in Vitro Diagnostik Kullanım için REF TV31-100/2FRT 2x 100 VER 02.11.2009 RotorGene 3000/6000 (Corbett Research), iq icycler ve iq5 (Biorad), MX3000P ve MX3005P (Stratagene), SmartCycler (Cepheid), Applied Biosystems 7300/7500 Real Time PCR Systems (Applera) ile kullanılan Real Time Kit HPV High Risk Screen Real-TM Quant 2x Kullanılan Semboller Liste Numarası in vitro Diagnostik Kullanım için Sıcaklık limiti Dikkat! Lot Numarası Son Kullanma Tarihi VER Versiyon Üretici Reaktif İçerir İSİM HPV High Risk Screen Real-TM Quant 2X GİRİŞ HPV genital enfeksiyonu dünyada viral etyolojinin en sık cinsel yolla bulaşan hastalıklarından (STDs) biridir (farklı ülkelerde cinsel açıdan aktif genç kadınlarda 20% - % 46 oranında görülür). Servikal kanseri dünyada kadınlarda en sık görülen ikinci kanserdir ve klinik, moleküler, epidemiyolojik ve deneysel kanıt ile dünyada cinsel yolla iletilen bazı HPV genotip ve servikal neoplazi arasında etyolojik ilişki kuruldu. Servikal Intraepithelial Neoplasia (CIN Sınıf I III) in farklı sınıflarından HPV genotipin tespit frekansına dayalı olarak HPV genotip, High-risk HPV tip (16, 18, 31 ve 45), Intermediate-risk tip (33, 35, 39, 51, 52, 56, 58, 59, ve 68), ve Low-risk tip (6, 11, 42-44) olarak ayrılmıştır. Birkaç yöntem Pap yayılması, elektron mikroskobu, immunositokimya ile sitolojik tarama, klinik gözleme sahip HPV klinik veya subklinik enfeksiyon teşhisi için kullanılmıştır, fakat bu yöntemler standartdizasyon olmaması, subjektiflik, yetersiz duyarlılık ve tahmin edilebilir düşük değer gibi dezavantajlara sahiptir. HPV teşhisinin en perspektif yolu polimeraz zincir reaksiyonu tarafından yüksek kanserojen riskli Human Papilloma virüsünün DNA dan doğrudan tespitidir. Servikal displazisi için rutin taramada Pap yayılma değeri tam olarak bilinmez iken, servikal kanser vakalarının % 99 da Human Papilloma virüsü (HPV) on iki genotipli enfeksiyonundan kaynaklandığı şimdi bilinmektedir. Bu yüksek-riskli genotiplerin belirlenmesi servikal karsinom yönetiminde, hem bir prognostik gösterge olarak hem de Pap yayılma sonuçlarının kesin
olmadığı ikinci bir tarama testi olarak çok önemlidir. Pap yayılma ve HPV DNA testinin kombinasyon gelen sonuçlar tarama için aralıklarla belirlemeye yardımcı olabilir. PCR a dayalı yöntemler, servikal swablar veya skrapes, servikovajinal lavaj, dondurulmuş biyopsiler ve formaline sabitlenmiş parafin-gömülü doku gibi klinik örneklerden alınan genital HPV genotiplerinin tiplenmesi ve tespiti için başarılı şekilde kullanıldı. KULLANIM AMACI HPV High Risk Screen Real-TM Quant 2x ürogenital swablarda Human Papillomavirus (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59) in kantitatif tespiti için in vitro Real Time amplifikasyon testidir. Bunun anlamı, viral yük parametresi bir prognostik değere sahiptir ve swabta 10 5 HPV genomik eşdeğerinden daha az olan viral yük yada 10 5 hücreleri için 10 3 genomik eşdeğerleri önemsiz olarak kabul edilir ve geçici enfeksiyonun varlığını gösterir ancak yükün bu tür düzeyi tedavi izleme vakasında sadece bir değere sahip olabilir. 