BK VIRÜS R-gene REF REF B

BK VIRÜS R-gene REF 69-013 REF 69-013B BİLEŞİM: REF 69-013 Extraction Kit, DNA EXTRACTION KIT Ref.: 67-000 Quantification Kit, BK Virus R-gene Ref.: 69-013B 1. Kit Tanımı 2 2. Kullanım amacı 2 3. Test Prensibi 2 4. Kit içeriği ve saklama koşulları 3 5. Kit içeriğinde bulunmayan fakat gerekli reaktif ve materyaller 4 6. Reaktiflerin rekonstitüsyonu 5 7. Uyarı ve Önlemler 5 8. İnternal kantifikasyon standartları ve kontrolleri 6 9. Örneğin işlenmesi ve taşınması 7 10. Örnek ekstraksiyon protokolü 8 11. Tespit ve Real Time kantifikasyon protokolü 9 12. Data analizleri 11 13. Sonuçların doğrulanması ve yorumlanması 13 14. Arıza giderme 14 15. Test performansı 16 16. İlgili ürünler 19 17. Referanslar 19 Sayfa 1 / 23

1. Kit tanımı BK virüs özellikle insan nüfusuna bulaşan papovaviridae ailesine ait bir polyomavirüsdür (seroprevalansı 60 ile 100%). Birincil enfeksiyon asemptomatiktir ve erken çocukluk çağında solunum yolu ile yayılır. Daha sonra, virüs gibi böbrek ve urothelium gibi latensin ilk alanına göç eder. Genel olarak, idrarda BK virüsün görülme sıklığı % 0.3 ile% 6 arasındadır, ama bu yayılma immünosupresyon düzeyi ile artar. Semptomların reaktivasyonu idrar yolu enfeksiyonu ile ilişkilidir ve hemorajik sistit (böbrek nakli hastalarında), üretral darlık, tubulo-interstisyel nefropati ve interstisyel nefritte (kemik iliği nakli hastalarında) kendini gösterir. Interstisyel nefrit böbrek tropism enfeksiyonunda gelişir ve organ reddine neden olabilir. Bu aşamada virüs daha sonra hem kan hem de idrar örneklerinde tespit edildi. Bir virolojik tanı spesifik virüs için bir arama ile elde edilir. Serolojik tanı yalnızca polyomavirus antikorların yüksek seroprevalansı nedeniyle sınırlı bir uygulamaya sahiptir. Elektronik mikroskopi ve idrar sitolojisi yerine koymak için ana teknikler kalır. BK Virus R-gen kit viral DNA ekstraksiyonu sonrası Real Time PCR da BK virüsünün miktar tayinini sağlar. BK virüs R-gen kullanımı kolaydır ve komplet kittir ve bu nedenle rutin teşhis için idealdir. Kit çok sayıda DNA saflaştırma sistemleri (otomatik ve manuel) ve amplifikasyon platformları ile birlikte örneğin birçok türünde klinik olarak doğrulanmıştır. R-gene kitlerinin tüm aralığı için genel bir amplifikasyon programı sayesinde numune analizi aynı anda tüm diğer DNA virüsleri için çalıştırılabilir: JC Virus r-gene Primers/Probe (ref.: 71-004), Adenovirus R-gene kit (ref.: 69-010B) ile Adenovirus, CMV R-gene kit (ref.: 69-003B) ile CMV, CMV HHV6,7,8 R-gene kit (ref.: 69-100B) ile CMV, HHV-6, HHV-7 ve HHV-8, EBV R-gene kit (ref.: 69-002B) ile EBV, HSV1 HSV2 VZV R-gene kit (ref.: 69-004B) ile HSV-1, HSV-2, ve VZV dir. Sonuçlar kit ile verilen (iç ekstraksiyon kontrolü de dahil olmak üzere) gerekli tüm kontroller doğrulanır. 2. Kullanım Amacı BK Virus R-gen tam kan, plazma ve idrar örneklerinde BK virüsünün viral yükünü ölçer. Viral yük kitle sağlanan bir kantifikasyon aralığı kullanılarak ölçülebilir. Viral DNA, Real Time PCR amplifikasyon öncesi ekstre edilmelidir. Biyolojik araştırmanın (tıbbi görüntüleme, biyokimyasal ve immünolojik analizi, vb) diğer yöntemlerle kombinesi, kit BK Virus R gene TM ile elde edilen sonuçları terapötik etkinliğini arttırmak için ve ilerlemesini takip etmek için olanak sağlar. BK Virus R-gene kit ile BK virüs miktarı, JC Virus grene Primers/Probe (ref. : 71-004) ile JCV tespiti, EBV R- gene kit (Argene, ref.: 69-002) kullanarak viral yük ölçümü ile, Adenovirus R-gene (Argene, ref. : 69-010) kullanarak Adenovirus viral yük ölçümü, CMV HHV6,7,8 R-gene kit (Argene, ref. : 69-100) kullanarak CMV, HHV- 6, HHV-7, HHV-8 viral yük ölçümü ve HSV1 HSV2 VZV R-gene ile HSV-1, HSV-2 ve VZV yük ölçümü aynı anda yapılmalıdır. Tüm Argene Real Time PCR kitleri aynı amplifikasyon prosedürü izler ve böylece aynı anda aynı deneyde kullanılabilir. 3. Test prensibi 3.1. ÖRNEK TÜRLERİ BK Virus R-gen tam kan, plazma ve idrar örneklerinde BK virüsünün viral yükünü ölçer. Kantitatif sonuçlar kopya / ml şeklinde görünür. BK virüs için kantifikasyon aralığı 500 kopya/ml ile 1011 kopya / ml ile doğrusaldır. Sayfa 2 / 23

Sonuçlar BK Virus R-gene kitinde bulunan bir ekstraksiyon, inhibisyon, pozitif ve negatif kontrol ile doğrulanır. 87 örneği analiz etmek için tüm reaktifler BK Virus R-gene de verilir. 3.2. VİRAL DNA SAFLAŞTIRMA: Aşağıdaki DNA ekstraksiyon yöntemleri BK Virus R-gene kit ref. : 69-013B kiti ile doğrulanır: o MagNA Pure Compact Instrument (Roche Diagnostics, Ref.: 03 731 146 001) ve MagNA Pure LC System (Roche Diagnostics, ref.: 12 236 931 001). o NucliSENS easy MAG (BioMerieux, ref.: 280110). o Versant kpcr Molecular System SP (SIEMENS, ref.: 06635740). o QIAcube (Qiagen, Ref.: 9001292 / 9001293). o QIAamp DNA Mini kit (Qiagen, ref.: 51 304 / 51 306). o DNA EXTRACTION KIT (Argene, ref.: 67-000). Numune ve ekstraksiyon + inhibisyon kontrolü (IC2) içinde bulunan hedef DNA yukarıda ekstraksiyon yöntemlerinden biri kullanılarak ekstre edilir. DNA EXTRACTION KIT (Ref.: 67-000) ile kullanılan teknik, bir mikrosentrifujasyon hızı ile silika jellerin seçici bağlayıcı özellikleri ile ilişkilidir. Numune ve internal kontrol (IC2) membran üzerinde DNA bağlayıcı kapasitelerini optimize etmek için proteaz ile ilk kez parçalanır. Silika kolonunun kullanımı, DNA kaplama sonrası, kontaminasyonu elimine etmek için numunenin verimli yıkmasını sağlar. Elüsyon sonrası, DNA amplifikasyon tekniklerinde direk kullanılmak için uygundur. 3.3. REAL TİME AMPLİFİKASYON VE KANTİFİKASYON: Real-time amplifikasyonun prensibi 5' nükleaz TaqMan teknolojisi (patent n : 5210015, 5487972) kullanılarak yapılır. Amplifikasyon premiks, ekstraksiyon adımında (lizis öncesi) bir internal kontrol (IC2) için problar, primerler, her bir virüs için spesifik problar, Taq polimaraz, amplifikasyon buffer, dntp ile kullanıma hazır olarak sağlanır. Aşağıdakilerle Real Time PCR platformların aralığı BK Virus R-gene kit ref. : 69-013B ile doğrulanır: o All LightCycler. o All Applied Biosystems. o SmartCycler 2.0 o Rotor-Gene o Stratagene, Versant kpcr Molecular System AD. Ekstre edilen örnek aynı zamanda amplifiye edildi ve tespit edildi. Amplifiye edilmiş parçanın büyüklüğü 158 baz çiftidir ve StAg alında bulunur. 4 kantifikasyon standartın aralığı BK Virus R-gene kit (QS1, QS2, QS3, QS4) ile verilmiştir. Kantifikasyon standartları PCR başına plazmidin 50 kopyası ile 50 000 kopyasına uygun gelen 5 000 kopya/μl ile 5 kopya/μl aralığındadır. Kantifikasyon standartları thermocycler ile sağlanan yazılımda yeni bir standart eğri oluşturmak için kullanılır. Bilinmeyen örneklerinde BK virüs genomunun kantifikasyonu bu standart eğriden (gerekli hesaplama yazılımı PCR cihazı ile birlikte verilir) ulaşılabilir. QS3 PCR başına 500 kopya plazmide karşılık gelen 50 kopya/μl standart DNA içeren bir kantifikasyon standardıdır. QS3 önceden oluşturulmuş bir standart eğri (bölüm 8.2 de anlatılan koşullarda) almak için kullanılabilir. SC, 10 kopya/pcr a karşılık gelen μl başına 1 kopya plazmid DNA içeren bir duyarlılık kontrolüdür. Bu kontrol (SC) testin performansını doğrular ve bir çalışma-kontrolü olarak düşünülmelidir. Bir ekstraksiyon ve inhibisyon kontrolü (IC2) eğer numune iyi ekstre edilmişse ve numunede amplifikasyon inhibitörlerinin varlığı doğrulanmışsa, lizis adımını kontrol etmek için BK Virus R-gene kitinde bulunur. UYARI: Kitin açıklanan performansları sadece önerilen ekstraksiyon sistemleri ve PCR cihazları için garanti edilebilir. Hasta takip boyunca, aynı protokolü kullanmak ve aynı ekstraksiyon ve amplifikasyon cihazını kullanmak zorunludur. Sayfa 3 / 23

4. Kit içeriği ve saklama koşulları 4.1. DNA IN SAFLAŞTIRILMASI İÇİN DNA EKSTRAKSİYON 67-000 Kit başına ekstraksiyon sayısı: 50 A QIAamp Mini column... 5 x 10 B Collection tubes (2 ml)... 2 x 50 C AL buffer Xn - HARMFUL... 12 ml D AW1 buffer (concentrated) Xn - HARMFUL... 19 ml E AW2 buffer (concentrated)... 13 ml F AE buffer... 12 ml G QIAGEN protease Xn - HARMFUL... 24 mg H Protease solvent... 1.2 ml Bu kit kutu üzerinde yazılı son kullanım tarihine kadar +2 C/+8 C de açılmadan önce ve açıldıktan sonra saklanabilir. Yüksek sıcaklıkta saklamadan kaçının. Çözündürülmüş QIAGEN proteaz, tekrarlanan donma/çözündürmeyi önlemek için -18 C/-22 C 'de eşit miktarlarda saklanabilir. 4.2. REAL TIME KANTİFİKASYON KIT BK Virüs R-gene 69-013B Test sayısı: 90 W0 IC2 R0 QS1 QS2 QS3 QS4 SC R13 Ekstraksiyon için su (Molecular grade)....2 x 1.8 ml Internal Kontrol 2....0.6 ml Amplifikasyon için su (Molecular grade)....0.3 ml Quantification standard 1 BKV (5 000 kopya*/μl)...0.3 ml Quantification standard 2 BKV (500 kopya*/μl)...0.3 ml Quantification standard 3 BKV (50 kopya*/μl)...0.3 ml Quantification standard 4 BKV (5 kopya*/μl)...0.3 ml Sensitivity control BKV (1 kopya*/μl)...0.3 ml BKV ve IC2 Amplifikasyon premiks...3x0.450 ml Kiti (ref. 69-013B), kutu üzerinde yazılı son kullanım tarihine kadar karanlıkta -18 C/-22 C de donmuş olarak açıldıktan sonra ve önce tutun. Reaktifler QS1, QS2, QS3, QS4, SC, IC2 ve W0 ilk açıldıktan önce ve sonra -18 C/-22 C de ekstraksiyon odasında saklanmalıdır. Reaktifler R13 ve R0-18 C/-22 C de premiksin hazırlanması için ayrı odada saklanmalıdır. 5. Kit içeriğinde bulunmayan fakat gerekli materyal ve reaktifler 5.1. ÖRNEK EKSTRAKSIYONU İÇİN: - DNA EXTRACTİON KİT ref. : 67-000 - QIAamp DNA Blood Mini kit (ref. : 51304/51306) - Etanol 96-100%. -Santrifüj (6 000xg. 12 000xg). -Vorteks. -Test tüpleri (1.5 ml, 2 ml).. -+56 C su banyosu. BK VİRÜS R-gene TM - ref. 69-013B ile doğrulanan diğer yöntemler Kitler QIAamp DNA Mini kit ref. : 51 304 / 51 306 MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I ref. : 03 003 990 001 Ekstraksiyon cihazları QIAcube Üreticinin talimatlarını izleyin. MagNA Pure LC System Üreticinin talimatlarını izleyin. Sayfa 4 / 23

-Aerosol filtreli steril mikropipet uçları. -Tek kullanımlık lateks veya benzeri eldivenler. MagNA Pure Compact Nucleic Acid Isolation Kit ref. : 03 730 964 001 NucliSENS easymag EasyMag Reaktifs VERSANT Sample Preparation 1.0 Reagents Ref.:06496457 Ref.:06496465 MagNA Pure Compact Üreticinin talimatlarını izleyin. NucliSENS easymag Üreticinin talimatlarını izleyin. VERSANT kpcr Molecular System SP Üreticinin talimatlarını izleyin. 5.2. Kantifikasyon kit 69-013B için: Aerosol filtreli steril mikropipet uçları. LightCycler, Applied Biosystems, SmartCycler, Rotor-Gene, Stratagene ya da Versant kpcr Molecular System AD LightCycler için LC Karusel Santrifüj veya 2mL reaksiyon tüplerine uygun tezgâh üstü mikrosantrifüj veya Applied Biosystems, Stratagene and Versant kpcr Molecular System AD için plaka santrifüj. Tek kullanımlık lateks veya benzeri eldivenler. BK Virus R-gene için doğrulanan real time PCR platformlar için kapileriler, tüpler ve mikroplakalar. Tercih edilen termocyler için uygun soğutma bloğu. U.V Light. Örnekler ve premiks dağıtımı için workstation veya pleksiglas ekran. LightCycler 2.0 sonuç yorumu için Renk Kompansasyon r-gene (Argene Ref.: 71-103). LightCycler 1.0 de bir ekstraksiyon + inhibisyon kontrol elde etmek için DICO Extra r-gene (Argene ref. : 71-101) in DP2 premiksi 6. Reaktiflerin çözündürülmesi Ekstraksiyon kiti (ref. : 67-000) ile sağlanan reaktifleri SADECE çözündürün. 6.1 Proteaz stok solüsyon hazırlama 24 mg liyofilize proteaz (G) e 1.2 ml proteaz çözücü (H) ekleyin. -18 C/-22 C de aynı hacimlerde saklayın (tekrar çözündürme ve dondurmadan kaçının). 6.2 AL tampon (C) hazırlama Kullanım öncesi çalkalayarak AL tampon (C) iyice karıştırın. AL tampon (C) karışımlı proteazı saklamayın. Eğer çökelti AL tamponunda (C) görünürse, çökelti çözünene kadar +70 C de ısıtın. AL tampon (C) +2 C / +8 C de saklandığında stabildir. 6.3. AW1 tampon (D) hazırlama +2 C/+8 C de saklayın. AW1 tampon (D) bir konsantre olarak verildi. İlk kullanım öncesi, 19 ml konsantre edilmiş tampona 25 ml etanol (96-100%) ekleyin. 6.4. AW2 tampon (E) hazırlama +2 C / +8 C de saklayın. AW2 tampon (E) bir konsantre olarak verildi. İlk kullanım öncesi, 13 ml konsantre edilmiş tampona 30 ml etanol (96-100%) ekleyin. Sayfa 5 / 23

