Glikolipitler ve Zarda Yeralan Glikosillenmiş Proteinler
Hayvan hücrelerinin yüzeyleri glikokonjugatlarca zengin bir yapıdadır. Glikanlar, plazma membranı üzerinde glikolipitlerden ve glikoproteinlerden oluşan bir ağ yapısı şeklinde ve 100Å (Angström) civarında bir genişlikte gösterilmiştir. Bu ağ yapısı Glikokaliks adını alır. Glikokaliks tabakasının, transmisyon elektron mikroskobu ile yapılan ultrstrüktürel çalışmalarında mikrografları alınmıştır (Şekil 5.1, 3.20). Bu tabaka hücrenin dışını neredeyse tamamen kaplar-sarar ve hücresel arası tanımalarda rol oynar. Tıpkı çözünebilir glikoproteinlerin şekerlere bağlanması gibi, bunlarda plazma zarında yer alarak, hem hücresel tanıma bilgilerinin, hem de yapısal verilerin taşınmasına hizmet ederler.
Şekil 3.2.20 E.coli JM109 ST-pUC 19 hücrelerinin TEM Mikrografları. X91.000
Çoğu İntegral Zar Proteinleri Glikosillenmiştir Zar protein glikosilasyonunun bazı formlarını daha önce tartıştık. Burada ise zarlarda bulunan en yaygın görülen zar glikoproteinlerini inceleyeceğiz. Hücre yüzeyi ile ilişkili suda çözülebilen proteinler genellikle ekstraselüler matriksin bir parçasıdır ve plazma zarında yer alırlar. Plazma zarında yer alan en büyük protein grubu integral zar proteinleridir. Genellikle N- ve O- bağlı şekerler içerirler. Benzer glikoprotein yapılarını; salgılanan, sentez makinesi gibi görev alan ve glikanlara tutunan proteinlerde de görmek mümkündür. Bununla birlikte yapılarında polilaktozamin uzantısı-kuyrukları içeren protein yapılarıda yaygın zar glikoproteinleri arasında yer alır.
Plazma zarı yüzeyinde yer alan glikosilasyon bölgelerinin düzenlenmesi ve bu yüzeylere bağlanmasında kesin kurallar yoktur. Buna karşın genellikle belli bir dağılma - yayılma motifi gözlenir (Şekil 5.2). Yani zar proteinlerinin bir membrana yayılmalara kendi içinde bir dizilim gösterirler. Özellikle zarda katlanarak yer alan proteinlerde en az bir N- glikosilasyon bölgesi vardır. Bu bölge proteinin membrana en yakın polipeptit dizisine bağlı olarak görülür.
Özellikle zar içinde birden fazla katlanma yapan oligomerik zar proteinlerinde yer alan glikosilasyon bölgesi, hücre yüzeyinin dışına doğru, bir yaka yapısı şeklinde uzanır. Bu oligosakkaritleri içeren halkasal yapı, hücre zarına dik bir şekilde dizilmiş proteinler üzerinde bulunur. O- glikosillenmiş integral protein bölgeleri de buna benzer rol oynar. Glikanların bu şekilde, hücre yüzeyi ile yakın ilişkide olmaları hücreler arasında tanıma görevleri için hedef yapılar olmalarını sağlar (Şekil 5.2).
Zar proteinleri zara dağılmış, çoklu yapıda birimler içerir. Bu birimler genellikle N- bağlı şeker gruplarından oluşan kübik yapılı kutucuklar gibi tanımlanabilir. Genel bir kural olarak, her bir polipeptitte sadece tek bir glikosilasyon bölgesi ve yaklaşık 30 veya daha fazla amino asitten oluşan bir dairesel bir bölge-ilmek (Ring) gözlenir. Glikosilasyonda genellikle bu bölgenin N-terminal ucunda yer alan amino asitlerde gerçekleşir. Bu seçilim sadece tek bir glikosilasyon bölgesi içeren glikoproteinlerde böyle gerçekleşir. Bu bölge alabildiği ölçüde glikosilasyona uğrar. Bu durumdaki zar birimi aslında sıkıca α-heliks bağlanmış zar birimini oluşturur. Böylece şekerler o protein üzerinde bölgesel şemsiyeler-korumalar oluşturmuş olurlar.