10 5 hücre için 10 5 genomik eşdeğerden fazla viral yük yüksek öneme sahiptir ve displastik değişiklikler veya yüksek risk varlığını gösterir. Viral yükün kantitatif tespiti enfeksiyonun karakterini değerlendirmeyi ve hastalık aşamasında bununla ilgili tahmin yapmayı sağlar. HPV High Risk Screen Quant, Human Papilloma virüsün onkogenik 12 genotipini tespit eder. Human Papilloma virüsü bir hücre içi faktör olduğundan yanlış negatif sonuçları önlemek için örnekte hücresel materyalin varlığını izlemesine ihtiyacı vardır. HPV High Risk Screen Quant kiti örnekte hücresel materyalin varlığının kontrolünü sağlayan internal kontrol (insan beta-globine gen) içerir. TEST PRENSİBİ Kit HPV High Risk Screen Real-TM Quant 2X iki temel aşamaya dayanır: örneklerden DNA izolasyonu ve E1-E2 alaında gen HPV (Joe kanalı) in Real Time amplifikasyon ve β-globine gen İnternal Kontrol (Fam kanalı) olarak kullanılır. PCR-mix-1-FRT A9 tüp, A9 grupun (HPV types 16, 31, 33, 35, 52, 58) bölgesine direk olarak karşı primerler içerir ve PCR-mix-1-FRT A7+ A7 grup (18, 39, 45, 59), HPV A5 grup (51) ve A6 grup (56) bölgesine direk olarak karşı primerler içerir. Eğer swab tam olarak hazırlanmazsa (yüksek miktarda mukoz ya da yetersiz miktarda epitel hücre), İnternal kontrol tespit edilemez. Bu kit, viral yük belirlenmesi sağlayan HPV DNA ın bilinen konsantrasyonlu kantitatif standardını içerir. Viral yükün hesaplanması için, örnek hazırlama sırasında olası hataları elimine etmeyi sağlayan genomik DNA'ın miktarı ve elde edilen HPV DNA konsantrasyonu arasındaki ilişki kullanılır. KİT İÇERİĞİ Part N 1 DNA-Sorb-A/100 : örnek hazırlama; Part N 2 HPV High Risk Screen Real-TM Quant 2X : Real Time amplifikasyon. Part N 3 Sonuç yorumlamak için Microsoft Excel format da programlama Part N 1 DNA-sorb-A/100 : Lizis Solüsyonu, 2 x 15 ml; Yıkama Solüsyonu, 2 x 50 ml; Sorbent, 2 x 1,0 ml; DNA-elüent, 2 x 5 ml; Transport medium, 2x15 ml. 100 test için gerekli reaktifler içerir. Part N 2 HPV High Risk Screen Real-TM Quant 2X : PCR-mix-1-FRT A9 (mavi kapak), 6 x 0,14 ml; PCR-mix-1-FRT A7+ (yeşil kapak), 6 x 0,14 ml; PCR-mix-2 buffer, 6 x 0,30 ml; TaqF DNA Polymerase, 6 x 0,02 ml; QS HPV K1, 3 x 0,04 ml (mix HPV DNA C+ 16, 18 ve insan DNA)**; QS HPV K2, 3 x 0,04 ml (mix HPV DNA C+ 16, 18 ve insan DNA); QS HPV K3, 3 x 0,04 ml (mix HPV DNA C+ 16, 18 ve insan DNA); Negative Control, 1,2 ml;* DNA-buffer (C-), 0,5 ml;
108 örnek için gerekli reaktif içerir. *Ekstraksiyon Negatif Kontrol olarak izolasyon prosedüründe kullanılmalı ** Standardların konsantrasyonu her lot için spesifiktir (HPV High Risk Screen Real-TM Quant Data Card da bildirildi) GEREKLİ FAKAT SAĞLANMAYAN MATERYALLER Zone 1: Örnek hazırlama: Biyolojik kabin eppendorf tipi tüpler için masa mikrosantrifüj (RCF max. 16,000 x g); Eppendorf 5415D ya da benzeri 60 C ± 2 C kuru ısı bloğu Vorteks mikser Aerosol bariyerli pipetörler (5-40 μl; 40-200 μl; 200-1000 μl) 1,5 ml polipropilen steril tüpler (Sarstedt, QSP, Eppendorf) Tek kullanımlık eldivenler, pudrasız Tüpe racks Zone 2: Real Time amplifikasyonu: Real Time Thermalcycler Tüpler Workstation Aerosol bariyerli pipetörler ( 0,5-10 µl; 5-40 µl kapsiteli) Tüp rackları UYARILAR VE ÖNLEMLER 1. Lizis Solusyonu, guanidine thiocyanate içerir. Guanidine thiocyanate, solunursa, deri ile temas ederse ya da yutulursa zararlıdır. Asitler ile teması toksik gaz oluşumuna neden olur. (Xn; R: 20/21/22-36/37/38; S: 36/37/39). 2. Örnekler ve reaktifler ile çalışırken tek kullanımlık eldivenler, laboratuar giysileri ve göz koruyucuları kullanın. 3. Ağızla pipetleme yapmayın. 4. Laboratuar çalışma alanında yemek yemeyin, bir şey içmeyin, kozmetik uygulamayın ya da kontak lenslerini ellemeyin. 5. Son kullanma tarihi geçmiş kitleri kullanmayın. 6. Tüm örnekleri ve kullanılmayan reaktifleri yasal düzenlemelere göre yok edin. 7. Örnekler potansiyel enfeksiyon ajanı olarak kabul edilmeli ve biyolojik kabinlerde Biyogüvenlik Seviye 2 ya da diğer uygun biyogüvenlik pratiklerine göre çalışılmalıdır. 