7. Uyarılar ve önlemler 7.1 MOLEKÜLER BİYOLOJİ İŞLEMLERİ İÇİN UYARILAR VE ÖNLEMLER Kit İyi Laboratuar Uygulamaları ve moleküler biyoloji için kullanım talimatlarına uygun olarak kalifiye personel tarafından çalışılmalıdır. Amplifikasyon prosedürlerinde numunenin kontaminasyon riskini önlemek için aşağıdaki talimatlar izlenmelidir: Numune hazırlama ve amplifikasyon reaksiyonu için ayrı çalışma alanları kullanın. Laboratuvarda hareket reaktif hazırlık alanından amplifikasyon alanı yönünde olmalıdır. Her alan için pipetler ve laboratuar ekipmanlarını hazırlayın. Reaktif yada numune hazırlama alanında amplifiye bir ürünü asla başlatmayın. Kullanılan örnekler sadece bu analiz için ayrılmalıdır. Numuneler biyolojik güvenlik kabini altında hazırlanmalıdır. Farklı örnek tüpleri aynı zamanda asla açılmalıdır. Örnekleri çalışmak için kullanılacak pipetler sadece bu amaç için ayrılmalıdır. Bu pipetler filtre uçlu pozitif boşluklu pipetler veya hazırlanmış pipetler olmalıdır. Kullanılan uçların farklı türleri steril olmalıdır. Eşit miktarlardaki reaktifler için kullanılan pipetler sadece bu amaç için ayrılmalıdır. Amplifikasyon için gerekli reaktifler tek bir deney sırasında kullanılmak üzere eşit miktarlarda ayrılmıştır. 7.2 GENEL UYARILAR VE ÖNLEMLER Bulaşıcı olan tüm örnekler ve malzemeleri çalışmayın yada atmayın. Kullandıktan sonra: malzemeler, reaktifler ve atığın bulaşıcı olarak ele alınması gerekir. Bu testi gerçekleştirmeden önce tüm talimatları okuyun. Son kullanım tarihinden sonra reaktifleri kullanmayın (etiket basılmış). Yalnızca kitte bulunan reaktifleri kullanın. Diğer üreticilerin yada farklı lot numaralı kitlerin reaktiflerini değiştirmeyin. Ağız ile asla pipetlemeyin. Özel çalışma alanlarında sigara veya içecek içmeyin, yemek yemeyin. 7.3 SPESİFİK REAKTİFLER İÇİN UYARILAR VE ÖNLEMLER AL (C) tampon ve AW1 tampon (D) guanidinyum klorür içerir (kaotropik tuz) R22: Yutulursa zararlıdır. R36/38: Göz ve cilt için zararlıdır. S13: Hayvan yemi, yiyecek ve içeceklerden uzak tutun. S26: Göz ile temas halinde, derhal bol su ile yıkayınız ve tıbbi yardım isteyiniz. S36: Uygun koruyucu önlük giyin. S46: Yutulduğunda derhal tıbbi yardım alınız ve bu konteynırı veya etiketi gösterin. Bu bileşen çamaşır suyu içeren dezenfeksiyon ajanlar ile kullanılmamalıdır. AW2 tampon (E) ve proteaz çözücü (H) koruyucu olarak % 0.04 Sodyum Azide içerir. Proteaz (G) subtilisin içerir. R37/38: Deri ve solunum sistemini tahriş edicidir. R41: Göze ciddi hasar riski. R42: Solunduğunda hassasiyete neden olabilir. S22: Tozlarını solumayın. S24: Cilt ile temasından sakının. S26: Göz ile temasında derhal bol su ile yıkayın ve doktora başvurun. S36/37/39: Çalışırken uygun koruyucu giysi, koruyucu eldiven, koruyucu gözlük / maske kullanın. S46: Yutulması halinde hemen bir doktora başvurun, kabı veya etiketi gösterin. Reaktiflerin cilde temasından kaçının. Eğer temas olursa bol miktarda su ile hemen yıkayın. Reaktifler kullanıldığında eldiven giyin. Sayfa 6 / 23

8. Kontroller Not 1 : 530 nm = Applied Biosystems, Smartcycler, Stratagene ve Versant kpcr Molecular System AD platformları üzerindeki "FAM" okuma kanalına karşılık gelir, fakat Rotor-Gene e "Yeşil" karşılık gelir. Şu andan itibaren sadece terim 530 nm kullanılacaktır. 560 nm = ABI platformların VIC okuma kanalına, Smartcycler Cy3 okuma kanalına, Rotor-Gene Yellow okuma kanalına, Stratagene and Versant kpcr Molecular System AD Platformlarına «Hex» okuma kanalına karşılık gelir. Şu andan itibaren sadece terim 560 nm kullanılacaktır. Not 2 : CT = Applied Biosystems, Rotor-Gene, Smartcycler ve Stratagene, Versant kpcr Molecular System AD için Crossing Threshold. Bu terim LightCycler platformları için CP (Crossing Point) e karşılık gelir. Şu andan itibaren sadece terim CT veri sayfası ile kullanılacaktır. UYARI: Numuneler ve kontrolleri eklemek için sıra takip edilmelidir (konu 11.2 bakın). 8.1. INTERNAL KANTİFİKASYON STANDARTLARI İnternal kantifikasyon standart aralığının kullanımı numune kantifikasyonu için zorunludur. Kantifikasyon standartlar (QS1-4) termocyler ile sağlanan yazılımda standart bir eğri üretmek için kullanılır. Her kantifikasyon standartları 5 000 copies/μl (QS1) ile 5 copies/μl (QS4) aralığındadır. Sonuçların doğrusallığı Standard kantifikasyon aralığı ötesinde devam eder. BK virüs kantifikasyon 2.5.103 ile 1.1011 kopya/ml dan gelen çok iyi doğrusal oluşturur (grafiğin karşısına bakın). Kantifikasyon standartları standart olarak belirlenmiştir ve onların değerleri örnek analiz yazılım tablosunda tanımlandığında girilmelidir. 8.2. KANTİFİKASYON STANDARTLARI (QS3) Kantifikasyon standart QS3 ilk çalışmada oluşturulan standart eğrinin alımını sağlar. Standart eğrisinin alımı AYNI lotlu reaktifler ile çalışmadan çalışmaya sadece kullanılacak bir kantifikasyon yöntemidir. Dört kantifikasyon standartları ile standart eğri tanımlanan çalışmalar arasındaki periyot ve alınmış standart eğri kullanılarak yapılan çalışma 3 aydan fazla olmamalıdır. ABI, Stratagene ve Versant kpcr Moleküler Sistemi AD real time PCR cihazları standart eğrisinin dışalımına izin vermez. 8.3. DUYARLILIK KONTROLÜ (SC) Duyarlılık kontrolü (SC) testin performansını doğrular ve bir çalışma-kontrolü olarak kabul edilmelidir. Duyarlılık kontrolü (SC) R13 amplifikasyon premiks ile amplifiye edilir. Sayfa 7 / 23

Sistematik olarak test edilmiş olan duyarlılık kontrolü (SC) zayıf bir negatif örnek ile eşdeğerdir. Bu nedenle, zaman zaman negatif olarak görünebilir. 8.4. EKSTRAKSİYON+İNHİBİSYON KONTROL 8.4.1 Numune ekstraksiyon+inhibisyon kontrol (IC2numune) Bir internal kontrol (IC2) den oluşan bu kontrol ekstraksiyon öncesi örneğe eklenmelidir ve hem ekstraksiyonun etkinliğini hem de olası inhibitörlerin varlığının tespit edilmesini kontrol eder. 560 nm de sinyal okunur. 8.4.2 Referans ekstraksiyon+inhibisyon kontrol (IC2W0) İnternal kontrolden (IC2) oluşan bu kontrole ekstraksiyon öncesi negatif ekstraksiyon kontrolü (W0) eklenmelidir ve bir referans (IC2W0) elde etmek için hasta örnekleri ile aynı zamanda amplifiye edilmelidir. Sonuçlar hasta numunelerinin (IC2sample) ekstraksiyon+inhibisyon kontrolü ile karşılaştırılmalıdır. 560 nm de sinyal okunur. 560 nm de hem IC2W0 hem de IC2 numune kontrollerin CT (Crossing Eşiği) değerlerinin karşılaştırılması ekstraksiyon etkinliğini değerlendirmek için ve olası bir inhibitörlerinin varlığını tespit etmek için kullanılır. 8.5. NEGATİF KONTOLLER 8.5.1 Negatif ekstrasksiyon+ amplifikasyon kontrol (IC2W0) Bu kontrol 8.4.2 de açıklandığı gibi tam olarak aynı tüptedir (referans ekstraksiyon + inhibisyon kontrolü). Ancak, 530 nm de analiz edildiğinde bu kontrol ekstraksiyon ve amplifikasyon sırasında kontaminasyonun yokluğunu gösterir. Negatif ekstraksiyon+amplifikasyon numunenin sinyal okuması 530 nm dir. 8.5.2 Negatif amplifikasyon kontrol Negatif amplifikasyon kontrol amplifikasyon premiks ile moleküler grade su (R0) karıştırılarak hazırlanır. Bu kontrol amplifikasyon sırasında olası bir kontaminasyonu gösterir. Bu kontrol opsiyoneldir. Sinyal 530 nm okunur. Negatif amplifikasyon kontrol ve IC2W0 in 530 nm de CT (Crossing Eşiği) değeri karşılaştırması bir olası kontaminasyonu belirler. 9. Numune toplama, çalışma ve taşıma Solunum yolu örnekleri laboratuvar talimatları izlenerek elde edilmelidir. 9.1. NUMUNE TAŞIMA: Taşınacak numunelerde zararlı ve bulaşıcı malzemenin taşınması için yerel mevzuatı kontrol edin. Örnekler sevk edilmeli ve olası en kısa sürede (tercihen 24 saat içinde) laboratuarda çalışılmalıdır. 9.2. NUMUNE TOPLAMA 9.2.1 Kan numuneleri UYARI : Heparinize tüplerin kullanımı genik amplifikasyon analizine uyum sağlamaz. Sitrat içeren kan toplama tüpleri amplifiye edilmiş ürünlerin tespiti sırasında azaltılmış sinyalden sorumlu olabilir. Kan EDTA tüplerinde toplanmalıdır. Laboratuvarda kan toplama ve getirme arasındaki süre 24 saati aşmamalıdır. Kan numuneleri oda sıcaklığında (+18 C/+25 C) laboratuvara gönderilmelidir. Sayfa 8 / 23

