SPEED-OLIGO DIRECT MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS

1 TR Tüberküloz Dışındaki Mikobakteriler (MOTT) SPEED-OLIGO DIRECT MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS SP016: Klinik örneklerde doğrudan Mikobakteri cins ve M. Tüberküloz kompleks türlerinin (M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG, M. africanum and M. microti) kalitatif belirlenmesi için oligokromatografik test. 40 test. GİRİŞ: Mikobakteriler bakteri grupları arasında en yüksek klinik öneme sahip, yüksek ölüm ve hastalık oranıyla çeşitli insan enfeksiyonlarına neden olan ajanlardır. Halen dünya çapında çok ciddi sağlık problemlerinden birini temsil etmektedirler. Yaklaşık olarak dünya popülasyonunun üçte biri tubercle bacillus ile enfekte olmuştur ve tüm önlenebilir ölümlerin % 26 dan sorumludur. Hastalığın görülme sıklığı ve şiddeti human immunodeficiency virus (HIV) ile ortak enfekte olmuş hastalarda fazladır. Tüberküloz vakasının erken tanısı transmisyon zincirini engellediği için hastalığın kontrolünde temeldir. Tüberküloz enfeksiyonunun mikrobiyolojik tanısı direk mikroskobik inceleme ve kültüre dayalı klasik yöntemler olmuştur. Smear mikroskopi akciğer tüberkülozu tanısı için temeldir; henüz, yöntemin orta duyarlılığı pozitif bir tespit için gerekli örnekte mililitrede 5,000-10,000 arasında basiller ile yapılması onun önemli dezavantajıdır. Dahası, bir negatif sonuç hastalığı atmak için güvenilir olmadığından, örnekler kültür ve tanının teyidi için işleme tabi tutulmalıdır.kültür, izolatların ilaç duyarlılık çalışmalarını ve tiplenmesini gibi tanısal duyarlılığın artışını sağlar. Sadece 10-100 mikroorganizma mükemmel bir hassasiyete sahip kültür tespiti için gereklidir. Yine de, mikobakteri in yavaş büyümesi önemli dezavantajıdır, yani negatif olarak bir örneği belirlenmesi için 6-8 hafta gerekmektedir. Bir pozitif kültür sonrası, klasik veya moleküler yöntemlerle M. Tüberküloz un teşhisi hala gereklidir. Doğrudan örneklerde nükleik asitlerin amplifikasyonuna dayalı moleküler yöntemler yukarıda bahsedilen geleneksel yöntemlerde net avantajları ile yüksek duyarlılığa sahip erken bir teşhis sağlar. Şu anda, yöntemlerin bu türü kültür ve mikroskobik tanı yöntemlerini tamamlar. Pratik bakış açısı olarak, Mikobakteri cinsi içinde 3 grup tanımlayabiliriz: 1) Tüberküloz a neden olan ve M. tuberculosis, M. bovis (BCG'yi kapsayan), M. africanum ve M. Microti türlerini içeren tüberküloz kompleks; 2) Leprae ye neden olan M. leprae; 3) Tüberkülozlu olmayan semptomatoloji üreten çoğu kez fırsatçı veya saprofitik olan, az patojenlik mikobakteri den başka grupları olan MOTT (Mycobacteria Other Than Tuberculosis). MOTT, hem özel odalarda hastaların izolasyonu hem de temas araştırmalarının başlangıcı için klinik ve halk arasında tüberküloz kompleksinin faklılaşmasından dolayı artarak izole ediliyor. M. tüberküloz kompleks Kompleks çeşitli patojenik türler içerir ama M. tüberküloz insan patojeni gibi büyük ilgiye sahiptir. İnsanlar bazı hayvanlarda yaygın ve ilerleyici bir hastalık üretebilen M. tüberküloz un doğal rezervuarıdır. Başka yerde bulunmasına ve yayılmasına rağmen tüberküloz esas olarak akciğerleri etkileyen kronik ve granülomatöz bir hastalıktır. Sığır, insan ve hayvanları etkileyen kronik bir hastalık olan sığır tüberkülozuna neden olan M. Bovis in ana rezervuarıdır. Enfekte sığırdan dolayı büyük ekonomik kayıp yanında insanlara bulaşması halk sağlığı ile ilgilidir. İnsanlarda M. bovis ve M. tuberculosis tarafından üretilen tüberküloz klinik olarak fark edilemez. M. bovis BCG, immün sistemi baskılanmış hastalarda yayılmış hastalık vakaları üretebilen bir zayıflatılmış aşı strainidir; bu nedenle kullanımı HIV endemik bölgelerden gelen çocuklarda önerilmez. M. africanum esas olarak Afrika'da bulunur ve bu kıtada akciğer tüberküloz olgularının önemli bir kısmından (% 60 kadar) sorumlu olduğu düşünülmektedir.son olarak, M. microti insanlarda aşılar için uygun avirulent suşu kabul edildi, ama immün sistemi baskılanmış kişilerde tüberkülozun ve bazı hastalarda deri tüberkülozunun raporlanması sonrası kullanımdan çıkarıldı. İnsanlarda hastalığa yol açabilecek mikobakteriler in bir grubunu içerir, ancak tüberküloz grubundan değildir; daha fazla, kişiden kişiye bulaşma sık görülmez ve bu nedenle bildirilen zaruri hastalıklar olarak sınıflandırılmaz. Bununla birlikte, frekans bağışıklığı baskılanmış kişilerde artışın bir sonucu olarak son yıllarda artmıştır. SPEED-OLIGO DIRECT MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS tespit kiti, doğrudan örneklerde kompleks M. tuberculosi in ve Mikobakteri cinsinin hızlı, yüksek duyarlılıklı ve spesifik tespitini sağlayan daldırma şeridi ile birleştirilmiş PCR-tabanlı bir yöntemdir. Bu şekilde, MOTT ile veya M. Tüberküloz kompleksinden gelen bakteriler tarafından bir enfeksiyonun tespitini sağlar. Kit kolaylıkla kullanılacak