8. Dökülen tüm örnekler ya da reaktifleri 0,5% sodyum hipoklorit ya da uygun diğer dezenfektanlar ile temizleyin. 9. Örnekler ve reaktiflerin deri, gözler ve mukoz membranlar ile temasından kaçının. Eğer bu solüsyonlar ile temas ederse bol su ile yıkayın ve doktorunuza başvurun. 10. Material Safety Data Sheets (MSDS) istenildiğinde verilebilir. 11. Bu kit DNA-Sorb ekstraksiyon kit ile kullanılmak için tasarlanmıştır. Eğer DNA-Sorb dan başka bir kit ile DNA ekstraksiyonu yapılıyorsa, bu kullanıcı sorumludur. 12. Bu kiti ancak PCR tekniği bilgisi olan kişiler kullanmalıdır. 13. Laboratuardaki iş akışı Ekstraksiyon alandan başlayıp Amplifikasyon ve Tespit alanlarına doğru tek bir kişinin yönetiminde olmalıdır. Örnekleri, ekipmanları ve reaktifleri bir önceki çalışma alanına geri götürmeyin. SAKLAMA KOŞULLARI DNA-sorb-A/100 +2-8 C de saklanabilir. HPV High Risk Screen Real-TM Quant 2X -20 C de saklanabilir. Kit 3-4 boyunca 2-8 C de taşınabilir fakat 2-8 C de ve -20 C de saklanmalıdır.
KARARLILIK HPV High Risk Screen Real-TM Quant 2X Test kit etiketi üzerinde belirtilen son kullanma tarihine kadar stabil kalır. Ürünün performansı etiket üzerinde yazılı kontrol tarihi ile sağlanacaktır. Işık, ısı ya da neme maruz kalmak bazı kit bileşenlerin raf ömrünü etkileyebilir. Tekrarlanan çözdürme ve bu reaktiflerin dondurulması duyarlılığı azaltabildiği için bu durumdan kaçınılmalıdır. ÖRNEK SAKLAMA, TOPLAMA VE TRANSPORT Aşağıdaki numunelerden HPV High Risk Screen Real-TM Quant 2X, DNA-Sorb-A (REF K-1-1/A) ile ekstre edilmiş DNA analiz edebilir: Servikal swablar: Bir pamuk veya polyester swab kullanarak servikal ağzından ve ektoserviksin çevresinden fazla mukusu alın. Bu swabı atın. En büyük kıl ektoservikse dokunana kadar servikal ağız içine 1.0-1.5 cm Örnekleme Servikal Fırça yerleştirin. Servikal kanal içine tamamen fırça takmayın. Kanaldan uzaklaştırarak saat yönünün tersi yönünde, 3 kere tam çevirerek fırçayı döndürün. 0,5 ml Transport ortamı (Sacace) ile nükleaz-free 2,0 ml tüp içine fırçayı yerleştirin. 15-20 saniye boyunca ortamda fırçayı şiddetlice sallayın. Tüp içinde fırçayı sonda bırakarak skorlanmış çizgide sapını koparın. doku mekanik homojenizör ile homojenize edilmiş ve PBS sterilde çözülmüş (önerilen DNA-Sorb-C REF K-1-6/50 bu kitte dahil değildir, ama ayrı ayrı sipariş edilebilir) Sıvı-bazlı sitoloji numuneler (Cytoscreen, PreservCyt) (bu kitte önerilen DNA-Sorb-D REF K-1-8/100 dahil değildir ama ayrı ayrı sipariş edilebilir) Toplamadan hemen sonra örneklerin çalışılması önerilir. 24 saatten daha uzun olmamak kaydıyla örnekleri 2 8 C de ya da daha uzun saklamak için 20/80 C de saklayın. Klinik örneklerin transportu, etiyolojik faktörlerin transportu için ülkesel, federal, lokal ve yasal düzenlemelere göre yapılmalıdır. ÖRNEK VE REAKTİF HAZIRLAMA 1. Lizis Solusyonu ve Yıkama Solusyonu (diğerleri +2-8 C de saklanmasına rağmen) buz kristalleri çözülene kadar 60 65 C ye kadar ısıtılır. Bir tüpte Ekstraksiyonun Negatif Kontrolü olacak şekilde gerekli miktarda 1,5 ml polipropilen tüpler hazırlayın. 2. Herbir tüpe 300 μl Lizis Solusyonu ekleyin. 3. Uygun tüplere 100 μl Örneklerden ekleyin. 4. Aşağıdaki gibi Kontrolleri ekleyin: Cneg işaretli tüpe 100 μl C (Negatif Kontrol amplifikasyon kiti ile sağlanır) ekleyin. 5. Tüpleri vorteksleyin ve 65 C de 5 dakika inkübe edin. 5-7 saniye santrifüj edin. Eğer numune tamamen çözülmemişse, maksimum hızda (12000-16000) 5 dakika yenicen santrifüj etmenizi ve supernatantı DNA ekstraksiyonu için yeni bir tüpe aktarmanızı öneririz. 6. Sorbenti şiddetlice vorteksleyin ve her bir tüpe 20 μl ekleyin. 7. 5-7 saniye vorteksleyin ve tüm tüpleri oda ısısında 3 dakika inkübe edin. Bu adımı tekrar edin. 8. Tüm tüpleri 5000g de 30 saniye santrifüj edin ve aerosol bariyerli mikropipet kullanarak pellete zarar vermeden her bir tüpten dikkatlice supernatantı atın. Yeni bir tüpe geçerken pipet ucunu değiştirin. 9. Her bir tüpe 500 μl Yıkama Solusyonu ekleyin. Şiddetlice vorteksleyin ve 10000g de 30 saniye vorteksleyin. Her bir tüpten supernatantı atın. 10. Aşama 9 u tekrar edin ve tüm tüpleri kapakları açık şekilde 65 C de 5-10 dakika inkübe edin. 11. Pelleti 100 μl DNA-eluent içinde yeniden süspense edin. 65 C de 5 dakika inkübe edin ve periyodik olarak vorteksleyin. 12. Tüpleri 12000g de 1 dakika santrifüj edin. 13. Supernatant amplifikasyon için hazır DNA içerir. Eğer amplifikasyon, ekstraksiyon ile aynı günde yapılmayacaksa hazırlanan örnekler maksimum 5 gün için 2-8 C de saklanabilir ya da 20 /-80 C de dondurulabilir.
PCR REAKTİGLERİ HAZIRLAMA: 1. Gerekli miktarlarda tüpler hazırlayın. 14 örnek için Mix hazırlayın : 14 örnekten daha az Miks hazırlayın (N + 4 kontroller): PCR-mix-2 buffer 20 µltaqf DNA Polimeraz içeren tüpe ekleyin. Tüpü vorteksleyin ve 2-3 saniye santrifüj edin. 15*(N+5) µl PCR-mix-2 buffer ve 1,0*(N+5) TaqF DNA Polymerazı yeni steril tüpe ekleyin. Tüpleri vorteksleyin ve 2-3 saniye boyunca santrifüj edin. 2 yeni tüp hazırlayın ve FRT A9 işaretli yeni bir tüpe 7*(N+5) µl PCR-mix-1-FRT A9 ve FRT A7+ işaretli ikinci bir tüpe 7*(N+5) µl PCRmix-1-FRT A7+ pipetleyin. FRT A9 tüpüne hazırlanmış miks [(8*(N+5) µl)] PCR-mix-2 buffer/taqf DNA Polimeraz ın yarısını ve FRT A7+ tüpüne [(8*(N+3) µl)] ikinci yarısını ekleyin. Dikkatli şekilde vorteksleyin ve 2-3 saniye boyunca santrifüj edin. Bir PCR-mix-1-FRT A9 tüpte ve bir PCR-mix- 1-FRT A7+ tüpte 160 µl hazırlanmış Miks hazırlayın 36 PCR tüp hazırlayın (N*2+8) PCR tüpleri hazırlayın (örnek için 2 tüp ve kontrol için 8 tüp) Tüplerin yarısına hazırlanmış miks FRT A9 in 15 µl sini ve diğer yarısına hazırlanmış miks FRT A7+ in 15 µl sini pipetleyin. X örnek karışımları hazırlama örneği (kontrol için reaktif hazırlama ile): Yeni steril tüpte ekleyin: Örnekler, N 1 2 3 4 5 6 7 PCR-mix-2 buffer 90 105 120 135 150 165 180 TaqF DNA Polymerase 6 7 8 9 10 11 12 Örnekler, N 8 9 10 11 12 13 14 PCR-mix-2 buffer 195 210 225 240 255 270 Tam tüp TaqF DNA Polymerase 13 14 15 16 17 18 Tam tüp FRT A9 işaretli bir steril tüpte hazırlayın: Örnekler, N 1 2 3 4 5 6 7 Mix PCR-mix-2 buffer/ TaqF DNA Polymerase 48 56 64 72 80 88 96 PCR-mix-1-FRT A9 (mavi kapak) 42 49 56 63 70 77 84 Örnekler, N 8 9 10 11 12 13 14 Mix PCR-mix-2 buffer/ TaqF DNA Polymerase 104 112 120 128 136 142 150 PCR-mix-1-FRT A9 (mavi kapak) 91 98 105 112 119 126 Tam tüp FRT A7+ işaretli bir steril tüpte hazırlayın : Örnekler, N 1 2 3 4 5 6 7 Mix PCR-mix-2 buffer/ TaqF DNA Polymerase 48 56 64 72 80 88 96 PCR-mix-1-FRT A7 (yeşil kapak) 42 49 56 63 70 77 84 Örnekler, N 8 9 10 11 12 13 14 Mix PCR-mix-2 buffer/ TaqF DNA Polymerase 104 112 120 128 136 142 150 PCR-mix-1-FRT A7 (yeşil kapak) 91 98 105 112 119 126 Tam tüp 2. Miks FRT A9 içeren tüplere 10 µl ekstrat DNA* ekleyin ve miks FRT A7+ içeren tüplere 10 µl ekstrat DNA ekleyin. * Ekstrat DNA içeren bütün tüpleri 2 dakika boyunca maksimum hızda (12000-16000 g) tekrar santrifüj edin ve supernatantı dikkatlice alın. Reaksiyonla inhibe olan sorbent pellete dokunmayın.
3. Her bir miks için 2 kontrol hazırlayın (toplam 4 PCR tüpü): Hazırlanmış miks FRT A9 içeren C nega9 işaretli tüpe ve FRT A7+ içeren C nega7 işaretli tüpe Negatif PCR kontrol olarak 10 µl DNA-buffer ekleyin; Hazırlanmış miks FRT A9 içeren QS1, QS2, QS3 3 uygun işaretli tüplere her standarttan (QS HPV K1, QS HPV K2, QS HPV K3) 10 µl ve hazırlanmış miks FRT A7+ içeren QS1, QS2, QS3 3 uygun işaretli tüplere 10 µl ekleyin; 4. Tüpleri kapatın ve Real Time PCR cihazının içine yerleştirin. 5. Örnek pozisyonlarını programlayın ve standart eğriyi oluşturmak için Joe (Yellow)/HEX ve Fam (Green) kanalında Kantitatif Standart ( Quant Data Card de rapor edildi) in konsantrasyonunu girin. Negatif kontrol için - ve Standards için K1, K2, K3 ve örnek içeren kuyulara Unknown ismini kullanın. Tüp pozisyon örneği ( iq icycler mikroplaka için lütfen aşağıdaki tabloyu kontrol edin): 2 tubes for each sample Samples 1-16 Mix FRT A9 blue cap Mix А7+ - green cap Positive Controls Negative Controls Veri Analizleri: 1.Deney geçerli olabilir eğer: Negatif Kontrol pozitif flüoresans sinyale sahip değilse; Standartlar bütün kanallarda (Fam, Joe/HEX/Cy3) pozitif sinyale sahipse. 2. Örneğin sonucu kabul edilir: Geçersiz: Flüoresans sinyal (pozitif veya internal) yoksa; Negatif: eğer sinyal sadece genomik DNA > 5 x 10 3 konsantrasyona sahip Fam (Green) kanalında varsa; Pozitif: eğer Joe/HEX/Cy3 kanallarında flüoresans sinyal 2 tüpten en az birinde (Ct 33) varsa. Örnekte flüoresans sinyal Fam kanalında vermeyebilir. Aşağıdaki formülü kullanarak HPV DNA konsantrasyonunu hesaplayın: HPV DNA copies/specimen lg[ x genomic DNA copies/specimen 200000] = lg (HPV DNA in 100.000 cells) SONUÇLARIN YORUMLANMASI: Sonuç lg (100.000 hücre içinde HPV ) Yorum < 3 Klinik olarak önemsiz 3-5 Klinik olarak önemli. Servikal displazin bulunma riski > 5 Klinik olarak çok önemli. Servikal displazin yüksek riski Sonuçlar, kit ile birlikte Microsoft Excel formatında program kullanılarak otomatik olarak hesaplanabilir. 1. HPV High Risk Screen Quant 2x programını açın ve Security Warning (Güvenlik Uyarısı) penceresinde Enable Macros (Makroları Etkinleştir) butonuna tıklayın (Microsoft Excel in güvenlik düzeyi Medium olarak seçilmelidir) (Araçlar Makro Güvenlik Ortam). 2. Name sütunundan örnek isimleri mousun sağ düğmesi ile kopyalayın ve HPV High Risk Screen Quant 2x programının Name sütununa isimleri yapıştırın.
3. FAM (Yeşil) kanalından Ct değerlerini aynı yolla kopyalayın ve programın uygun sütununa yapıştırın. Joe/HEX/Cy3 kanalları için aynı prosedürü tekrar edin. Standartlar K1, K2, K3 ve Negatif Kontrol olarak isimlendirilmeli ve - olarak işaretlenmelidir. 4. Quantitative analysis seçin ve Internal Calibration tercih edin. 5. Pencerenin sağ üstünde Quant Data Kartta bildirilen Kantitatif Standartın konsantrasyonu Standards tablosunda ayarlanır. 6. Sign unnamed ve Results butonunu tıklayın. 7. Yeni bir isim ile dosyayı kaydedin. PERFORMANS ÖZELLİKLERİ Analitik özgüllük Primerler ve probların analitik özgüllüğünü negatif numuneler ile doğrulanmıştır. Bu numuneler spesifik Human Papillomavirus primerler ve probları ile sinyal vermezler. HPV High Risk Screen Real-TM Quant 2X kitin özgüllüğü 100% dir. Kit HPV High Risk Screen Real-TM Quant 2X ın potansiyel çaprazreaktivitesi kontrol grubuna karşı test edilmiştir. Diğer patojenler ile herhangi bir çapraz-reaktivite gözlenmez. Analitik hassasiyet Kit HPV High Risk Screen Real-TM Quant 2X, 1000 kopya/ ml den az olmayan % 100 duyarlılıkla testlerin Human Papillomavirus DNA tespitini sağlar. Tespit, negatif numuneler tarafından kontrol standardını ve dilüsyonlarını gerçekleştirir. Hedef bölge: E2, E1 Rotor-Gene 3000/6000 2 kanal(corbett Research) ile Real Time Amplifikasyon 1. Tüpleri kapatın ve bu sıra ile Rotor-Gene in karuseline tüpleri yerleştirin: ilk tüpe miks FRT A9 içeren tüp ve sonra miks FRT A7+ içeren tüpü koyun. 2. Reaksiyon hacmi, 25 µl. RG6000 penceresi için 15 μl oil layer volume seçildiğinden emin olun. Önemli:Rotor-Gene 6000 için 1.7 Build 67 software ya da updated versiyon kullanılmalıdır (software bilgi için info@sacace.com ). 3. Rotor-Gene 3000/6000 aşağıdaki gibi programlayın: t, C Zaman Flüoresans tespit Döngü Bekleme 95 15 dk 1 Bekleme 2 65 2 dk 1 95 20 sn Döngü 64 İnme: 25 sn 5 Döngü başına 1 derece 65 55 sn 95 15 sn Döngü 2 60 25 sn 40 65 40 sn Fam(Green), Joe(Yellow) 4. Flüoresans, Fam (Green), Joe (Yellow) kanallarında 65 C de tespit edilir. Not: Cihazı yerleştirmek için kit ile verilen HPV high Risk Screen Real-TM Quant.rex dosyasının kullanılması önerilir. 5. Fam ve Joe kanalında kalibratör parametreleri girin: 1ci devralmadan önce Perform Kalibrasyon seçin ve bütün kanallar için 4FI 8FI ayarlayın (Auto gain calibration channel settings). Sonuç Analizleri: 1. Analize bastıktan sonra Quantitation (Kantitasyon) butonunu seçin. Fam (Green) ve Joe (Yellow) kanalları için işlemi gerçekleştirin. 2. Threshold: 0,03 ayarlayın.
3. Dynamic Tube, Slope Correct seçin. 4. More settings (Outlier Removal For RG6000) seçin ve 15% a NTC Threshold ayarlayın. 5. Eliminate cycles before: 5 ayarlayın. Fam kanal Internal Kontrol (β-globine gen) Joe kanal HPV SmartCycler (Cepheid) ile Real Time Amplifikasyonu 1. Minisantrifüjün rotorunun içine SmartCycler PCR tüplerini aktarın ve kısa bir süre santrifüj edin (3-5 sn). 2. Aşağıdaki sırayla termalcycler içine SmartCycler tüpleri ekleyin: her bir örnek için FRT A9 tüpü bir SmartCycler konumuna koyun ve diğer FRT A7+ tüpü onun yanına koyun. 3. Ana menüde Define Protocols (Protokoller tanımla) seçin ve sol alt köşedeki New Protocol (Yeni protokol) seçeneğini seçin. Protokol için bir isim belirleyin ve aşağıdaki parametreleri ayarlayın: Aşama Sıc. Saniye Optikler Tekrar Aşama 1. Hold 95 900 1 Aşama 2. Hold 65 120 1 95 20 Aşama 3. 3-Sıcaklık döngüsü 63 30 65 60 5 Aşama 4. 3-Sıcaklık döngüsü 95 25 60 30 65 60 Açık 42 4. Save Protocol (Protokol kaydet) seçin. 5. Ana menüden Create Run (Çalışma Oluştur) seçeneğini seçin ve Run Name (Çalışma ismi) penceresinde deney için bir isim girin. 6. Dye Set (Boya Ayarı) düğmesini tıklayın ve FCTC25 seçin. 7. Add/Remove Sites (Ekle/Çıkar Site) seçin ve analiz için yeni bir pencerede Protokol ve Sites seçin. OK tıklayın. 8. View Results (Sonuçları gör) menüsünde Results Table (Sonuç tablosu) basın ve Sample ID (örnek ID) kolonuna örnek isimlerini ekleyin. 9. Flüoresans HPV DNA için Cy3 kanalında ve İnternal Kontrol için FAM kanalında Real Time da gözlenir. Applied Biosystems 7300/7500 Real Time PCR System ile Real Time Amplifikasyonu: 1. Ana menü seçeneğinde New (Yeni) seçeneğini seçin ve yeni belgenin verilerini ayarlayın: Assay (Test) penceresinde Absolute Quantitation (Mutlak kantitasyonu) seçeneğini, Template (Kalıp) penceresinde Blank Document (Boş Belge) seçeneğini seçin. OK tuşuna basın.
2. Tools (Araçlar) menüsündeki yeni pencerede Detector Manager (Dedektör Yöneticisi) düğmesini tıklayın. 3. Pencerenin sol alt köşesindeki File (Dosya) tıklayın ve New (yeni) seçin. New detector (Yeni dedektör) penceresinde probların özelliklerini ayarlayın: POZ tespit: Name (isim) ve Description (açıklama) çizgileri POZ gösterir; Reporter Dye Joe ve Quencher Dye None çizgisinde. Color (renk) (örneğin kırmızı) seçin. Create Another (Başka oluşturma) düğmesini tıklayın. New detector (Yeni dedektör) penceresine karşı açıldı. İnternal Kontrol için aşağıdaki parametreleri ayarlayın: Name (isim) ve Description (açıklama) çizgileri IC gösterir; Reporter Dye Fam ve Quencher Dye None çizgisinde. Color (renk) (örneğin mavi) seçin. OK tıklayın. 4. Prob bilgileri ile Detector manager (Dedektör yöneticisi) penceresini kapatın. 5. Instrument (Cihaz) penceresini seçin. 6. Thermal profile (Termal profil) aktif edin ve aşağıdaki amplifikasyon programını ayarlayın: Aşama Profile Tekrar 1 95 C 15:00 1 2 65 C 02:00 1 3 4 95 C 0:20 63 C 0:30 65 C 0:55 95 C 0:25 60 C 0:30 65 C 00:55* 10 35 *Fam, Joe kanalında flüoresans belirlenir. 7. Reaksiyon hacmini 25 μl olarak seçin. 9600 Emulation seçin. 8. Oluşturulmuş dokümanı kaydedin: File menüsünde Save as... seçin, File type çizgisinde SDS Templates (*.sdt) seçin ve Save tıklayın. 9. Pencerenin sağ üst köşesinde Set up (Kur) seçin. Açılan Plate penceresinde planlanmış amplifikasyon hücreleri mouse ile seçin. View (Görüntüle) menüsünde Well inspector (Kuyu kontrolör) düğmesini tıklayın. 10. Add Detector (Dedektör ekle) düğmesini tıklayın ve Detector manager penceresinden POS ve IC probları seçin. Bunu yapmak için, mouse ile çizgileri seçin ve Add to Plate Document (Plaka dokümanı ekle) ve Done (Bitti) düğmesini tıklayın. 11. Well inspector (Kuyu kontrolör) penceresinin kullanılan sütununda POS ve IC probları seçin. 12. Passive Reference (Pasif Referans) çizgisinde pencerenin sağ alt köşesinde none (hiçbiri) ayarlayın. 13. Sample Name (Örnek ismi) alanına örneklerin isimlerini ekleyin.
MX3000P ve MX3005P TM (Stratagene) ile Real Time Amplifikasyon: 1. Stratagene programını başlatın. 2. New Experiment Options Quantitative PCR (Multiple Standards) pencerelerini seçin ve Turn lamp on for warm-up koyun. Not: Cihazı deneye başlamadan önce en az 15 dakika önce açın. 3. Termalcyclera tüpleri (plaka) ekleyin ve cihazı kapatın. 4. Options menüsünden Optics Configuration seçin ve FAM filter set içine Fam ve HEX/JOE filter set içine Joe ekleyin. 5. Instrument menüsünden Filter Set Gain Setting seçin ve yeni pencerede aşağıdaki parametreleri ayarlayın: HEX/JOE x4 FAM x4 6. Well type penceresinde örnekler için Unknown ayarlayın ve Collect fluorescence data alanında Fam ve Hex kanalları bütün örnekler için seçin. 7. Bütün hücreleri çift tıklayın ve örnek bilgisinde bütün pozitif örnekleri + olarak ve negatif örnekleri - olarak girin. Standard Quantity kutusunda Quantitative Standards (reported on the HPV Quant Data Kartta bildirildi) konsantrasyonunu girin. 8. Pencerenin sol üst kısımında Thermal Profile Setup düğmesine basın. t, C Zaman Flüoresans tespit Döngü Segment 1 95 15 dk 1 Segment 2 65 2 dk 1 95 20 sn Segment 3 (Döngü) Segment 4 (Döngü) Sonuç Analizleri: 64 Touchdown: 1 deg. per cycle 25 sn 65 55 sn 95 20 sn 60 25 sn 65 55 sn Fam, Joe 1. Pencerenin sol üst kısmında Analysis düğmesine ve sonra Results basın. 2. Dyes shown menüsünde Threshold fluorescence alanına aşağıdaki eşikleri koyun: HEX/JOE 150 FAM 150 3. Dört olan flüoresans kanallarının aktif olduğundan emin olun ( Dyes Shown alanında Hex ve Fam düğmelerini seçin) 5 40 iq icycler ve iq5 (Bio-Rad) ile Real Time Amplifikasyon Not: Cihazı deneye başlamadan önce en az 15 dakika önce açın. 1. Örneklere plate oluşturmak için Plate Setup seçin ve Fam ve HEX kanalında tespiti ayarlayın. 2. Ana menüde Define Protocols seçin ve Create a new protocol tıklayın. Aşağıdaki parametreleri ayarlayın: Döngü Tekrar Set Point Kalan Zaman 1 1 95 15:00 2 1 65 02:00 3 5 95 00:20 64 Sıc-: 1.0 döngü 00:25
65 00:55 95 00:20 4 42 60 00:25 65 * 00:55 *Flüoresans 65 C de FAM ve Hex kanalında ölçülür. 3. Select well factor source (kuyu faktör kaynağını seçin) Experimental Plate (Deney plakası) hattı altında Run-Time Central penceresinde seçin ve standart protokol dosya dynamicwf.tmo: 95 kullanın. Her örnek için 2 tüp Tüp pozisyonları için örnek Bu pozisyonları kullanmayın 4. Bu protokolu kaydedin ve işleme başlayın. Sonuç Analizleri: 1. Select Analysis Mode (Analiz modunu seçin) penceresinde PCR Baseline Subtracted Curve Fit seçilip seçilmediğinden emin olun. 2. Select a Reporter de FAM-490 simgesini ayarlayın. 3. Threshold Cycle Calculations de 10 ile Baseline döngüsü User defined, Baseline döngüsü 2 seçin.(orijinal dosya im.5) 4. Auto Calculated alanında Threshold Position seçin. Gösterilmiş eşik pozisyonu yanında User Defined (kullanıcı Tanımlı) tıklayın ve eğer eşik çizgisi (threshold line) otomatik hesaplama ayarlanıyorken çok yüksekse, manuel olarak threshold ayarlayın (im.3 ve 5 bakın) 5. Hex-530 (Joe-530) kanalı için benzer bir prosedür yapın. 6. Flüoresans HPV DNA için Hex kanalında ve İnternal Kontrol için FAM kanalında Real Time da gözlenir.
Örnek I. Orijinal dosya (Background subtracted) Mix А9 II. Dates after setting (PCR Base Line Subtracted Curve Fit) Mix А7+ a) correct treatment b) Im.1. Fam Im.2 (Joe/Hex) Mix А9 Mix А7+ Im.3. Fam kanal User defined Im.4 Hex kanal б) non correct treatment Im.5. Fam kanal Auto Calculated *icycler and iq5 are trademarks of Bio-Rad Laboratories * Rotor-Gene Technology is a registered trademark of Corbett Research *MX3000P and MX3005P are trademarks of Stratagene *Applied Biosystems is trademarks of Applera Corporation * SmartCycler is a registered trademark of Cepheid Sacace Biotechnologies Srl 44 Scalabrini str, 22100 Como, Italy *PCR: The Polymerase Chain Reaction (PCR) process is covered by patents owned by Hoffmann-La Roche and applicable in certain countries. Sacace does not encourage or support the unauthorized or unlicensed use of the PCR process. Use of this kit is recommended for persons that either have a license to perform PCR or are not required to obtain a license