N-asetilglukozaminiltransferaz IVa enziminin CD147 nin glikozilasyonu ile fare hepatokarsinoma hücrelerinin metastatik potansiyelini düzenlemesi

Transkript

1 N-asetilglukozaminiltransferaz IVa enziminin CD147 nin glikozilasyonu ile fare hepatokarsinoma hücrelerinin metastatik potansiyelini düzenlemesi Kerem YANAR

2 N-asetilglukozaminiltransferaz nedir? Çalışmanın amacı nedir? N-asetilglukozaminiltransferaz (GnT) IVa, N-asetilglukozamin (GlcNAc) β1-4 bağlarının kurulmasını katalizleyen kilit enzimdir. Bu bağlar N-glikanların çekirdek yapısında bulunur. N-glikanlar ise embriyonik gelişim, büyüme ve hücre farklılaşmasında önemli rollere sahiptir. N-glikan biyosentezi golgi aparatında N-asetilglukozaminiltransferazlar sayesinde gerçekleşir. Ayrıca bu enzimler N-glikan çekirdek yapısına 2 adet mannoz ve 3 adet GlcNAc ekleyerek üçlü ya da çoklu dallanma yapılarını oluşturur. Çalışmanın amacı ise; İki tip fare hepatokarsinoma hücresi (Hca-F ve Hepa1-6) kullanılarak, bu enzimin bu hücrelerde metastaz kapasitesinin artmasıyla ve CD147 glikoproteiniyle alakalı olup olmadığını anlamaktır.

3

4 Başlangıç Hca-F ve Hepa1-6 fare hepatokarsinoma hücreleridir ve Hca-F hücrelerinin metastatik aktiviteleri çok yüksekken, Hepa1-6 hücrelerinin metastatik aktivitesi yoktur. Metastaz kanser hücrelerinin kan veya lenf yoluyla bir organ veya dokudan kendisiyle bağlantılı olmayan başka bir organa veya dokuya taşınması olayına verilen addır. Tümör hücrelerindeki N-bağlı oligosakkaritlerin yapısının değişmesi, kanser ve metastaz ile bağlantılıdır. Metastaz, tümör hücrelerindeki anormal oligosakkarit ekspresyonu ile gerçekleşir. N-glikanlarda dallanmanın artması hücrenin metastatik potansiyelini artırır. Daha önce yapılan çalışmalarda GnT-IVa enziminin tip-2 diyabet, koryokarsinoma ve pankreas kanseriyle alakası olduğu gösterilmiştir.

5 Başlangıç CD147 ya da EMMPRIN (Extracellular Matrix Metalloproteinase Inducer), bir plasma transmembran glikoproteinidir. Bütün hücrelerde bulunur ancak tümör hücrelerinde ekspresyonu çok fazla artar. Ig domaini içerir ve bu domain de 3 adet Asn glikozilasyon bölgesi içerir. CD147 glikoproteininin çok glikozillenmesi, çoklu matriks metalloproteinazları (MMPs) oluşturarak ekstraselüler matriksi parçalar ve metastaza öncülük eder. CD147 glikoproteini iki çeşit N-glikolize olur; Çok glikolize-cd147 (HG- CD147) ve Az glikolize-cd147 (LG-CD147). HG-CD147 de kompleks karbonhidratlar bulunurken LG-CD147 de bolca mannoz bulunur.

6 Başlangıç Daha önceki çalışmalarda bu iki tip hepatokarsinoma hücresinde de HG- CD147 ye rastlanmış ancak Hca-F tipinde daha fazla olduğu gözlenmiştir. Buna karşın LG-CD147 ise Hepa1-6 hücrelerinde daha fazla bulunmuştur. Ayrıca GnT- IVa enzimi HG-CD147 glikoproteinin ekspresyonunun yüksek olduğu Hca-F hücrelerinde daha fazla, ekspresyonun az olduğu Hepa1-6 hücrelerinde ise daha az olduğu görülmüştür. Bunun üzerine Hepa1-6 hücrelerinde GnT-IVa ekspresyonu artırılarak ve Hca-F hücrelerinde GnT-IVa ekspresyonu azaltılarak GnT-IVa ile hücrenin metastatik potensiyeli arasındaki bağ araştırılmıştır.