9.2.2 Plazma numuneleri Kan EDTA içeren bir tüpte ya da kuru bir tüpte toplamalıdır. 20 C de 10 dakika 1200xg de tüpü santrifüj edin. 2 ml (en az 200μL) plazma nın maksimumu soğuk tüplerde biyolojik güvenlik kabini altında aktarılır. Plazma oda sıcaklığında (18 C/25 C) veya +2 C/+8 C de tercihen laboratuvara gönderilmelidir. Plazma maksimum bir hafta +2 C/+8 C de saklanmalıdır. Bir haftayı aşan gecikmede, -18 C/-22 C'deplazma saklayın. Eğer plazma örnekleri kuru buz üzerinde laboratuvara gönderilirse, örnekler daha sonra -18 C/-22 C veya tercihen -78 C/-82 C de saklanmalıdır. 9.2.3 İdrar numuneleri Idrar örnekleri steril bir potta (idrar sitoloji testi pot örneğin) toplanır. Laboratuvarda geldiğinde idrar çalışılmazsa, maksimum 2 C/+8 C'de bir hafta saklanmalıdır. Bu süre dışında idrar -18 C/-22 C saklanır. 10. Numune ekstraksiyon protokolü UYARI : Ekstraksiyon prosedürüne başlamadan önce, numune ve reaktifler IC2 homojen olduğundan emin olun. Örnek ekstraksiyonu için ayrılmış odada 10.1 DNA Ekstraksiyon Kit ile (ref. : 67-000 + IC2 +W0) +18 C/+25 C oda sıcaklığına IC2 ve W0 örnekleri dengeleyin. +18 C/+25 C oda sıcaklığına AE buffer (F) dengeleyin. AW1 tamponu (D), AW2 tampon (E) ve çözündürülmüş proteazı solüsyonunu kılavuzda verilen bölüm 6 "Reaktifleri rekonstitüsyon a göre hazırlayın. Gerekirse +70 C 'de ısıtarak AL tampon (C) daki çökeltiyi tekrar çözün ve kullanmadan önce oda sıcaklığında soğutun. Tüm santrifüj adımları oda sıcaklığında gerçekleştirilmelidir. 10.1.1 Lizis Analiz edilecek numune için 1,5 ml microcentrifuge tüplerinden eşit sayıda belirleyin (kapakta) ve hazırlayın. Ekstre edilecek (W0+IC2) karışımı BİR tüpe ekleyin. +56 C ye termocylere ya da su banyosunu ısıtın. 1.5 ml bir mikrosantrifüj tüp içine 200 µl AL buffer (C) pipetleyin. 20 μl proteaz pipetleyin. 10µL internal kontrolü (IC2) ekleyin. W0+IC2 karışım için belirlenen tüp içine 200 µl W0 ekleyin. Numune ekstraksiyonu için belirlenen tüp içine 200 μl numune ekleyin. Numune hacmi 200 μl den az ise, PBS numuneye ekleyin. 15 dakika boyunca pulse-vorteksleyerek karıştırın. Verimli lizis sağlamak için, örnek homojen bir solüsyon verene kadar iyice karıştırılır. +56 C de 10 dakika boyunca inkübasyon edin. Lizisin 10 dakika sonra inkübasyonu tamamlanır. Uzun inkübasyon süresinin saflaştırılmış DNA nın kalitesi veya verimi üzerinde etkisi yoktur. Potansiyel olarak bulaşıcı ajanlar lizis adımdan sonra numune 95 C'de 15 dakika inkübe edilerek inaktive olabilir. Ancak uzayan bu inkübasyon DNA nın bozulmasına neden olur. Kapağın içindeki damlaları uzaklaştırmak için 1,5 ml mikrosantrifüj tüpünü kısa süre santrifüjleyin. 10.1.2 Yükleme adımı Numuneye 200 μl 96-100% lik etanol ekleyin ve 15 dakika boyunca pulse-vorteksleyerek karıştırın. Kısa süre santrifüjleyin. Sayfa 9 / 23

Test edilecek örnekler ile spin kolonu aynı sayıda belirleyin ve hazırlayın. Kenarlarını ıslatmadan spin kolonuna (2 ml toplama tüpünde) yukarıdaki karışımı dikkatle uygulayın. 6000xg de 1 dakika santrifüjleme ve santrifüj sırasında aerosol oluşumunu önlemek için her spin kolonunu kapatın. Eğer lizisat santrifüj sonrası kolon üzerinden tamamen geçerse, spin kolonu boşalana kadar daha yüksek hızda tekrar santrifüjleyin. Temiz bir 2 ml toplama tüp içine spin kolonu yerleştirin ve süzüntü içeren tüpü alın. 10.1.3 Yıkama Spin kolonunu dikkatlice açın ve kenarlarını ıslatmadan 500 μl AW1 tampon (D) ekleyin. Kapağı kapatın ve 6000xg de 1 dakika santrifüjleyin. Temiz bir 2 ml toplama tüp içine spin kolonu yerleştirin ve süzüntü içeren tüpü alın. Spin kolonunu dikkatlice açın ve kenarlarını ıslatmadan 500 μl AW2 tampon (E) ekleyin. Kapağı kapatın ve full hızda (12000xg) 3 dakika santrifüjleyin. Temiz bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüp içine spin kolonu yerleştirin, süzüntülü eski toplama tüpünü alın. Elüsyon öncesi full hızda (12000xg) 3 dakika santrifüjleyin. Bu adım AW2 tampon (E) etkisini ortadan kaldırır. 10.1.4 Elüsyon Spin kolonunu dikkatlice açın. UYARI : Elüsyon miktarları örneklerin içeriğine göre değişir: - Tam kan ve amniyotik sıvı örnekleri için, oda sıcaklığında dengelenmiş elüsyon tampon AE (F) ın 100 μl sini ekleyin. - Serum, plazma veya CSF örnekleri için oda sıcaklığında dengelenmiş elüsyon tampon AE (F) ın 50 μl sini ekleyin. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inkübe edin. 6000xg de 1 dakika santrifüjleyin. Ekstre edilmiş DNA -18 C/-22 C de saklandığında bir yıla kadar stabildir. 10.2. Ekstraksiyon cihazı ile ve/veya BK R-gene ekstraksiyon kit ile valide edilen kitler Bu ekstraksiyon cihazları nitelikli ve eğitimli personel tarafından üreticisinin önerdiği şekilde düzenli olarak çalışılmalıdır. CİHAZLAR : Kit Numune + IC2 Miktarı Numune Tipi Tam kan, İdrar Protokol Elüsyon miktarı 100 µl QIAcube MagNA Pure Compact MagNA Pure LC System QIAamp DNA Kan Mini kit MagNA Pure Compact Nükleik Asit İzolasyon Kit I MagNA Pure DNA İzolasyon Kit I 200 µl da amostra + 10 µl IC2 Plazma 50 µl Tam kan, İdrar Plazma Tam kan, İdrar Plazma Tam kan, İdrar Kan ve vücut sıvısı spin 100 µl protokolü V3 50 µl DNA_Blood_100_400 100 µl Toplam_NA_Plazma_100_4 00 DNA I Kan_Cell High Performance 50 µl 100 µl Plazma Toplam_NA 50 µl İdrar Variable_elution_volume 100 µl Sayfa 10 / 23

