THERMOFİL BACILLUS SP. DEN ALKALİN, TERMOFİLİK, OKSİDANT DİRENÇLİ, SELÜLAZ ÜRETİMİ VE KARAKTERİZASYONU* Production and Characterzation of Alkaline, Thermophilic, Highly Thermostabil and Oxsidant Resistant Cellulase From A Thermophilic Bacillus Sp. Yasemin CAF Biyoteknoloji AnabilimDalı Burhan ARIKAN Biyoteknoloji Anabilim Dalı ÖZET Bu çalışmada Adana ili ve çevresinden alınan toprak ve doğal gübre ile biyokompost örneklerinden Bacillus suşları izole edilmiştir. CMC substratı içeren katı besiyerinde çeşitli ph ve sıcaklık koşullarında Bacillus sp. CY-3 suşunun enzim üretme yeteneği araştırılmış ve maksimum enzim üretimi için optimum ph ve sıcaklık değerleri tespit edilmiştir. Daha sonra kısmi olarak saflaştırılan enzimin karakterizasyonu yapılmış ve endüstriyel kullanılabilirliği araştırılmıştır. Kısmi olarak saflaştırılmış enzim ph 9 da ºC de optimum aktivite göstermiştir. Aktivitesi ºC de 60 dk inkübasyon sonucunda ph 6-13 arasında % 65 ten ve 20-120 C arasında da % 83 ten fazla aktiviteyle stabil olduğu tespit edilmiştir. Enzimin göstermiş olduğu yüksek termostabilik, ph stabiliği bu enzimi tekstil, deterjan ve diğer endüstri uygulamalarda potansiyel olarak kullanışlı yapmaktadır. Anahtar Kelimeler: Selüloz, CMC, Selülaz, Alkalifil, Termofil ABSTRACT In this study, Bacillus strains isolated from the samples of soil, natural fertilizer and biocompost in Adana. The optimum temperature and ph for strains growth and enzyme production were determined on CMC-plate. After that the partial purified enzyme was characterized and the industrial using of enzyme were researched. The partially purified enzyme showed optimally activite at ph 9 and C and it was stable from ph 6 to 13 with more than % 65 activity. And it was stable from 20-120 C with more than 83 % activity after incubating at C for 60 min. Highly thermostability, ph stability, and stability make this enzyme potentially useful in textil, laundry and in other industrial applications. Key Words: Cellulose, CMC, Cellulase, Alkaline, Thermophile Giriş Enzim teknolojisinin giderek gelişmesi, ürünlerin kullanım alanlarının çeşitliliği ve ekonomik değerinin çok yüksek olması nedeniyle, biyoteknolojinin endüstriyel enzimlerle ilgili alanında yapılan araştırmalar, giderek önem kazanmaktadır. Özellikle birkaç ülke dışındaki diğer ülkeler bu konuda tamamen dışa bağımlı durumdadırlar (Saraçoğlu, 2010). Yüksek Lisans Tezi-MSc. Thesis - 50 -
Günümüzde endüstri ve diğer alanlarda yaygın olarak kullanılan enzimlerin büyük bir kısmı mezofilik mikroorganizmalardan elde edilen enzimler olmasına rağmen, bununla birlikte enzimlerin kullanım alanlarının artmasına ve bu alanlarda gerçekleştirilen kimyasal işlemlerdeki ekstrem ph, sıcaklık ve iyon konsantrasyonu gibi uygulamalara bu enzimlerin kullanımları sınırlı kalmaktadır. Buna bağlı olarak ortaya çıkan gereksinimlere karşılık enzimlerin bahsedilen ekstrem (sert) koşullara sahip olmaları ön plana çıkmıştır. Bu nedenle son 20 yılda biyoteknolojik uygulamalarda yaygın olarak ekstremozimlerin izolasyonları