7 Materyal ve Metotlar Hücre kültürü (Hca-F ve Hepa1-6 hücre kültürleri) Kalitatif RT-PZR tahlili (Real Time RT-PZR kullanılarak yapılmıştır.); hepatoma hücrelerindeki GnT-IVa sayımı için yapılmıştır. Aşırı ekspresyon vektörlerinin oluşturulması; GnT-IVa enzimini kodlayan gen olan Mgat4a geni pmd18-t vektörüne aktarılmıştır ve daha sonra pcdna3.1 vektörüne alt klonlama yapılmıştır. Daha sonra bu vektör Hepa1-6 hücrelerine aktarılmıştır ve Hepa1-6/GnT-IVa (GnT-IVa) hücreleri oluşturulmuştur. sirna ve retroviral enfeksiyon; GnT-IVa enzimine spesifik olan oligonükleotitler dizayn edilip birleştirildikten sonra pll3.7 vektörüne aktarılmıştır. Bu vektörler de 293-T insan böbrek hücrelerine aktarılmıştır. Daha sonra transfekte olan bu hücrelerden lentivirüsler elde edilmiştir. Daha sonra bu lentivirüsler Hca-F hücrelerine aktarılmıştır ve «GnT-IVa i» oluşturulmuştur. Yarı kalitatif RT-PZR analizi; aynı örneğe ait birden fazla kopyanın ekspresyon seviyesini değerlendirmek için yapılmıştır. Western Blot analizi Lektin Blot analizi

8

9 Materyal ve Metodlar İmmünopresipitasyon; Anti GnT-IVa ve anti Cd147 antikorları kullanılarak işaretleme yapılmıştır. Transwell migrasyon tahlili; agar kuyucuklarının arasına bir membran yerleştirilip, hücreler buraya ekilerek gözlemlenmiştir. Flow sitometri analizi; süspansiyon halindeki hücrelerin bir akış kanalından belirli bir hızda tek tek geçerken sınıflandırılıp analiz edilmesidir. Yapa kapatma tahlili; bir levhadaki hücreleri pipetle ayırıp ayrılan bölgeyi doldurup dolduramayacaklarını kontrol etmek için kullanılan bir tahlildir. Migrasyon potansiyelini ölçmek için kullanılır. Yumuşak agar koloni oluşumu tahlili; koloni sayımı için kullanılan bir yöntemdir. In vivo hayvan deneyleri Hematoksilen-Eozin Boyaması, İmmünohistokimya ve Lektinhistokimya İstatistiksel analizler

10 Lektin Blot Analizi Glikoproteinlerin glikan yapıları hakkında bilgi sahibi olmak için kullanılır. Burada lektinlerin karbonhidratlara olan özgüllükleri kullanılır. Bu sayede glikanları glikoproteinden kopartmadan inceleme imkanı sağlanır. Bu çalışmadaki lektin blot analizinde üç lektin kullanılmıştır; concanavalin A (ConA), lökofitoagglutinin (L-PHA) ve eritrofitoagglutinin (E-PHA). Ayrıca bu lektinler horseradish(yaban turpu) peroksidaz enzimi ile işaretlenmiştir. 3,3 - diaminobenzidin ise renk verici olarak kullanılmıştır.(parçalandığında kahverengi renk verir.) Concanavalin A, mannoz ve glikoza karşı affinite gösterir. Bu çalışmada kontrol olarak kullanılmıştır. L-PHA, kompleks N-glikanların üçlü, dörtlü veya çoklu dallanmış yapılarındaki β1-6 dallarına affinite gösterir. E-PHA, kompleks N-glikanların ikili veya üçlü dallanmış yapılarına affinite gösterir.