NucliSENS easymag NucliSens Magnetik ekstraksiyon reaktifleri Tam kan 140 µl silika ve 2 ml lizis tampon ile Üreticinin Spesifik B protokolü 50 µl Plazma 50 µl Spesifik B İdrar 100 µl Versant kpcr Molecular Sistem SP Versant Numune Hazırlama 1.0 400 µl numune + 10 µl IC2** (ekstrat 250 µl) Plazma,İdrar Numune hazırlama protokolü 5 65µL (eluate 50µL) * 400μL den daha yüksek başlangıç miktar örneklerini ekstre etmek için, IC2 reaktife aşağıdaki miktarları ekleyin: 1 başlangıç örnek miktarı için, IC2 reaktiften 1/40 th oranında ekleyin (örneğin: 600µL numune ekstre etmek için, 15µL IC2 reaktif ekleyin). 11. Tespit ve Real Time PCR kantifikasyon protokol Not: Talimatları basitleştirmek amacıyla, amplifikasyon reaksiyon karışımı veren cihaz bir "tüp" olarak adlandırılır. UYARILAR: Hasta takibi sırasında, aynı protokolü kullanmak ve aynı ekstraksiyon ve amplifikasyon cihazı kullanmak zorunludur. Tüp sayılarını belirlemek için, kontrol edin : - eğer deneyde standart eğrinin oluşumu gerekirse, (bölüm 8.2 bakın). Plan: - Test edilen örnek başına 1 tüp - BK virüs kantifikasyon standart eğrisi oluşturmak için 1 veya 4 tüp - BK virüs duyarlılık kontrolü (SC) için 1 tüp - Referans ekstraksiyon+inhibasyon kontrolü (IC2W0) için 1 tüp ekstraksiyon ve amplifikasyon için negatif kontrol olarak da kullanıldı Not : UNG kullanıldığında, ürün Argene ref.65-001 in teknik belgede açıklanan protokol ve programına bakın. 11.1 PROGRAM: Real time PCR platformu kullanılır yada kullanılmazsa, amplifikasyon programı aynı kalır. Amplifikasyon programı aşağıdaki tabloda açıklanmıştır. Not 1: Sıcaklık geçiş oranı/eğimi 20 C/sn yada 100% kadar önceden tanımlanmıştır. Not 2 :LightCycler üzerinde, PCR ın sonunda soğutma adım: 30 sn / 40 C / 1 devir ekleyiniz. Not 3: LightCycler üzerinde, programlamada 60 C a seek temperature parameter ayarlayın. Sayfa 11 / 23

Not 4: LightCycler 2 üzerinde, bir renk kompensasyon dosyanın kullanımı sonuçlarını yorumlamak için ŞART tır. Bu Colour Compensation kit r-gene (Argene ref.: 71-103) kullanılarak LightCycler 2.0 için yönetim yazılımında oluşturuldu ve kaydedildi. Not 5: LightCycler 480 üzerinde, iki optikal sistem vardır: sadece "Sistemi II" CMV R-gene kite uyumludur. "Sistemi II" yazılımda otomatik renk kompensasyon içerir. Not 6: ABI üzerinde, passive reference içinde none seçin. Not 7: Rotor-Gene üzerinde, "gain optimisation" tıklayarak sinyal kalibre edin. Not 8: Stratagene ya da Versant kpcr Molecular System AD de "referans Dye içinde "none" seçin. Her real time PCR platformu için programlama ayrıntıları bulunur. 11.2 AMPLİFİKASYON HAZIRLAMA Amplifikasyon odası Deneye başlamadan önce: -Vorteksleyerek veya pipetleyerek çözündürülmüş reaktifleri homojenize edin, sonra kısa bir süre santrifüjleyin. -Soğutma bloğu 30 dakika U.V. light altında dekontamine edildiğinden emin olun. -Soğutma bloğu +2/ +8 C de önceden soğutulduğundan emin olun. UYARI: Mümkün olduğunca kontaminasyonu önlemek için dağıtım tamamlandığında tüpleri kapatın. -18 C/-22 C'de kullanımdan sonra hemen amplifikasyon premiksi (R13) değiştirin. Tüm tüplere aynı hacimde dağıtmak için pipet ile hafifçe homojenizasyon yaparak 15 μl amplifikasyon premiks(r13) toplayın. UYARI: Numuneler/reaktifleri eklemek için aşağıdaki sıra takip edilmelidir. o İlgili tüpte ekstre edilmiş numunenin 10 μl sini ekleyin. o İlgili tüplerde duyarlılık kontrolünün (SC) 10 μl sini ekleyin (bölüm 8 bakın). o İlgili tüplerde her standardın (QS4 den QS1 e) 10 μl sini ekleyin (bölüm 8 bakın). o İlgili tüplerde ekstre edilmiş miks IC2+W0 in 10 μl sini ekleyin. Bu kontrol IC2W0 kontroldür (bölüm 8 bakın). o İlgili cihazla tüpleri santrifüj edin ve sonra tüpleri termocyclera aktarın. 11.3 BK Virüs R-gene PROGRAMINI ÇALIŞMA Amplifikasyon programını çalıştırın (bölüm 11.1 de açıklanan talimatlara göre saklandı). Aşağıdaki tabloya göre kontroller ve numuneler belirlenmiştir: BK virüs kantifikasyon için, aşağıdaki değerleri kantifikasyon standartları için girin (kopya/ml): Sayfa 12 / 23

11. Data Analizleri Not 1: Cihazların türleri ile sonuçların kullanımına ilişkin istenen detaylar mevcuttur. Not 2 : 530 nm = Applied Biosystems, Smartcycler, Stratagene ve Versant kpcr Molecular System AD platformları üzerindeki "FAM" okuma kanalına karşılık gelir, fakat Rotor-Gene e "Yeşil" karşılık gelir. Şu andan itibaren sadece terim 530 nm kullanılacaktır. 560 nm = ABI platformların VIC okuma kanalına, Smartcycler Cy3 okuma kanalına, Rotor-Gene Yellow okuma kanalına, Stratagene ve Versant kpcr Molecular System AD Platformlarına «Hex» okuma kanalına karşılık gelir. Şu andan itibaren sadece terim 560 nm kullanılacaktır. 12.1 LIGHTCYCLER 1.0 İLE 2 ölçüm noktasında Arithmetic modda Fit Points yöntemini kullanın. Threshold line (kırmızı) taşıyın, böylece arka plan gürültüsünün yukarısında bulunan lineer parçasında her floresan eğrisi çaprazlanır. NOT: Eğer bir düz çizgi aynı anda, kendi doğrusal kısmında bütün eğrileri çaprazlamazsa, her numune için bir CP elde etmek için gerektiği kadar çalışmayı tekrar edin. Her bir örnek için, bir CP Crossing Point 530 nm de hesaplanır. Örnekleri ölçmek için, Arithmetic modda "Second Derivative maximum" yöntemini kullanın. BKV için hesaplanan konsantrasyonu Calculated sütununda görünür (kopya/ml). 12.2 LIGHTCYCLER 2.0 İLE Viral hedef analizi Absolute Quantification modunda 530 nm de yapılmalıdır. Ekstraksiyon + inhibisyon testi Absolute Quantification modunda 560 nm de aktivasyon (Colour Compensation tab) sonunda analiz edilmelidir sonra renk kompensasyonu dosyası ile önceden oluşturulmuş uygun dosyayı seçin (Argene Colour Compensation r-gene ref: 71-103). Fit Points yöntemini kullanın. Threshold line taşıyın, böylece arka plan gürültüsünün yukarısında bulunan lineer parçasında her floresan eğrisi çaprazlanır. NOT: Eğer bir düz çizgi aynı anda, kendi doğrusal kısmında bütün eğrileri çaprazlamazsa, her numune için bir CP elde etmek için gerektiği kadar operasyonu tekrar edin. Her bir örnek için, bir CP Crossing Point 530 nm de hesaplanır. Örnekleri ölçmek için, Automated F max modu seçin (ikinci derivatif yöntem). BKV için hesaplanan konsantrasyonu Conc sütununda görünür (kopya/ml). Ekstraksiyon + inhibisyon kontroller 560 nm de referans ekstraksiyon + inhibisyon testinin (IC2W0) CP değeri ile her bir ekstraksiyon + inhibisyon kontrolü(ic2sample) için hesaplanan CP değeri karşılaştırılarak analiz edilir. Sayfa 13 / 23

