanan konsantrasyonu Conc sütununda görünür (kopya/ml). Ekstraksiyon + inhibisyon kontroller 560 nm de referans ekstraksiyon + inhibisyon testinin (IC2W0) CP değeri ile her bir ekstraksiyon + inhibisyon kontrolü(ic2sample) için hesaplanan CP değeri karşılaştırılarak analiz edilir. 12.3 LIGHTCYCLER 480 (System II) İLE LC480 (System II) FAM - HEX otomotik kompensasyonu açın. Viral hedef 530 nm (FAM) de Absolute Quantification modunda analiz edildi. Ekstraksiyon + inhibisyon kontroller 560 nm (HEX) de Absolute Quantification modunda analiz edildi. Her pozitif numune için, bir Crossing Point (CP) 530 nm de hesaplandı. Ekstraksiyon + inhibisyon kontroller 560 nm de referans ekstraksiyon + inhibisyon testinin (IC2W0) in CP değeri ile her bir ekstraksiyon + inhibisyon kontrolü(ic2sample) için hesaplanan CP değeri karşılaştırılarak analiz edilir. 12.4 ABI (ABI StepOne ve ABI Fast içerir) İLE None, Dye reference alanında seçildiğine emin olun çünkü CMV R-gene premiks herhangi bir pasif referans florokrom içermez. Örnek Detector/target alanında FAM R-gene detektör seçildikten sonra aynı yolla analiz edilir.

Kendi lineer bölgesinde tüm örneklerin floresans eğrilerini çarpılayan bir konum için manuel olarak Manual Baseline ayarlanır. Bu adım hesaplanan CT değerine karşılık gelen pozitif örnekleri tespit etmek için yapılır. Negatif örnek SDS yazılımı tarafından CT kolonunda görüntülenen Undetermined olarak tanımlanır. İnhibisyon kontroller (IC2sample ve IC2W0) Detector/target alanında VIC R-gene seçildikten sonra aynı yolla analiz edilir. Örnekleri ölçmek için, lineer moda dönün. CMV için hesaplanan konsantrasyon her deneyin sonunda rapor basılmış ve hazırlanmış olarak görünür. Ekstraksiyon + inhibisyon kontroller 560 nm de referans ekstraksiyon + inhibisyon testinin (IC2W0) in CP değeri ile her bir ekstraksiyon + inhibisyon kontrolü(ic2sample) için hesaplanan CP değeri karşılaştırılarak analiz edilir. 12.5 ROTOR-GENE İLE Viral hedef 530 nm de Cycling A Green modunda analiz edildi. Ekstraksiyon + inhibisyon test 560 nm de Cycling A Yellow modunda analiz edildi. Threshold line (eşik çizgisi), Dynamic tubes ve Slope Correct seçildikten sonra Linear Scale modunda ayarlanmalıdır. Her bir örnek için hesaplanan konsantrasyon Quant. Results Cycling A Green penceresinde Calc Conc kolonunda (copies/ml) görünür. Ekstraksiyon + inhibisyon kontroller 560 nm de referans ekstraksiyon + inhibisyon testinin (IC2W0) in CP değeri ile her bir ekstraksiyon + inhibisyon kontrolü(ic2sample) için hesaplanan CP değeri karşılaştırılarak analiz edilir. 12.6 STRATAGENE, Mx3000PVersant kpcr Molecular System AD İLE None, Dye reference alanında seçildiğine emin olun çünkü CMV HHV6,7,8 R-gene premiks herhangi bir pasif referans florokrom içermez. Viral hedef, Hex butonu seçilmeyerek analiz edildi. Ekstraksiyon + inhibisyon kontrol Fam butonu seçilmeyerek analiz edildi. Threshold line (eşik çizgisi) Linear scale moda ayarlanmalıdır. Her bir örnek için hesaplanan konsantrasyon Quant özet tablo penceresinde Quantity kolonunda (copies) görünür. Ekstraksiyon + inhibisyon kontroller 560 nm de referans ekstraksiyon + inhibisyon testinin (IC2W0) in CP değeri ile her bir ekstraksiyon + inhibisyon kontrolü(ic2sample) için hesaplanan CP değeri karşılaştırılarak analiz edilir. 13. Sonuçların yorumlanması ve hesaplanması 13.1 TEST VALİDASYONU UYARI: Eğer aşağıdaki koşulların hepsi yerine getirilirse, test geçerlidir. Eğer durum böyle değilse, tüm numuneler ve kontroller tekrar test edilmelidir. Not: CT = ABI PRISM aralık, Rotor-Gene,Stratagene Mx3000P, Opticon ve i.cycler için Crossing Threshold. Bu terim LightCycler aralığındaki cihazlar için CP e karşılık gelir. Talimatları basitleştirmek için, sadece terim CT kullanılır.

1 ci KOŞUL: IC2W0 tespit edilebilir bir sinyal 530 nm de vermez. 2 ci KOŞUL: IC2W0 560 nm de 32 döngüye eşit olmalı ya da daha düşük olmalıdır. 3 cü KOŞUL: Standart eğrisi ve QS3. Real Time PCR Platform Değerlendirme CT QS3 CMV Standart eğrisi her bir deney için tüm 4 kantifikasyon standartları ile oluşturulur. Değerlendirme Eğim/ Verim Standart eğrisi sonraki deneyler için tüm 4 kantifikasyon standartları ile oluşturulur. LightCycler 1.0-3.917< Eğim <-3.103-3.587< Eğim <-3.208 LightCycler 2.0 / LightCycler 1.8 < Verim < 2.1 1.9 < Verim < 2.05 480 Rotor-Gene 0.8 <Verim< 1.1 0.9 < Verim < 1.05 ABi 30-35 döngü Prisme ABI -4.339< Eğim <-3.103 StepOne ve ABI Fast Stratagene MX3000P Versant kpcr 0.8< Verim < 1.1 Uygulanamaz Moleküler Sistem AD Opticon -3.917< Eğim <-3.103 => Eğer TÜM bu koşullar yerine getirilirse, sonuçlar analiz edilecek numune ile elde edilebilir. 13.2 SONUÇLARIN YORUMLANMASI Her bir örnek tek tek analiz edilmelidir. Pozitif bir örnek bir CT değerini gösterir. Eğer bir CT değeri hesaplanamazsa, örnek negatif veya inhibe ve/veya yetersiz ekstrat olarak kabul edilmektedir. 13.2.1 Amniyotik sıvı için İlk adım: Dilüsyon edilmemiş numune analizi DİLÜE EDİLMEMİŞ NUMUNE IC2örnek CMV uygun/ +/- uygun değil * + uygun - uygun SONUÇ 1 Pozitif olarak doğrulanmış numune. Doğrulanmış kantifikasyon. Negatif olarak doğrulanmış numune. İkinci adım: 1:100 analiz oranında dilüe edilmiş numune 1:100 E DİLÜE EDİLMİŞ NUMUNE IC2örnek SONUÇ 2 CMV uygun/ +/- uygun değil * + uygun Tamamlayıcı analizi gerekli değil Pozitif olarak doğrulanmış numune. 1:100 e dilüe edilmiş numunenin kantifikasyonu doğrulanır.

- Uygun değil elde etmek için, tamamlayıcı analizine + Uygun değil bakın (1:100 e seyreltilmiş numunenin - Uygun analizi) - Tamamlayıcı analizine bakın (1:100 e seyreltilmiş numunenin analizi). Uygun değil + Uygun + Uygun değil - uygun - Uygun değil Pozitif olarak doğrulanmış numune. Kantifikasyon sonuçlarını elde etmek için, ekstre edilmiş DNA yı (konsantre numuneden ekstre edilmiş DNA ve 1:100 e dilüe edilmiş numuneden ekstre edilmiş DNA) 1:10 a seyreltin ve amplifikasyon adımını bir kez tekrar edin. Pozitif olarak doğrulanmış numune. 1:100 e dilüe edilmiş numunenin kantifikasyonu doğrulanır. Pozitif olarak doğrulanmış numune. Kantifikasyon sonuçlarını elde etmek için, ekstre edilmiş DNA yı (konsantre numuneden ekstre edilmiş DNA ve 1:100 e dilüe edilmiş numuneden ekstre edilmiş DNA) 1:10 a seyreltin ve amplifikasyon adımını bir kez tekrar edin. Klinik numune inihibitör ajanlar içerir. Bir kez daha dilüe edilmemiş numuneden ekstraksiyon adım gerçekleştirin. Klinik numune inihibitör ajanlar içerir. Bir kez daha dilüe edilmemiş numuneden ve 1:100 e dilüe edilmiş numuneden ekstraksiyon adımını gerçekleştirin. *IC2örnek uygun: CT [IC2numune] CT [IC2W0] + 3 döngü *IC2örnek uygun değil: CT [IC2numune]> CT [IC2W0] + 3 döngü WARNING: Eğer geçerli kantifikasyon numunenin dilüsyonunun (1:10 yada 1:100 yada 1:1000) başlaması ile elde edilirse, dilüe edilmiş numune dilüsyon faktörüne restore edilmiştir (x10, x100 yada x1000).

13.2.2 Diğer örnekler için Ekstraksiyon+Inhibasyon kontrol (IC2numune) Numune CMV CT [IC2örnek] CT [IC2W0] + 3 döngü INHİBE OLMAYAN NUMUNE ve doğru şekilde ekstre edilmiş Hesaplanamamış Hesaplanan CT CT Doğrulanmış kantifikasyon Negatif olarak doğrulanmış numune CT [IC2örnek]> CT [IC2W0] + 3 döngü INHIBE NUMUNE ve/veya zayıf şekilde ekstre edilmiş Hesaplanamamış Hesaplanan CT CT Kantifikasyonu tekrar yapın Geçersiz Pozitif olarak doğrulanmış numune UYARI: Negatif bir numune durumunda: Eğer eğrinin eğimi son floresans IC2W0 kıyasla son flüoresansın ( % 50) bir düşüşüne neden olursa, zayıf bir inhibisyon mümkündür. Örneğin tekrar test edilmesi ve ekstre edilmesi önerilir. IC2 IC2Sam ÖNEMLİ NOTLAR: log 10 raporlama biçiminin kullanılması önerilir. İki kantifikasyon sonucu eğer her iki değer arasındaki fark en az 0.5 log 10 den daha yüksekse faklı olarak kabul edilir ve bu sonuçlar ekstraksiyon ve amplifikasyon için aynı cihaz ve aynı ekstraksiyon kullanılarak elde edilir. Hastanın viral durumunu tanımlamak için teşhis inceleme yöntemlerinden başka EBV R-gene kiti ile elde edilen sonuçları karşılaştırmak için gereklidir. Bu ürünün satın alınması sadece insan in vitro teşhis hizmetleri sağlamak için kullanılacak belli roche patenti altında alıcı hakları vermektedir. Alıcının kullanımının bu özel hakları dışında diğer lisans veya genel patent Argene tarafından verilmez. 14. Arıza giderme kılavuzu 14.1. Pozitif örneklerde sinyalin olmaması veya az olası OLASI NEDENLER Laboratuarda yanlış numune toplama, taşıma ve saklama ÖNERİLER Taşıma ve saklama için opsiyonel koşulları (sıcaklık zamanı) tanımlayan konu 9 bakın. Numune toplama ve analizin başlaması arasındaki gecikmeyi kontrol edin.

CMV R-gene kit koşullarının taşıma ve saklanması karşılanamadı. -18 C/-22 C 'de ve tercihen karanlıkta CMV R-gene kit 69-003B in saklanması ile ilgili bölüm 4 deki talimatları izleyin. Ekstraksiyon adımında problem Ekstraksiyon yapmadan önce numuneleri dikkatlice homojenize etmişseniz, kontrol edin. Tüm yıkama adımlarını gerçekleştirin ve DNA Ekstraksiyon kit (ref.67-000) kullanıldığında inkübasyon zamanına uyun. Bölüm 10.1 bakın. Eğer material ve protokolde CMV R-gene kit 69-003B ile analiz etmek için önerilen protokol (bölüm 10 Bkz) ve materyale karşılık gelen ekstre numune kullanılırsa, kontrol edin. Üreticinin önerileri doğrultusunda otomatik ekstraksiyon ve santrifüj sistemleri için iş istasyonlarının önleyici bakımını her zaman gerçekleştirin. Pipetlerin kalibrasyonunu kontrol edin. Numune ve reaktiflerin dağıtılmış miktarını kontrol edin. Pipetleme hatası Amplifikasyon tüplerindeki dağıtım öncesi reaktif ve numuneleri dikkatle homojen edin. Programlama hatası Bütün program verilerini kontrol edin (tespit kanalı, modu, döngü sayısı, sıcaklık ve zaman). Örneklerin giriş ile ilgili tüm adımları kontrol edin. Saklanmış