FERMENTE ET ÖRNEKLERİNDEN İZOLE EDİLEN ENTEROCOCCUS TÜRLERİNİN BAZI TEKNOLOJİK ÖZELLİKLERİ VE ÇOKLU ANTİBİYOTİK DİRENÇLİLİĞİ.

FERMENTE ET ÖRNEKLERİNDEN İZOLE EDİLEN ENTEROCOCCUS TÜRLERİNİN BAZI TEKNOLOJİK ÖZELLİKLERİ VE ÇOKLU ANTİBİYOTİK DİRENÇLİLİĞİ Zehra KARABIYIK YÜKSEK LİSANS TEZİ (BİYOLOJİ) GAZİ ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ŞUBAT 2011 ANKARA

Zehra KARABIYIK tarafından hazırlanan FERMENTE ET ÖRNEKLERĠNDEN ĠZOLE EDĠLEN ENTEROCOCCUS TÜRLERĠNĠN BAZI TEKNOLOJĠK ÖZELLĠKLERĠ VE ÇOKLU ANTĠBĠYOTĠK DĠRENÇLĠLĠĞĠ adlı bu tezin Yüksek Lisans tezi olarak uygun olduğunu onaylarım. Doç. Dr. Sumru ÇITAK Tez Danışmanı, Biyoloji Anabilim Dalı.. Bu çalışma, jürimiz tarafından oy birliği ile Biyoloji Anabilim Dalında Yüksek Lisans tezi olarak kabul edilmiştir. Prof. Dr. Nilüfer Cihangir Biyoteknoloji Anabilim Dalı, H. Ü... Doç. Dr. Sumru ÇITAK Biyoloji Anabilim Dalı, G. Ü... Doç. Dr. Neslihan Gündoğan Biyoloji Anabilim Dalı, G.Ü... Tarih: 15/02/2011 Bu tez ile G.Ü. Fen Bilimleri Enstitüsü Yönetim Kurulu Yüksek Lisans derecesini onamıştır. Prof. Dr. Bilal TOKLU Fen Bilimleri Enstitüsü Müdürü..

TEZ BİLDİRİMİ Tez içindeki bütün bilgilerin etik davranış ve akademik kurallar çerçevesinde elde edilerek sunulduğunu, ayrıca tez yazım kurallarına uygun olarak hazırlanan bu çalışmada bana ait olmayan her türlü ifade ve bilginin kaynağına eksiksiz atıf yapıldığını bildiririm. Zehra KARABIYIK

iv FERMENTE ET ÖRNEKLERĠNDEN ĠZOLE EDĠLEN ENTEROCOCCUS TÜRLERĠNĠN BAZI TEKNOLOJĠK ÖZELLĠKLERĠ VE ÇOKLU ANTĠBĠYOTĠK DĠRENÇLĠLĠĞĠ (Yüksek Lisans Tezi) Zehra KARABIYIK GAZĠ ÜNĠVERSĠTESĠ FEN BĠLĠMLERĠ ENSTĠTÜSÜ ġubat 2011 ÖZET AraĢtırmamızda ġubat 2009 Aralık 2009 tarihleri arasında Ankara nın çeģitli marketlerinden toplanan 20 sucuk, 20 sosis, 20 salam ve 20 pastırma örneği materyal olarak kullanılmıģtır. ÇalıĢılan 80 fermente et örnekten Enterococcus izolasyonu gerçekleģtirilerek, tür seviyelerindeki tanımlamaları Becton Dickinson (BD) BBL Crystal Identification Systems ve Gram-Positive ID kit ile yapılmıģtır. Tanımlamaları yapılan Enterococcus türlerinde; 7 C de ve 25 C de proteolitik aktivite, 30 C de lipolitik aktivite ve antibiyotik duyarlılıkları araģtırılmıģtır. Fermente et örneklerinden izole edilen 134 Enterococcus izolatının 79 u (%59) E. faecium, 35 i (%26.1) E. faecalis, 13 ü (%9.7) E. gallinarum, 5 i (%3.7) E. durans, 1 i (%0.7) E. avium ve 1 i (%0.7) E. hirae olarak tanımlanmıģtır. Fermente et örneklerinden izole edilen 134 Enterococcus izolatının 18 inde (%13.4) 7 0 C deki proteolitik enzim aktivitesi, 2 sinde (%1.5) 25 0 C de proteolitik enzim aktivitesi, 112 sinde (%83.5) lipolitik enzim aktivitesi pozitif olarak saptanmıģtır. Kirby-Bauer disk difüzyon yöntemine göre antibiyotik dirençliliklerini araģtırdığımız 134 Enterococcus izolatının, 49 u (%36.5) streptomisin, 8 i (%6) siprofloksasin, 1 i (% 0.8) ampisilin, 8 i (%6) tetrasiklin, 98 i (%73.2) rifampin, 20 si (%15) nitrofurantoin, 1 i (%0.8) penisilin, 3 ü (%2.3) gentamisin, 27 si (%20.2) eritromisin, 3 ü (%2.3)

v teikoplanin ve 2 si kloramfenikol (%1.5) antibiyotiklerine dirençli bulunmuģtur. Ġzole edilen Enterococcus ların tamamı vankomisin antibiyotiğine duyarlı olduğu tespit edilmiģtir. Bilim Kodu : 203.1.010 Anahtar Kelimeler : Fermente et, Enterococcus, antibiyotik Sayfa Adeti : 105 Tez Yöneticisi : Doç. Dr. Sumru ÇITAK

vi TECHNICAL FEATURES AND SEVERAL ANTIBIOTICS RESISTANCE OF ENTEROCOCCUS SPECIES WHICH WERE ISOLATED FROM FERMENTED MEAT (M.Sc.Thesis) Zehra KARABIYIK GAZI UNIVERSITY INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY February 2011 ABSTRACT In this research; we examined 20 soucuk, 20 sausage, 20 salami and 20 pastirma collected from different sale point in Ankara, as material between February 2009 and December 2009. Enterococcus species were isolated from fermented meat and identified with Becton Dickinson (BD) BBL Crystal Identification Systems and Gram-Positive ID Kit. Identified Enterococcus species were analysed for proteolytic activity at 7 C and 25 C, lipolytic activity at 30 C and antibiotic susceptibilities. The distribution rate of 134 Enterococcus strains isolated from fermented meat were 79 (59%) E. faecium, 35 (26.1%) E. faecalis, 13 (9.7%) E. gallinarum, 5 (3.7%) E. durans, 1 (0.7%) E. avium and 1 (0.7%) E. hirae. 18 (13.4%) of total 134 Enterococcus isolated from fermented meat samples were determined as proteolitycally positive at 7 0 C, 2 (1.5%) of 134 were determined as proteolitycally positive at 25 0 C and 112 (83.5%) of 134 were determined positive at 30 0 C for lipolitic activity. Antibiotic sensitivities of Enterococcus isolates were detected Kirby-Bauer disc diffusion method. The distribution of antibiotic resistances of Enterococcus isolates was 49 (36.5%) streptomycin, 8 (6%) ciprofloxacin, 1 (0.8%) ampicillin, 8 (6%) tetracycline, 98 (73.2%) rifampin, 20 (15%) nitrofurantoin, 1 (0.8%) penicilin, 3 (2.3%)

vii gentamicin, 27 (20.2%) erythromycin, 3 (2.3%) teicoplanin, 2 (1.5%) chloramphenicol. All Enterococcus isolates were sensitive to vancomycin. Science Code : 203.1.010 Key Words : Fermented meat, Enterococcus, antibiotic Page Number : 105 Adviser : Assoc. Prof. Dr. Sumru ÇITAK

viii TEġEKKÜR Tez konumun belirlenmesi ve yürütülmesinde bana yardımcı olan, bilgi ve deneyimlerinden faydalandığım, teģvikleriyle beni destekleyen Sayın Hocam Doç. Dr. Sumru ÇITAK a; bilgi ve deneyimlerinden faydalanma olanağı bulduğum hocalarım Sayın Doç. Dr. Neslihan Gündoğan ve Sayın Doç. Dr. Nihal Yücel e; laboratuvar çalıģmalarım süresince bilgi ve deneyimleriyle bana destek olan ve yardımlarını esirgemeyen Sayın Hocam Dr. Ebru Yılmaz a; doğduğum günden beri her koģulda yanımda olan, yetiģmemde büyük özveriler gösteren babam Ġrfan KARABIYIK ve annem Miyase KARABIYIK a; lisans hayatımdan bu yana hiçbir zaman beni yalnız bırakmayan sevgili arkadaģım ġakir ġenol ġahġn e ve kardeģim Dr. Afife KARABIYIK a; bir arada çalıģtığım laboratuvar arkadaģlarım Seral ORMANCI, Gülcan AYDIN, Özlem ATAOL, Aytuna ÇERÇĠ, Burcu KAVUKOĞLU, Safiye GÜNAL, ġ. Ceren ÖCAL, Derya ÜNAL, Pınar AYTOP ve Özge ÜNAL ÇOLAK a teģekkürü bir borç bilirim.

ix ĠÇĠNDEKĠLER Sayfa ÖZET..iv ABSTRACT...vi TEġEKKÜR..viii ĠÇĠNDEKĠLER..ix ÇĠZELGELERĠN LĠSTESĠ...xii RESĠMLERĠN LĠSTESĠ...xiv SĠMGELER VE KISALTMALAR xv 1. GĠRĠġ.1 2. KAYNAK ARAġTIRMASI..4 2.1. Enterococcus ların Genel Özellikleri...4 2.1.1. Bazı Enterococcus türlerinin özellikleri.8 2.1.2. Enterococcus türlerinin neden olduğu hastalıklar.9 2.1.3. Enterococcus türlerinin epidemiyolojisi...11 2.1.4. Enterococcus türlerinin virülans özellikleri...13 2.2. Enterococcus ların Gıda Ürünleriyle ĠliĢkisi...15 2.3. Fermente Etler ve Fermente Etlerin Mikrobiyolojik Kalitesi..20 2.4. Enterococcus ların Starter ve Probiyotik Özellikleri...21 2.5. Proteolitik Aktivite..26 2.6. Lipolitik Aktivite.....29 2.7. Antimikrobiyal Direnç.....30 3. MATERYAL VE METOD 41

x Sayfa 3.1. Fermente Et Örneklerinden Enterococcus ların Ġzolasyonunda KullanılanYöntemler...41 3.1.1. Örnek alma ve örnekleri analize hazırlanması.......41 3.1.2. Fermente etlerde Enterococcus izolasyonu... 42 3.2. Gıda örneklerinde Enterococcus Ġzolasyonu ve Ġdentifikasyonunda Kullanılan Besiyerleri ve Testler.42 3.2.1. Azide dekstroz broth.42 3.2.2. Peptonlu su 43 3.2.3. Slanetz Bartley besiyeri....43 3.2.4. Blood agar base....44 3.2.5. Gram boyama yöntemi..44 3.2.6. Katalaz testi...44 3.2.7. %6,5 luk NaCl de üreme...44 3.2.8. 10 0 C de ve 45 0 C de üreme..45 3.2.9. Eskülin hidrolizi 46 3.2.10. PYR (pyrolidonyl arylamidase) testi.. 47 3.2.11. Hareket testi 48 3.2.12. Arjinin hidrolizi......49 3.2.13. Karbonhidrat fermentasyon testi.50 3.3. Enterococcus Ġzolatlarının Tür Seviyesinde Tanımlanması.....52 3.4. Fermente Etlerden Ġzole Edilen Enterococcus ların Proteolitik Aktivitelerinin Belirlenmesi.....52 3.4.1. 7 0 C deki proteolitik enzim aktivitesininbelirlenmesi 52 3.4.2. 25 0 C deki proteolitik enzim aktivitesinin belirlenmesi.54