12.3 LIGHTCYCLER 480 İLE LC480 (System II) FAM - HEX otomotik kompensasyonu açın. Viral hedef 530 nm (FAM) de Absolute Quantification modunda analiz edildi. Ekstraksiyon + inhibisyon kontroller 560 nm (HEX) de Absolute Quantification modunda analiz edildi. Her pozitif numune için, bir Crossing Point (CP) 530 nm de hesaplandı. Ekstraksiyon + inhibisyon kontroller 560 nm de referans ekstraksiyon + inhibisyon testinin (IC2W0) in CP değeri ile her bir ekstraksiyon + inhibisyon kontrolü(ic2sample) için hesaplanan CP değeri karşılaştırılarak analiz edilir. 12.4 SMARTCYCLER 2.0 İLE Viral hedef 530 nm de FAM modunda analiz edildi. Ekstraksiyon + inhibisyon test 560 nm de Cy3 modunda analiz edildi. Her pozitif numune için, bir Crossing threshold (CT) 530 nm de hesaplandı(fam Ct). BKV için hesaplanan konsantrasyon FAM Std/Res Green kolonunda görünür. Ekstraksiyon + inhibisyon kontroller 560 nm de referans ekstraksiyon + inhibisyon testinin (IC2W0) in CT değeri ile her bir ekstraksiyon + inhibisyon kontrolü(ic2sample) için hesaplanan CT değeri karşılaştırılarak analiz edilir. 12.5 ABI (including ABI StepOne ve ABI Fast) İLE None, Passive reference alanında seçildiğine emin olun çünkü BK Virus R-gene premiks herhangi bir pasif referans florokrom içermez. Örnek Detector/target alanında FAM R-gene detektör seçildikten sonra aynı yolla analiz edilir. Kendi lineer bölgesinde tüm örneklerin floresans eğrilerini çaprazlayan bir konum için manuel olarak Manual Baseline ayarlanır. Bu adım hesaplanan CT değerine karşılık gelen pozitif örnekleri tespit etmek için yapılır. Negatif örnek SDS programı tarafından CT kolonunda görüntülenen Undetermined olarak tanımlanır. İnhibisyon kontroller (IC2sample ve IC2W0) Detector/target alanında VIC R-gene seçildikten sonra aynı yolla analiz edilir. Örnekleri ölçmek için, lineer moda dönün. BKV için hesaplanan konsantrasyon her deneyin sonunda rapor basılmış ve hazırlanmış olarak görünür. Ekstraksiyon + inhibisyon kontroller 560 nm de referans ekstraksiyon + inhibisyon testinin (IC2W0) in CT değeri ile her bir ekstraksiyon + inhibisyon kontrolü(ic2sample) için hesaplanan CT değeri karşılaştırılarak analiz edilir. 12.6 ROTOR-GENE İLE Viral hedef 530 nm de Cycling A Green modunda analiz edildi. Ekstraksiyon + inhibisyon test 560 nm de Cycling A Yellow modunda analiz edildi. Threshold line (eşik çizgisi), Dynamic tubes ve Slope Correct seçildikten sonra Linear Scale modunda ayarlanmalıdır. BKV için hesaplanan konsantrasyon Quant. Results Cycling A Green penceresinde Calc Conc kolonunda (copies/ml) görünür. Ekstraksiyon + inhibisyon kontroller 560 nm de referans ekstraksiyon + inhibisyon testinin (IC2W0) in CT değeri ile her bir ekstraksiyon + inhibisyon kontrolü(ic2sample) için hesaplanan CT değeri karşılaştırılarak analiz edilir. 12.7 STRATAGENE, Mx3000PVersant kpcr Molecular System AD İLE None, Dye reference alanında seçildiğine emin olun çünkü BK virüs R-gene kit premiks herhangi bir pasif referans florokrom içermez. Viral hedef, Hex butonu seçilmeyerek analiz edildi. Ekstraksiyon + inhibisyon kontrol Fam butonu seçilmeyerek analiz edildi. Sayfa 14 / 23

Threshold line (eşik çizgisi) Linear scale moda ayarlanmalıdır. BKV için hesaplanan konsantrasyon Quant özet tablo penceresinde Quantity kolonunda (copies) görünür. Ekstraksiyon + inhibisyon kontroller 560 nm de referans ekstraksiyon + inhibisyon testinin (IC2W0) in CP değeri ile her bir ekstraksiyon + inhibisyon kontrolü(ic2sample) için hesaplanan CP değeri karşılaştırılarak analiz edilir. 13. Sonuçların yorumlanması ve hesaplanması 13.1 TEST VALİDASYONU UYARI: Eğer aşağıdaki koşulların hepsi yerine getirilirse, test geçerlidir. Eğer durum böyle değilse, tüm numuneler ve kontroller tekrar test edilmelidir. Not: CT = Applied Biosystems, Rotor-Gene, Smartcycler ve Stratagene, Versant kpcr Molecular System AD için Crossing Threshold. Bu terim LightCycler aralığındaki cihazlar için CP e karşılık gelir. Talimatları basitleştirmek için, sadece terim CT kullanılır. 1 ci KOŞUL: IC2W0 tespit edilebilir bir sinyal 530 nm de vermez. 2 ci KOŞUL: IC2W0 560 nm de 32 döngüye eşit olmalı ya da daha düşük olmalıdır. 3 cü KOŞUL: Standart eğrisi aralığın QS3 CT 28 ve 32 döngü arasında olmalıdır. 4 cü KOŞUL: Standart aralık için eğim ve / veya verimlilik aşağıdaki tabloda listelenen değerler arasında olmalıdır. *SmartCycler ile, regresyon hattının eğimi CT = f (Giriş (konsantrasyonu)) grafikte sağa tıklanarak ve X ve Y eksenleri seçilerek elde edilir. => Eğer TÜM bu koşullar yerine getirilirse, sonuçlar analiz edilecek numune ile elde edilebilir. 13.2. SONUÇLARIN YORUMLANMASI Her bir örnek tek tek analiz edilmelidir. Pozitif bir örnek bir CT değerini gösterir. Eğer bir CT değeri hesaplanamazsa, örnek negatif veya inhibe ve/veya yetersiz ekstrat olarak kabul edilmektedir. Sayfa 15 / 23

UYARI: Negatif bir numune durumunda: Eğer eğrinin eğimi son floresans IC2W0 kıyasla son flüoresansın ( % 50) bir düşüşüne neden olursa, zayıf bir inhibisyon mümkündür. Örneğin tekrar test edilmesi ve ekstre edilmesi önerilir. IC2W0 IC2Sample ÖNEMLİ NOTLAR: log 10 raporlama biçiminin kullanılması kuvvetle önerilir. İki kantifikasyon sonuçları eğer her iki değer arasındaki fark en az 0.5 log 10 den daha yüksekse, ekstraksiyon ve amplifikasyon için aynı cihaz ve aynı ekstraksiyon kullanılarak elde edilen bu sonuçlar faklı olarak kabul edilir. Hastanın viral durumunu tanımlamak için teşhis inceleme yöntemlerinden başka BK Virus R-gene kiti ile elde edilen sonuçları karşılaştırmak için gereklidir. Bu ürünün satın alınması sadece in vitro insan teşhis hizmetleri sağlamak için kullanılacak belli roche patenti altında alıcı hakları vermektedir. Satın alıcının kullanımının bu özel hakları dışında diğer lisans veya genel patent Argene tarafından verilmez. 14. Arıza Giderme 14.1 Pozitif örneklerde sinyalin olmaması veya az olması. OLASI NEDENLER Laboratuarda yanlış numune alma, taşıma ve saklama olabilir. BK VİRÜS R-gene kitin son kullanım tarihi ve saklama koşulları uygun olmayabilir. Ekstraksiyon adımında problem Pipetleme hatası Programlama hatası Amplifikasyon adımında sorun ÖNERİLER Taşıma ve saklama için opsiyonel koşulları (sıcaklık, zamanı) belirleyen konu 9 a bakın. 18 C/-22 C 'de ve tercihen karanlıkta BK VİRÜS R-gene kit 69-013B in saklanması ile ilgili bölüm 4 deki talimatları izleyin. Ekstraksiyon yapmadan önce numuneleri dikkatlice homojenize etmişseniz, kontrol edin. Tüm yıkama adımlarını gerçekleştirin ve DNA Ekstraksiyon kit (ref.67-000) kullanıldığında inkübasyon zamanına uyun. Bölüm 10.1 bakın. Eğer önerilen protokol (bölüm 10 Bkz) ve materyale karşılık gelen ekstre numune kullanılırsa, kontrol edin. Üreticinin önerileri doğrultusunda otomatik ekstraksiyon ve santrifüj sistemleri için workstations koruyucu bakımını her zaman gerçekleştirin. Pipetlerin kalibrasyonunu kontrol edin. Numune ve reaktiflerin dağıtılmış miktarını kontrol edin. Tüplerdeki dağıtım öncesi reaktif ve numuneleri dikkatle homojen edin. Bütün program verilerini kontrol edin (tespit kanalı, modu, döngü sayısı, sıcaklık ve zaman). Örneklerin giriş ile ilgili tüm adımları kontrol edin. Saklanmış standartların konsantrasyonlarını kontrol edin. Sayfa 16 / 23