11 Sonuçlar

12

13

14

15

16

17 Sonuçlar Hepatoma hücrelerinin lenfatik metastaz potansiyeli, GnT-IVa enziminin ifade düzeyi ile ilişkilidir. Hepa1-6/GnT-IVa hücrelerinin HRP L-PHA ile boyanma yoğunluğu artmış, E-PHA ile boyama yoğunluğu azalmıştır. Buna karşın GnT-IVa ifadesi susturulmuş olan Hca-F hücrelerinde (GnT-IVa i) HRP L-PHA boyanma yoğunluğu azalırken, E-PHA boyanma yoğunluğu değişmemiştir. Bu veri glikoproteinlerdeki anten dallanma yapısının, GnT-IVA enziminin ifade düzeyi ile ilişkili olduğunu gösterir. Çünkü bu enzimin ifade düzeyi, glikoproteinlerdeki N-glikan oligosakkarit yapısını değiştirir. Hepa1-6/GnT-IVa hücrelerinde GnT-IVa enziminin aşırı ifadesi, bu hücrelere büyük bir migrasyon ve metastaz yeteneği kazandırmıştır. GnT-IVa ifadesi susturulmuş olan Hca-F (GnT-IVa i) hücrelerinde de migrasyon ve metastaz potansiyeli engellenmiştir.

18 Sonuçlar Yara kapama tahiiline göre Hepa1-6/GnT-IVa hücrelerinin migrasyon kapasitesi diğer hücrelere göre fazladır. Yumuşak agar koloni oluşumu tahlili sonucunda koloni sayısı ve büyüklüğü GnT-IVa i hücrelerinde normal Hca-F hücrelerine göre daha az ve küçüktür. Hepa1-6/GnT-IVa hücrelerinde ise büyük koloniler oluşmuştur. Bu veri, GnT-IVa ifadesinin, hücre migrasyonunu ve tümörijenitesini belirgin bir biçimde etkilediğini göstermiştir. Normal Hepa1-6 hücrelerinde HG-CD147 miktarı çok az iken, Hepa1-6/GnT-IVa hücrelerinde çok fazla görülmüştür. GnT-IVa i hücrelerinde ise GnT-IVa enzim ifadesi susturulduğu için HG-CD147 ifadesi azalmıştır. Lektin blot analizi sonuçlarına bakıldığında aşırı ifade edilmiş GnT-IVa bulunan hücrelerdeki CD147 glikoproteinde β1-6glcnac dallanmalarının arttığını ve ikili dallanmaların azaldığını, buna karşın GnT-IVa i hücrelerinde β1-6glcnac dallanmalarının azaldığını ancak ikili dallanmaların sayısının değişmediğini anlayabiliriz. Ayrıca CD147 glikoproteinin dallanmasındaki çeşitlilik, onun GnT-IVa enziminin hedef proteini olabileceğini gösterir.

19 Tartışma GnT-IVa enziminin hücre içindeki ifadesi, CD147 glikoproteinin glikozilasyonunu etkiler. HG-CD147 hücrenin metastatik potansiyelini artırırken, LG-CD147 nin metastatik aktivitesi yoktur. GnT-IVa, CD147 glikoproteininin glikozilasyonunu büyük ölçüde değiştirerek CD147 nin L-PHA sinyal gücünü artırmıştır. GnT-IVa enziminin Hepa1-6 hücrelerindeki aşırı ifadesi sonucu hücrelerde bulunan LG- CD147, HG-CD147 ye dönüşmüştür.

20 Tartışma GnT-IVa tarafından üretilen ürünler, diğer GnT enzimleri (GnT-V ya da GnT-III) için bir substrat olabilirler. Yapılan çalışmalar sonucu GnT-IV enziminin GnT-IVa ve GnT-IVb türlerinin olduğu bulunmuştur. Ancak GnT-IVb enziminin daha fazla ifade edilmiş olmasına rağmen GnT- IVa enziminin daha aktif olduğu keşfedilmiştir. Bunun nedeni ise GnT-IVb enziminin GnT- IVa enziminden daha az affinitesi olmasıdır. Hepa1-6 hücrelerinde GnT-IVa enziminin aşırı ifadesi sonucu GnT-V ve GnT-III enzimlerinin de ifade düzeyi belirgin bir biçimde değişmiştir. GnT-V enziminin aşırı ifadesi metastaz riskini artırırken, GnT-III enzimi GnT-V enzimine karşı zıt bir göreve sahiptir. Çünkü GnT-V, GnT-IVa enzimi gibi çok dallanmış yapılar oluştururken, GnT-III ikili dalları oluşturur.

21 Dinlediğiniz için teşekkürler!!!