Zarlarda yer alan Glikolipitler Hayvan hücreleri zarlarında yer alan integral proteinlere bağlanan şekerlerin bazılarının baş kısımlarında lipit grupları yer alır. Bu lipit içeren yapılara glikolipitler adı verilir. Bu yapılar zarda yer alan çift sıralı lipit yaprakları arasına gömülmüşlerdir ve iki farklı yapıda karşımıza çıkarlar (Şekil 5.3). Bunlar seramid (Ceramide) yapısı içeren glikosifingolipitler (Glycosphingolipids) dir. Burada seramit uzun zincirli amino-alkol yapısındaki sifingosinlerin (sphingosine) yağ asitlerine amid bağları ile bağlanır. Glikosifingolipitlerde, glikoproteinler gibi hücre-hücre etkileşimlerinde, tanıma molekülleri görevini görürler. Glikolipitlerin bir diğer görevi ise özel zar alt birimleri oluşturmaktır. Glikolipitlerin tersine fosfotidilgliserol (phosphatidylglycerol) çekirdek yapısındaki bu moleküller proteinlerin hücre yüzeyine çıpalanmasında görev alırlar.
Glikosifingolipitlerin iki temel alt grubu vardır. Bunlar bağlandıkları ilk şekerin galaktoz veya glukoz olmasına bağlı olarak farklılaşırlar. Öncelikli olarak bağlanan şeker galaktoz olduğunda oluşan galaktosifingolipit in (galactosphingolipid) 3. Pozisyonundaki karbona bazit bir sulfatit (sulphatide) grubu bağlanır. Glukosifingolipit (glucosphingolipids) yapısında olanlar ise proteinlerin terminal gruplarına bağlanırlar. Glikosifingolipitlerin isimlendirilmesi genellikle kafa karıştırıcı olabilir.glikosfingolipidlerin İsimlendirilmesinde Sfingo ön adı, Sfenksin eşsizliğine dikkat çekmek için eklenmiştir. bu glikolipidlerin bilinmeyen görevlerini yansıtmak için kullanıldı Ganglio Bu lipidlerin çoğu orijinal olarak beyinden izole edildiği için kullanıldı G3 Ganglio serisinin en kısa üyeleri, bir tek galaktoz birimi çekirdek glukoza bağlanmıştır G2 Bir N-asetilgalaktozamin (GalNAc) birimi eklenince oluşur G1 İlave galaktoz kalıntısıyla uzamayla oluşur G ile sayı arasında eklenen (M,D ve T gibi) harfler sialik asidin sırasıyla tek, iki ve üç olduğunu işaret eder.
Glikolipidler de gözlenen farklı çekirdek sıraları vardır. En az yedi çekirdek sırası bilinir. Neolaktositler (Neolactosides) denilen çekirdek serilerinde kendini tekrar eden birimler, Galβ1 4GlcNAc disakkarit birimleridir. Bu yapı glikoproteinlerin N-ve O-bağlı glikanları üzerinde yer alan polilaktozamin yapılarına benzer. Buna benzer yapıları, farklı çekirdek (core) yapılarında ve uzamayı sağlayan terminal rezidülerde hem glikolipitlerde hem de glikoprotein glikanlar da görmek mümkündür. Bu benzerlikler yukarıda adı geçen her iki tip glikokonjugatın terminal yapılarının detaylandırılması çalışmalarında tespit edilmiştir.
Glikosfingolipid biyosentezi Golgi Apereyinde (Aygıtında) meydana gelir. Buna göre dolikole bağlı, asparajin rezidüsüne transfer edilen, glikosfingolipit biyosentezinde ilk adım, ilk glukoz biriminin ER un sitoplazmik yüzünde bir nukleotid şeker vericisinden seramide eklenmesi ile olur. Böylece glikosfingolipit sentezini başlar (Şekil 5.4). Seramit zarın diğer tarafına döndürüldükten-atlatıldıktan sonra, farklı ve uygun nukleotit şeker vericilerinin bulunduğu Golgi sahasına geçer. Burada yeni şekerler eklenerek uzatılır.
Bunun tam tersi olarak Galaktosfingolipid biyosentezinde, ilk safha da ER zarının lümeninde gerçekleşir. Çünkü oluşan öncül yapı zardan doğrudan geçemez yada atlatılamaz. Diğer bir değişle zardan geçiş meydana gelmez. Burada farklı glikoziltransferazlara ihtiyaç duyulur. Bu aşamada kullanılan glikoziltransferazlar hücre tipine özel yapıda glikosiltransferazlardır. Dolayısıyla burada kullanılan enzimin yeteneğini hücrenin çekirdeğindeki bilgi belirler. Bununla beraber daha genel yapıya sahip, N-ve O-bağlı glikoproteinlerde sıklıkla bulunan bazı uç şekerlerin eklenmeside daha konvansiyonel (Genel-geleneksel) enzimler görev alır. Fakat çoğu durumda karşımıza glikolipid ve glikoproteinlerde belirgin modifikasyonlar (değişiklikler) oluşturan belli enzimler çıkar (Şekil 5.4).