standartların konsantrasyonlarını kontrol edin. Amplifikasyon adımında sorun Data analizinde hata Sonuçları yorumlamada hata Üretici tarafından önerilen real time PCR platformların performanslarını kontrol edin. Üreticinin önerileri doğrultusunda real time PCR platform ve santrifüjün önleyici bakımını her zaman gerçekleştirin. Rotor-Gene karüselin kilitleme halka ekini kontrol edin. Sınır çizgisi ayarını kontrol edin. Dışalım aralığına dayalı bir analiz durumunda, analiz için hedeflenen virüse karşılık gelen alınmış aralığı kontrol edin. Deneylerde elde edilen sonuçların doğruluğunu kontrol edin (Bölüm 13 de açıklanan bütün doğrulama koşullarını kontrol edin). LightCycler 2.0 ile: renk kompansasyon dosyası Colour Compensation r-gene (Argene ref.: 71-103) dan oluşturduğunu ve LightCycler 2.0 software de saklandığını kontrol edin. ABI ile: None, passive reference field seçilmezse, kontrol edin. Referans ekstraksiyon+inhibisyon kontrolü sonucu ile şüpheli

numunenin ekstraksiyon+inhibisyon kontrol (IC2sample) sonucunu karşılaştırın (IC2W0) (bölüm 13.2 bakın). Eğer gerekirse, ekstre edilmiş numuneyi dilüe edin. 14.2. Negatif örneklerde Floresan sinyalı OLASI NEDENLER Deney sırasında kontaminasyon ÖNERİLER Bölüm 7 deki bütün önerileri izleyin. UV ışığı ile kapiller için soğutma bloğunu dekontamine edin. Real time PCR cihazı ve otomatik ekstrakasiyon iş istasyonunun dekontaminasyonu için üreticinin önerilerine uyun. The CMV R-gene kiti sadece eğitimli personel tarafından kullanılması gerekir. Kontamine edilmiş adımı tanımlamak için ekstre edilmiş numunelere bağlı olarak kitte sağlanan R0 reaktifini kullanın. Pipetlerin kalibrasyonunu kontrol edin. Pipetleme hatası Programlama hatası Data analizinde hata Sonuçları yorumlamada hata Numune ve reaktiflerin dağıtılmış miktarını kontrol edin. Amplifikasyon tüplerindeki dağıtım öncesi reaktif ve numuneleri dikkatle homojen edin. Bütün program verilerini kontrol edin (tespit kanalı, modu, döngü sayısı, sıcaklık ve zaman). Örneklerin giriş ile ilgili tüm adımları kontrol edin. Saklanmış stardartların konsantrasyonlarını kontrol edin. Sınır çizgisi ayarını kontrol edin. Dışalım aralığına dayalı bir analiz durumunda, analiz için hedeflenen virüse karşılık gelen alınmış aralığı kontrol edin. Deneylerde elde edilen sonuçların doğruluğunu kontrol edin (Bölüm 13 de açıklanan bütün doğrulama koşullarını kontrol edin). LightCycler 2.0 ile: renk kompansasyon dosyası Colour Compensation r-gene (Argene ref.: 71-103) dan oluşturduğunu ve LightCycler 2.0 software de saklandığını kontrol edin. ABI ile: Hiçbiri pasif referans alanda seçilmezse, kontrol edin. Referans ekstraksiyon+inhibisyon kontrolü sonucu ile şüpheli numunenin ekstraksiyon+inhibisyon kontrol (IC2sample) sonucunu karşılaştırın (IC2W0) (bölüm 13.2 bakın). Eğer gerekirse, ekstre edilmiş numuneyi dilüe edin.

15. Testin performansı UYARI: CMV R-gene kitinin açıklanan performansları ekstraksiyon sistemleri ve PCR cihazları önerilen kullanımları için yalnızca garanti edilebilir. 15.1 CMV R-GENE İN INTRA- VE INTER-TEST TEKRARLANABİLİRLİĞİ CMV R-gene testin intra-test ve inter-test tekrarlanabilirliği farklı numuneler üzerinde yapılan çalışmalar sayesinde test edilir. Deney 7 kez tekrar edilir. Aşağıdaki tablolar: çalışmaların her çeşidi için elde edilen varyasyon katsayısı yanında her bir örnek için elde edilen ortalama CT yi gösterir. Varyasyon katsayısı intra-test ve inter-test tekrarlanabilirliği için sırasıyla % 0,21 den % 1,77 a ve 1.22% 'den 3.83% a değişmektedir. Intra-test tekrarlanabilirliği Average Ortalama CP / CT Standard deviation Coefficient of variation 10 000 cp/ml 35.39 0.627 1.77% 200 000 cp/ml 31.2 0.095 0.3% 1 500 000 cp/ml 28.72 0.06 0.21% Inter-test tekrarlanabilirliği Average Ortalama CP / CT Standard deviation Coefficient of variation 10 000 cp/ml 34.43 1.317 3.83% 200 000 cp/ml 34.55 0.641 2.03% 1 500 000 cp/ml 28.89 0.352 1.22% 15.2 CMV R-GENE İN ANALİTİK DUYARLILIĞI CMV R-gene kit in analitik duyarlılığı CMV pozitif örnekler ile sınırlı bir dilüsyon yöntemi ile değerlendirilmiştir. CMV R-gene kit ile CMV tespitinin eşiği tam kanın 150 kopya/1 ml sin dan daha azdır (3 kopya / PCR karşılık gelen) dir. 15.3 CMV R-GENE İN ANALİTİK ÖZGÜLLÜĞÜ CMV R-gene primerler ve probların özgüllüğü şu virüsler üzerinde test edilmiştir: - Human Herpesvirus: HSV-1, HSV-2, VZV, CMV, HHV-6, HHV-7, HHV-8. - Human Polyomavirus: JCV ve BKV. - Adenovirus 12. Bu virüslerin hiçbiri testin özgüllüğü kanıtlayan CMV R-gene kiti ile amplifiye edilmemiştir. NOT: İnsan dizilerini amplifiye etmeyen CMV R-gene testini kanıtlamak için ilave testler CMV negatif kan örnekleri ve insan numuneleri üzerinde gerçekleştirilmiştir. 15.4 KLİNİK ÇALIŞMA 1- Caen Hastanesin (Fransa) de Viroloji Bölümünde test edilmiş 117 tam kan örneğinde yapılan retrospektif klinik çalışma. Örneklerin çoğunluğu böbrek nakli olan hastalardan toplanmıştır. Örnekler daha önce CMV ppul83 antigenemia yöntemi ile karakterize edildi (Cinakit, Argene). CMV DNA örnekleri DNA EXTRACTION Kit (ref. : 69-003, Argene sağlanan) kullanılarak ekstre edilir, daha sonra rutin laboratuar real time PCR ve CMV R-gene kit (Argene ref.: 69-003) ile LightCycler 1.0 de aynı anda test edildi.

Total CMVppUL83 antigenemia test ve CMV R-gene ile elde edilen sonuçların karşılaştırılması: Sonuçların 79 % u uyumludur. CMV R-gene Antigenemia ppul83 Cinakit Argene + - + 86 20 106-4 7 11 90 27 117 CMV R-gene kiti CMV antigenemia testinden daha erken bir CMV tespiti sağlar ve bu sonuçlar bu kit çalışması ile onaylanır. Uyumsuz sonuçların bir kısmının analizi CMV R- gene kit ile elde edilen sonuçlarla in-house real time PCR ile elde edilen sonuçlar karşılaştırarak yapıldı. Her iki yöntem ile sonuçların karşılaştırılması aşağıdaki tabloda görüntülenir. İn-house real time PCR ve CMV R-gene ile elde edilen sonuçların karşılaştırılması: CMV R-gene Total In House Real Time PCR + - + 105 1 106-7 4 11 112 5 117 Sonuçların 93% u uyumludur. Bu karşılaştırma onaylamayı şunlar sağlar: -CMV R-gene ile 20 pozitif örneklerin 19 u daha önce CMV antigenemia Cina kit ile negatif olarak test edildi. - CMV antigenemia Cinakit (1 pozitif çekirdek/200 000 hücre ) ile 1 pozitif örnek - Her iki real time PCR test ile 1 negatif örnek. Cinakit ve CMV R-gene arasında 4 uyumsuz sonuçlar (2 örnek < 5 çekirdek/200 000 hücre ve 2 örnek > 5 çekirdek/200 000 hücre) in-house real time PCR kullanılan zayıf pozitif örnektir (< 3 100 kopya/ml). Sonraki 4 numune 3 test kullanılarak tekrar test edilecektir. Bunlara karşılık gelen inhibisyon kontrol klinik arka plan hesaba katılarak analiz edilecektir. 3 test ile elde edilen pozitif örneklerin kantitatif analizi Argene kiti ve antigenemia ppul83 testi ile elde edilen ölçümlerin karşılaştırılması, değerlerin relatif bir dağılımını gösterir.

Diğer taraftan, iki real-time PCR teknikleri kullanılarak elde edilen ölçümlerin karşılaştırılması çok daha iyi bir korelasyon gösterir. Yaklaşık 0,7 log un bir ölçüm farkı Caen ve Argene teknikleri arasında aşağıdaki şekilde gösterildiği gibi açıkça görünür. 2 - St Louis Hastanesin (Paris, Fransa) de Viroloji Bölümünde test edilmiş 218 tam kan örneğinde yapılan klinik çalışma. Örnekler kemik iliği nakli olan hastalarından toplanmıştır. Viral DNA örnekleri MagnaPure LC cihazı kullanılarak ekstre edilir, daha sonra rutin laboratuar real time PCR ve CMV R-gene kit (Argene ref.: 69-003) ile ABI PRISM 7500HT de aynı anda test edildi. İn-house real time PCR ve CMV R-gene ile elde edilen CMV sonuçlarının karşılaştırılması: Kantitatif sonuçların 96% sı uyumludur. CMV HHV,6,7,8 R-gene In House Real Time PCR + - + 73 1 74-7 137 144 CMV R-gene li tüm 7 negatif sonuçlar ancak in house real time PCR lı pozitif sonuçlar düşük viral yüklü örneğe karşılık gelir (413 kopya/ml den daha az). 500 kopya/ml olan CMV R-gene duyarlılık eşiğini hesaba katarak, 500 kopya/ml altında olan viral yüklü örnek üzerinde negatif sonuçları elde etmek statik olarak mümkündür. Bir örnek (289 kopya/ml) CMV R-gene ile pozitif ancak in-house real time PCR ile negatif test edildi.

Kantifikasyon grupları kullanılarak CMV sonuçlarının analizi. Kantifikasyonun CMV grubunun 95.41% (208/218) si uygundur. Tüm çelişkili sonuçların analizi in-house real time PCR ve CMV R-gene arasında 0.5 log dan daha az kantifikasyon farkını gösterir. CMV R-gene kitinin intra ve inter test tekrarlanabilirliği hesaba katılarak, 2 sonuç arasında 0.5log in farkı anlamlı olarak kabul edilemez. CMV HHV6,7,8 R-gene ve in house real time PCR test arasında CMV kantifikasyon farkı: Kantifikasyon RT-PCR Laboratuvarı CMV HHV6,7,8 R-gene Delta Log Kopya/ml Log Kopya/ml Log 2100 3,32 3131 3,50-0,17 2935 3,47 4212 3,62-0,16 16 549 4,22 33 862 4,53-0,31 21 700 4,34 35 602 4,55-0,22 23 151 4,36 58 593 4,77-0,40 24 629 4,39 38 474 4,59-0,19 32 056 4,51 11 912 4,08 0,43 158 391 5,20 424 381 5,63-0,43 206 004 5,31 630 596 5,80-0,49 231 817 5,37 317 915 5,50-0,14 2 test CMV genomunun 2 farklı bölgede amplifiye edilmiş olmasına rağmen, her iki testte elde edilen CMV sonuçları tamamen uyumludur. 3- Toulouse Hastanesi (Fransa) Viroloji Bölümünde test edilmiş 74 tam kan örneğinde yapılan retrospektif klinik çalışma. Örneklerin büyük kısmı böbrek nakli olan hastalarda toplanmıştır. Örnekler daha önce in house real time PCR* ile karakterize edildi. CMV DNA örnekler DNA EXTRACTION KIT (ref. : 69-003 sağlanan, Argene) kullanılarak ekstre edildi sonra CMV R-gene kit (Argene ref. : 69-003) ile LightCycler 2.0 de test edildi. *Real-Time PCR test tarafından tam kanda İnsan Sytomegalovirus DNA ın otomatik Ekstraksiyonu ve Kantifikasyonu (Mengelle et al. J Clin Microbiol 2003, 41, 3840-3845)