için ekstrem koşullardan elde edilen mikroorganizmalar üzerindeki araştırmalar yoğunlaşmıştır (Hough ve ark. 1999; Sterner ve Liebl, 2001). Bu çalışmada, topraktan izole edilecek proteaz üretme yeteneği olmayan Termofil Bacillus sp. suşlarından Alkalin, Termofilik, Oksidant dirençli selülaz enzimlerinin üretilmesi, kısmi saflaştırılması ve elde edilen enzimlerin karakterizasyonu ve endüstriyel kullanılabilirliğinin araştırılması amaçlanmaktadır. Materyal ve Metot Materyal Bu çalışmada ekipman olarak: yağ ve su banyosu, soğutmalı santrifüj, çalkalamalı inkübatör, spektrofotometre kullanılmıştır. Ayrıca LB agar, N1 agar, CMC-LB agar ve skim-milk LB agar besiyerleri ve karakterizasyonda kullanılacak çeşitli kimyasallardan yararlanılacaktır. Metot Bacillus sp. suşlarının izolasyonu Çeşitli bölgelerden alınan toprak örnekleri 1 er gram tartılıp 5 ml steril distile su ile karıştırılıp homojen hale getirildikten sonra, Bacillus sp. organizmalarını izole edebilmek için ısı şoku uygulanmıştır (Aygan ve Arıkan, 2008; Arıkan, 2008 ). Örnekler ön işlemi takiben, tek koloni elde edebilmek için seri sulandırma (10-5 - 10-6 ) yapılarak, LB agara yayma metoduyla ekim yapılmış ve 55 ºC de 1 gece inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon sonrasında tek düşmüş kolonilerden karakteristik Bacillus görünümüne sahip koloniler seçilip N1 agara çizgi şeklinde ekilerek 55 ºC de bir gece inkübe edilmiştir. Elde edilen Bacillus suşları identifikasyon çalışmaları, selülaz enziminin üretimi ve karakterizasyonu amacıyla stok kültür şeklinde saklanmıştır. - 51 -
Bacillus sp. Suşlarının Tanımlanması Seçilen bakteri örneklerinin teşhisi için gram boyama, hareketlilik, spor oluşumu gibi kültüt morfolojisi testlerinin yanı sıra, katalaz, glikoz, ksiloz ve mannitolden asit oluşumu gibi biyokimyasal testler yapılmıştır (Aygan, 2008). Selülaz Üreten Proteaz Negatif Bacillus sp. Suşlarının Saptanması Tanımlanan Bacillus sp. suşları CMC ve skimmilk içeren LB agar besiyerlerine çizgi şeklinde ekilerek 55 C de bir gece inkübasyona bırakılmıştır. Selülaz aktivitesi CMC li besiyerinin %0.1 lik kongo kırmızısı ile boyanması ve 1M NaCl çözeltisi ile boyanın geri alınması sonucunda sarı zon oluşumuna göre saptanmıştır. Proteaz aktivitesi skimmilk bulunan besiyerinde üretilen kolonilerin etrafındaki şeffaf zon oluşumuna göre saptanmıştır İzole edilen örnekler içerisinde proteaz negatif olan ve en geniş selülaz zon çapına sahip suş selülaz üretimi için kullanılmıştır (Voget ve ark., 2006). Bacillus sp. Suşunun Katı Besiyerinde Ürediği ve Enzim Sentezinin Gerçekleştiği ph ve Sıcaklık Aralığının Saptanması Bu amaçla, ph aralığı 6.0-13.0 arasında değişen CMC li katı besiyerlerine proteaz negatif selülaz pozitif suşlar, çizgi şeklinde ekilip farklı sıcaklıklarda (20-60 ºC) inkübasyon gerçekleştirilmiştir. İnkübasyon sonunda koloni ve zon çapları ölçülerek üremenin ve enzim sentezinin gerçekleştiği optimum ph ve sıcaklık değerleri belirlenmiştir (Voget ve ark.2006). Enzim Üretimi ve Kısmi Saflaştırma Bu amaçla seçilen suşun 1 gecelik taze kültüründen CMC-LB sıvı besiyerine aşılama yapılarak optimum ph ve sıcaklıkta çalkalayıcı inkübatörde ve 190 devir/dakika hızda 24 saat inkübasyon yapılarak üretim gerçekleştirilmiştir. Elde edilen kültür +4 ºC de 00 devir/dakikada 30 dk santrifüj edilerek bakteriler çöktürülüp, sıvı faz temiz bir şişeye aktarılmıştır. Sıvı fazın üzerine orijinal hacmin %70 i oranında %96 lık soğuk etanol eklenip -33 ºC de 1 gece bekletilerek alkol presipitasyonu yapılmıştır. Örnek +4 ºC de 15 dk süreyle 00 devir/dakika hızda santrifuj edilerek enzim çöktürülmüştür. Enzim çökeltisi, ph sı 7.0 olan 0.1 M lık sodyum fosfat tamponunda çözülerek aktivite analizlerinde kullanılmak amacıyla +4 ºC de saklanmıştır (Aygan ve Arıkan, 2008). Enzimin Optimum Aktivite Gösterdiği ph Değerinin Saptanması Kısmi saflaştırma işlemi ile elde edilen enzimin optimum aktivite gösterdiği ph değerinin saptanması için Na-fosfat (ph 6.0-8.0), Glisin-NaOH (ph 8.5-10.5) ve Borax-NaOH (ph 11-12) tamponları kullanılarak %0.1 lik selüloz çözeltileri - 52 -
hazırlanmıştır. Aktivite tayini için 0.5 ml enzim ve her ph taki substrat çözeltilerinden 0.5 ml örnek alınarak tüpte karıştırılmıştır. Hazırlanan enzim substrat karışımları enzimin üretildiği sıcaklıkta su banyosunda 60 dk süreyle inkübe edilmiştir. İnkübasyonun sonunda her bir tüpe eşit miktarda DNS ayıracı konularak 5 dk kaynatma işlemi uygulanmıştır. Tüpler soğutulduktan sonra spektrofotometrede 540 nm dalga boyu kullanılarak, köre karşı okuma yapılmıştır (Coral ve ark., 2002). En yüksek absorbans değerinin elde edildiği ph değeri kabul edilerek diğer ph değerleri buna göre oranlanıp, rölatif enzim aktivitesi saptanmıştır. Enzimin Optimum Aktivite Gösterdiği Sıcaklığın Saptanması Enzimin optimum aktivite gösterdiği sıcaklık değerinin saptanması için 20-110 ºC lik sıcaklık değerleri seçilmiştir. Aktivite tayini için 0.5 ml enzim ve 0.5 ml substrat karıştırılarak (optimum ph değerinde hazırlanmış) seçilen sıcaklıklarda 60 dk süreyle inkübasyon gerçekleştirilmiştir. İnkübasyon sonunda standart aktivite tayini yapılmıştır (Coral ve ark., 2002; Arıkan, 2008). Enzimin Sıcaklık Stabilitesinin (Termal Stabilite) Saptanması Termal (sıcaklık) stabilitenin saptanması için enzimler 20-120 C aralığındaki sıcaklıklarda 60 dk ön inkübasyona bırakılmıştır. Ön inkübasyon uygulamasından sonra 0.5 ml enzim ve 0.5 ml substrat (optimum aktivitenin gerçekleştiği ph değerinde hazırlanmış) karıştırılarak optimum aktivitenin görüldüğü sıcaklıkta 60 dk inkübasyon gerçekleştirilmiştir. İnkübasyon sonunda standart aktivite tayini yapılmıştır. Orijinal aktivite analizinden elde edilen değer ( olarak kabul edilmiştir) ve ön inkübasyondan sonra elde edilen aktivite değerleri arasındaki fark enzimin relatif termal stabilitesi olarak değerlendirilmiştir (Arıkan, 2008). Enzimlerin ph Stabilitelerinin Saptanması Stok enzim örneğinden, 2 ml alınarak 10 devirde 5 dk santrifuj edilmiştir. Üst faz atıldıktan sonra örnek üzerine aynı miktarda tampon eklenerek (ph sı 8.0-12.0 olan yeni hazırlanmış) enzim süspanse edilip 24 saat oda sıcaklığında ön inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon sonunda standart aktivite tayini yapılmıştır. Orijinal aktivite analizinden elde edilen değer ( olarak kabul edilmiştir) ve ön inkübasyondan sonra elde edilen aktivite değerleri arasındaki fark enzimin relatif termal stabilitesi olarak değerlendirilmiştir (Arıkan, 2008). - 53 -
Araştırma Bulguları Alkalin Termofilik Bacillus sp. Suşlarının İzolasyonu ve Tanımlanması Bu çalışmada, selülozik atıkların bulunduğu toprak örnekleri alınmış ve izole edilen toplam 283 Bacillus sp. suşları arasından 84 suşun (%29.7) sinin alkalin selülaz üreticiticisi olduğu tespit edilmiştir. Alkalin selülaz üreticisi 84 Bacillus sp. suşu içerisinde 8 suşun (%9.5) proteaz negatif alkalin selülaz üreticisi olduğu saptanmıştır. İzole edilen organizmalar geniş, beyaz renkli ve dalgalı kenarlı koloni morfolojisine sahiptirler. Suşlar gram pozitif, aerob, spor oluşturan, çubuk şekilli ve hareketli bakteriler olup, glikoz, ksiloz ve mannitolü asit oluşturarak parçalarken katalaz pozitif özellik göstermektedirler. Koloni morfolojileri ve diğer özellikleri dikkate alınarak seçilen suşlar Bacillus sp. şeklinde adlandırılmışlardır. Proteaz negatif fakat CMCaz pozitif özellik gösteren suşlar içerisinde optimum üreme ph ve sıcaklık değerleri dikkate alınarak CY-3 örneği enzim üretimi için seçilmiş ve Bacillus sp. CY3 şeklinde adlandırılmıştır. Literatürde katı besiyerinde elde edilen aktivite zon çapının genişliğinin sıvı kültürdeki enzim kosantrasyonunun yüksekliğini yansıttığı belirtilmektedir (Theather ve Wood, 1982; Fujinami ve Fujisawa, 2010). Bakterinin Katı Besiyerinde Ürediği ve Enzim Sentezinin Gerçekleştirdiği Optimum ph ve Sıcaklık Aralığının Saptanması Enzim üretimi ve karakterizasyonu için seçilen Bacillus sp. CY-3 suşu CMC agar besiyerine ekilerek 20-60 ºC sıcaklık ve ph 6.0-12.0 aralığında inkübasyon gerçekleştirilmiştir. Koloni ve zon çapları ölçülerek suşun optimum ürediği ve enzim sentezini gerçekleştiği sıcaklık ve ph değeri saptanmıştır. Bacillus sp. CY-3 suşunun ph 9.0 ve 55 ºC de optimum ürediği ve enzim sentezlediği tespit edilmiştir. Bulgular çizelge. 1.de gösterilmiştir. Çizelge.1. Bacillus sp. CY-3 suşuna ait 20-60 ºC de ve farklı ph değerlerinde (8.0-12.0) katı besiyerindeki koloni ve aktivite zon çapları K.Ç.: koloni çapı; Z.Ç.: zon çapı; * optimum değer; ----- üreme veya zon yok - 54 -
Relatif Enzim Aktivitesi (%) Ç.Ü Fen ve Mühendislik Bilimleri Dergisi Yıl:2012 Cilt:27-1 Fujinami ve Fujisawa (2010), Alkalifillerin optimum ph sının üreme koşullarına bağlı olarak değişmesine rağmen ph 9.0-12.0 aralığında en iyi olduğunu bildirmişlerdir. Enzimin Optimum Aktivite Gösterdiği ph Aralığına Ait Bulgular Spektrofotometrik ölçümler sonunda, enzim ph 6.0-9.0 aralığında ortalama %74.33 aktiviteye sahipken, ph 10.0-13.0 aralığında %73 aktivite değeri bulunmuştur. Bu sonuçlar enzimin oldukça geniş bir ph aralığında (6.0-13.0) yüksek düzeyde aktif olduğunu (ortalama %77) ve çok farklı ph değerlerinde kullanılabileceğini göstermektedir. Bacillus sp. CY-3 suşundan izole edilen CMCaz enzimi optimum aktivitesini ph 9.0 da göstermesi, ph 11.0 de diğer ph değerlerine göre ikinci bir pik oluşturması (%83) nedeni ile alkalin özelliğe sahiptir. Elde edilen bulgular şekil 1 de grafiksel olarak gösterilmiştir. Liu ve ark (2008), Bacillus isolatından izole ettikleri III-3-B selülaz enziminin optimum aktivitesini ph 8.0-10.0 arasında gösterdiğini belirtmişlerdir. 120 71 73 72 83 69 68 60 40 20 0 6 7 8 9 10 11 12 13 ph Değerleri Şekil 1. Bacillus sp. CY-3 selülaz enziminin optimum aktivite gösterdiği ph aralığı Enzimin Optimum Aktivite Gösterdiği Sıcaklık Aralığına Ait Bulgular Spektrofotometrik ölçümler sonucunda, enzim 60 dk lık inkübasyon sonunda 20-110 ºC aralığında yüksek bir katalitik aktiviteye sahiptir. Optimum katalitik aktivite ºC de gerçekleşirken, 90-110 ºC aralığında %93 aktivitenin oluşması enzimin hiper termofil özellikte olduğunu göstermektedir. Elde edilen sonuçlar şekil 2 de gösterilmiştir. - 55 -
Kalan Relatif Enzim Aktivitesi (%) Relatif Enzim Aktivitesi (%) Ç.Ü Fen ve Mühendislik Bilimleri Dergisi Yıl:2012 Cilt:27-1 Enzimin Termal Stabilitesine Ait Sonuçlar Aktivite analiz sonunda enzim, ön inkübasyonunun gerçekleştirildiği bütün sıcaklıklarda orijinal aktivitesini minumum %86.36 oranında korurken, ºC de kalan aktiviteyi değeri %90 olarak ölçülmüştür. Bu sonuçlar enzimin termostabil özelliğe sahip olduğunu göstermektedir. Elde edilen veriler şekil 3 te gösterilmiştir. Aygan ve Arıkan (2008), Bacillus sp. C14 suşundan izole ettikleri selülaz enziminin 20-40 ºC arasında 30 dk lık ön inkübasyonun ardından orijinal aktivitesini yaklaşık %89 koruduğunu saptamışlardır. 110 90 70 76 76 75 82 86 93 70 60 50 40 20 30 40 50 60 70 90 110 İnkübasyon Sıcaklıkları (ºC) Şekil 2. Bacillus sp. CY-3 selülaz enziminin optimum aktivite gösterdiği sıcaklık aralığı 105 95 90 85 75 70 65 60 90 86 87 87 88 88 86 85 86 84 85 Kont 20 30 40 50 60 70 90 110 120 Ön İnkübasyon Sıcaklıkları (ºC) Şekil 3. Bacillus sp. CY-3 selülaz enziminin sıcaklık stabilitesi sonuçları Enzimin ph Stabilitesine Ait Sonuçlar Analiz edilen ph değerleri incelendiğinde orijinal enzim aktivitesinin ph 6.0-12 arasında yaklaşık ortalama %68 oranında koruduğu saptanmıştır. En yüksek stabilizasyon %72 ile ph 8.0 de gerçekleşmiştir. Sonuçlar şekil 4. te gösterilmiştir. - 56 -
Kalan Relatif Enzim Aktivitesi (%) Ç.Ü Fen ve Mühendislik Bilimleri Dergisi Yıl:2012 Cilt:27-1 120 68 70 72 67 66 66 66 60 40 20 0 Kont 6 7 8 9 10 11 12 ÖN inkübasyon Gerçekleştirilen ph Değerleri Şekil 4. Bacillus sp. CY-3 selülaz enziminin ph stabilite sonuçları Tartışma ve Sonuçlar Katı besiyerindeki üreme ve enzim sentezleme yeteneği göz önünde tutularak enzim üretimi için seçilen Bacillus sp. CY-3 suşuna ait CMCaz enzimi optimum katalitik aktivitesini ph 9.0 da gösterirken, bütün ph değerlerinde ortalama %77 aktivite saptanmıştır. Enzim alkali özellik göstermekle beraber ph 6.0-12.0 aralığında ki bütün uygulamalar için kullanılabilecek özelliktedir. Literatür bilgileri ile karşılaştırıldığında Shanmughapriya ve ark (2010) nın sonuçları ile tam bir uyumluluk gözlenmektedir. Shanmughapriya ve ark (2010) Marinobacter sp. MSI032 suşundan izole ettikleri selülaz enziminin optimum aktivitesini ph 9.0 da gösterdiğini bildirmişlerdir. İzolasyonu gerçekleştirilen CY-3 CMCaz enzimi optimum katalitik aktivitesini C de göstermiştir. Bununla birlikte, enzim 20-60 ºC aralığında ortalama %74.25, 60-110 ºC aralığında ise %87 relatif aktiviteye sahiptir. Enzimin 60 dakika süreyle 90-110 ºC aralığında %93 düzeyinde aktivite göstermesi hiper termofil özelliğin göstergesidir. Enzimin bu özelliği, özellikle 90- ºC aralığında yaklaşık 60 dakika uygulama gerektiren tekstil endüstrisi için oldukça önemli bir kullanım olanağı oluşturmaktadır. Literatürlerde Bacillus sp suşuna ait selülaz (CMCaz) enziminin optimum aktivitesini 70 ºC, Bacillus licheniformis suşuna ait enzimin 65 ºC ve termofilik bakteriden üretilen enzimin ise 75 ºC de gösterdiği belirtilmektedir (Mayende ve ark., 2006; Bischoff ve ark., 2006). Bacillus sp. CY-3 suşundan izole edilen CMCase enzimine ait optimum aktivite sıcaklığı bütün literatür verilerinden oldukça yüksektir. CY-3 CMCaz enzimi 60 dk süreyle 20-120 ºC aralığındaki sıcaklıklarda ön işleme tabi tutulduğu zaman bütün sıcaklıklarda orijinal aktivitesini minumum %84 oranında koruduğu saptanmıştır. Özellikle ºC de orijinal aktivitenin yaklaşık %90 oranında devam etmesi enzimin termostabil olduğunun göstergesidir. Annamalai ve ark (2011), Bacillus lichenifornis AU01 suşundan izole ettikleri - 57 -
selülaz enziminin orijinal aktivitesini ºC de %85, 90ºC de ise %51 oranında koruduğu saptanmıştır. Literatür verileri dikkate alındığı zaman Bacillus sp. CY-3 CMCaz enziminin yüksek düzeyde termostabil olduğu görülmektedir. Bu özellikleri nedeni ile selülozik materyalin hidrolizi (hidrolizasyonda daima ºC nin üzerindeki yaklaşık 60 dakikalık sıcaklıklar kullanılır) ve biyoetanol üretiminde kullanımı için ideal özellikler göstermektedir. CY-3 CMCase enzimi ph 6.0-12.0 aralığında 24 saat süreyle ön inkübasyona bırakılmış ve orijinal aktivitesini ortalama %70 oranında koruduğu saptanmıştır. Bu özellik analiz edilen enzimin yüksek düzeyde ph stabil olduğunu göstermektedir. Literatürde elde edilen stabilite değerinin Bacillus endoglukanaz enzimleri için karakteristik olduğu bildirilmiştir (Mawadza ve ark, 2000). Aygan ve Arıkan (2008), Bacillus sp. C14 suşundan izole ettikleri selülaz enziminin 50 ºC de 24 saat lik ön inkübasyondan sonra ph 6.0-12.0 arasında orijinal aktivitesini %65 ten fazla koruyarak stabil olduğunu saptamışlardır. Analizi gerçekleştirilen enzime ait ph stabilite sonuçları literatür verileri ile uyumluluk göstermektedir. Bacillus sp.cy-3 CMCase enziminin optimum ºC de aktivite göstermesi, ºC de %90 stabil olması ve alkali özellik göstermesi nedeni ile tekstilde tüylenmenin giderimi işlemlerini tek başına yaparak önemli miktarda enerji tasarrufu ve çevre kirliliğinin önlenmesine çok önemli katkı yapması söz konusudur. Kaynaklar ANNAMALAI N., THAVASI R., VIJAYALAKSHMI S. and BALASUBRAMANIAN T., 2011. A novel thermostable and halostable carboxymethylcellulase from marine bacterium Bacillus licheniformisau01. World J Microbiol Biotechnol. 27: 2111-2115. ARIKAN, 2008. Highly thermostable, thermophilic, alkaline, SDS and chelator resistant amylase from a thermophilic Bacillus sp. isolate A3-15. Bioresource Technology. AYGAN, A., and ARIKAN, B., 2008. A new halo-alkaliphilic, thermostable endoglucanase from moderately halophilic Bacillus sp. C14 isolated from Van Soda Lake. International Journal of Agriculture, 4: 369-374. AYGAN, A., 2008. Haloalkalofil Bacillus sp. İzolasyonu, Amilaz, Selülaz ve Ksilanaz Enzimlerinin Üretimi, Karakterizasyonu ve Biyoteknolojik Uygulamalarda Kullanılabilirliği. Ç.Ü. FBE. Doktora Tezi. BISCHOFF K.M., ROONEY A.P., LI X.L., LIU S., AND HUGHES S.R., 2006. Purification and characterization of a family 5 endoglucanase from a moderately thermophilic strain of Bacillus licheniformes. Biotechnol Lett. 28:1761-1765. - 58 -
FUJINAMA, S. AND FUJISAWA, M., 2010. Industrial applications of alkaliphiles and their enzymes- past, present and future. Environmental Technology, 31(8): 845-856. HOUGH,D.W AND DANSON,M,J. 1999. Extremozymes. Current Opinion in Chemical Biology. 3: 39-46. CORAL, G., ARIKAN, B., ÜNALDI, M.N., and GÜVENMEZ, H., 2002. Some Properties of Crude Carboxymethyl Cellulase of Aspergillus niger Z10 Wild-Type Strain. Tübitak. 26: 209-213. STERNER, R. and LIEBL, W. 2001. Thermophilic adaptation of proteins. Crit.Rev. Biochem Mol. 36: 39-106. VOGET, S., STEELE, H. L., and STREIT, W. R., 2006. Characterization of a metagenome-derived halotolerant cellulase. Journal of Biotechnology. 126 : 26-36. MAYENDE, L., WILHELMI, B.S., and PLETSCHKE, B.I., 2006. Cellulases (CMCases) and polyphenol oxidases from thermophilic Bacillus spp. isolated from compost. Soil Biology & Biochemistry, 38:2963-2966. THEATHER R.M. and WOOD P.J., 1982. Use of congo red-polysaccaride interaction in enumeration and characterization of cellulilytic bacteria from the bovine rumen. Appl Environ Microbiol 38:148-158. LIU S.L., CHEN W.Z., WANG Y., LIU G., YU S.W., AND XING M., 2008. Purification and Characterization of a novel neutral β-glucanase and an alkaline β-glucanase from an alkaliphilic Bacillus isolate. World J Microbiol Biotechnol 24:149-155. SARAÇOĞLU, Z.N., 2010. Cellulase-free alkaline xylanase enzim üreticisi Bacillus sp. suşlarının izolasyonu, enzim üretimi, karakterizasyonu ve biyoteknolojik kullanım olanaklarının araştırılması. Ç.Ü.FBE. Yükseklisans Tezi. SHANMUGHAPRIYA, S., KIRAN, S. G., SELVIN, J., THOMAS, T. A., RANI, C., 2010. Optimization, purification, and characterization of extracellular mesophilic alkaline cellulase from sponge-associated Marinobacter sp. MSI032. Appl Biochem Biotechnol, 162:625 640. MAWADZA, C., HATTI-KAUL, R., ZVAUYA, R., AND MATTIASSON, B., 2000. Purification and characterization of cellulases produced by two Bacillus strains. Journal of Biotechnology 83: 177 187-59 -