Bundan sonraki aşamada glikolipitler, hücrenin zarla ayrılmş diğer bir değişle kesecik yapısı gösteren kompartmanlarından, hücre zarına doğru yol alır. Bu aslında genellikle zar proteinlerinin takip ettiği-izlediği yoldur. Bu iletim-taşıma sırasında birçok farklı glikolipit ayrı birimler (rafts= salkayık yapıları) içinde toplanırlar. Bu lipit taşıyıcıları şekillenmesinde görev alan birimler ve bunların oluşumuna dair moleküler yolaklar tam olarak bilinmemektedir. Jelimsi bir yapı şeklinde olan bu fosfolipit yapılı rezidüleri içeren kesecikler, sıvı fazdaki bir ortamda paketlenirler. Hücre içinde yer alan ve zara ait bu fosfolipit yapıları taşıyan kesecikler deterjanla erimeye dayanıklıdırlar.
Bu lipit taşıyan kesecikler hücrelerin apikal yüzlerine yönlendirilirler. Bu hareket zarın sitoplazmik yüzünde yer alan ve olasılıkla hedef proteinlerle olan ilişkilere bağlı bir yönlendirme hareketidir. Büyüklükleri-cesametleri bu yönlendirme hareketi üzerinde diğer bir etken olabilir ve yönlendirmenin buna bağlı özel bir yol izleyebildiği de düşünülmektedir. Hücre yüzey çöküntülerinin (caveolae) varlığıda buralarda, ekzositozun gerçekleştiği ve böylece glikolipit yapıda, salgılanan materyalin, lipid taşıyıcıları bakımından bu bölgelere getirildiği ve salındığı hipotezini destekler.
Konun başında da belirtildiği üzere glikolipidlerin çoğu beyinden elde edilmiş ve izole edildikleri gangliositlere göre isimlendirilmiştir Bu durumda, bu yapıların özellikle sinir sistemi için önemli olduğu aşikardır. Buna göre yapılan ölçümler fosfolipit ve glikolipit içeren yapıların normal dokularda %5 den az olduğunu, sinir sisteminde, özellikle sinir hücrelerinde yer alan myelin kılıflarda %25 den fazla lipit bulunduğunu göstermiştir. Sinir siteminde hangi hücrelerde diye sorguladığımızda, oligodendrositler (merkezi sinir sistemi hücreleri) ve Schwann hücreleri (periferal sinir sistemi hücreleri) çıkmaktadır.
Glikolipidler ne işe yarar? Öncelikle yapıları gereği glikolipidler tanımada hedef gruplar olarak yer alırlar. Şişe benzeri yapıları nedeni ile oluşturdukları boşluklar, lipit tabakaları arasında özel kılıf yapıları yada diğer bir değişle hareket alanları şekillendirilmesine yardım ederler. Bu şekilde aslında hücre yüzeyinde glikokaliks benzeri bir koruyucu tabaka şekillendirirler. Böylece zarda yer alan integral proteinlerin glikozilasyonu, protein yapısını ve dayanıklılığını analog bir hale getirerek arttırırlar.
Glikosfingolipidler ne iş yapar? Nöral dokularda bol ve çok farklı şekillerde yer alırlar. Böylece; sinir sistemi hücreleri arasında tanıma-tutunmada işaretleyici olarak rol oynarlar. Bu görevler arasında; aksonlara rehberlik etme, komşu hücreler veya hücreler arası matrikse tutunmayı sağlama ve lektinler vasıtasıyla etkileşimler sayılabilir. Bununla beraber bazı araştırıcılara göre bu görevler doğrudan glikosfingolipitler ile değil başka moleküllerce karşılandığı fikrine de rastlanabilmektedir.
Son olarak glikolipidlerin görevleri arasında Zarın tüm fiziksel özelliklerinin belirlenmesi, tanıma olaylarının düzenlenmesi ve bazı zar proteinlerinin davranışlarını değiştirmesi de sayılabilir. Buna en güzel örnek Epidermal Büyüme Faktörü (Epidermal Growth Factors, EGF) verilebilir. EGF aktivitesi GM3 gangliosidinin davranışının düzenlenmesinde görev alır.
Glikolipilerin Kırılması Glikolipidlerin fizyolojik rolleri çok da iyi bilinmemektedir. Bununla beraber patolojik bazı rahatsızlıkların olumasında etkili olduğu görülmüştür. Örneğin; bakteri toksinlerinin tanınması ve yakalanmasında etkilidirler. Genetik hastalıkların önemli bir grubunda glikolipit parçalanma yolaklarındaki kusurlar etkili olur. Benzer olarak sinir sisteminde ve dolayısıyla beyinde ortaya çıkan bazı rahatsızlıklarda yine glikolipid sentezi ve glikolipit parçalanması ile ilişkilidir. Yine glikolipitlerin lizozomlara taşınması ve özel hidrolazlar yardımıyla parçalanması, hidrolazlardan herhangi birinin aktivitesinin kaybolması yine lipitlerin çalışma bozuklukları ile ilgili sorunlardan köken alır.
Yine benzer şekilde Tay-Sachs Hastalığı ölümcül nörolojik bir rahatsızlıktır. Hastalık gangliosit GM2 lizozomlarında birikimlere yol açar. Bu hasalık β- hekzosaminidazı kodlayan A genin mutasyonu nedeniyle ortaya çıkar. Bir diğer hastalık Gaucher s Hastalığı olarak bilinir. Herhangi bir nörolojik rahatsızlık bu hastalarda görülmez (Şekil 5.5). Hastalık β-glukoserebrozidaz geninde (glukosilseramidi parçalayan enzimin geni) mutasyonlara neden olur. Böylece karaciğer ve dalak ta büyüme görülür. bu durum organların aktivitesini bozar ve makrofajlarda glukosilseramit birikmesinden dolayı iskelet anormallikleri görülür. Bu hastalık dışarıdan enzim verilerek başarılı şekilde tedavi edilebilir.
Proteinlerin Zara Demirlenmesi yani Glikosilfosfatidil Inositol (GPI) Çapaları Proteinlerin zar yapılarına demirlenmesi hidrofobik amino asit sıraları ile yağ asidi ve/veya lipitlerin kovalent bağlanmalarıyla gerçekleşir. Çok sayıda lipit, zar proteinlerine plazma zarının dış yüzeyine uzanacak şekilde glikolipitleryardımıyla bağlanırlar. Bu lipitler diasilgliserol yapısında, hidrofobik yapılı rezidülerdir. Proteinlere bağlanmış glikolipidlere genel olarak Glikosilfosfatidil Inositol (GPI) Çıpaları adı verilir.
GPI çıpaları organizmalara göre değişir (Şekil 5.6). Bununla beraber bazı yapısal ortak noktalar içerirler. Örneğin, protein ve lipiti bağlayan glikan köprüleri lipitlerin baş grubunda yer alan inositole glukozamin in (GlcN) glikosidik bağ ile bağlanması ile oluşur. Diğer bir ortak noktaları bilinen tüm lipit çıpalarının üç mannozlu bir çekirdek yapısı içermesidir. Bir molekül etanolamin, bir fosfodiester bağı yardımıyla üçüncü mannoz kalıntısına bağlanır. Amino asidin serbest kalan amino ucu, proteinin diğer ucunda yer alan C-ucuna bir amid bağı şekillendirerek bağlanır.
Glikosilfosfatidil inositol çıpalarında görülen değişikliklere bakarsak; Örneğin; gliserole bağlanan yağ asidi kuyruklarının uzunluğu değişebilir. İlk mannoz kalıntısına tutunan, ikinci bir etanolamin fosfat kalıntısının varlığı veya yokluğu bir diğer değişiklik sebebi olabilir. İnositol halkasında yer alan esterleşmiş palmitat grubunun olması veya olmaması önemlidir. Bir tek GalNAc kalıntısının ilk mannoz kalıntısına bağlanması ve yeni eklenen diğer şekerlerin varlığı, Galaktoz kalıntılarının dallanmış grupları ve zarlara bu yolla bağlanan proteinlerin, fosfolipaz C enzimiyle serbest kalması sayılabilir.