Data analizinde hata Sonuçları yorumlamada hata Üretici tarafından önerilen real time PCR platformların performanslarını kontrol edin. Üreticinin önerileri doğrultusunda real time PCR platform ve santrifüjün önleyici bakımını her zaman gerçekleştirin. Rotor-Gene karüselin kilitleme halka ekini kontrol edin. Sınır çizgisi ayarını kontrol edin. Dışalım aralığına dayalı bir analiz durumunda, analiz için hedeflenen virüse karşılık gelen alınmış aralığı kontrol edin. Deneylerde elde edilen sonuçların doğruluğunu kontrol edin (Bölüm 13 de açıklanan bütün doğrulama koşullarını kontrol edin). LightCycler 2.0 ile: renk kompansasyon dosyası Colour Compensation r-gene (Argene ref.: 71-103) dan oluşturduğunu ve LightCycler 2.0 software de saklandığını kontrol edin. ABI ile: None, passive reference field seçilmezse, kontrol edin. Referans ekstraksiyon+inhibisyon kontrolü sonucu ile şüpheli numunenin ekstraksiyon+inhibisyon kontrol (IC2sample) sonucunu karşılaştırın (IC2W0) (bölüm 13.2 bakın). Eğer gerekirse, ekstre edilmiş numuneyi dilüe edin. 14.2 Negatif örneklerde Floresan sinyalı veya klinik numunenin fazla hesaplamış miktarı OLASI NEDENLER Deney sırasında kontaminasyon Pipetleme hatası Programlama hatası Data analizinde hata Sonuçları yorumlamada hata ÖNERİLER Bölüm 7 deki bütün önerileri izleyin. UV ışığı ile kapiller için soğutma bloğunu dekontamine edin. Real time PCR cihazı ve otomatik ekstrakasiyon iş istasyonunun dekontaminasyonu için üreticinin önerilerine uyun. BK VİRÜS R-gene kiti sadece eğitimli personel tarafından kullanılması gerekir. Kontamine edilmiş adımı tanımlamak için ekstre edilmiş numunelere bağlı olarak kitte sağlanan R0 reaktifini kullanın. Pipetlerin kalibrasyonunu kontrol edin. Numune ve reaktiflerin dağıtılmış miktarını kontrol edin. Amplifikasyon tüplerindeki dağıtım öncesi reaktif ve numuneleri dikkatle homojen edin. Bütün program verilerini kontrol edin (tespit kanalı, modu, döngü sayısı, sıcaklık ve zaman). Örneklerin giriş ile ilgili tüm adımları kontrol edin. Saklanmış stardartların konsantrasyonlarını kontrol edin. Sınır çizgisi ayarını kontrol edin. Dışalım aralığına dayalı bir analiz durumunda, analiz için hedeflenen virüse karşılık gelen alınmış aralığı kontrol edin. Deneylerde elde edilen sonuçların doğruluğunu kontrol edin (Bölüm 13 de açıklanan bütün doğrulama koşullarını kontrol Sayfa 17 / 23

edin). LightCycler 2.0 ile: renk kompansasyon dosyası Colour Compensation r-gene (Argene ref.: 71-103) dan oluşturduğunu ve LightCycler 2.0 software de saklandığını kontrol edin. ABI ile: Hiçbiri pasif referans alanda seçilmezse, kontrol edin. Referans ekstraksiyon+inhibisyon kontrolü sonucu ile şüpheli numunenin ekstraksiyon+inhibisyon kontrol (IC2sample) sonucunu karşılaştırın (IC2W0) (bölüm 13.2 bakın). Eğer gerekirse, ekstre edilmiş numuneyi dilüe edin. 15. Testlerin performansı UYARI : BK Virus R-gene kitin açıklanan performansları sadece önerilen ekstraksiyon sistemleri ve PCR cihazları için garanti edilebilir. 15.1 BK Virus R-gene KITIN INTRA- VE INTER-TEST TEKRARLANABİLİRLİĞİ 15.1.1. Intra-test tekrarlanabilirliği a. Plazmada İntra-test tekrarlanabilirlik çalışması NucliSENS easymag (Biomerieux) kullanılarak ekstraksiyon sonrası ABI Prism 7500 Fast (Applied Biosystems) cihazında 10 kez analiz edilen farklı örneklerde yapıldı. QCMD 2009 yeterlilik panelinin bir örneği 1.6.104 ile 1.6.102 kopya/ml arasında viral yük elde etmek için sağlanan 10 oranlarında BKV negatif plazmada üç ardışık dilüsyon yapmak için seçildi. Tablo her bir değer için elde edilen ortalama CT yi gösterir. Referans sapma ve varyasyon katsayısı hesaplandı. Varyasyon katsayısı 0.44% ve 3.2% arasındadır. Bu değerler BK Virus R-gene kitin en iyi intra-test tekrarlanabilirliği gösterir. Aşağıdaki tablo örneklerin her biri için elde edilen ortalama miktar logs gösterir. Referans sapma ve varyasyon katsayısı hesaplandı. Varyasyon katsayısı 0.83% ve 15.97% arasındadır. Ancak, 15.97% in değişim katsayısı çok düşük bir pozitif numune elde edilmiştir. Bu değerler BK Virus R-gene kitin plazmada en iyi intra-test tekrarlanabilirliği gösterir. Sayfa 18 / 23

b. İdrarda İntra-test tekrarlanabilirlik çalışması NucliSENS easymag (Biomerieux) kullanılarak ekstraksiyon sonrası ABI Prism 7500 Fast (Applied Biosystems) cihazında 10 kez analiz edilen farklı örneklerde yapıldı. QCMD 2009 yeterlilik panelinin bir örneği 1.6.104 ile 1.6.102 kopya/ml arasında viral yük elde etmek için sağlanan 10 oranlarında BKV negatif idrarda üç ardışık dilüsyon yapmak için seçildi. Tablo her bir değer için elde edilen ortalama CT yi gösterir. Referans sapma ve varyasyon katsayısı hesaplandı. Varyasyon katsayısı 0.55% ve 3.12% arasındadır. Bu değerler BK Virus R-gene kitin en iyi intra-test tekrarlanabilirliği gösterir. Aşağıdaki tablo örneklerin her biri için elde edilen ortalama miktar logs gösterir. Referans sapma ve varyasyon katsayısı hesaplandı. Varyasyon katsayısı 1.15% ve 16.74% arasındadır. Ancak, 16.74% in değişim katsayısı çok düşük bir pozitif numune elde edilmiştir. Bu değerler BK Virus R-gene kitin en iyi intra-test tekrarlanabilirliği gösterir. 15.1.2. Plazma örneklerinde Inter-test tekrarlanabilirliği İnter-test tekrarlanabilirlik çalışması MagNA Pure Compact (Roche) kullanılarak ekstraksiyon sonrası ABI StepOne (Applied Biosystems) cihazında 10 kez analiz edilen farklı örneklerde yapıldı. Bir konsantre BKV pozitif örnek 1.105 ile 1.103 kopya/ml arasında viral yük elde etmek için sağlanan 10 oranlarında BKV negatif idrarda üç ardışık dilüsyon yapmak için seçildi. Tablo her bir değer için elde edilen ortalama CT yi gösterir. Referans sapma ve varyasyon katsayısı hesaplandı. Varyasyon katsayısı 0.61% ve 1.14% arasındadır. Bu değerler BK Virus R-gene kitin iyi inter-test tekrarlanabilirliği gösterir. Aşağıdaki tablo örneklerin her biri için elde edilen ortalama miktar logs gösterir. Referans sapma ve varyasyon katsayısı hesaplandı. Varyasyon katsayısı 1.04% ve 3.61% arasındadır. Bu değerler BK Virus R-gene kitin iyi tekrarlanabilirliği gösterir. Sayfa 19 / 23

15.2 BK Virus R-gene KITIN ANALİTİK DUYARLILIĞI Kitin analitik duyarlılığı 5.103 kopya/ml da ölçülen Accrometrix panelinden alınan BKV örneği bir dilüsyon aralığında tespit edildi. Seri dilüsyonlar önceden negatif olarak test edilen tam kan, idrar ve plazma kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Her bir dilüsyon Nuclisens easymag (biomérieux) ekstraksiyon cihazı kullanılarak 15 kez, sonra tam kan için Rotor-Gene (Corbett) cihazında ve idrar için ve plazma için ABI 7500Fast (Applied Biosystems) cihazında BK Virus R-gene kit ile amplifiye edilerek ekstre edildi. Eğriler burada görünen olasılık analizini gösterilir. Bu eğriler göstermektedir: - 65 kopya / ml de plazmada BK virüs tespitinin % 95 olasılığını - 140 kopya / ml de idrarda BK virüs tespitinin % 95 olasılığını - 260 kopya / ml de tam kanda BK virüs tespitinin % 95 olasılığını 15.3 BK Virus R-gene KITIN ANALİTİK ÖZGÜNLÜĞÜ Adenovirus primerler ve probların özgüllüğü insan polyomaviruses WUV, KIV ve özellikle Merkell Hücre ve veri bankalarında dizi analizi (virüs, bakteri ve insan diziler) yoluyla test edilmiştir. Bu analizde, hiçbir çapraz reaksiyon beklenmedi. Bu deneyler aşağıdaki virüsler üzerinde test edilmiştir - Human Herpesvirus : HSV-1, HSV-2, VZV, CMV, EBV, HHV6 - Human Adenovirus : AdV12, AdV3, AdV11, AdV5, AdV8, AdV4, AdV40 - Human Polyomavirus JCV. Bu virüslerin hiçbiri açıkça testin özgüllüğü kanıtlayan BK Virus R-gen kit ile amplifiye edilmedi. NOT: Ek testler BKV negatif örnekler üzerinde yapılmıştır. Bu testler insan dizilerini amplifiye etmeyen BK Virus R- gen testinde kanıtlandı. 15.4 QCMD PANELS 2009 DAN ALINAN 12 ÖRNEKTE YAPILAN ÇALIŞMA Avrupa JCV / BKV kontrol ürünü 2009 yılında QCMD tarafından önerilerek 12 örnek BK Virus R-gen kiti kullanılarak test edildi. MagNA Pure Compact programı DNA Kan 200/100 ektraktör kullanarak ekstre edilen her bir örnekten alınan 10μL BK Virus R-gene kitinden alınan R13 BKV amplifikasyon pre-miks ile ABI Prism 7500 Fast kullanılarak amplifiye edildi. Test edilen örneklerin % 100 (12/12) QCMD sonuçları ile uyumluluk gösterdi. Sayfa 20 / 23