şekilde tasarlanmıştır. PCR thermocycler kullanımına bağlı olarak amplifikasyon adımı 60 ila 75 dakika kadar bir zaman alır, oysa daldırma şeridi ile belirlemek için sadece 5-10 dakika gereklidir. PCR karışımının liyofilize sunumu kontaminasyonu önlemek için kullanım ve pipetleme prosedürlerini minimize eder. TESTİN PRENSİBİ: Testin prensibi iki spesifik bir gen fragmanlarının amplifikasyonuna dayanır. Bunlardan birincisi tüm Mikobakteri cins için ortaktır ve ikincisi M. Tüberküloz kompleksin üyelerinde sadece mevcuttur. M. Tüberküloz kompleks ve MOTT arasında ayırt etmek için ve mikobakteriler tarafından üretilen enfeksiyonların hızlı tanısını sağlar. Bir insan geninin iç amplifikasyon kontrolü doğru DNA ekstraskisyon işlemi, örnekte amplifikasyon inhibitörlerinin taşınmadığında ve doğru amplifikasyonu kontrol etmek için testte bulunur. Bu amaçla, strip üzerinde insan RNAsaP gen ve tespit çizgisine karşılık gelen için spesifik primerler dahildir. İnsan kaynaklı klinik örnekler bu geni içermelidir ve eğer yukarıda belirtilen adımlar düzgün çalışırsa bu çizgi üzerinde pozitif bir bant verir. Teknik üç ana adıma bölünmüştür: DNA ekstraksiyonu, spesifik oligo çifti ile amplifikasyon ve amplifiye edilmiş ürünün belirlenmesi. Belirleme daldırma şeriti ile gerçekleştirilir. Amplifikasyon yapıldığında, reaksiyon ürünü denature edilir ve stripte ilerlemesine olanak sağlar ve strip üzerine yerleşmiş spesifik problar için hibridize edilir. PCR fragmanları, daldırma şeridinin en alt kısmında bulunan altın partiküllerinin kolloidal süspansiyonu ile birleştirilmiş spesifik oligonükleotidler ile reaksiyon verir. Sonra PCR ürünleri ve kolloidal altın arasındaki kompleks ikinci hibridizasyonun meydana geldiği yer olan spesifik problara (iki farklı test çizgisi biri M. tuberculosis kompleks için spesifik ve diğeri Mycobacterium cins için ve bir amplifikasyon ve ekstraksiyon kontrol çizgisi) ulaşana kadar membrandan yukarı doğru ilerler. Ek olarak, altın probun tamamlayıcı oligonükleotidler ile hibridizasyonundan artan kısmın membran tarafından absorbe edilmesinden dolayı ürün kontrol çizgisi ortaya çıkar. Altın reaksiyonunun olduğu konumda kırmızı çizgiler görünür hale gelir. Bu teknik klasik PCR dan daha duyarlı ve daha spesifiktir. Çift hibridizasyon spesifik ve spesifik olmayan amplifikasyon fragmanları arasındaki ayırımı sağlar. Product control line PCR amplification control line Test line 1: Mycobacterium genus Test line 2:M. tuberculosis complex Specific oligonucleotide bound to the nitrocellulose membrane Colloidal gold Specific oligonucleotide bound to colloidal gold

2 KİT ÖZELLİKLERİ: Kit DNA amplifikasyonu ve hibridizasyon prensiplerine dayanmaktadır. Kontaminasyon riskinden dolayı Öneriler ve önlemler bölümünün dikkatle okunması önemlidir. PCR karışımı ve pozitif kontrol reaktifleri liyofilizedir. Kullanımdan önce kullanıma hazır forma getirilmeleri gerekmektedir (Reaktiflerin ön hazırlığına bakın). Geri kalan reaktifler kullanıma hazırdır. KİT İÇERİĞİ: 1 VIRCELL DMT PCR MIX: Liyofilize PCR bufferı, Cl 2 Mg, dntps, Taq polimeraz, Mycobacterium cins için spesifik primerler, M. tuberculosis kompleks için spesifik primerler ve RNAseP insan gen için primerler içeren 5 şişe. 2 VIRCELL DMT POSITIVE CONTROL: Pozitif kontrol olarak kullanılan liyofilize non-infectious DNA içeren 1 şişe. 3 VIRCELL NEGATIVE CONTROL: Negatif kontrol olarak kullanılan 200 μl deiyonize su içeren 1 şişe. 4 VIRCELL DMT STRIPS: Spesifik DNA tespiti için 40 strip. 5 VIRCELL PCR MIX RECONSTITUTION SOLUTION: Triton X-100 içeren, PCR karışımını kullanıma hazırlamak için 1 ml sulu çözeltili 1 şişe. 6 VIRCELL POSITIVE CONTROL RECONSTITUTION SOLUTION: Triton X-100 içeren, pozitif kontrolü kullanıma hazırlamak için 500 µl sulu çözeltili 1 şişe. 7 VIRCELL DMT RUNNING SOLUTION: Proklin içeren hibridizasyon çözeltisinin 1 ml sini içeren 2 şişe. 8 VIRCELL DMT LYSIS SOLUTION: 10 ml buffer solüsyonu içeren 2 şişe. 9 VIRCELL DMT EXTRACTION VIAL: Solunum örnekleri için cam boncuk içeren 40 şişe. Bu kit bileşenleri iki farklı pakete ayrılır: Kutu 1/2: 1 ile 8 deki bileşenleri içerir. 2 ve 8ºC arası saklayınız. Kutu 2/2:9 deki bileşenleri içerir. 2 ve 25ºC arası saklayın. Son kullanma tarihini kontrol edin. Gerekli fakat sağlanmayan materyaller: -Solunum örnekleri olmayanlar için DNA ekstraksiyon kitleri (öneriler için test prosedürüne bakın) -Thermocycler -Mineral yağ (ısıtılmış kapağı olmayan thermocycler için) -Hassas mikropipet (10-200 μl) -Aerosol bariyerli steril uçlar -Tek kullanımlık eldivenler -55ºC±2ºC ısıtıcı blok -1.5 ml lik mikrosantrifüj tüpleri -Mikrosantrifüj -PCR odası (tavsiye edilen) -Vorteks -Hücre disruptor SAKLAMA KOŞULLARI: Belirtilen sıcaklıkta saklayın. Kit reaktiflerini son kullanma tarihinden sonra kullanmayın. Bu reaktifler kapalı ve belirtilen sıcaklıkta saklandığında geçerlidir. VIRCELL PCR MIX ve VIRCELL POSITIVE CONTROL kullanıma hazırlandığında, -20ºC nin altında saklanmalıdır ve tekrarlayan dondurup çözme işleminden kaçınılmalıdır. AÇILDIĞINDA REAKTİFLERİN KARARLILIĞI: REAKTİF VIRCELL PCR MIX ve VIRCELL POSITIVE CONTROL kullanıma hazırlandığında VIRCELL EKTRACTION VIAL Diğer bileşenler KARARLILIK -20ºC nin altında saklayın ve son kullanma tarihine kadar kullanın. 2-25ºC nin altında saklayın ve son kullanma tarihine kadar kullanın. 2-8ºC de saklayın ve son kullanma tarihine kadar kullanın. KARARLILIK VE REAKTİFLERİN KULLANIMI: Kit belirtilen sıcaklıkta son kullanma tarihine kadar kararlılığını korur. VIRCELL PCR MIX ve VIRCELL POSITIVE CONTROL kullanıma hazırlandıktan sonra, -20ºC'nin altındaki sıcaklıkta son kullanma tarihine kadar kararlılığını korur. Mikrobiyal kontaminasyondan kaçınmak için reaktifleri aseptik koşullarda kullanın. Reaktifleri sadece test için gereken miktarda kullanın. Artan çözeltiyi şişeye geri koymayın. VIRCELL, S.L. kit içeriğindeki reaktiflerin hatalı kullanımına dair sorumluluk kabul etmemektedir. ÖNERİLER VE ÖNLEMLER: 1. Sadece laboratuvar içi kullanım içindir. Sadece profesyonel kullanım içindir. 2. Sadece kit bileşenlerini kullanın. VIRCELL PCR MIX RECONSTITUTION SOLUTION, VIRCELL POSITIVE CONTROL RECONSTITUTION SOLUTION ve VIRCELL NEGATIVE CONTROL farklı Vircell SPEED-OLIGO kitleri ile kullanılabilir. VIRCELL EXTRACTION VIAL ve VIRCELL LYSIS SOLUTION aynı referansın farklı lotları ile kullanılabilir. VIRCELL PCR MIX, VIRCELL POSITIVE CONTROL, VIRCELL STRIP ve VIRCELL RUNNING SOLUTION lotlar ve kitler arasında değişim yapmayın. 3. Aerosol bariyerli steril uçlar DNA ekstraksiyonu ve PCR performansı esnasında kontaminasyonu engellemek için zorunludur. 4. Numuneler bulaşıcı örneklerdeki gibi laboratuar güvenlik prosedürleri uygulanarak kullanılmalıdır. Tüm çalışma alanlarını taze olarak hazırlanmış deiyonize veya distile suda %0.5 lik sodyum hipoklorit çözeltisi ile tamamen temizleyin ve dezenfekte edin. 5. Tüm örneklerin alındıktan sonraki en kısa aralıkta test edilmesi en doğru test sonuçlarının elde edilmesine yardımcı olacaktır. Numunenin yollanması sırasında saklama süresindeki değişimler değerlendirilmemiştir. 6. Numuneleri kullanırken koruyucu tek kullanımlık eldivenler, laboratuar kıyafetleri ve göz koruyucu kullanın. Örnekler ile çalıştıktan sonra ellerinizi tamamen yıkayın. 7.Reaktif tüplerinden numune alırken reaktiflerin mikrobiyal kontaminasyonundan kaçının. 8.Testi gerçekleştirirken üç farklı alan olması zorunludur: Amplifikasyon öncesi, Amplifikasyon ve Amplifikasyon sonrası veya Belirleme alanı. Laboratuardaki iş akışı Amplifikasyon öncesi başlangıcından ve Amplifikasyon sonrası alana doğru hareket ederek tek yönlü biçimde ilerlemelidir. Her bir alanda eldiven giyilmeli ve herbir alandan ayrılırken eldiven atılmalıdır. A) Amplifikasyon öncesi alan: Sadece örneğin toplanması ve DNA ekstraksiyonu içindir. Yalnızca amplifikasyon öncesi faaliyetler için spesifik ekipmanlar belirlenmelidir (eldivenler, steril tüpler, bariyer uçlar, mikropipetler, mikrosantrifüj veya diğer gerekli ekipman) ve diğer prosedürler için kullanılmamalıdır veya diğer alanlara taşınmamalıdır. B) Amplifikasyon alanı: Bu alanda PCR gerçekleştirilir ve sadece PCR reaktifleri kullanılmalıdır. Amplifikasyon faaliyetleri için spesifik ekipmanlar belirlenmelidir (eldivenler, steril tüpler, bariyer uçlar, mikropipetler, mikrosantrifüj, thermocycler, katmanlı hava akış dolabı veya diğer gerekli ekipman) ve diğer prosedürler için kullanılmamalıdır veya diğer alanlara taşınmamalıdır. Amplifikasyon tamamlandıktan sonra, PCR tüpleri asla bu alanda açılmamalıdır. C) Amplifikasyon sonrası veya belirleme alanı: Belirleme bu alanda gerçekleştirilir. Isıtma bloğu, 1.5 ml lik mikrosantrifüj tüpleri mikropipet gereklidir. Amplifikasyon sonrası materyeller ve teçhizat her zaman amplifikasyon sonrası alanda durmalıdır. 9.Testin yüksek analitik duyarlılığından dolayı, kit reaktifleri veya amplifikasyon karışımlarının saflığını korumak için aşırı özen gösterilmelidir. Tüm reaktiflerin saflığı yakından takip edilmelidir. Şüpheli reaktifleri atın. 10. Bu ürün PCR testlerinin tekniklerinde eğitilmiş personel ile sınırlandırılmalıdır. 11. Kiti son kullanma tarihinden sonra kullanmayın. 12. Kullanılmamış reaktifleri ve atığı uygulanabilir yönetmeliklere göre atın. 13. Bu kitin reaktifleri genetik materyal veya hayvan ve/veya insan orjinli maddeler içerebilir. Her ne kadar bu materyal bulaşıcı olmasa da potansiyel olarak bulaşıcı gibi kullanılmalıdır. Tüm materyal potansiyel olarak bulaşıcı gibi kullanılmalı ve atılmalıdır. Klinik atıkların yok edilmesi için yerel yönetmeliklere uyun. 14. Edinilen stripler PCR kontaminasyon riskinden kaçınmak için amplifikasyon öncesi alandan uzak bir yerde saklanmalıdır. Daha iyi bir koruma için edinilen striplerin kenarlarının kesilmesi tavsiye edilir.

3 ÖRNEK TOPLAMA VE KULLANMA: Laboratuvar tanısı için tercih edilen numuneler dekontamine olmuş balgamdır. Bununla birlikte, nazofarengeal aspirasyon ve bronş ve pulmoner lavaj gibi diğer örnekler kitte bulunan ekstraksiyon reaktifler ile kullanılabilir. Dışkı, mide suyu, idrar ve beyin omurilik sıvısı gibi solunum örnekleri için ticari ekstraksiyon kitlerin kullanımı tavsiye edilir. Balgam toplanması üç gün içinde yapılmalıdır ve bu gibi durumlarda ekstraksiyon ve PCR için inhibitör olabilen kanlı balgam dikkate alınarak bir ticari kit ile yapılmalıdır. Test için laboratuara yüksek kaliteli örneklerin teslimatını sağlamak amacıyla, numuneler pratik olarak kısa zamanda laboratuvara taşınmalıdır. Numune saklama Numuneler 24 saate kadar 2-8ºC de saklanmalıdır veya uzun bir zaman dönemi için -20ºC'nin altındaki sıcaklıkta dondurulmalıdır. Ekstrakt en az -20ºC de bir yıl saklanabilir. Tekrarlayan dondurup çözme işleminden kaçınılmalıdır. Numune kullanıldıktan sonra işleme tabi tutulan her bir örneğin kalan miktarı testin tekrarlanması gerektiği durumlarda 2-8ºC de saklanmalıdır. Tekrar yapılan test numune işleme tutulduktan sonraki 7 gün içinde gerçekleştirilmelidir. Örneklerin NALC-NaOH yöntemi ve nötralizasyonu tarafından dekontaminasyonu laboratuvarun protokollerine göre yapılmalıdır. Tüm örnekler sanki enfeksiyöz ajanlar bulaştırabilecekmiş gibi ele alınmalıdır. Klinik örneklerin işlemleri BSL-2 protokolune göre bir biyolojik güvenlik kabininde yapılmalıdır. SOLUMUN YOLU ÖRNEKLERİNİN EKSTRAKSİYONU: 1-Vidalı tüpe 200 μl dekontamine, nötralize ve konsantre olmuş solunum yolu numunelerini aktarın. 2- Bir mikrosantrifüj de 12.000 g de 10 dakika boyunca santrifüj edin. 3-Bir pipet ile supernatantı dikkatlice alın ve 300 μl VIRCELL LYSIS SOLUTION 8 pelleti tekrar süspanse edin. 4 -Bir mikrosantrifüj de 12.000 g de 10 dakika boyunca santrifüj edin. 5-Bir pipet ile supernatantı dikkatlice alın ve 100 μl VIRCELL LYSIS SOLUTION 8 sedimenti tekrar süspanse edin. 6-VIRCELL EXTRACTION VIAL 9 a bu süspansiyonu aktarın. 7-95ºC de termoblok içinde 20 dakika boyunca mikroorganizmaları inaktif edin. 8-3000 rpm (top speed) de 5 dakika boyunca hücre disruptor ile yavaşça çalkalayın. 9- Amplifikasyon reaksiyonunda kullanılana kadar numuneyi 2-8ºC de saklayın. Uzun saklamalar için -20ºC den aşağıda sıcaklıkta dondurun. 95ºC de termal işlem de mikobakteriler inaktif olduğu halde, tüm klinik örnekler potansiyel bulaşıcı olarak ele alınmalıdır ve laboratuarın biyogüvenlik kuralları izlenmelidir. REAKTİFLERİN İLK HAZIRLIĞI: VIRCELL PCR MIX ve VIRCELL POSITIVE KONTROL dışındaki tüm reaktifler kullanıma hazır olarak temin edilmiştir. 1 VIRCELL PCR MIX. Her bir PCR mix 8 PCR reaksiyonu gerçekleştirmek için yeterli reaktifi içerir. Kullanıma hazırlamak için sonraki adımları takip edin: - Her bir tüpe 150 µl VIRCELL PCR MIX RECONSTITUTION SOLUTION 5 ekleyin. - 1-2 saniye vorteksleyerek karıştırın. PCR karışımının tamamen homojenize olduğundan emin olmalısınız. 2 VIRCELL POSITIVE CONTROL. Kullanıma hazırlamak için sonraki adımları takip edin: -İlgili tüpü 5000 g de 5 saniye santrifüjleyin. - Herbir tübe 200 μl VIRCELL POSITIVE CONTROL RECONSTITUTION SOLUTION 6 ekleyin. - 1-2 saniye vorteksleyerek karıştırın. - Tüpü 5000 g de 5 saniye santrifüjleyin. Kullanıma hazırladıktan sonra VIRCELL PCR MIX 1ve VIRCELL POSITIVE CONTROL2 daha sonraki reaksiyonlarda kullanmak için - 20ºC nin altındaki sıcaklıkta saklanabilir. TEST PROSEDÜRÜ: 1-DNA ekstraksiyonu: (Amplifikasyon öncesi alanda gerçekleştirilir). DNA ekstraksiyonu için, solunum yolu örneklerinde prosedür olarak yukarıda açıklanan "Solunum yolu örneklerinin ekstraksiyonu" bölümünü kullanılmalıdır. Solunum yolu veya inhibitör örneklerinde üretici talimatları izlenerek ticari ekstraksiyon kitleri kullanılmalıdır. Lütfen müşteri servisi ile temasa geçin. 2-PCR (Amplifikasyon alanında gerçekleştirilir): PCR karışımı 1 liyofilizedir. Her bir PCR miks 8 PCR reaksiyon için gerekli bileşenleri içerir. 2.1. Analiz edilecek örnek sayısına ve çalışma için kontrol sayısına bağlı olarak PCR karışımı tüpleri kullanıma hazırlanmalıdır: Reaktiflerin ön hazırlığı" na bakın. 2.2.-PCR tüpleri hazırlama: Gerekli sayıdaki tüpleri raklara koyun ve etiketleyin: negatif kontrol için örnek başına bir ve pozitif kontrol için örnek başına bir. 2.3.-PCR miks ekleme: Her tüp kullanıma hazırlanan PCR karışımının 15 μl sini pipetleyin. Hazırlanmış PCR miks in fazlası sonraki reaksiyonda kullanılması için -20ºC in altında dondurulabilir. 2.4- Her tüpe 10 ml ekstre edilmiş örnek ekleyin. Karşılık gelen etiketli tüplere 10 μl VIRCELL POSITIVE CONTROL ve VIRCELL NEGATIVE CONTROL ekleyin. Negatif kontrol sudur. Negatif kontrol verilen test için hazırlanmış son örnek olmalıdır. 2.5.-PCR program: Thermocycler a PCR tüplerini yerleştirin ve aşağıdaki programı uygulayın*: 1 döngü 92ºC 1 dakika 92ºC 20 saniye 40 döngü 55ºC 20 saniye 72ºC 20 saniye 1 döngü 72ºC 1 dakika *(95-105ºC arasındaki sıcaklıklar da thermocycler üreticisi tarafından verilen talimatları izleyin). PCR ürünlerinin belirlenmesi daldırma çubuğuyla yapılır. Eğer hibridizasyon hemen gerçekleştirilmezse PCR tüpleri -20ºC nin altındaki sıcaklıkta dondurulabilir. 3-Strip belirlemesi: (Amplifikasyon sonrası alanda gerçekleştirilir). Strip hibridizasyonu gerçekleştirmeden önce ısıtıcı bloğun 55ºC de ön ısıtması gereklidir. Örnek tüpü kadar kontrol gerekli olacaktır. Gerekli strip sayısını belirtin ve aşağıdaki adıma geçmeden önce örnekleri tanımlayarak etiketleyin. Bütün tespit işlemi farklı adımlar arasında kesintisiz hemen yapılmalıdır. 3.1.-Hibridizasyon solüsyonunu ön ısıtma: 1.5 ml lik Eppendorf tübe 35 μl VIRCELL RUNNING SOLUTION 7 ekleyin ve 55ºC de 2 ve 5 dakika inkübe edin. Tüp tespit işleminin sonuna kadar termoblokta kalmalıdır. 3.2.-PCR ürününün denatürasyonu: Önceki adıma eş zamanlı olarak 2. adımdan alınan PCR ürünlünü termocyler içinde 1 dakika boyunca 95ºC de denature edin. Denatürasyon sonrası, PCR ürününü hemen buz üzerine ya da 4ºC de izofreez rack içine koyun. Hemen sonraki adıma geçin.

4 95ºC de denatürasyon adımından sonra oda sıcaklığında rak içine PCR ürünlerini bırakmayın. Buz veya isofreeze raf yoksa, 95ºC de denatürasyon sonrası ve strip tanıtıldıktan sonra hemen soğutmadan örneği doğrudan pipetleyin. 3.3.- PCR ürünü ekleme: Önceden ısıtılmış hibridizasyon solüsyonu içeren ve termoblok içinde bulunan 1.5 ml tüpe 5 μl denatüre PCR ürünü ekleyin. Eğer PCR ürünü son PCR denatürasyon adımdan sonra hemen 1.5 ml tüpe eklenmezse, PCR denatürasyon adımını 4ºC de buz üzerinde veya bir izofreez rack içine koyarak bir kez daha gerçekleştirmek gerekecektir. Aynı anda birçok numunenin analizi durumunda, strip tespiti ve denatürasyon adımı arasında geçerek 2 dakikadan fazla zamanı önlemek için 5-3 li gruplar halinde numuneler hibridize ve denatüre edilmelidir. Bu şekilde görünecek hatalı negatiflerden kaçının. 3.4.-PCR ürününün hibridizasyonu: Örnek eklendikten sonra hemen Hemen stribi doğru yönelimde (oklar örneğe doğru göstermektedir: plana bakın) yerleştirin ve 55ºC de 5 dakika inkübe edin. Test 3 okuma alanı içerir: - Ürün kontrol çizgisi: Eğer test doğru olarak gerçekleştirildiyse her zaman pozitif ve okunaklı olmalıdır. Bu çizgi kolloidal altının doğru olarak çalıştığını gösterir, prob uygulanabilirliği yeterli ve çalışma bufferı uygun bir şekilde akmıştır. - PCR amplifikasyon kontrol çizgisi: Kırmızı şeritin olmaması durumu ya numunede insan hücresinin olmamasını yada DNA nın yetersiz ekstraksiyonu veya amplifikasyon reaksiyonu ile girişim yapabilecek inhibitörlerin bulunduğunu gösterir. O takdirde numuneden alınan ikinci bir örnek veya yeni numune tekrar test edilmelidir. Şiddetli pozitif örneklerde örnekteki spesifik hedefin yüksek içeriğinden dolayı çizgi zayıf veya negatif olabilir ama son sonucu geçersiz kılmaz. - Test çizgisi: İki farklı çizgi içerir, ilki bütün Mycobacterium cinsleri (Test çizgi 1: Mycobacterium genus) diğeri ise M. tuberculosis kompleks in (Test çizgi 2:M. Tuberculosis kompleks) spesifik sırasına uygun olandır. Mycobacterium cins üzerindeki kırmızı bir çizgi sadece tüberkülozdan (MOTT) başka mikobakteriden gelen genetik materyalin varlığını gösterir. M. Tuberculosis kompleks çizgisi üzerindeki kırmızı bir bant cins çizgisine bakmaksızın kırmızı bir bant olup olmadığını ve M. Tuberculosis kompleksin üyelerinin genetik materyalini gösterir. M. Tuberculosis kompleks için hedef gösterir ki cins çizgisi üzerinde reaksiyon olmadığında spesifik çizgi üzerinde olası reaksiyonun birden fazla kopyası bulunur. Ürün Kontrol Çizgisi her zaman görünür ve okunabilir olmalıdır aksi taktirde test geçersiz olur. 3.5.- Sonuçların yorumlanması: Stripi çıkarın ve yorum kardı kullanarak sonuçları okuyun ve aşağıda verilen göstergeleri izleyin. Sonuçların yorumu strip çıkarıldıktan sonra gerçekleştirilmelidir. Kurutma işaret yoğunluğundaki değişimlere neden olabilir ve negatif örneklerde bazı zeminler görülebilir. Edinilen stripler PCR kontaminasyon riskinden kaçınmak için amplifikasyon öncesi alandan uzak bir yerde saklanmalıdır. İÇ KALİTE KONTROL: İç kalite kontrol testine tabi olan her bir parti piyasaya çıkmadan önce, yüksek derecede kesin tanımlamalara uymaktadır. Her bir özel lot için son kalite kontrol sonuçları mevcuttur. Ştripler spesifik koyucu ve tarayıcı kullanarak otomatik okuma için bir barkod içerir. Striplerin otomatik okumasını yapmak için lütfen barkod alanının üstüne yazmayın. Ek bilgi için, lütfen müşteri servisi ile temasa geçin. PCR ürün kontaminasyonunun kontrolü için Nükleik Asit İzolasyonu adımından başlayarak kitin herbir çalışmasında negatif kontrol kullanın. KULLANICILAR İÇİN SONUÇLARIN YORUMU VE GEÇERLİLİK PROTOKOLÜ: Gerçekleştirilen her bir test çalışmasına bir negatif kontrol her zaman dahil edilmelidir. Negatif kontrol sudur, bundan dolayı sadece kırmızı bir bant ürün kontrol çizgisinde görünür. Gerçekleştirilen her bir test çalışmasına bir pozitif kontrol dahil edilmelidir. Her iki test çizgisi için ve PCR amplifikasyon kontrol çizgisi için pozitif olacaktır. Yeni bir kit açıldığında en az bir kez pozitif kontrol çalışılmalıdır. Pozitif kontrol reaktif hataları ve zorunlu prosedürün doğru çalışılmasının izlenmesi içindir. Negatif kontrol reaktiflerin veya çevresel kontaminasyonun izlenmesi içindir. Sonucu okumak için okuma kartında S ile gösterilen pozisyona stribi yerleştirin. SINIRLAMALAR: 1.-Kit insan klinik numunelere ait örneklerle kullanılmak için tasarlanmıştır. 2.-Kit kullanıcısına paket insert ünü dikkatle okuması ve anlaması tavsiye edilmiştir. Güvenilir test sonuçları elde etmek için protokole katı bir şekilde bağlı kalınması gereklidir. Özellikle doğru örnek ve reaktif pipetleme, dikkatli kullanımla birlikte inkübasyon adımlarının zamanlama ve sıcaklıkları doğru sonuçlar için zorunludur. Bu özellikle test protokolünde tanımlanan atanmış alanlarda her bir test adımını gerçekleştirmek için önemlidir. 3.-Bu test enfeksiyonun yerini göstermez. Bu izolasyon yenilemesini kastetmemektedir. 4.- Mikroorganizmanın belirlenmesi numunede bulunan organizma sayısına bağlıdır ve numune toplama metotlarından, hasta faktörlerinden, enfeksiyon aşaması ve/veya türünden etkilenebilir. 5.-Herhangi bir tanı testinde, sonuçlar tüm klinik ve laboratuar bulgular göz önüne alınarak yorumlanmalıdır. Kit sonuçları klinik değerlendirme ve diğer tanı prosedürleri ile birlikte kullanılabilir.

5 6.-Bu ürünün kullanımı sadece PCR tekniklerinde eğitilmiş personel ile sınırlandırılmalıdır. 7.-Test kalitatif sonuçlar sağlar. Pozitif sonuç büyüklüğü ve örnekteki mikroorganizma sayısı arasında bir korelasyon oluşturulamaz. 8.-Bu test insan solunum sistemi örnekleriyle kullanım için doğrulanmıştır. Bu test diğer örnek tipleriyle doğrulanmamıştır. 9.-Güvenilir sonuçlar yeterli numune toplanması, nakil, saklama ve prosedürlerin uygulanmasına bağlıdır. 10.-Performans özellikleri tüm genotipler için belirlenmemiştir. 11.-Test sadece seçilen probun genomik bölgelerinin limitleri içerisinde çalışır. Bakteriyel genomların yüksek değişkenliğinden dolayı bazı alt tiplerin belirlenememesi olasıdır. PCR oligolarında veya mikroorganizma oligonükleotid dizi problarındaki değişiklikler yanlış negatif sonuçlara neden olabilir. 12.-Negatif test sonucu hedef organizma düzeyinin testin belirleme limitinin altında olduğu durumda dışlanamaz. 13.-Pozitif test diğer patojenlerin bulunma olasılığını bertaraf etmez. 14.-Testin içerdiği iç kontrol tüm yanlış negatif test sonuçlarını ortadan kaldırmayacaktır. 15.-Mycobacterium cins ve M. Tuberculosis kompleksin (M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG, M. Africanum ve M. microti) türlerinin tespiti numunelerde verilen episode olayındaki patojenin nedensel rolünü muhakkak gösteren değildir. Ancak patajonenin klinik kanıtlarının tümü ve pozitif PCR sonuç mikroorganizmanın belirlenmesiyle kökeni gösterir. 16.-SPEED-OLIGO DIRECT MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS klinik değerlendirmeye dayalı şüpheli tüberküloz smear-pozitif veya negatif hastalarından alınan konsantre ve dekontamine edilmiş örneklerle kullanılmak için tasarlanmıştır. Mikroorganizmaların PCR tespiti yanı sıra mikroskopik inceleme ve sonraki doğrulama için örneğin kültürü yapılmalıdır. 17.-Bu talimatlarda belirtilen manuel prosedür ile ekstraksiyon sonrası inhibitör olarak kanıtlanan örnekler ticari ekstraksiyon kitleri ile tekrar hazırlanmalıdır. Hücre parçalama geliştirmek için önceki VIRCELL EXTRACTION VIAL 9 kullanılmalıdır. PERFORMANS DUYARLILIK VE SPESİFİKLİK: 379 örnek kültür ve smear mikroskopi karşı Hastanelerde ölçüldü. Sonuçlar aşağıdadır: Nocardia brasiliensis, Nocardia cyriacigeorgica/asteroides, Nocardia farcinica, Nocardia nova, parainfluenza 1 virus, parainfluenza 2 virus, parainfluenza 3 virus, Propionibacterium acnes, Rhodococcus equi, Rickettsia conorii, Salmonella typhi, Streptomyces ambofaciens, Streptomyces gardneri/nocardia beijingensis, Streptomyces sampsonii, Streptococcus pneumoniae, Toxoplasma gondii, respiratory syncitial virus). Yanlış pozitif sonuçlar elde edilmemiştir. ETİKETLERDE KULLANILAN SEMBOLLER: 2ºC x 8ºC İn vitro tanı medikal aygıt Son kullanım tarihi 2-8ºC de saklayın. <X> teste yeterli içerik Lot number Katalog numarası Kullanım talimatlarına başvurun <X> μl de kullanıma hazırlayın Monoline test için okuma kartı Yorumlama kartı Ürün Kontrol Çizgisi PCR Amplifikasyon Kontrol Çizgisi Test Çizgisi Spesifik sonuçlar 100% dür. ANALİTİK DUYARLILIK: Mycobacterium tuberculosis saf DNA'nın seri dilüsyonları yapılmıştır. DNA sının seri dilüsyonları işleme tabi tutulmuş ve test edilmiştir. Kit, M. tuberculosis kompleks test çizgisinde her reaksiyonda 2 cins kopya ya ve Mycobacterium cins her reaksiyonda 20 cins kopya ya kadar belirleyebilmiştir. TEST İÇİ KESİNLİK: 3 örnek (belirleme limitine yakın bir pozitif ve bir negatif) aynı operatör ile değiştirilmemiş koşullarda tekli testte 5 kez çoğaltılması gerçekleştirilmiştir. Tüm testlerde aynı sonuçlar gözlenmiştir. TESTLER ARASI KESİNLİK: 3 örnek (belirleme limitine yakın bir pozitif ve bir negatif) 2 farklı operatör tarafından ardışık 3 günde ayrı ayrı çoğaltılmıştır. Tüm testlerde aynı sonuçlar gözlenmiştir. Test Çizgisi 1 Test Çizgisi 2 Numune Pozitif numune Negatif numune Geçersiz test Tarih ÇAPRAZ REAKTİVİTE VE GİRİŞİMLER: Test aşağıdaki mikroorganizmalar ile spayk örnekler ile kontrol edilmiştir (Adenovirus, Aspergillus fumigatus, Bacillus cereus, Bordetellapertussis, Brucella abortus, Candida albicans, Chlamydia trachomatis, Chlamydophila pneumoniae, Chlamydophila psittaci, Corynebacterium amycolatum, Corynebacterium haemolyticum, Corynebacterium xerosis, Coxiella burnetii, Haemophilus influenzae, Haemophilus ducreyi, HSV1, HSV2, influenza A virus, influenza B virus, Legionella pneumophila, Mycoplasma pneumoniae, Neisseria meningitidis serogroups A, B and C,

6 BİBLİYOGRAFYA: 1. Alcaide Fernández de Vega, F., Esteban Moreno, J., González Martín, J., Palacios Gutiérrez, J. 2005. Mycobacterias. Procedimientos en Microbiología Clínica. 9ª. 2. Aldous W.K., Pounder J.I, Cloud J.L, Woods G.L. Comparison of six methods of extracting Mycobacterium tuberculosis DNA from processed sputum for testing by quantitative real-time PCR. J Clin Microbiol. 2005 May;43(5):2471-3. 3. Amaro A., Duarte E., Amado A., Ferronha H., Botelho A. Comparison of three DNA extraction methods for Mycobacterium bovis, Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium avium subsp. avium. Lett Appl Microbiol. 2008 Jul;47(1):8-11. Epub 2008 May 21. 4. Barrett A., Magee J.G., Freeman R. An evaluation of the BD ProbeTec ET system for the direct detection of Mycobacterium tuberculosis in respiratory samples. J Med Microbiol. 2002 Oct;51(10):895-8. 5. CDC. Report of an Expert Consultation on the Uses of Nucleic Acid Amplification Tests for the Diagnosis of Tuberculosis. 6. Deshpande P.S., Kashyap R.S., Ramteke S.S., Nagdev K.J., Purohit H.J., Taori G.M., Daginawala H.F. Evaluation of the IS6110 PCR assay for the rapid diagnosis of tuberculous meningitis. Cerebrospinal Fluid Res. 2007 Nov 2;4:10. 7. de Boer R., Peters R., Gierveld S., Schuurman T., Kooistra-Smid M., Savelkoul P. Improved detection of microbial DNA after bead-beating before DNA isolation. J Microbiol Methods. 2010 Feb;80(2):209-11. Epub 2009 Dec 6. 8. Hellyer T.J., DesJardin L.E., Teixeira L., Perkins M.D., Cave M.D., Eisenach K.D. Detection of viable Mycobacterium tuberculosis by reverse transcriptase-strand displacement amplification of mrna. J Clin Microbiol. 1999 Mar;37(3):518-23. 9. Honoré-Bouakline S., Vincensini J.P., Giacuzzo V., Lagrange P.H., Herrmann J.L. Rapid diagnosis of extrapulmonary tuberculosis by PCR: impact of sample preparation and DNA extraction. J Clin Microbiol. 2003 Jun;41(6):2323-9. 10. Kirschner, P., and E. C. Bottger. 1998. Species identification of mycobacteria using rdna sequencing. Methods Mol. Biol. 101:349-361 11. Kox L.F., Jansen H.M., Kuijper S., Kolk A.H. Multiplex PCR assay for immediate identification of the infecting species in patients with mycobacterial disease. J Clin Microbiol. 1997 Jun;35(6):1492-8. 12. Millar B.C., Jiru X., Moore J.E., Earle J.A. A simple and sensitive method to extract bacterial, yeast and fungal DNA from blood culture material. J Microbiol Methods. 2000 Oct;42(2):139-47. 13. Palomino JC. Molecular detection, identification and drug resistance detection in Mycobacterium tuberculosis. FEMS Immunol Med Microbiol. 2009 Jul;56(2):103-11. 14. Pérez-Martínez I., Ponce-De-León A., Bobadilla M., Villegas- Sepúlveda N., Pérez-García M., Sifuentes-Osornio J., González-y- Merchand J.A., Estrada-García T. 2008. A novel identification scheme for genus Mycobacterium, M. tuberculosis complex, and seven mycobacteria species of human clinical impact. Eur J Clin Microbiol Infect Dis; 27:45-9. 15. Reischl U., Lehn N., Wolf H., Naumann L. Clinical evaluation of the automated COBAS AMPLICOR MTB assay for testing respiratory and nonrespiratory specimens. J Clin Microbiol. 1998 Oct;36(10):2853-60. 16. Roth, A., M. Fischer, M. E. Hamid, S. Michalke, W. Ludwig, and H. Mauch. 1998. Differentiation of phylogenetically related slowly growing mycobacteria based on 16S-23S rrna gene internal transcribed spacer sequences. J. Clin. Microbiol. 36:139-147. 17. Scherer L.C., Sperhacke R.D., Ruffino-Netto A., Rossetti M.L., Vater C., Klatser P., Kritski A.L. Cost-effectiveness analysis of PCR for the rapid diagnosis of pulmonary tuberculosis. BMC Infect Dis. 2009 Dec 31;9:216. 18. Soo P.C., Horng Y.T., Hsueh P.R., Shen B.J., Wang J.Y., Tu H.H., Wei J.R., Hsieh S.C., Huang C.C., Lai H.C. Direct and simultaneous identification of Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC) and Mycobacterium tuberculosis (MTB) by rapid multiplex nested PCR-ICT assay. J Microbiol Methods. 2006 Sep;66(3):440-8. Epub 2006 Mar 3. 19. Syre H., Myneedu V.P., Arora V.K., Grewal H.M. Direct detection of mycobacterial species in pulmonary specimens by two rapid amplification tests, the gen-probe amplified Mycobacterium tuberculosis direct test and the genotype mycobacteria direct test. J Clin Microbiol. 2009 Nov;47(11):3635-9. Epub 2009 Sep 30. 20. Tang Y.W., Meng S., Li H., Stratton C.W., Koyamatsu T., Zheng X. PCR Enhances acid-fast bacillus stain-based rapid detection of Mycobacterium tuberculosis. J Clin Microbiol. 2004 Apr;42(4):1849-50. 21. Wang J.Y., Lee L.N., Chou C.S., Huang C.Y., Wang S.K., Lai H.C., Hsueh P.R., Luh K.T. Performance assessment of a nested-pcr assay (the RAPID BAP-MTB) and the BD ProbeTec ET system for detection of Mycobacterium tuberculosis in clinical specimens. J Clin Microbiol. 2004 Oct;42(10):4599-603. 22. Xiong, L., Kong, F., Yang, Y., Cheng, J. and Gilbert, G.L. 2006. Use of PCR and reverse line blot hybridization macroarray based on 16S-23S rrna gene internal transcribed spacer sequences for rapid identification of 34 Mycobacterium species. J. Clin. Microbiol. 44:3544-3550. Daha fazla bilgi için lütfen temasa geçin: customerservice@vircell.com REVİZE TARİHİ: Eylül-10