Glikolipit Çıpalarının Proteinlere Tutunması Granüllü Endoplazmik Retikulumda (GER) Gerçekleşir GPI çıpaları GER da meydana gelir. N-bağlı şekerlerin oluşturulmasına benzer. Çıpa proteine geçirilmeden önce burada oluşturulur. Çekirdek yapı inositol lipitinin oluşturulması iki farklı safhada meydana gelir. ilk aşama GER in sitosole bakan yüzünde bir GlcNAc kalıntısının eklenmesi ve bir N-asetil grubunun uzaklaştırılmasıdır. İnositol içeren halkaya palmitat eklenmesini takiben, GER lümeninde mannoz ve etanolamin fosfat eklenmeleri ile gerçekleşir. Glikolipit çıpaları için proteinler başlangıçta zara gömülü tip I proteinler olarak sentezlenirler. N-acunda yer alan sinyal sırasıyla ER a yönlendirilirler. Sonraki adımda C-ucu yadımıyla, hidrofobik yapıda aa sıra yardımıyla zara demirlenirler. Glikolipit çıpanın tutunması, polipeptit zincirin kesilmesi, etanolamine ait amin grubuyla bir amit bağı şekillenmesiyle meydana gelir.
Glikolipit çıpalarının proteinlere tutunmasıyla ilişkili özel sıra motifi yoktur. Proteini oluşturan C-uçlu amino asidin kesilmesinden sonra gelen amino asit birimi genel olarak küçük yan zincirler içerir. Bu çıpa proteinlerinin öncü formlarını oluşturur. C-ucunda hidrofilik yapıda sitoplazmik aa birimleri yer almaz. Glikolipit çıpalarının son demirlenmeleri memeli ve memeli olmayan proteinlere benzer şekilde gerçekleşir. Zara demirlenmeleri benzer şekilde gerçekleşse de zar çıpalarını oluşturan biyosentetik yollaklar birbirlerinden önemli miktarda farklıdır. Örneğin; Tripanazoma parazitinde inositolün 2.pozisyonuna bir açil grubunun eklenmesi, GlcN kalıntısının ilk mannoza eklenmesinin ardından yapılır. Memelilerde ise önce mannoz eklenir. Benzer şekilde, parazit de çıpa yapısı proteine taşınmadan önce lipit zincirleri şekillendirilirken, memelilerde önce lipit molekülü taşınır sonra şekillendirme yapılır (Şekil 5.8).
Araştırıcılar arasında GPI çıpalarına dair de farklı görüşlere rastlanır. Buna göre proteinlerin hepsinin plazma zarına GPI çapalarıyla bağlanmadığı düşünülür. Bu tip proteinlerin sitoplazmik domainleri de tespit edilememiştir. Endositozis düzenleyen mekanizmada ve diğer tip hücre içi ve plazma zarları arasında trafikte her zaman görülmezler. Plazma zarının sınırlı bölgelerinde yer aldıkları tespit edilmiştir. En belirgin farkları kutuplaşmalarında gözlenmiştir. Buna göre epitel hücrelerinde yapılan çalışmalarda epitel hücrelerinde bazen apikalde ve bazı durumlarda da lateral zarlar arasında görülmüşlerdir. Doğru hedeflemeyi sağlayan glikolipit taşıyıcılar yardımı ile zarda doğru yerde lokalize olurlar.
GPI-çıpalı proteinleri içeren bazı lipit taşıyıcıları plazma zarının özel çöküntüleri(cavaolae) ile ilişkilidir. Kavaola, kaveolin adı verilen bir örtü proteiniyle sarılı çöküntülerdir. Endositozisin bir formudur. Bu kesecikler reseptörler ile idare edilen, klatrin-örtülü keseciklerin iş gördüğü endositozisten farklıdır. Glikolipit Çıpa Kusurları GPI Çapalarının Yokluğu durumunda, kan hücrelerinde Paraxysmal nocturnal haemoglobinuria ile ilişkilidir. GPI çıpa biyosentezinde ilk safhayı katalize edeen GlcNActransferazı kodlayan gende meydana gelen mutasyon nedeniyle ortaya çıkan bir rahatsızlıktır. Diğer bir değişle sonradan kazanılmış bir hastalıktır. Mutasyon germ hücrelerinde bulunmaz. Bazı kemik iliği kök hücrelerinde bir somatik mutasyonla ortaya çıkar. Komplement sistemini bozar. Yanlış yönlendirilme nedeniyle eritrositlerin lizisiyle ortaya çıkar
Kullanılan Kaynak 1. Introduction to Glycobiology; M.E. Taylor, K. Drickamer, 2nd Ed. Oxford Press, 2006 2. E.Ü. Fen Fak. Moleküler Biyoloji AD. Prof.Dr.Sabire Karaçalı Glikobiyoloji Ders Notları