xi Sayfa 3.5. Fermente Etlerden Ġzole Edilen Enterococcus ların Lipolitik Enzim Aktivitelerinin Belirlenmesi..... 55 3.6. Enterococcus Türlerinin Antibiyotik Duyarlılıklarının Belirlenmesi.....56 4. BULGULAR.....58 5.TARTIġMA VE SONUÇ...74 KAYNAKLAR..91 ÖZGEÇMĠġ.....105

xii ÇĠZELGELERĠN LĠSTESĠ Çizelge Sayfa Çizelge 1.1. Enterococcus cinsi içerisinde yer alan türler...1 Çizelge 2.1. Gram pozitif kok ve kokobasillerin ayrımında kullanılan testler...6 Çizelge 2.2. Enterococcus ların fenotipik özelliklerine sınıflandırılması...8 Çizelge 3.1. AraĢtırmamızda kullanılan antibiyotik diskleri ve duyarlılık sınırları 57 Çizelge 4.1. Enterococcus türlerinin izole edildiği materyallere göre dağılımları 58 Çizelge 4.2. Fermente et örneklerinden izole edilen Enterococcus ların türlere göre dağılımı..... 59 Çizelge 4.3. 7 0 C deki proteolitik enzim aktivitesi gösteren Enterococcus ların fermente et çeģitine göre dağılımı...... 60 Çizelge 4.4. Fermente et örneklerinde 7 0 C de proteolitik enzim aktivitesi gösteren Enterococcus ların türlere göre dağılımı... 61 Çizelge 4.5. 25 0 C de proteolitik enzim aktivitesi gösteren Enterococcus ların fermente et örneklerine göre dağılımı..62 Çizelge 4.6. Fermente et örneklerinde 25 0 C de proteolitik enzim aktivitesi gösteren Enterococcus ların türlere göre dağılımı...63 Çizelge 4.7. Lipolitik enzim aktivitesi gösteren Enterococcus ların fermente et örneklerine göre dağılımı..64 Çizelge 4.8. Fermente et örneklerinde lipolitik enzim aktivitesi gösteren Enterococcus ların türlere göre dağılımı...65 Çizelge 4.9. Fermente etlerden izole edilen Enterococcus türlerinin proteolitik ve lipolitik aktiviteleri....66 Çizelge 4.10. Fermente gıdalardan izole edilen Enterococcus ların antibiyotik duyarlılıklarının dağılımı....67 Çizelge 4.11. Fermente et örneklerinden izole edilen Enterococcus ların antibiyotik duyarlılıklarının dağılımı.68

xiii Çizelge Sayfa Çizelge 4.12. Fermente et örneklerinden izole edilen Enterococcus ların Antibiyotik dirençliliklerinin türlere göre dağılımı.... 70 Çizelge 4.13. Fermente et örneklerinden izole edilen Enterococcus ların çoklu antibiyotik dirençliliği...72

xiv RESĠMLERĠN LĠSTESĠ Resim Sayfa Resim 3.1. %6,5 luk NaCl de Üreme testi...45 Resim 3.2. 10 0 C de ve 45 0 C de üreme testi... 46 Resim 3.3. Eskülin Hidrolizi Testi..47 Resim 3.4. Hareket Testi....49 Resim 3.5. Arjinin Hidrolizi Testi......50 Resim 3.6. Karbonhidrat fermentasyon testi......51 Resim 3.7. 7 0 C de Proteolitik Enzim Aktivitesi Testi....53 Resim 3.8. 25 0 C de Proteolitik Enzim Aktivitesi Testi......54 Resim 3.9. Lipolitik Enzim Aktivitesi Testi... 56

xv SĠMGELER VE KISALTMALAR Bu çalıģmada kullanılmıģ bazı simgeler ve kısaltmalar, açıklamaları ile birlikte aģağıda sunulmuģtur. Simgeler Açıklama α Alfa β Beta dk Dakika o C gr L Derece Santigrat Gram Litre µ Mikron µg Mikrogram ml Mililitre mm Milimetre - Negatif + Pozitif % Yüzde ph Asitlik değeri Kısaltmalar Açıklama AM ARE ATM C CLSI CN CIP Ampisilin Antibiyotiğe Dirençli Enterococcus Atmosfer Basıncı Kloromfenikol Clinical and Laboratory Standarts Instute Gentamisin Siproflaksasin

xvi Kısaltmalar Açıklama D DEĞ: DNA E F GAZ GRAS GRE H 2 S H 2 O 2 HCI ĠE K 2 HPO 4 KOH LAP NACI P PYR RF RRNA SPP. S TA TE TEC TS UHT VA VAN Dirençli DeğiĢken Deoksiribonükleik asit Eritromisin Nitrofurantoin Gaz oluģturması Generally Recognised As Safe Glikopeptite Dirençli Enterococcus Hidrojen Sülfür Hidrojen peroksit Hidroklorik asit Ġnfektif Endokardit Dipotasyum Hidrojen Fosfat Potasyum Hidroksit Lösinaminopeptidaz Sodyum Klorür Penisilin L-pyronidolyl-betanaphthlamide Rifampin Ribozomal ribonükleik asit Tür Hassas Tributyrin Agar Tetrasiklin Teikoplanin Türk Standardı Ultra-High Temperature Vankomisin Vankomisin Direnci

xvii Kısaltmalar Açıklama VRE VREF VB. YY. Vankomisine Dirençli Enterococcus Vankomisine Dirençli Enterococcus faecium Ve benzeri Yüzyıl

1 1. GĠRĠġ Enterococcus adı ilk kez Thiercelin tarafından 1899 yılında, dıģkıdan elde ettiği çift veya kısa zincirler halinde görülen bakteriler için kullanmıģtır. Aynı yıl Mac Collum ve Hasting sonraları hemolitik bir Enterococcus olduğu anlaģılan, endokardite neden olan bir mikroorganizmaya Micrococcus zymogenes adını vermiģlerdir. Streptococcus faecalis adı ilk kez 1906 yılında Andrewes ve Horder tarafından endokarditli bir hastadan izole edilen mikroorganizmalar için kullanılmıģtır [Murray, 1990]. Bu mikroorganizmalar yıllarca Streptococcus cinsinin içinde ana gruplardan biri olarak kabul edilmiģ, ancak kimyasal ve fiziksel ajanlara daha dirençli olmaları ve çoğu grup D streptokok içerisinde barındırması ile Streptococcus lardan ayrılmıģlardır. Son yıllarda Enterococcus cinsinin taksonomisinde dikkati çeker değiģiklikler olmuģ, Enterococcus cinsi Streptococcus cinsinden ayrılarak ayrı bir cins olarak tanınmaya baģlanmıģtır. Streptococcus faecalis ve Streptococcus faecium un ve diğer türlerden farklı olduğu ve yeni bir cins içerisinde değerlendirilmesi gerektiği görüģü 1984 te Schleifer ve Kipper Balz. ın moleküler çalıģmalarıyla da desteklenmiģtir. Diğer Enterococcus türleri de bu yeni tanımlanan cins içerisine dahil edilmiģtir [Murray, 1990; Scheleifer ve ark., 1984]. Enterococcus türleri karģılaģtırıldığında son zamanlarda tanımlanan türlerin fizyolojik ve biyokimyasal davranıģlarında önemli farklılıklar gözlenmiģtir. Bunlar 16S rrna dizilimlerine göre 26 tür olarak tanımlanmıģtır. Günümüze kadar tanımlanmıģ olan 26 Enterococcus türü Çizelge 1.1 de sunulmuģtur [Klein, 2003]. Çizelge 1.1. Enterococcus cinsi içerisinde yer alan türler [Klein, 2003] E. haemoperoxidus E. asini E. dispar E. mundtii E. porcinus E. raffinosus E. saccharolyticus E. casseliflavus E. pseudoavium E. gallinarum E. faecalis E. avium E. malodoratus E. cecorum E. faecium E. ratti E. flavescens E. sulfureus E. durans E. solitarius E. columbae E. gilvus E. hirae E. villorum E. pallens E. moraviensis

2 Enterococcus lar hemen her zaman, her yerde bulunabilen mikroorganizmalardır [Halkman, 2000]. Enterococcus lar hayvansal kaynaklı gıdalarda potansiyel bir tehlike oluģturmaktadır. Hatta hayvansal gıdalar bu tür patojen mikroorganizmaların geliģebilmesi için mükemmel bir besi ortamıdır. Çiğ et tüketiciye ulaģıncaya kadar herhangi bir iģlem görmemektedir. Özellikle salamura et ve fermente et ürünlerinde genellikle ısısal iģlem uygulanmamaktadır. Bunun doğal bir sonucu olarak et ve et ürünleri, insanlara geçen gıda kaynaklı birçok hastalıkta en önemli gıda grubunu oluģturmaktadır [Ünlütürk, 1998]. Enterococcus lar pek çok yararlı özellik taģırken potansiyel patojenik özellikler de sergileyebilirler. Bu mikroorganizmalar starter kültür olarak yararlı rol oynarlarken, diğer taraftan da bazı süt ürünlerinde Enterococcus ların fekal orijinli olanları hakkında kuvvetli bir soru iģareti vardır. Fermente gıdalardan izole edilen Enterococcus ların potansiyel veya araģtırılan patojeniteleri üzerine; hayvan model sistemlerinde daha detaylı çalıģmalara ihtiyaç vardır. Enterococcus içeren gıdaların sağlık riski olmaksızın tüketiminin uzun bir tarihi olmasına karģın Enterococcus ların GRAS (Generally Recognised As Safe) mikroorganizma olarak kabul edilmesi çok daha fazla çalıģmayı gerektirmektedir [Halkman, 2000; Riboldi ve ark., 2009]. Gıdalar üzerinde geliģen bazı mikroorganizmalar proteinleri hidrolize ederek tat ve koku bileģenleri üzerinde olumsuz etkiye neden olabilirler. Psikrotrofik mikroorganizmalardan bazılar kuvvetli proteolitik özellikleri nedeniyle süt, et ve dondurulmuģ gıdalar üzerinde istenmeyen değiģikliklere neden olmaktadır. Özellikle depolama süresi boyunca bu mikroorganizmalar çoğalmakta ve bazen gıdaları tüketemeyecek hale getirmektedir. Diğer yandan peynir, fermente et gibi bazı gıdaların olgunlaģması ve yapıların istenen düzeyde geliģmesi, mikrobiyel proteolitik aktivitenin bir sonucudur [Halkman, 2000].

3 Gıda maddelerinin birçoğu lipit içermektedir. Süt, krema, tereyağ, beyaz peynir gibi bazı gıdalarda meydana gelen mikrobiyel lipoliz üründe kalite kaybına ve bozulmaya neden olur. Diğer yandan lipolitik aktivitenin olması bazı gıdalarda tat ve aroma oluģumuna katkıda bulunmaktadır. Örneğin peynir ve sucuk gibi fermente ürünlerin olgunlaģarak istenen tat ve aromaya sahip olması sağlanır. Bir diğer ifade ile belirli bir lipoliz gerçekleģmesi bir kalite faktörü olarak değerlendirilir [Halkman, 2000]. Antibiyotikler, hayvanları hastalıklardan korumak ve verimi arttırmak amacıyla yaygın bir Ģekilde kullanılmaktadır. Ancak her madde gibi antibiyotiklerin de bir takım avantaj ve dezavantajları bulunmaktadır. Önemli olan bunların yerinde kullanımına dikkat edilmesi ve bunda aģırıya kaçılmamasıdır. Çünkü bazı bilinçsiz üreticiler, hastalıkları daha çabuk tedavi edeceklerine ve verimi arttıracaklarına inanarak fazla ve gereksiz antibiyotik kullanımı seçmektedir [Metin ve ark., 2003]. Glikopeptide dirençli özellikle vankomisine dirençli Enterococcus ların sayısının artmasıyla birlikte bu türler dünya çapında önemli bir problem olarak ortaya çıkmaktadır. Glikopeptidler immun sistemi zayıf ya da bastırılmıģ bireylerde birkaç enfeksiyona karģı en son çare olarak kullanılan antibiyotiklerdir. Enfeksiyona neden olan Enterococcus cinsi bakteriler arasında en sık izole edilen türler Enterococcus faecalis ve Enterococcus faecium dur. Meydana gelen enfeksiyonlarda, Enterococcus faecium, antibiyotiklere karģı Enterococcus faecalis den daha dirençli olmasıyla dikkat çekmekte ve patojenik Enterococcus faecium un çok çabuk antibiyotik direnç mekanizması geliģtirebilmesinin ve bu özelliğini transfer edebilme kabiliyetinin sağlık açısından önemli bir risk olduğu düģünülmektedir [KarataĢ, 2005]. Bu çalıģmada çeģitli fermente et ürünlerinden (sucuk, sosis, salam, pastırma) Enterococcus izolasyonu, izolatların identifikasyonu, identifiye edilen türlerde proteolitik enzim aktivitesi, lipolitik enzim aktivitesi ve çeģitli antibiyotiklere karģı hassasiyetlerinin araģtırılması amaçlanmıģtır.

4 2. KAYNAK ARAġTIRMASI 2.1. Enterococcus ların Genel Özellikleri Enterococcus spp., taksonomide 1984 yılından önce Streptococcus cinsi altında yer almaktaydı. 1989 dan sonra Thiercelin tarafından bu cinsin ilk tanımlaması yapılmıģ ve 1993 yılında Thiercelin ve Jouhaud tarafından Enterococcus olarak tanımlanmıģtır. Daha önce Streptococcus faecalis ve Streptococcus faecium olarak bilinen bakteriler, yeni sınıflandırmada Enterococcus faecalis ve Enterococcus faecium olarak adlandırılmıģtır. Enterococcus cinsine ait bakteriler, aerobik ya da fakültatif anaerobik, katalaz (-), kok Ģeklindedirler. Besin gereksinimleri komplekstir. GeliĢebilmeleri için gerek B vitaminleri ve gerekse bazı temel amino asitler açısından pek çok gram (+) bakteriden daha fazla besin maddesine gereksinim duyarlar. Bu bakteriler Lancefield D grubu içinde yer almaktadırlar. Laktozu fermente edebilirler, arabinoz pozitif ve pürivat negatiftirler. Karbonhidratları fermente ederek L (+) laktik asit oluģtururlar ve bu özelliklerinden dolayı tipik homofermentatif laktik asit bakterileri olarak bilinirler, ancak gaz oluģturmazlar. Karbonhidrat metabolizmaları için Embden-Mayerof-Parnas yolunu kullanırlar [KarataĢ, 2005; Komprda ve ark., 2010]. Ġdeal üreme ısısı 35 C dir. %6.5 NaCl de ürerler. %40 safra varlığında eskülini hidrolize ederler. Tüm Streptococcus bovis türlerinin ve viridans streptokokların %10 unun safra-eskülin hidrolizi pozitiftir. E. cecorum, E. columbae ve E. saccharolyticus dıģında tüm Enterococcus lar, PYR (L-pyronidonylbetanaphthylamide) pozitiftir (+). Tüm suģlar lösinaminopeptidaz (LAP) oluģtururlar. Glikozdan gaz oluģturmazlar ve glikoz fermentasyonunun son ürünü laktik asittir. 60ºC ye 30 dakika dayanıklıdır. Kanlı agarda 0,5-1,5 mm boyutunda, (streptokoklardan daha büyük) kabarık, gri-beyaz renkte koloniler yaparlar. Bazen zayıf bir alfa hemoliz meydana getirebilirlerse de genellikle nonhemolitiktirler. E. faecalis ve E. durans suģları kanlı agarda beta-hemoliz yapabilirler. E. faecalis in bazı suģları at veya tavģankanı içeren besiyerlerinde beta hemoliz yapmalarına

5 rağmen, koyun kanı içeren besiyerlerinde hemoliz yapmazlar [Barbosa, 2009; Sayıner, 2008; Ortigosa, 2008]. Enterococcus ların diğer gram pozitif koklara benzer hücre duvar yapısı vardır. Hücre duvarları peptidoglikan, teikoik asit, lipoproteinler ve yüzey protein antijenlerinden oluģur. Lancefield' in grup D antijeni, hücre duvarı ile bağlantılı bir gliserol olan teikoik asitten oluģur. Enterococcus lar %80 oranında D grubu antiserumlarla aglütinasyon verirler. Grup D antijeni tespiti, Enterococcus lar dıģında, S. bovis, S. equinus, S. suis, Pediococcus spp. ve Leuconostoc spp. gibi diğer gram pozitif bakterilerde de bulunabildiğinden, Enterococcus ların özellikle doğal olarak glikopeptid direnci bulunan Leuconostoc spp. ve Pediococcus spp. den ayırımı için PYR hidrolizinden yararlanılır [Sayıner, 2008]. Grup D streptokoklar, Enterococcus lar ve Listeria türleri %40 safra varlığında ürer ve eskülini eskületine hidrolize eder. Eskületin ferrik sitratla birleģir ve siyah bir kompleks oluģur. Viridans streptokok türlerinin çoğu eskülini hidrolize eder, fakat %40 safra varlığında üreyemez. Bu özellik Enterococcus ların diğer Streptococcus lardan ayırt edilmesini sağlasa da inokülum yoğun olursa ve safra konsantrasyonu %40 tan düģük olursa viridans Streptococcus larda da yalancı pozitiflik gözlenebilir. Lactococcus garvie PYR ve NaCl pozitif olup, sadece grup D antijeni içermemesi ile Enterococcus lardan ayrılır [Sayıner, 2008]. Enterococcus ların laboratuvar ortamında üretilmesi ve yaģatılması kolaydır. Çoğu 60 C de 30 dk ısıtılmaya dayanıklıdır. Buzdolabında aylarca, -70 C de yıllarca saklanabilir, fakat donma ve sonra yeniden eritme iģlemleri ömürlerini kısaltır. Normal etüv ortamında, her türlü besiyerinde kolayca ürer. Trypticase-soy-%5 koyun kanlı agar, Brain-Heart infüzyon-%5 koyun kanlı agar ya da herhangi bir kanlı besiyeri üremesini destekleyicidir. Ġzolasyonlarında seçici besiyerleri kullanılabilir. Azide içeren besiyerleri seçici izolasyonda baģarılıdır [Sayıner, 2008]. Slanetz Bartley besiyeri Enterococcus lar için seçici besiyeridir [Nováková, 2010]. Gram

6 pozitif kok ve kokobasillerin ayrımında kullanılan testler Çizelge 2.1 de gösterilmiģtir. Çizelge 2.1. Gram pozitif kok ve kokobasillerin ayrımında kullanılan testler [Sayıner, 2008] Cins VAN GAZ PYR LAP %6.5 NaCl 10 C de üreme 45 C de üreme Enterococcus H-D - + + + + + + Eskülin Hidrolizi Streptococcus H - + + Değ. - - Değ. Lactococcus H - + + Değ. + - + Aerococcus H - Değ. Değ. + Değ. - - Leuconostoc D + - Değ. Değ. + Değ. Değ. Pediococcus D - - - Değ. - Değ. + Gamella H - Değ. + - - - - Vagococcus H - + + + + - + VAN=vankomisin direnci, GAZ=gaz oluģturması, PYR= L-pyronidonylbetanaphthylamide, LAP= lösinaminopeptidaz, H=hassas, D=dirençli, (+)=pozitif, (-)=negatif, Değ.=değiĢken Enterococcus ların tiplendirilmesi için çeģitli moleküler teknikler kullanılmaktadır. Ayrıca bakteriyosin tiplendirmesi, faj tiplendirmesi, biyokimyasal reaksiyon profilleri, antimikrobiyal direnç paternleri ve serolojik yöntemler de kullanılabilir [Sayıner, 2008]. Enterococcus lar mannitol, sorbitol, sorboz içeren sıvı besiyerlerinde asit oluģturmalarına ve arjinini hidrolize etmelerine göre beģ gruba ayrılırlar. Enterococcus lar mannitol, sorbitol, sorboz içeren sıvı besiyerlerinde asit oluģturmalarına ve arjinini hidrolize etmelerine göre beģ gruba ayrılmaları Çizelge 2.2 de gösterilmiģtir [Tekin, 2004; Vaningelgem, 2006].

7 Grup 1: E. avium, E. malodoratus, E. raffinosus, E. pseudoavium, E. saccharolyticus, E. pallens, E. gilvus dan oluģur. Bu türler mannitol, sorbitol ve sorboz sıvı besiyerinde asit oluģturur, ancak arjinini hidrolize etmezler [Tekin, 2004]. Grup 2: E. faecalis, E. faecium, E.casseliflavus, E. haemoperoxidus, E. mundtii ve E. gallinarum dan oluģur. Bu gruptaki türler arjinini hidrolize ederler, mannitollü sıvı besiyerinde asit oluģtururlar, sorbozdan asit oluģturmazlar ve sorbitollü sıvı besiyerinde değiģken reaksiyon verirler [Tekin, 2004]. Grup 3: E. villorum, E. dispar, E. durans, E. hirae, E. ratti ve E. faecalis ile E. faecium un mannitol negatif varyantları bu grubu oluģturur. Bu gruptaki türler D antijeni içermez, arjinini hidrolize ederler, fakat mannitol, sorboz ve sorbitol içeren sıvı besiyerlerinin hiçbirisinde asit oluģturmazlar [Tekin, 2004]. Grup 4: E. sulfurens, E. asini, E. phoeniculicola ve E. cecorum bu grupta bulunmaktadır. Bu gruptaki türler mannitol ve sorboz içeren sıvı besiyerlerinde asit oluģturmaz ve arjinini hidrolize etmezler. Sorbitol içeren sıvı besiyerinde ise E. cecorum asit oluģtururken, E. sulfurens asit oluģturmaz [Tekin, 2004]. Grup 5: E. columbae, E. canis, E. moraviensis bu grupta bulunur. Bu gruptaki türler arjinini hidrolize etmezler, mannitollü sıvı besiyerinde asit oluģtururlar, sorbozdan asit oluģturmazlar ve sorbitollü sıvı besiyerinde değiģken reaksiyon verirler [Tekin, 2004].

8 Çizelge 2.2. Enterococcus ların fenotipik özelliklerine göre sınıflandırılması (*aynı türler farklı özelliklere göre farklı gruplarda dahil edilmiģtir.) [Tekin, 2004]. Grup1 Grup2 Grup3 Grup4 Grup5 E.avium E.malodoratus E.raffinosus E.pseudoavium E.palens E.gilvus E.saccharolyticus E.faecalis E.faecium E.casselifalvus E.mundtii E.haemoperaxidus E.gallinarum E.durans E.hirae E.ratti E.dispar E.faecalis* E.faecium* E.villorum E.asini E.cecorum E.sulfurens E.phoeniculicola E.canis E.columbae E.moraviensis E.casselifalvus* E.faecalis* 2.1.1. Bazı Enterococcus türlerinin özellikleri E. faecalis: Gastrointestinal flora üyesidir. Ġnsan kaynaklı enfeksiyonlardan en sık sorumlu tutulan türdür. Ayrıca çeģitli hayvanlarda da bulunur. Üriner enfeksiyon, yara, periton sıvısı, derin pelvik apse, endokardit ve kan kültürlerinden izole edilmiģtir. Beta hemolitiktir. %6,5 luk NaCl ve ph 9,6 da ürer [Sayıner, 2008]. E. faecium: Ġnsan ve sığırların gastrointestinal sisteminde bulunur. Yiyecek, sebze ve yemlerden de izole edilmiģtir. E. faecalis e göre antimikrobiyallere daha dirençlidir. Alfa hemolitiktir. %6,5 luk NaCl ve ph 9,6 da ürer [Sayıner, 2008]. E. durans: Süt ve kuru gıdadan izole edilmiģtir. Ġnsan ve hayvanda nadiren, barsak ve üriner sistemden izole edilmiģtir. Alfa hemolitiktir. %6,5 luk NaCl ve ph 9,6 da ürer. 50 0 C de üremez [Sayıner, 2008]. E. avium: KuĢ, tavuk, köpek gibi hayvanlardan izole edilmiģtir. Ġnsan gastrointestinal sistem florasının da bir parçasıdır. Apandisit, otit ve beyin apselerinden izole edilmiģtir. Alfa hemolitiktir. %6,5 luk NaCl de üremesi zayıftır. H 2 S üretir, pigment yapmaz [Sayıner, 2008].

9 E. casseliflavus: Bitki ve toprakta bulunur. Vankomisine dirençlidir. Fırsatçı insan enfeksiyonları yapar. %6,5 luk NaCl ve ph 9,6 da ürer. Hareketlidir, sarı pigment yapar [Sayıner, 2008]. E. gallinarum: Evcil kuģların gastrointestinal sisteminde bulunur. Koyun kanlı agarda nonhemolitiktir. At kanlı agarda beta hemoliz yapabilir. %6,5 luk NaCl ve ph 9,6 da ürer. Hareketlidir, pigment yapmaz [Sayıner, 2008]. E. hirae: Domuz ve tavuklarda bulunur. Önceden atipik E. faecium sanılırdı. Hemoliz yapmaz. 10-45 0 C arasında üreyebilir. %6,5 luk NaCl ve ph 9,6 da ürer [Sayıner, 2008]. 2.1.2. Enterococcus türlerinin neden olduğu bazı hastalıklar Son yıllarda Enterococcus ların neden olduğu enfeksiyonlar belirgin Ģekilde artmıģ olup, özellikle hastane enfeksiyonlarına neden olan etkenler arasında ön sırada yer almaya baģlamıģtır [Sayıner, 2008; Billstro ve ark., 2008]. Enterococcus lar barsak ve genitoüriner sistem dıģında, yumuģak dokuda da kolonize olabilirler. Virülansı düģük olan bu bakteri çoğu kez hastanın kendi endojen florasından kaynaklanan enfeksiyonlara yol açar. Genel olarak enterokokal enfeksiyonların %80-90 ı E. faecalis ile geliģir. Ġkinci sık etken %5-15 ile E. faecium dur [MenteĢ, 2007]. Endokardit, üriner enfeksiyonlar, intraabdominal abseler, yara ve dekubitus enfeksiyonları, akut ya da kronik safra kesesi iltihabı, menenjit, hastane kaynaklı pnömoni ve septisemi gibi enfeksiyonlara neden olabilirler. Safra yolları enfeksiyonlarında Escherichia coli den sonra ikinci sırayı alırlar. Enterococcus lar nozokomiyal bakteremide üçüncü, üriner sistem ve yara enfeksiyonların da ikinci en sık saptanan etkendir. Enterococcus ların en sık neden olduğu enfeksiyonlar arasında üriner sistem enfeksiyonları yer almaktadır [MenteĢ, 2007, Canto n ve ark., 2010].

10 Üriner sistem enfeksiyonları: Enterococcus ların en sık neden olduğu klinik tablo üriner sistem enfeksiyonlarıdır. Enterococcus türleri tüm nozokomiyal üriner sistem enfeksiyonlarının %16 sını oluģturur. Enterococcus lar, toplumda geliģen üriner sistem enfeksiyonlarında sağlıklı genç kadınlarda %5 sıklıkta etken iken, üriner katater, genitoüriner patoloji, önceden antibiyotik alma gibi risk faktörleri bu oranı artırmaktadır. YaĢlı erkeklerde de en sık görülen patojenlerden biridir [MenteĢ, 2007]. İnfektif Endokardit (İE): En sık toplumda geliģir. Tüm endokarditlerin üçüncü en sık nedenidir. Tüm ĠE lerin %10-15 ini oluģturur. En sık E. faecalis e bağlı olarak geliģir. Erkeklerde 50-60 yaģ arasında, kadınlarda ise doğurganlık yaģında daha sıktır. Enterokokal bakteremilerin kötü bir komplikasyonudur. Altta yatan kalp kapak hastalıkları önemli bir risk faktörüdür. Ancak normal kalp kapaklarında da enfeksiyona yol açabilirler. En sık mitral ve aort kapak tutulmaktadır. Genelde kaynak bulunamayan çoğu olguda genitoüriner sistem sorumlu tutulur [MenteĢ, 2007]. Bakteremi: Enterokokal bakteremilerin %78 i nozokomiyaldır. Nozokomiyal enterokokal bakteremilerin çoğunda infektif endokardit yoktur. Ancak hastane dıģında geliģen bakteremilerin 1/3 üne endokardit eģlik eder. Polimikrobiyal bakteremilerde en sık izole edilen gram-pozitif bakterilerdir. Genellikle altta yatan hastalığı olanlarda daha sık görülür. Bakteremiye bağlı mortaliteleri %13-68 arasında değiģirken, VRE de mortalite %17-100 arasındadır. Enterokokal bakteremilerde mortaliteyi artıran faktörler ampisiline direnç, önceden antibiyotik kullanımı ve uygunsuz antibiyotik kullanımı ve altta yatan hastalıktır. Bakteremilerin en sık kaynağı üriner sistemdir. Bunu genital sistem, intraabdominal ve pelvik enfeksiyonlar ve intravenöz kataterler izlemektedir [MenteĢ, 2007]. İntraabdominal ve Pelvik Enfeksiyonlar: Enterococcus lar vajen ve gastrointestinal sistemin normal flora elemanları olduğundan bu enfeksiyonlardaki rolü tartıģmalıdır.

11 Genel görüģ, intraabdominal ve pelvik infeksiyonlarda tek baģına izole edilmediği sürece Enterococcus ların tedavi edilmemesidir [MenteĢ, 2007]. Deri ve Yumuşak Doku Enfeksiyonları: Bu bölgelerin enfeksiyonlarından nadiren saf olarak elde edilirler. Sıklıkla cerrahi yara enfeksiyonlarından, diyabetik ayak ülserlerinden ve yanıklardan diğer bakteriler ile birlikte izole edilirler [MenteĢ, 2007]. Yeni doğan ve Pediatrik Enfeksiyonlar: Yeni doğanlar enterokokal enfeksiyonlar için risk gruplarıdır. En sık sepsis ve menenjit görülür. Yeni doğan sepsis ve menenjitlerinin %13 ünde Enterococcus lar etken olarak gösterilmiģtir. VRE salgınları bu yaģ grubunda da özellikle onkoloji ünitelerinde görülmüģtür. VRE kolonizasyonundan enfeksiyona geçiģ için risk faktörleri nötropeninin süresi, seftazidim, amikasin, teikoplanin kullanımı ve kullanılan antibiyotiklerin sayısıdır [MenteĢ, 2007]. Menenjitler: Enterokokal menenjit seyrek görülen fakat çok ciddi seyirli akut bakteriyel menenjitlerden biridir. Bakteriyel menenjitlerin %0.3-4 unu oluģtururlar [MenteĢ, 2007]. Respiratuvar Enfeksiyonlar: Enterococcus ların neden olduğu respiratuvar enfeksiyonlar nadirdir. Pnömoni ve akciğer abseleri hariç olmak üzere genelde debil hastalarda görülürler [MenteĢ, 2007]. 2.1.3. Enterococcus türlerinin epidemiyolojisi Enterococcus lar, insan ve hayvanların gastrointestinal sistemlerinin üyeleridir. Doğada; toprak, su, bitki, kuģlar, böcekler ve memelilerde yaygın olarak bulunur [Belgacem ve ark., 2010]. Ġnsanlarda, esas olarak gastrointestinal florada bulunmaları nedeni ile gerek hastane gerekse hastane dıģı ortamda endojen kaynaklı enfeksiyonlara yol açmaktadırlar. E. faecalis, diğer Enterococcus türlerine göre

12 dıģkıda daha yüksek oranda bulunur. Enterococcus larda çevre koģullarına dayanıklı olduklarından her çeģit ortamda canlılıklarını sürdürebilirler [Creti ve ark., 2004]. Hastane ortamında bulunan stetoskop, kapı tokmağı, yatak, komodin gibi cansız eģyalar üzerinde uzun süre yaģayabilmektedir [Sayıner, 2008]. Enterococcus lar barsakta kolonize olan gram pozitif koklar arasında en yoğun olanıdır. Bu bölgede en sık E. faecalis izole edilir. E. faecium, E. casseliflavus, E. durans ve E. gallinarum gibi diğer türler insan gastrointestinal kanalında da değiģik oranda bulunabilirler [Fisher ve ark., 2009]. Ayrıca yapılan birçok araģtırmada gıdalarda en fazla izole edilen Enterococcus cinsine ait olan türler Enterococcus faecalis ve Enterococcus faecium dur. Enterococcus durans, Enterococcus gallinarum, Enterococcus mundtii, Enterococcus raffinosus daha az sıklıkla bulunmaktadır [Çıtak ve ark., 2009]. Enterococus lar fırsatçı patojen oldukları için insanlarda enfeksiyona yol açan her bir türün insidansı insan gastrointestinal sistemdeki varlığının bir yansıması olacaktır. Bu bölge hastalıklara neden olan suģların önemli bir kaynağı olarak kabul edilir. Bakteriler enfeksiyon yapmak üzere bulundukları yerden baģka bir bölgeye göç edebilir, ayrıca baģka konaklara ya da çevreye yayılabilirler. Ayrıca Enterococcus türleri değiģik hayvan türlerinde bulunabilirlerse de baģka kaynaklarda farklı Enterococus türlerinin bulunması, dağılımın insanlardan daha farklı olduğunu göstermektedir. Enterococcus ların dıģkıda yoğun olarak bulunmaları, kimyasal ve fiziksel koģullara dayanıklılıkları ile bulundukları ortamda canlılıklarını sürdürmeleri nedeniyle gıda, süt ve kullanım suyunun hijyenik özelliklerini belirlemede ve dıģkı kontaminasyonunun saptanmasında bir belirteç olarak kullanılmasına yol açar [Teixeira ve ark., 2009]. Schlegelová ve ark. (2010), yapmıģ oldukları bir çalıģmada, et iģleme tesisleri ve süt ürünlerinde sıklıkla kontaminasyona neden olan türleri; E. coli, Enterococcus ve Staphylococcus olarak belirtmiģlerdir [Schlegelová ve ark., 2010].

13 2.1.4. Enterococcus türlerinin virülans faktörler Sitolizin: Hemolitik özellik taģımaktadır. Sitolizin kodlayan gen bölgesi plazmid üzerinde ya da bakteriyel kromozoma entegre olarak bulunabilmektedir. Ġmmun sistem üzerinde makrofaj ve polimorfonükleer lökositlere zarar verici etkisi olduğu ve direkt doku harabiyeti yapabildiği gösterilmiģtir. Ayrıca çok sayıda gram pozitif bakteriyi etkileyebilen bakteriyosin olarak da iģlev gördüğü gösterilmiģtir. Toksinin insan ile at kanlı agarlarda hemolitik aktiviteye sahipken, koyun eritrositlerinde etkili olmayıģı klinik laboratuvarlarda tanısal açıdan önemli bir özelliktir. Ġnsanlarda patojen olan Enterococcus suģları arasında, sitolizin üretenlerin oranının, nonpatojen olduğu düģünülen suģlardan fazla olduğu gösterilmiģtir. Sitolizin üretimi salgınlardan izole edilen E. faecalis suģlarında %60'a varan sıklıkta saptanabilen bir virülans faktörüdür [Sayıner ve ark., 2008]. Agregasyon Faktörü: Bir yüzey proteinidir. Birçok özelliği ile bakterinin virülansına katkıda bulunmaktadır. Etkin alıcı ve verici hücre birleģmesini sağlayarak plazmid transferini kolaylaģtırmaktadır. Aynı zamanda bakterilerin agregasyonunu da sağlayarak virülansa katkıda bulunmaktadır. Agregasyon faktörü, Enterococcus lara kalp kapakları ve böbrek epitel hücrelerine bağlanma ve bu sayede endokardit ve üriner sistem enfeksiyonu oluģturma yeteneğini sağlamaktadır. E. faecalis suģlarına katetere tutunma yeteneğini, agregasyon faktörü sağlamaktadır. Özellikle katater enfeksiyonlarında, E. faecalis izolasyonu E. faecium' a göre daha fazladır [Sayıner ve ark., 2008]. Hemolizinler: Özellikle E. faecium ve E. faecalis suģlarında bulunabilen, tavģan, insan, at, sığır eritrositlerini hemoliz eden hemolizinler virülansta rol oynar. Toksik aktivitesi ile birlikte çok sayıda gram pozitif bakteriyi etkileyebilen bakteriyosin olarak da iģlev gördüğü gösterilmiģtir. Ayrıca immun sistem üzerinde makrofaj ve polimorfonükleer lökositlere zarar verici etkisi olduğu ve direkt doku harabiyeti yaptığı da gösterilmiģtir [Sayıner ve ark., 2008].

14 Jelatinaz: Jelatinaz enzimi olan ve olmayan izojenik E. faecalis suģları ile yapılan çalıģmalarda, Jelatinaz üreten suģların akut toksik etkilerinin üretmeyen suģlara kıyasla daha yüksek olduğu gösterilmiģtir [Sayıner ve ark., 2008]. Feromonlar: Enterococcus lar tarafından sentezlenen küçük peptitlerdir. SuĢlar arası plazmid DNA sının konjugasyonunu denetler. Nötrofiller için kemotaktik olduklarından enfeksiyonlarda inflamatuar cevabı artırırlar [Sayıner ve ark., 2008]. Ekstraselüler Süperoksit: E. faecalis suģlarının büyük çoğunluğu ve bazı E. faecium türleri tarafından sentezlenmektedir. Süperoksit üretiminin bakterinin yaģam süresini uzattığı gösterilmiģtir [Sayıner ve ark., 2008]. Ekstraselüler Yüzey Proteini: Ġlk kez E. faecalis türlerinde tanımlanan büyük yüzey proteininin kompleks bir yapılanması bulunmaktadır. Karboksi ucu hücre duvarına tutunmayı sağlarken, proteinin iç kısmında tekrarlayan ünitelerden oluģan ve moleküle uzayıp kısalabilme özelliği kazandıran bölge bulunmaktadır. Bu proteinin bakterinin immun yanıttan kaçıģını kolaylaģtırdığı düģünülmektedir [Sayıner ve ark., 2008]. Lipoteikoik asit: Enterococcus ların D grubu antijenini oluģturur. Tümör nekroz faktör ve interferon salınması neden olarak, immun cevabın düzenlenmesini sağlar [Sayıner ve ark., 2008]. Barbosa ve ark. (2010), Kuzey Portekiz ülkesinde yapmıģ olduğu bir çalıģmada, geleneksel fermente etlerinden (Alheira, Chouriça de Vinhais, Salpicao de Vinhais) Enterococcus izolasyonu yaparak, yüksek oranda jelatinaz ve hemolizin virülans özelliği ve genotipik olarak 13 farklı virülans gen tespit etmiģlerdir. Buna göre Enterococcus türleri, virülans özelliklerinden dolayı gizli patojen tür olabileceğini belirtmiģlerdir [Barbosa ve ark., 2010].

15 2.2. Enterococcus ların Gıda Ürünleriyle ĠliĢkisi Enterococcus cinsine ait bakteriler, genelde fekal çevrelerde yoğun olarak bulunmalarına karģın, gıdalarda üretim aģamalarında hijyenik olmayan koģullar sonucunda ortaya çıkarlar [Sanchez, 2006; Giraffa, 2003]. Ayrıca intestinal ve çevresel kontaminasyonla da süt ve et gibi çiğ gıdalarda kolonize olabilirler. ph, sıcaklık ve tuza karģı olan dirençleri sayesinde, gıda üretimi sırasında canlı kalarak son ürünü de kontamine edebilirler. Bu sebeple gıdalarda bulunmaları kontaminasyonun bir göstergesi olarak kabul edilirler [KarataĢ, 2005; Hugas, 2003]. Bu özelliklerinden dolayı Enterococcus ların sularda ve bazı gıda ürünlerinde hijyen indikatörü olarak kullanılmaktadır [KarataĢ, 2005; Arizcun ve ark., 1997]. Hayvanların gastrointestinal sisteminde Enterococcus ların bulunması kesimhanelerde ete bulaģma potansiyelini arttırmaktadır. Tavuk çiftliklerinde E. faecalis izole edilen gram pozitif türleri içinde ilk sırayı almaktadır [Franz ve ark., 1999]. Enterococcus cinsi bakteriler, gıdaların normal floralarının da bir parçası oldukları için, sadece kötü hijyen koģullarının göstergesi değildirler [KarataĢ, 2005; Giraffa, 2002]. Bu bakteriler birçok gıdada doğal olarak bulunan ve çeģitli gıdaların fermentasyonunda rol oynayan önemli mikroorganizmalardır [KarataĢ, 2005, Guessas ve ark., 2004]. Özellikle bazı fermente et ürünlerinin ve bazı peynir çeģitlerinin mikrofloralarının önemli bir kısmını oluģtururlar [KarataĢ, 2005; Giraffa, 2003]. Diğer yandan, Enterococcus cinsi bakterilerin bazıları, et ürünlerinde, Ģarap ve meyve sularında bozulma yaparlar [KarataĢ, 2005; Semedo, 2003]. Bu organizmalar, sıcaklığa karģı dirençleri sayesinde ile pastörizasyonda canlılıklarını koruyabildikleri için piģmiģ, dilimlenmiģ ya da paketlenmiģ etlerde çapraz kontaminasyon sonucunda geliģerek, diğer birçok laktik asit bakterileri gibi bozulma yapan mikroorganizmalar olarak tanımlanırlar. Fermente sucuklarda da yüksek sayılarda bulundukları zaman bozulmaya neden olurlar [KarataĢ, 2005; Franz, 1999].

16 Son yıllarda gıda kaynaklı hastalıkların mikrobiyal kontaminasyon sebebi olmasından dolayı patojenleri inhibe eden maddelere karģı ilgi artmaktadır. Enterococcus ların ürettiği bakteriyosin maddesine enterosin denmektedir. Enterococcus lar süt ürünlerinden, fermente sosislerden, balıktan, sebzelerden ve fermente yağlardan izole edilebilmektedir. [Sümerkan, 2002;. Strompfova, 2008]. Gıdalara uygulanan iģlem sırasında hijyen kuralarına yeterince riayet etmeyen personelin yanı sıra alet ve ekipmanlar özellikle fekal mikroorganizmalarca gıdaların kontamine olmasına aracılık etmektedirler [Keeratipibul ve ark., 2009]. E. faecalis ve E. faecium türlerinin yapılan birçok araģtırmada gıdalarda en fazla sıklıkta izole edilen mikroorganizmalar olduğu belirtilmiģtir. E. durans, E. gallinarum, E. mundtii, E. raffinosus daha az sıklıkta bulunmaktadır [Giraffa, 2002; Nes ve ark., 2007]. Kinley ve ark. (2010), yapmıģ olduğu bir çalıģmada, iģlenmiģ hayvan ürünlerinde Salmonella ve Enterococcus varlığı araģtırılarak, Enterococcus varlığı %81.3 oranında tespit edilmiģ ve Enterocoocus un kontaminasyona sebep olduğunu belirtmiģlerdir [Kinley ve ark., 2010]. Çıtak ve ark. (2009), yapmıģ olduğu bir çalıģmada, dondurulmuģ gıdalarda indikatör mikro-organizmaların varlığı ve bu indikatörün gıdada belirli bir limitin üstünde bulunması, ürünlerin yetersiz hijyen ve sanitasyon koģullarında iģlendiğini, insan, hayvan, toprak, su ve dıģkı kaynaklı bir bulaģma ile birlikte toksijenik mikroorganizmalarla kontamine olabilecek koģullarda üretilip tüketime sunulduğunun bir göstergesi olarak kabul etmektedir [Çıtak ve ark., 2009]. Fisher ve ark. (2009), yapmıģ oldukları bir çalıģmada, sosislerde ve peynirlerde Enterococcus kontaminasyonu daha sıklıkla izole edilerek, bu gıdalar ısı iģlemi gördüğü için raf ömürleri daha uzun süreli olduğunu bildirmiģlerdir [Fisher ve ark., 2009].

17 Fontana ve ark. (2009), Arjantinde fermente sosislerle yapmıģ olduğu çalıģmada, en fazla sıklıkla E. faecium (%56) ve E. faecalis (%17) izolasyonu yaparken, daha az sıklıkla Enterococcus durans, Enterococcus casseliflavus and Enterococcus mundtii (%27) izolasyonu yapmıģlardır [Fontana ve ark., 2009]. Korenova ve ark. (2009), Slovakya da yapmıģ olduğu bir çalıģmada, koyun sütü ve et ürünlerinde yüksek oranda kontaminasyona neden olarak Staphylococcus ve Enterococcus bakterilerini tanımlanmıģlardır [Korenova ve ark., 2009]. Valenzuela ve ark. (2009), yapmıģ olduğu çalıģmada, hayvansal gıdalardan izole edilen 25 Enteroccoccus izolatının 16 sı E. faecium, 9 u E. faecalis olarak bulunmuģtur [Valenzuela ve ark., 2009]. Barbosa ve ark. (2009), yapmıģ olduğu çalıģmada, fermente etlerden izole edilen 182 Enterococcus izolatlarından 76 sı E. faecalis, 44 ü E. faecium, 1 i E.casseliflavus ve 31 i Enterococcus spp. olarak tespit edilmiģtir [Barbosa ve ark., 2009]. Ġnat (2008), pastırma üretimi sırasında kontaminasyon kaynaklarının belirlenmesi ve iyileģtirme koģullarının araģtırılması amacıyla yaptığı çalıģmada, farklı zamanlarda üretilen 40 adet pastırma, üretim prosesi boyunca (20 adet deneysel üretim ve özel bir Ģirkette ticari olarak üretilen 20 adet pastırma) mikrobiyolojik ve kimyasal olarak (ph ve aw) analiz edildi. Bu amaçla, üretim prosesinin farklı aģamalarında (salamura sonrası, yıkama, baskılama, çemenleme ve kurutma iģlemi), et, buy otu tohumu unu (Trigonella foenum graecum L), toz kırmızı biber, salamurada kullanılan tuz, ekipmanlar (bıçaklar, parçalama kütükleri ve baskı makinesi) ve iģçi ellerinden toplam 240 adet örnek alındı. Alınan bu örnekler aerob genel canlı, laktobasil, mikrokok/stafilokok, koagulaz pozitif stafilokok, enterobakter, koliform bakteri sayısı, B.cereus, Enterococcus, Pseudomonacae spp., maya/küf ve sülfit indirgeyen anaerob bakteriler yönünden analiz edildi. Analiz bulguları; yıkama, baskılama ve çemenleme iģlemleri sonrasında aerob genel canlı sayısının, çemenleme iģlemi sonrası laktobasil, enterobakter, Enterococcus, mikrokok/stafilokok ve maya/küf sayılarının, baskılama iģlemi sonrası ise koliform bakteri sayısı ve Pseudomonacae

18 spp. sayılarının yükseldiğini göstermiģtir. Elde edilen veriler pastırma üretiminde baskılama ve çemenleme iģlemlerinin önemli bir kontaminasyon kaynağı oluģturduğunu, isçi elleri ve parçalama kütüklerinin de diğer kontaminasyon kaynaklarını oluģturduğunu göstermektedir [Ġnat, 2008]. Ogier ve ark. (2008), yapmıģ olduğu bir çalıģmada, süt örneklerinin, hayvanlarının fecesleri ya da direk su kaynakları ile Enterococcus kontaminasyonuna neden olabileceğini belirtmiģlerdir [Ogier ve ark., 2008]. Gomes ve ark. (2008), yapmıģ olduğu çalıģmada, et, süt ve sebzeden en fazla izole edilen Enterococcus türü E. faecium olduğunu, bunu takiben E. faecalis, E. casseliflavus ve E. gallinarum olarak saptamıģtır [Gomes ve ark., 2008]. Moreno ve ark. (2006), E. faecium ve E. faecalis türlerini peynir, balık, sosis, dana kıyma ve domuz etinde çoğunlukla izole etmiģlerdir [Moreno ve ark., 2006]. Çıtak ve ark. (2005), çiğ süt ve beyaz peynir ile yapmıģ olduğu çalıģmada, %62.6 E. faecalis, %30.1 E. faecium, %7.14 E. durans izolasyonu yapmıģtır [Çıtak ve ark., 2005]. Çıtak ve ark. (2005), yapmıģ oldukları çalıģmada, çiğ sütten izole edilen 177 Enterococcus izolatının %54.2 si E. faecalis, %29 u E. faecium, %6.2 si E. durans %5 i E.hirae\dispar, %3 ü E. gallinarum, %2.2 si E. mundtii ve %0.5 i E. raffinosus olarak izole etmiģtir [ Çıtak ve ark., 2005]. Martin ve ark. (2005), yapmıģ olduğu çalıģmada, sosislerden izole edilen Enterococcus türlerinden E. faecium sıklıkla izole etmiģtir [Martin ve ark., 2005]. KarataĢ (2005), yapmıģ olduğu çalıģmada Adana daki çeģitli marketlerden 20 adet sucuk ve 30 adet peynir örneğinden E. faecium, E. durans, E. avium izole etmiģtir [KarataĢ, 2005].

19 Sustackova ve ark. (2004), yapmıģ olduğu çalıģmada, et ürünlerinden izole edilen Enterococcus izolatlarının %67 si E. faecalis, %13.7 si E. faecium olarak tespit etmiģtir [Sustackova ve ark., 2004]. Papamanoli ve ark. (2003), fermente sucuklardan izole ettikleri laktik asit bakterilerinin %4 ünün Enterococcus spp. nin oluģturduğunu saptamıģlardır [Papamanoli ve ark., 2003]. Bodil (2003) ve Klein (2003), yapmıģ olduğu bir çalıģmada, Enterococcus ların birçok gıdada, özellikle de hayvansal orijinli gıdalarda bulunduğunu ve Enterococcus faecium un fermente gıdalardan sıklıkla izole edildiğini bildirmiģlerdir [Bodil, 2003; Klein, 2003]. Giraffa (2003), yaptığı çalıģmada, Enterococcus faecim un 68 ºC de 30 dakikalık ısıl iģlem sonunda canlılığını sürdürebildiğini göstermiģtir. Bu nedenle fermente olan ya da olmayan gıdalardaki Enterococcus varlığının kaçınılmaz olduğunu ifade etmiģtir [Giraffa, 2003]. Peters ve ark. (2003), yapmıģ olduğu çalıģmalarda E. faecalis ve E. faecium un ardından E. durans, E. hirae ve E. avium izole edilmiģtir [Peters ve ark., 2003]. Giraffa ve ark. (2002), yapmıģ olduğu çalıģmada, E. faecalis ve E. faecium türleri ile yapılan birçok araģtırmada gıdalarda en fazla izole edilen mikroorganizmalar olduğu belirtilmiģtir. E. durans, E. gallinarum, E.mundtii, E. raffinosus daha az sıklıkta izole edilmiģtir [Giraffa ve ark., 2002]. Giraffa ve ark. (1997), Ġtalya da yapmıģ oldukları bir araģtırmada gıda ürünlerinde Enterococcus ların varlığı üretim ve yapım sırasındaki yetersiz sanitasyon koģullarının bir göstergesi olduğunu tespit etmiģlerdir [Giraffa ve ark., 1997].

20 2.3. Fermente Etler ve Fermente Etlerin Mikrobiyolojik Kalitesi Et ve et ürünleri insan beslenmesinde önemli bir yere sahiptir. Fermente et ürünler, düģük ph ve düģük su aktivitesi, yüksek tuz konsantrasyonu, düģük nem içeriği ile uzun raf ömrüne sahip dayanıklı ürünlerdir. Fermente et ürünleri genellikle belli oranda et ve yağ parçacıklarının emülsiyonu, tuz, kür maddeleri, baharatlar v.b nin belli bir kılıf içinde fermentasyonu ve kurutulmasından ibarettir. Fermente gıdalar deneyimlerle uzun bir süre sonunda mikroorganizma etkisi bilinmez iken geliģmiģtir. Fermentasyonun ilk görünmesi ve geliģimi kurutulmuģ etlerin üretimi ile olmuģtur. Ġlk fermentasyonu bundan 2000 yıl önce Çinliler gerçekleģtirmiģtir. Bu ilk ürünler kalitesiz olmalarına rağmen ürün geliģim açısından önemlidir. Muhtemelen 13.yy içinde fermente ürünlerde tuz ve nitrat kullanılmaya baģlanmıģtır. 1940 lı yıllara kadar fermentasyon geliģimi hem çok yavaģ hem de olumsuz Ģartlarda gerçekleģmiģtir. Bu yıldan sonra fermentasyon metodu bilimsel esaslar doğrultusunda geliģmiģ ve starter kültür kullanımı sağlanmıģtır. Fermente et ürünleri geniģ bir coğrafyada farklı tür etleriyle üretilirler. Bu yüzden çok geniģ ürün çeģitliliği sağlanmıģtır. Sadece Almanya da 350 nin üstünde fermente et ürünü çeģidi vardır ve çoğu çok küçük farklılıklar gösterir. Bu yüzden sınıflandırılması zordur. Genellikle fermente et ürünleri basitçe kuru veya yarı kuru fermente et ürünleri Ģeklinde sınıflandırılırlar [Danacıoğlu, 2008]. Fermente et ürünleri, mikroorganizmalarının çoğalmaları ve metabolik faaliyetleri sonucunda elde edilmektedir. Son ürün kalitesi, fermentasyonda rol oynayan mikroorganizmaların tipine, hammadde seçimine ve üretim sırasındaki koģullara bağlı olarak büyük değiģmeler göstermektedir. Fermentasyonla elde edilen et ürünlerinin üretim aģamalarında biyolojik yöntemlerin yanında, kurutma ve koruyucu maddelerin ilavesi gibi fiziksel ve kimyasal muhafaza yöntemleri de pay almaktadır [Danacıoğlu, 2008]. Fermente et ürünlerinde, ürüne özgü kıvam, lezzet, aroma ve renk olgunlaģma sırasındaki bakteriyel, enzimatik ve biyokimyasal reaksiyonlara bağlı olarak

21 Ģekillenmektedir. Fermente et ürünlerinin olgunlaģması ve buna bağlı olarak kalite niteliklerinin geliģmesinde en önemli faktör bakteriyel aktivitelerdir. OlgunlaĢmada özellikle Laktobasiller, Pediyokoklar, Mikrokoklar ve Stafilokoklar etkili olurlar. Bu bakteri gruplarından özellikle Laktobasiller, olgunlaģma sırasında oluģturdukları laktik asit ile yapısal nitelikler, kıvam, renk ve lezzetin geliģmesinde, ayrıca patojen mikroorganizmaların baskılanmasında etkin rol oynarlar [Danacıoğlu, 2008]. Enterococcus faecium ve Enterococcus faecalis gıdalardan ve barsaklardan en sık izole edilen, gıda proseslerinde yer alan en önemli türlerdir. Bu iki tür, fermente etlerin, özellikle sucukların fermentasyonu sırasındaki baskın mikroflorayı oluģtururlar. Ayrıca süt ürünleri ve peynirlerde de yüksek sayılarda bulunurlar. Her iki tür de peynir ve fermente süt ürünleri ile sucuk, salam gibi fermente gıdaların üretiminde, organoleptik özellikleri geliģtiren, raf ömrünü ve stabilitesini arttıran doğal starter kültürlerdir. Ayrıca, E. faecium ve E. faecalis karıģık kültür ya da yardımcı kültürler olarak da kullanılırlar [KarataĢ, 2005]. Ammor ve ark. (2005), geleneksel kuru sosisler üzerinde yaptığı bir araģtırmada, izole edilen 88 suģ fenotipik ve genotipik olarak identifiye edilmiģtir. Fenotipik karakterizasyonda, L. sakei, E. faecium, E. faecalis ve Leuc. mesenteroides olarak tanımlanmıģtır. Genotipik ve fenotipik karakterizasyon arasında ise iyi bir korelasyon olduğu saptanmıģtır. Ayrıca ürünün fermantasyonu süresince L. sakei nin dominant tür olduğu da belirlenmiģtir [Ammor ve ark., 2005]. 2.4. Enterococcus ların Starter ve Probiyotik Özellikleri Starter kültürler; fermente et ürünlerine, görünüm, tat, aroma ve koku gibi özellikleri geliģtirmek, dayanıklılığı artırmak, olgunlaģtırma süresini kısaltmak ve kontrol etmek amacıyla katılan, spesifik özellikleri nedeniyle seçilmiģ saf veya karıģık kültür halindeki mikroorganizmalardır. Fermente et ürünlerinin hazırlanmasında mikroorganizmaların kullanılması hususunda 1919 yılından beri önerilen ve patent çalıģmaları olmasına karģın, ilk defa starter kültürler, ancak 1960 lı yılların

22 baģlangıcında piyasaya sürülmüģtür. Bugün, teknolojide geliģmiģ ülkelerin çoğunda; fermente, kuru, yarı-kuru sosis ve salamların üretiminde starter kültürlerden yararlanılmaktadır. Örneğin, Almanya da büyük kapasiteli et iģletmelerinin %90 ında starter kültürler fermente et ürünleri üretiminde düzenli olarak kullanılmaktadır. Starter kültür katımı ile olgunlaģmadaki prosesler daha iyi kontrol edilebilmekte, böylelikle standart ve üstün kaliteli ürünler üretmek mümkün olmaktadır. Ayrıca, kültürlerin kullanımı ile patojen ve toksik mikroorganizmaların inhibisyonu sağlanmakta ve böylelikle de mikrobiyolojik açıdan daha güvenilir ürünler halkın tüketimine sunulabilmektedir [Danacıoğlu, 2008]. Starter olarak kullanılan mikroorganizmaların büyük bir çoğunluğu laktik asit bakterileri ve mikrokoklar gibi gram-pozitif bakterilerdir. Bakteriler dıģında çeģitli maya ve küf mantarları da starter olarak kullanılmaktadır [Danacıoğlu, 2008]. Starter kültürlerin et ürünlerine eklenmesinin amaçları, patojenleri inhibe ederek gıda güvenliğini arttırmak, bozulma etmeni olan bakterileri inhibe ederek ürünün raf ömrünü uzatmak, arzu edilen duyusal özellikleri geliģtirmek ve sağlık üzerinde olumlu etkiler sağlamaktır. Çok uzun zamandan beri laktik asit bakterileri ürünlerinde starter kültür olarak kullanılmaktadır. Probiyotikler beslenme üzerine etkilerinin yanı sıra, insan sağlığına faydaları olan canlı mikrobiyal kültürlerdir. Günümüzde probiyotik özellikteki laktik asit bakterilerinin kullanılmasıyla üretilen fonksiyonel gıdalara olan ilgi gün geçtikçe artmaktadır [BaĢyiğit ve ark., 2007]. Enterococcus ların düģük ph ve yüksek tuz konsantrasyonlarına dayanıklı olmaları ile yüksek enzimatik aktiviteleri nedeniyle fermente ürünlerde starter veya ek starter olarak kullanılabilecekleri bildirilmektedir. Ancak starter kültür olarak kullanılacak Enterococcus türlerinin belirlenmesinde, suģun apatojen olması yanında, antibiyotiklere dirençliliğinin olmaması gerekliliği vurgulanmaktadır. [Klare ve ark., 2003; Riboldi ve ark., 2008]. Bu kapsamda Cheddar, Manchego, Feta gibi çeģitli peynirlerin üretiminde mevcut starter kültürlerin yanında apatojen Enterococcus suģlarının da kullanılmasına yönelik çalıģmalar mevcut olup Enterococcus ların

23 starter kültür olarak kullanıldıklarında, gerek duyusal gerekse olgunlaģma süresi bakımından olumlu sonuçlar alındığı belirtilmiģtir [Sarantinopolulos ve ark., 2002; Centeno ve ark., 1996; Gardiner ve ark., 1999; Nunez ve ark., 1997]. Peynir starter kültürleri ile birlikte Enterococcus faecium suģlarının antibakteriyel maddeler (enterosin) oluģturmaları, ürünün hijyenik kalitesi için de avantaj olarak görülmektedir [Moreno ve ark., 2002]. Enterococcus lar genellikle kümes hayvanları ve çiftlik hayvanlarının beslenmesinde kullanılmakta olup, probiyotik olarak gıda ürünlerinde geniģ bir kullanım alanına sahiptirler. Enterococcus lar probiyotik olarak insanlarda ve hayvanlarda bağırsak florasında mikrobiyel dengeyi sağlamak için kullanılmaktadırlar. Ayrıca probiyotik kültür olarak Enterococcus içeren bazı eczacılık ürünleri, insanların klinik tedavisinde kullanılmaktadırlar. Bu probiyotik preperatlar gastrointestinal dengeyi geliģtirerek gastroenteritisin tedavisinde kullanılmaktadır. Probiyotik preperatlar hayvanlarda enterik hastalıkları önlemek amacıyla da kullanılmaktadırlar. Enterococcus cinsi içinde probiyotik özellik gösteren iki tür Enterococcus faecium ve Enterococcus faecalis olarak bildirilmiģtir. Enterococcus cinsi bakteri özellikle süt ve et ürünlerinin doğal floralarının bir parçası olmaları nedeniyle, bu ürünlerin fermantasyonunda doğal starter kültürler arasında yer almaktadır. Bu bakteriler çeģitli geleneksel fermente ürünlerin üretiminde faydalı rol oynayabilirler. Enterococcus ların fermente ürünlerin olgunlaģtırılması sırasında istenen teknolojik ve metabolik özelliklerine sahip olmaları nedeniyle, Enterococcus cinsi bakteriler, özellikle de E. faecium ve E. faecalis peynir ve fermente sucukların üretiminde bazı laktik asit bakterileri ile birlikte kullanılan starter kültürler arasındadır [Enginkaya ve ark., 2007; Leroy ve ark., 2003; Jurkovic ve ark., 2006; Eaton ve ark., 2001; Psoni ve ark., 2006]. Akdeniz ülkelerinde birçok küçük iģletmelerde, çiftlik ve yerel kasaplarda, geleneksel veya ev yapımı fermente et ürünlerinin üretimi, starter kültürler kullanılmadan, doğal floraya bağlı olarak gerçekleģtirilmektedir. Ev yapımı bu ürünler yüksek ph ya sahip olmaları nedeniyle, Enterococcus lar için iyi bir geliģme

24 ortamı sağlamaktadır. Böylece Enterococcus faecium ve Enterococcus faecalis bu ürünlerin fermentasyonu süresince yüksek sayılarda bulunabilmekte ve fermentasyona katkıda bulunmaktadır. Doğal yolla üretilen bu ürünler birçok ülkede eskiden beri beğenilerek tüketilmektedir [Hugas, 2003]. Enterococcus faecium aynı zamanda bakteriosin üretimi ile de dikkat çekmektedir. Enterococcus faecium un ürettiği bakteriosinler Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Vibrio choleroe, Clostridium spp., Bacillus spp. ve diğer gram pozitif patojenik bakteriler ile gıda bozulması yapan bakterilere karģı inhibitör etki gösteren antimikrobiyel peptit veya proteinlerdir. Enterococcus ların ürettiği bakteriosinler enterosin olarak adlandırılmaktadır. Enterococcus faecium tarafından üretilen enterosinler küçük sıcaklığa dirençli katyonik, hidrofobik, ribozomal yapıdaki düģük molekül ağırlıklı class2 bakteriosinleri içinde yer alan antimikrobiyal peptit veya proteinlerdir. Bakteriosin üreten Enterococcus lar doğada yaygın olarak bulunmaktadır ve birçok araģtırmada süt ürünleri, fermente sucuklar, balık, sebze ve gastrointestinal yoldan oldukça sık izole edilmiģlerdir. Bakteriosinlerin gıda bozulması yapan organizmalar ile gıda kaynaklı patojenleri inhibe edici aktiviteleri nedeniyle gıda endüstrisinde biyokoruyucular olarak kullanılmaktadır ve bu bileģiklerin geleneksel kimyasal koruyuculara bir alternatif olabileceği düģünülmektedir. Bakteriosin üreten Enterococcus faecium un aynı zamanda iyi bir rekabetçi olması bu organizmanın teknolojik açıdan önemini arttırmaktadır. Gıdalarda bakteriosinlerin kullanımı iki Ģekilde olmaktadır. Ya bakteriosin üreten suģ starter kültür olarak ya da üretici kültürden saflaģtırılan bakteriosinin gıda ürününe eklenmesiyle kullanılmaktadır [Enginkaya, 2007]. Enterococcus faecium un ürettiği bakteriosinler gıda ürünlerinde raf ömrünün ve gıdanın güvenliğinin arttırılmasında kullanılmaktadır. Enterococcus faecium a ait bakteriyosinlerin starter kültür ya da biyokoruyucu olarak et ve süt endüstrisinde kullanımı yaygındır. Enterosinler ve enterosin üreten Enterococcus faecium suģları sucukların fermentasyonunda, dilimlenmiģ ve paketlenmiģ etlerde Listeria monocytogenes ve mukaz oluģturan laktik asit bakterilerinin geliģiminde, Cheddar

25 peynirlerinde ise Listeria aktivitesinin inhibisyonunda kullanılmaktadır [Enginkaya, 2007]. Terzic-Vidojevic ve ark. (2009), yapmıģ olduğu çalıģmada, starter kültür ilave etmeden çiğ inek sütünden imal edilen Zlatar BGNV peynirinden Lactobacillus casei/paracasei (65.43%) ve Enterococcus faecalis (29.63%) izolasyonu yapılmıģtır. 3 Enterococcus izolatında yüksek düzeyde proteolitik aktivite saptanmıģtır [Terzic- Vidojevic ve ark., 2009]. Kucerova ve ark. (2009), yaptıkları bir çalıģmada, Enterococcus ların süt ürünlerinin olgunlaģmasında önemli role sahip olduğunu ve sahip oldukları bazı organoleptik özellikleri sayesinde starter olarak kullanıldığını belirtirken, Enterococcus ların ürettiği biyojen aminden dolayı gıda zehirlenmesine neden olabileceğini söylemiģlerdir [Kučerová ve ark., 2009]. Dağdemir ve ark. (2006), yapmıģ olduğu bir çalıģmada, ekolojik olarak laktik asit bakterileri içinde yer alan Enterococcus ların, insan ve hayvanların bağırsak sistemlerinde ve fermente edilmiģ gıdalarda yer aldığını belirtmiģlerdir [Dağdemir ve ark., 2006]. KarataĢ (2005), Enterococcus cinsine ait bazı bakterilerin insanlar ve hayvanlar için probiyotik özellik taģıdığı ve gıdalarda probiyotik olarak kullanım alanı bulunduğunu bildirmektedir [KarataĢ, 2005]. Hugas ve ark. (2003), fermente sucuklardan izole edilen Enterococcus faecium CTC492 nin sucuk üretiminde starter kültür olarak kullanıldığında, bu suģun proses sonuna kadar geliģim gösterdiğini tespit etmiģlerdir [Hugas ve ark., 2003].

26 2.5. Proteolitik Aktivite Gıdalar üzerinde geliģen bazı mikroorganizmalar proteinleri hidrolize ederek tat ve koku bileģenleri üzerinde olumsuz etkiye neden olabilirler. Psikrotrofik mikroorganizmalardan bazılar kuvvetli proteolitik özellikleri nedeniyle süt, et ve dondurulmuģ gıdalar üzerinde istenmeyen değiģiklikler olmaktadır. Özellikle depolama süresi boyunca bu mikroorganizmalar çoğalmakta ve bazen gıdaları tüketemeyecek hale getirmektedir. Diğer yandan peynir, fermente et gibi bazı gıdaların olgunlaģması ve yapıların istenen düzeyde geliģmesi mikrobiyel proteolitik aktivitenin bir sonucudur. Ancak süt, et, kanatlı et ve deniz ürünlerinde proteolitik bakteri sayımları kalite kayıplarının belirlenmesinde önemli bir mikrobiyel kriterdir [Kaleli ve ark., 2000; Papamanoli ve ark., 2003; Koneman ve ark., 1997; Jensen ve ark., 1999; Eaton ve ark., 2001]. Enterococcus faecium un fermente et ürünlerindeki rolleri ve sucuklardaki biyokimyasal aktiviteleri ilgili bazı araģtırmalarda, Enterococcus faecium un sucuk aromasına glikolitik, proteolitik ve lipolitik aktiviteleri ile katkıda bulundukları ifade edilmiģtir [Hugas ve ark., 2003]. Proteolitik mikroorganizma türleri Bacillus, Clostridium, Psudomonas ve Proteus cinsleridir. Bu bakterilerden baģka bazı maya ve küf türleri de proteolitik aktivite gösterebilmektedir. Enterococcus faecalis ve Micrococcus caseolyticus gibi proteolitik aktivitenin yanında asit fermentasyonuda yapabilenlere asit-proteolitik mikroorganizma denir [Kaleli ve ark., 2000; Papamanoli ve ark., 2003,. Booth ve ark., 1996]. Valenzuela ve ark. (2009), yapmıģ olduğu çalıģmada, Enterococcus ların gıdalarda daha çok fermente ürünlerde bulunduğu, bunun nedeni olarak da Enterococcus ların proteolitik, lipolitik ve sitrat aktiviteleri olduğu belirtilmiģtir. Ayrıca E. faecalis ve E. faecium un ürettiği enterosin gıdalarda bozulmaya neden olan Bacillus cereus,

27 Clostridium spp., Listeria monocytogenes ve Staphylococcus aureus gibi patojen bakterilerinin varlığını inhibe ettiği belirtilmiģtir [Valenzuela ve ark., 2009]. Veljovic ve ark. (2009), Enterococcus izolatlarının bakteriyosin ve proteolitik aktivitesi süt ve fermente et ürünlerinin teknolojik özellikleriyle ilgili olabileceğini belirtmiģlerdir [Veljovic ve ark., 2009]. Terzic-Vidojevic ve ark. (2009), Azerbaycan da süt ürünleri ile yapılan bir çalıģmada, izole edilen 378 izolatın 296 sı gram pozitif ve katalaz negatif olarak tanımlanmıģtır. Lactobacillus plantarum, Lactobacillus brevis, Lactobacillus paraplantarum ve Enterococcus faecium dominant tür olarak tespit edilmiģtir [Terzic-Vidojevic ve ark., 2009]. Terzic-Vidojevic ve ark. (2009), geleneksel peynirlerinde yaptıkları bir çalıģmada, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paraplantarum, Lactobacillus arizonensis, Lactobacillus farciminis, Lactobacillus brevis, Lactococcus lactis subsp. lactis, Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides, Leuconostoc pseudomesenteroides, Enterococcus faecium ve Enterococcus faecalis izolasyonu gerçekleģtirilirken, L. plantarum, L. arizonensis, L. paraplantarum, L. farciminis ve L. pseudomesenteroides türleri iyi proteolitik aktivite göstermiģtir. Fermente ürünlerde bakteri çeģitliliğini arttırmak için ve teknolojik olarak kalitesini arttırmak için bu bakterilerin fermente ürünlerde kullanılabileceğini belirtmiģlerdir [Terzic- Vidojevic ve ark., 2009]. Casaburi ve ark. (2008), Ġtalya da yapmıģ oldukları bir çalıģmada, fermente etlerde starter kültür olarak Lactobacillus curvatus ve Staphylococcus xylosus türleri kullanılmasının nedenini, bu bakterilerin lipolitik ve proteolitik özelliklerinden kaynaklandığını belirtmektedir [Casaburi ve ark., 2008]. Çıtak ve ark. (2005), yapmıģ oldukları bir çalıģmada, çiğ süt ve beyaz peynirden izole edilen E. faecalis suģlarının %91.8 i 7ºC de proteolitik aktivite, %60.7 si

28 25ºC de proteolitik aktivite, E. faecium suģlarının %71 i 7ºC de proteolitik aktivite, %52.6 sı 25ºC de proteolitik aktivite, E. durans suģunun %72.2 si 7ºC de proteolitik aktivite, %38.9 u 25ºC de proteolitik aktivitesini pozitif olarak saptanmıģtır [Çıtak ve ark., 2005]. Hugas ve ark. (2003), yaptıkları bir çalıģmada Alman ve Ġtalyan fermente sucuklarda olgunlaģtırma prosesinin sonunda hem starter kültür kullanılan, hem de kullanılmayan sucuklarda Enterococcus konsantrasyonunun 103-105 arasında olduğunu bildirmiģlerdir. Enterococcus ların sucukların olgunlaģtırılması sırasındaki varlığını geniģ aralıktaki geliģim sıcaklıkları ve tuza olan yüksek toleransına bağlamıģlardır [Hugas ve ark., 2003]. El-Din ve ark. (2002), çiğ sütten yapılan Mısır Domiatti ve Mish peynirlerinden çeģitli Enterococcus türleri izole etmiģlerdir. Ġzole edilen suģların proteolitik ve lipolitik aktivitelerini incelemek amacıyla peynir üretimi yapmıģlar ve peynir üretiminde Enterococcus faecium kullanılan örnekleri kontrol örneği ile kıyasladıklarında, bu örneklerin organoleptik özellikleri geliģtiren daha fazla suda çözünebilir nitrojen ve toplam serbest amino asit içerdiğini tespit etmiģlerdir. Bu özellikleri nedeniyle Enterococcus faecium kültürlerinin geleneksel peynir üretiminde yardımcı kültür olarak kullanılabileceğini belirtmiģlerdir [El-Din ve ark., 2002]. Hayaloğlu ve ark. (2001), Mısır da Enterococcus faecalis in tek veya karıģık suģlarının kullanılarak yoğurt benzeri bir ürün elde edildiği ve bu bakterinin yeterince proteolitik aktivite göstererek istenen düzeyde asit ve aroma oluģturduğunu belirtmiģlerdir [Hayaloglu ve ark., 2001]. Arizcun ve ark. (1997), Roncal ve Idızabal peynirlerinden yapmıģ olduğu çalıģmada 4 E. faecalis, 2 E. faecium, 1 E. avium suģlarından proteolitik aktivitenin varlığını tespit etmiģlerdir [Arizcun ve ark., 1997].

29 2.6. Lipolitik Aktivite Gıda maddelerinin birçoğu lipit içermektedir. Gıdalarda bulunan özellikle düģük molekül ağırlığına sahip serbest yağ asitleri lipit hidrolizinin en önemli nedenlerinden biridir. Lipit parçalanması genellikle mikrobiyel olmayan nedenlerden kaynaklanmakla birlikte bakterilerin birçoğu mayalar ve bazı küfler sahip oldukları enzimlerle gıdalardaki lipolitik parçalanmaya neden olurlar [Kaleli ve ark., 2000]. Süt, krema, tereyağ, beyaz peynir gibi bazı gıdalarda meydana gelen mikrobiyel lipoliz üründe kalite kaybına ve bozulmaya neden olur. Diğer yandan lipolitik aktivitenin olması bazı gıdalarda tat ve aroma oluģumuna katkıda bulunmaktadır. Örneğin peynir ve sucuk gibi fermente ürünlerin olgunlaģarak istenen tat ve aromaya sahip olması sağlanır. Bir diğer değiģ ile belirli bir lipoliz gerçekleģmesi bir kalite faktörü olarak değerlendirilir [Kaleli ve ark., 2000]. Enterococcus faecium ve Enterococcus faecalis bazı gıdalarda organoleptik özellikleri iyileģtirmenin yanı sıra lipolitik ve esterolitik aktivite, sitrattan yararlanma ile uçucu aromatik bileģikleri sentezleme gibi özellikleri nedeniyle bazı fermente süt ve et ürünlerinin olgunlaģması sırasında diğer laktik asit bakterileri ile birlikte starter kültür olarak kullanılmaktadır [Enginkaya ve ark., 2007]. Türkiye de beyaz peynirin olgunlaģma süresi uzun (90 gün) olsa da, ekonomik nedenlerle 15-20 gün gibi kısa sürelerde tüketime sunulmakta, bu kısa süre içerisinde arzu edilen aroma ve yapı oluģmamaktadır. Göncüoğlu ve ark (2009), yapmıģ olduğu çalıģmada, Enterococcus ların proteolitik, lipolitik özellikleri ve üreme koģulları göz önünde bulundurularak, starter kültür olarak kullanılmalarının, beyaz peynirin olgunlaģma süresini kısaltabileceği, yüksek sıcaklıkta pastörize edilen sütten üretilen peynirlerde oluģan yapı bozukluklarının çözümlenebileceği düģünülerek planlandığını belirtmiģlerdir [Göncüoğlu ve ark., 2009].

30 Martin ve ark. (2009), yapmıģ oldukları bir çalıģmada, fermente sosislerden sıklıkla E. faecium ve E. faecalis izolasyonu yapıldığı, Enterococcus un insana geçmesindeki en önemli kaynağın, fermente etlerin çiğ olarak tüketilmesi olarak bildirilmiģtir [Martin ve ark., 2009]. Siminova ve ark. (2008), yapmıģ olduğu çalıģmada, süt ürünlerinde ve et ürünlerinde izole edilen Enterococcus ların yüksek lipolitik aktiviteye sahip olduğu için oluģan üründe kaliteyi arttırdığını belirtmiģtir [Siminova ve ark., 2008]. Çıtak ve ark. (2005), yapmıģ olduğu çalıģmada, beyaz peynir ve çiğ sütten izole edilen E. faecalis suģunun %3.1 i, E. faecium suģunun %10.5 i, E. durans suģunun %16.7 sınde 30ºC de lipolitik enzim aktivitesini pozitif olarak saptamıģtır [Çıtak ve ark., 2005]. Linaje ve ark. (2004), yapmıģ olduğu bir çalıģmada, E. faecium ve E. faecalis türlerinin peynir ve fermente süt ürünleri ile sucuk, salam gibi fermente gıdaların üretiminde, organoleptik özellikleri geliģtiren, raf ömrünü ve stabilitesini arttıran doğal starter kültürler olduğunu bildirmiģlerdir [Linaje ve ark., 2004]. Sarantinopoulos ve ark. (2002), yapmıģ olduğu bir çalıģmada, Enterococcus ların proteolitik ve lipolitik aktiviteleri sayesinde bazı peynirlerin olgunlaģtırılmalarında önemli rol oynadığını belirtmiģlerdir [Sarantinopoulos ve ark., 2002]. Sarantinopoulos ve ark. (2002), yapmıģ olduğu bir çalıģmada, Enterococcus faecium, Akdeniz ülkelerinde üretilen Feta, Mozerella, La Serena ve Comte gibi peynirlerde doğal floralarının bir parçası olduğunu bildirmiģtir [Sarantinopoulos ve ark., 2002]. 2.7. Antimikrobiyal Direnç Direnç, bir bakterinin antimikrobiyal bir ajanın öldürücü veya üremeyi durdurucu etkisine karģı koyabilme yeteneğidir. Direnç geliģimi ve yayılımı genellikle gereksiz

31 ve uygunsuz antibiyotik kullanımına bağlanmakla birlikte, 1940 lı yıllarda antibiyotiklerin kullanılmadığı bazı adalarda toprak ve dıģkı örneklerinde tetrasiklin ve streptomisin antibiyotiklerine dirençli bakteriler bulunduğu; antibiyotik direncinin yalnızca yaygın antibiyotik kullanımı sonucu değil, bakterilerin olumsuz çevre koģullarında yaģamını sürdürmek için kullandığı savunma sürecinin bir parçası olduğu da belirtilmektedir. Ancak antibiyotiklerin yoğun Ģekilde kullanıma girmesi ile birlikte yıllar içinde çoğul dirençli mikroorganizmalar ortaya çıkmakta ve bunlarla oluģan infeksiyonların sağaltımında büyük sorunlar yaģamaya baģlamıģtır. Günümüzde tüm dünyada bir yandan hızla yeni ilaçlar geliģtirmekte iken, öte yandan bunlara süratle direnç kazanan mikroorganizmalarla oluģan infeksiyonlar bildirilmekte ve sorunun boyutu gün geçtikçe büyümektedir [Yüce, 2001]. Enterococcus lar 1970 li yıllardan beri hastane kaynaklı enfeksiyonların en sık sebeplerinden biri olarak tanımlanmaktadır. Enterococcus ların doğal olarak dirençli oldukları üçüncü kuģak sefalosporinlerin yaygın kullanımı bu artıģtan sorumlu tutulmaktadır. Bu bakterinin hastane ortamında yaģamasının nedenleri yaygın olarak kullanılan birçok antibiyotiğe intrensek olarak dirençli olmaları, ayrıca kullanımda bulunan tüm antibiyotiklere karģı direnç geliģtirebilme (mutasyon veya plazmid/transpozon aracılığıyla genetik materyalin transfer edilmesi) özelliğine sahip olmalarıdır. Enterococcus lar klinik kullanımda olan antibiyotik gruplarının çoğuna duyarlı ya da dirençlidir. Bu nedenle özellikle ciddi enterokokal enfeksiyonların tedavisi oldukça güçtür ve bakterisidal etki sağlayabilmek için kombinasyon tedavileri yapılmalıdır [Rizotti ve ark., 2009, MenteĢ ve ark., 2007]. İntrensek Direnç Ġntrensek direnç, Enterococcus türlerinin çoğunda ya da tümünde doğal olarak kromozomlarda kodlanmıģ bir özelliktir. Bazı antibiyotikler için gözlenen yapısal direnç mekanizmaları tipik olarak bazı Enterococcus türlerine veya cinslerine özeldir [Teixeira ve ark., 2009]. DüĢük düzeyde klindamisin direnci ve düģük düzeyde aminoglikozid direnci Enterococcus lardaki intrensek direncin en tipik örnekleridir.

32 Polimiksine, sefalosporinlere, penisilinaz dirençli semisentetik penisilinlere, aztreonama direnç ve florokinolonlara sınırda duyarlılık da Enterococus ların karakteristik özelliğidir. Penisilinaz dirençli semisentetik penisilinlerin yanı sıra Enterococus ların diğer penisilinlere duyarlılığı da azalmıģtır [MenteĢ ve ark., 2007]. Enterococcus lar üzerinde tek baģına bakterisidal etkili antibiyotik bulunmaması enterokokal endokardit tedavisinde tek ilaç kullanıldığında baģarısızlığa neden olur. E. faecium beta-laktam grubu antibiyotiklere doğal olarak daha dirençli olmasının yanında aminoglikozid direncinde de türe özgü farklılık gösterir [MenteