İNDÜKTE BALGAM Prof. Dr. Betül Ayşe Sin Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Göğüs Hastalıkları Anabilim Dalı Allerjik Hastalıklar Bilim Dalı
Tarihçe Eski Yunan da Hipokrat: Phlegm 1980 HIV li hastalarda Pneumocystis carinii pnömonisi 1992 Pin ve ark. (astım) FE Hargreaves ve ark. (yöntemin geliştirilmesi)
BALGAM Disülfid bağlarıyla birbirine tutunan glikoproteinleri içeren, submukozal bezlerden salgılanan jelatinöz bir madde olan mukus ve asılı bulunan hücrelerden oluşan bir materyaldir
Normal şartlarda balgam spontan olarak çıkmaz Balgam elde etmek için indüksiyon yapılmalıdır Amaç Astım ve diğer solunum sistemi hastalıklarında havayolu inflamasyonunun özelliklerini incelemek için spontan olarak balgam çıkaramayan hastalarda alt havayollarından yeterli miktarda sekresyon örneği toplamaktır
HAVAYOLU İNFLAMASYONU İDEAL TEST NEDİR? Non-invaziv direkt tanı yöntemi Basit, güvenilir, geçerli
İndükte Balgam Havayolu hastalıkları Astım KOAH Kronik öksürük Eozinofilik bronşit
İndükte Balgam Diğer solunum sistemi patolojileri Tüberküloz Akciğer kanseri Kistik fibrozis Sarkoidozis İnterstisyel akciğer hastalıkları Ekstrensek allerjik alveolit Mesleki toz hastalıkları (asbestoz, karbon ve mineral partikülleri) Mantar sporu, polen maruziyeti Hücre içi bakterileri saptamak
İndükte Balgam Sol ventrikül yetmezliği (hemosiderin yüklü makrofajlar) Soğuk algınlığı (nötrofilik inflamasyon)
YÖNTEM Balgamın indüklenmesi İşlemden geçirilmesi (hücre ve sıvı faz analizi için) İnflamatuvar belirteçlerin okunması Klinik çalışmalarda ve klinik pratikteki değeri
İşlem sırasında önemli konular Malzeme, personel Öncesinde bronkodilatör tedavi Akciğer fonksiyonunun takibi Salin solüsyonu konsantrasyonu Nebülizatörden aerosolün çıkış hızı İnhalasyon süresi Ekspektorasyon tekniği Balgam indüksiyonu sıklığı
%4 ve %5 hipertonik salin hazırlanması -1 Gerekli malzemeler 8 tane steril 50 ml Falcon tüp 2 tane steril ölçekli plastik bardak 2 tane steril filtre (0.22 μm çap) 30 cc lik steril şırınga 1 tane steril cam pipet Toz NaCl (Sigma ) Steril distile su (non-pirojen, ph=5.5)
%4 ve %5 hipertonik salin hazırlanması -2 Hassas terazide 2 tane plastik kapta 4 g ve 5 g kuru toz NaCl tart Plastik ölçekli 2 tane 100 ml steril bardak içine non-pirojen distile su koy ve üzerine NaCl tozu ekle. İyice çözülene kadar bekle Steril 30 ml enjektörün iç tıpasını çıkar ve steril filtreyi bu enjektörün ucuna tak Bu şekilde 50 ml Falcon tüpün üstüne yerleştir
%4 ve %5 hipertonik salin hazırlanması -3 Bardakta çözülen solüsyonu bu tüpün üstüne yerleştirilen enjektörün 25 ml lik kısmına kadar ilave et İç tıpa alınarak ucundaki siyah lastikli kısmı enjektörün içine oturt Yukarıdan aşağı doğru pistonu yavaş yavaş iterek bu sırada Falcon tüpe filtreden sıvıyı süz
MEKANİZMA Direkt Havayolunu döşeyen sıvının ozmolaritesinde İndirekt Mast hücre aktivasyonu Duyu siniri uçlarının uyarılması Bronş mukozasında damar permeabilitesi Submukozal bezlerde mukus yapımı Havayolu lümenindeki sekresyonların klirensinin
Altın standart teknik yok Ancak geçerli olanlar var
Yüksek out-put ~1 ml/dk Ultrasonik nebulizatörle (De Vilbiss Ultra Neb 99) İzotonik (%0.9) veya hipertonik (%3, %4, %5) NaCl (salin) solüsyonu aerosol halinde Farklı zaman periyotlarında (5 dk, 7 dk) toplam 3 kez inhale ettirilir (12-30 dk) Bu sırada hastaya belli komutlar verilerek ayrı bir kaba tükürmesi, steril bir kaba balgam çıkarması söylenir
Tüplerin Bağlanması 2pc Hipertonik salin Aquapack (20 ml HS) 4 parça Distile su T-tube 1 pc ağızlık (mouth piece)
Hasta için öneriler 1 Öncesinde diş fırçalanır Nebülizasyon sırasında postür, oturur ve dik pozisyonda olmalıdır Buruna klip takılabilir Buharı ağızlıktan inhale eder Bu süre boyunca tidal solunum yapar ve her 20 sn de bir kez yavaş derin nefes alır
Hasta için öneriler 2 Yassı epitel hücre kontaminasyonunu azaltmak için İnhalasyon sırasında aşırı tükrük olursa ayrı bir kaba tükürür Her indüksiyon periyodu sonunda burnunu temizler, ağzını ve boğazını suyla çalkalar ve yutar, ağız mukozasını gazlı bezle tahriş etmeden kurular Hafifçe öne eğilerek derin bir öksürükle steril petri kabına balgam çıkarır
Balgam İndüksiyonu - 1 Hastaya işlem hakkında ayrıntılı bilgi verilir Bazal SFT ölçülür (pre-bronkodilatör FEV 1, en az 3 kez) 2 puff (200 μg) salbutamol (MDI + spacer) ile inhale ettirilir 10-15 dk sonra FEV 1 ölçülür (post-bronkodilatör) Eğer post-bronkodilatör FEV 1 >%60 (beklenen) ya da >1 lt ise devam edilir
Balgam İndüksiyonu 2 Pirojensiz steril hipertonik salin ya sabit konsantrasyonda (%3 veya %4.5) ya da artan konsantrasyonlarda (%3,4,5) kullanılır (20 ml) 5 veya 7 dk arayla (<21 dk/toplam) indüksiyon yapılır. (Ya da; 1,4 ve 5 dk, sonra 3 kez 5 dk arayla) Her indüksiyon periyodu sonunda FEV 1 ölçülür
Balgam İndüksiyonu 3 Yeterli miktar ve kalitede balgam çıkaramaz ise %4 ve %5 salin ile devam edilir. Ancak FEV 1 de düşüş %10 veya 200 ml den fazla olmamalıdır Eğer post-bronkodilatör FEV 1 e göre %10 veya 200 ml den fazla, ancak %20 ya da 400 ml den az FEV 1 düşmüş ise diğer 7 dk aynı salin konsantrasyonu kullanılır
Balgam İndüksiyonu 4 FEV 1 en iyi post-bronkodilatör değerin %20 (veya 400 ml) sinden fazla düşerse ya da semptom olursa işleme son verilir Hasta 2 puf kısa etkili β2 agonist ile tedavi edilir FEV 1 bazal değerin %5 ine kadar yükselmesi için hasta izlemde tutulur
Yüksek riskli hastada alternatif protokol - 1 İşlem öncesi hastaya gerekli bilgi sunulur Güvenlik önlemi alınır. Ekipman hazırlanır Bronkodilatör öncesi FEV 1 ölçülür 200 μg inhale salbutamol verilir 10-15 dk sonra post-bronkodilatör FEV 1 ölçülür (%20 düşüş değeri hesaplanır) %0.9 steril salin solüsyonuyla başlanır; 30 sn, 1 dk ve 5 dk inhale ettirilir, her periyot sonrası FEV 1 değeri ölçülür
Yüksek riskli hastada alternatif protokol 2 Balgam çıkaramazsa HS %3 e arttırılır, 30 sn, 1 dk ve 2 dk inhalasyon yapar Yine yeterli balgam yoksa %4.5 a arttır. 30 sn, 1 dk, 2 dk, 4 dk ve 8 dk süreyle inhalasyon yapar Her indüksiyon süresi sonunda FEV 1 ölçüm Post-bronkodilatör değere göre FEV 1 de >%20 düşüş ya da semptom olursa işlem durdurulur Hasta spontan olarak öksüremez ise 4-8 dk sonra öksürüp balgam çıkarması söylenir
Teknikte Önemli Noktalar Aynı kişide indüksiyonlar arasındaki inhalasyon süresi sabit tutulmalı 15-21 dk standart süre 2 indüksiyon arasında 48 saat ara olmalı İnhale edilen hipertonik solüsyonun volümü Solunum hızı (dakikada 1 kez hafif derin nefes alarak tidal solunum yapar)
Balgamın İşlenmesi 1 Tüm balgam örneği ya da gözle görülen visköz kısımlar ayrılarak 2 saat içinde işlemden geçirilmelidir 50 ml opak polipropilen santrifüj tüpün ağırlığını tart (polistiren tüp kullanma) Balgam örneğini bu tüpe transfer ederek ağırlığını tart Balgamın ağırlığını hesapla Fosfat tamponlu salin = PBS veya normal salin ile 1:10 dilüsyonda %0.1 DTT solüsyonunu günlük taze hazırla (9 ml PBS + 1 ml Sputolysin )
Dithiothreitol (DTT) Rezidüel mukusa hapsolmuş hücrelerin likefaksiyonla açığa çıkmasını sağlar Disülfit bağlarını parçalar. Bu bağlar müsinöz glikoproteinlerle çapraz bağ yaparak balgamı jel formunda tutar Çok az hücre hasarına yol açar Hücre eldesi için yararlı ancak bazı immünolojik teknikler için uygun değil
Balgamın İşlenmesi 2 Balgam miktarına eşdeğer volümde %10 Sputolysin ekle (1 ml DTT 1gr balgam) Bu karışım 3-5 kere (15 ) vortekslenir Tüpü bench rocker da oda ısısında 15 dk beklet (tam homojenizasyon için) (48 μm naylon gazlı bezden filtre edilebilir) Bu karışım 2500xg (+4 C) 15 dk (veya 300-1500xg, 10-15 dk) santrifüj et Üstte kalan süpernatanı pipetle 1 ml tüplere al ve -20,-80 C de sakla (soluble mediatör)
Balgamın İşlenmesi 3 Altta kalan hücre peleti, Ringerli laktat (veya PBS) ile resüspande edilerek volüm 1 ml ye tamamlanır, hafifçe karıştırılır 10 μl hücre süspansiyonu + 10 μl tripan mavisi ile hücre canlılığına bakılır (>%50) Bu karışımdan 10 μl alıp Neubauer manual hemositometride toplam hücre sayımı yapılır (ml deki hücre sayısı) Toplam hücre sayısı= (toplam hücre x karede/x kare)x10.000xörneğin volümü 2.600.000=104/1X10.000X2.5 cc
Balgamın İşlenmesi 4 Toplam hücre sayısından yassı hücre kontaminasyon yüzdesini hesapla (<%20 olmalı) Sitospin slaytta, optimal hücre (40-60x10 3 ) yoğunluğu elde etmek için uygun miktarda Ringerli laktat solüsyonu ile resüspande edilir (dilüsyon faktörü için TCC/160.000. 2.600.000:160.000=16.25 ml-2.5 ml= 14 ml RL ekle. Böylece her slaytta 40.000 hücre)
Balgamın İşlenmesi 5 Hücre konsantrasyonu 1x10 6 hücre/ml ye ayarlanır. 40-65 μl (450-650 x 10 3 hücre) hücre süspansiyonu her sitospine ilave edilir En az 6 kodlanmış sitospin hazırlanır. Her cytofunnel a 200 μl hücre süspansiyonu konur 600 rpm (22xg) de 6 dk santrifüj edilir (Shandon III Cytocentrifuge)
Balgamın İşlenmesi 6 24-48 saat havada kurumaya bırakılır Diff-Quick (Giemsa ve Wright) ile boyanır En iyi boyanan slaytlardan 400 intakt non-skuamöz toplam hücre sayılarak diferansiyel hücre dağılımı elde edilir Toplam hücre sayısının yüzdesi olarak ifade edilir Kodlanmış slaytlar çift kör okuyucular tarafından değerlendirilmelidir
İnvaziv yassı hücreli akciğer kanserinde indükte balgam örneği
Atipik mikobakteri enfeksiyonu olan hastanın indükte balgamında aside-rezistans basiller
Astımlı hastanın indükte balgam örnekleri
İndükte balgamda eozinofiller
Astımlı hastanın indükte balgamında eozinofil
KOAH lı hastanın indükte balgamında makrofajlar
J Allergy Clin Immunol 2002; 109; S100-101
Normal yetişkinde indükte balgamda diferansiyel hücre sayıları Hücre sayısı Median (%) Makrofaj 60.8 Nötrofil 36.7 Eozinofil 0.0 Lenfosit 0.5 Bronş epitel hücresi 0.3 Metakromatik hücre 0.0
İndükte Balgamın Klinik Anlamı HÜCRE TİPİ Eozinofilik Nötrofilik Lenfositik ARTIŞIN NEDENLERİ Kontrolsüz astım Astımsız eozinofilik bronşit Allerjen ve kimyasal duyarlandırıcı maruziyeti Steroide cevap veren kronik havayolu darlığı Sigara içmek Hava kirleticileri (ozon) Endotoksin İnfeksiyon Steroide dirençli astım Sarkoidozis Chlamydia pneumonia İnterstisyel akciğer hastalıkları
Balgam İndüksiyonu Erken alınan örnekler Santral hava yollarından geliyor, mukus fazla Geç alınan örnekler Surfaktan yüksek, periferik havayolu ve alveollerden geliyor
İndükte Balgam Bronş yıkaması Santral (proksimal) havayolu lümeninden gelen sekresyonlar Bronkoalveolar lavaj Periferik havayolu lümeninden Bronş biyopsisi Santral havayolu duvarından hücre örneği İndükte Balgam Eozinofil ve nötrofilden zengin, lenfosit ve makrofaj daha az
BRONKOSKOPİ İNDÜKTE BALGAM AVANTAJLARI Biopsi ve BAL alınabilir Yapısal değişiklikle ilgili bilgi verir İmmün histokimya, insitu hibridizasyon, elektron mikroskopi Segmental allerjen provokasyonu Bronşial yıkama (invitro çalışma için hücre eldesi) Nispeten noninvaziv Proksimal havayolundan direkt örnekler alınabilir Tekrarlanabilir Geçerlidir Basit, pratik, ucuz ve güvenilir Geniş sayıda hastada çalışma mümkün DEZAVANTAJLARI Eğitimli personel ve pahalı ekipman İnvaziv Alveolar ve bronşiyal materyal karışabilir Kanla kontamine olabilir Biopsi örneği sadece büyük havayolundan alınabilir Hücre sayısı verimliliği düşük Bronkokonstriksiyon riski var Başarı oranı ~%80 İşlenme yöntemi biraz fazla iş yükü gerektiriyor Hemen sonuç alınamıyor (zaman sorunu var) (en az 100 dakika gerekli)
Balgam inceleme yönteminin, özel tekniklerin uygulanmasını kolaylaştırmak amacıyla daha standart hale gelmesi ve geliştirilmesi gereklidir
Özel Teknikler Flow sitometri İn situ hibridizasyon PCR İmmün sitokimyasal boyanma İn vitro hücre kültürü Genetik analiz
Cevap Bekleyen Sorular Güvenilir hücre sayıları için en düşük kabul edilebilir hücre viabilitesi Hücreler ve sıvı fazda yapılacak ölçümler üzerinde balgamın işlenme zamanının uzamasının etkisi Sıvı faz ve hücreler üzerinde sallamaya karşı sabit durmanın etkisi Hücre morfolojisinde santrifüj hızının etkisi Hücre sayısı ve sıvı faz için naylon filtreden geçirmenin etkisi
Dr. F. Özer Atopik astımlılarda antilökotrien tedavinin, allerjenle uyarılan havayolu enflamasyonu üzerine etkisi (2003) Dr. Ö. Abadoğlu The effect of montelukast on eosinophil apoptosis: induced sputum findings of patients with mild persistent asthma. (Allergol Immunopathol 2005; 33: 105-11) Dr. E. Kurt The effect of natural pollen exposure on eosinophil apoptosis and its relationship to bronchial hyperresponsiveness in patients with seasonal allergic rhinitis. (Ann Allergy Asthma Immunol 2005; 95: 72-8) Dr. A. Berna Dursun Mevsimsel allerjik rinitli hastalarda indükte balgam örneklerinde sisteinil lökotrien ve matriks metalloproteaz-9 ile doku matriks metalloproteaz inhibitör-1 düzeylerinin değerlendirilmesi ve bu faktörlerin bronş aşırı duyarlılığı ile ilişkisinin araştırılması (2006)