Paneldeki 6 BKV pozitif örnekleri BK Virus R-gen kit ile tüm BKV pozitifleri doğrulandı. Kantifikasyona göre görülen aralıklar 0.07 log dan 0.92 loga varyasyonları ile de uyumludur. Bu sonuçlar BK Virus R-gen kitinin oldukça yüksek hassasiyetini göstermektedir. Paneldeki 6 BKV negatif örnekler JCV için pozitif olan 5 örnekte BK Virus R-gene kiti ile negatif tüm örnekler doğrulandı. Bu sonuçlar ve JCV ve BKV arasındaki çapraz reaksiyon yokluğu kit için seçilen BKV primerleri ve problarının özgünlüğünü göstermektedir. 15.5 KLİNİK ÇALIŞMA 15.5.1 Plazma ve idrarda retrospektif ve prospektif klinik çalışmalar-saint Louis Viroloji Laboratuvarı (AP- Paris) a. Prospektif çalışma Prospektif bir klinik çalışma CHU de Saint Louis viroloji laboratuvarında, 175 plazma ve 126 idrar örnekleri üzerinde yapılmıştır. Bu örnekler MagNA Pure LC (Roche) kullanılarak otomatik ekstraksiyon sonrası ABI 7500Fast (Applied Biosystems) kullanılarak analiz edildi. Bu prospektif çalışma için, örnekler bu yüzden ekstre edildi ve daha sonra BK Virus R-gen kit kullanarak ve referans tekniği kullanarak aynı ekstrat ile aynı anda test edildi. Sonuçların kalitatif analizi: İki teknik arasında % 91 uyum vardı (274/301). Her iki teknik ile 91 örnek pozitifti ve 183 negatiftir. 17 örnek referans tekniği ile pozitif ve Argene tekniği ile negatif test edilmiştir. 15 böbrek nakli hastaları ve 2 kemik iliği nakli hastalarından alınan 12 plazma ve 5 idrar örneği vardır. 17 örneğin 13 ü 100 kopya BKV / ml altında ölçüldü ve 4 ü 161 ve 305 kopya BKV / ml arasında konsantrasyonlara sahiptir. 10 örnek referans tekniği ile pozitif ve Argene tekniği ile negatif test edilmiştir. 9 böbrek nakli hastaları ve 1 kemik iliği nakli hastalarından alınan 6 plazma ve 4 idrar örneği vardır. Tüm 10 örnek 100 kopya BKV / ml altında belirlendi. Sayfa 21 / 23

Sonuçların Kantitatif analiz: Laboratuvarların real-time PCR tekniği ve BK Virus R-gen real-time PCR tekniği arasındaki sonuçların analizi iki teknik ile ölçülen tüm örneklerde (idrar ve plazma ) yapılmıştır. Bu analiz 0,97 iki teknik arasında bir korelasyon katsayısı gösterir. Regresyon çizgisi (0.94) eğimi her iki tekniğin kantifikasyonu arasında iyi bir korelasyon gösterir. Spearman s rho korelasyon katsayısı 0.9574 olarak hesaplandı, böylece iki teknik arasında mükemmel bir korelasyon gösterdi. b. Retrospektif çalışma Prospektif bir klinik çalışma CHU de Saint Louis viroloji laboratuvarında, 51 plazma ve 55 idrar örnekleri üzerinde yapılmıştır. Bu örnekler MagNA Pure LC (Roche) kullanılarak otomatik ekstraksiyon sonrası ABI 7500Fast (Applied Biosystems) kullanılarak analiz edildi. Bu retrospektif çalışma için, örnekler ekstre edildi ve daha sonra BK Virus R- gen kit kullanarak ve referans tekniği kullanarak aynı ekstrat ile aynı anda test edildi. Sonuçların kalitatif analiz: İki teknik arasında % 98 uyum vardır. Her iki teknik ile 99 örnek pozitifti ve 183 negatiftir. 1 örnek referans tekniği ile pozitif ve Argene tekniği ile negatif test edilmiştir. Bu örnek 243 kopya/ ml sahiptir. Bu böbrek nakli hastalarından alınan bir örneğine sahiptir. 1 örnek referans tekniği ile negatif ve Argene tekniği ile pozitif test edilmiştir. Bu örnek 22 kopya/ ml sahiptir. Bu böbrek nakli hastalarından alınan bir örneğine sahiptir. Sonuçların Kantitatif analiz: Laboratuvarların real-time PCR tekniği ve BK Virus R-gen real-time PCR tekniği arasındaki sonuçların analizi iki teknik ile ölçülen tüm örneklerde (idrar ve plazma ) yapılmıştır. Bu analiz 0.95 iki teknik arasında bir korelasyon katsayısı gösterir. Regresyon çizgisi (0.91) eğimi her iki tekniğin kantifikasyonu arasında iyi bir korelasyon gösterir. Spearman s rho korelasyon katsayısı 0.9574 olarak hesaplandı, böylece iki teknik arasında mükemmel bir korelasyon gösterdi(p<0.00001). Sayfa 22 / 23

15.5.2 Plazma ve idrar üzerinde klinik deneme - Saint Luc (Brüksel) Viroloji Laboratuvarı Retrospektif bir klinik çalışma CHU de Saint Louis viroloji laboratuvarında, 132 plazma ve 46 idrar örnekleri üzerinde yapılmıştır. Bu örnekler MagNA Pure Compact (Roche) kullanılarak otomatik ekstraksiyon sonrası LC480 (Roche) de analiz edildi. Bu retrospektif çalışma için, örnekler bu yüzden ekstre edildi ve daha sonra BK Virus R-gen kit kullanarak ve referans tekniği kullanarak aynı ekstrat ile aynı anda test edildi. Sonuçların kalitatif analizi: İki teknik arasında % 85 uyum vardır. Her iki teknik ile 80 örnek pozitift ve 72 negatif bulunmuştur. 4 örnek referans tekniği ile pozitif ve Argene tekniği ile negatif test edilmiştir. Bu 4 örnek düşük pozitif <1200 kopya / ml dir (referans tekniği kullanılarak kantitatif ). 22 örnek referans tekniği ile negatif ve Argene tekniği ile pozitif test edilmiştir. Bu örnek 60 ve 4000 kopya/ ml arasında zayıf pozitiflere sahiptir( Argene tekniği kullanılarak kantitatif ). 16. Referanslar 1) M. Vignoles, J. Bes, S. Magro, M. Bertrand, C. Barranger. and M. Joannes. Development of a new diagnostic tool for the detection and quantification of BK virus by real time PCR. 2010 (Milan, Italy) and CVS 2010 (Daytona, US). 2) Noah G. Hoffman,1 Linda Cook,1 Ederlyn E. Atienza,1 Ajit P. Limaye,1,2 and Keith R. Jerome Marked Variability of BK Virus Load Measurement Using Quantitative Real-Time PCR among Commonly Used Assays. Journal of Clinical Microbiology, Aug. 2008, p. 2671 2680 3) Bialasiewick S, Whiley DM, Lambert SB, Nissen ND, Sloots TP Detection of BK, JC, WU, or KI polyomavirus in faecal, urine, blood, cerebrospinal fluid and respiratory samples. Journal of Clinical Virology, jul. 2009, p. 249 254. 4) Mathur VS, Olson JL, Darragh TM, Yen TS. Polyomavirus-induced interstitial nephritis in two renal transplant recipients: case reports and review of the literature. Am J Kidney Dis. 1997 May;29(5):754-8. 5) Randhawa PS, Finkelstein S, Scantlebury V, Shapiro R, Vivas C, Jordan M, Picken MM, Demetris AJ. Human polyoma virus-associated interstitial nephritis in the allograft kidney.transplantation. 1999 Jan 15;67(1):103-9. 6) Hirsch HH, Knowles W, Dickenmann M, Passweg J, Klimkait T, Mihatsch MJ, Steiger J. Prospective study of polyomavirus type BK replication and nephropathy in renaltransplant recipients. N Engl J Med. 2002 Aug 15;347(7):488-96. 17. İlgili Ürünler JC Virus r-gene Primers/Probe Argene ref. : 71-004 DICO Extra r-gene Argene ref. : 71-101 Colour Compensation r-gene Argene ref. : 71-103 CELL Control r-gene Argene ref. : 71-106 Sayfa 23 / 23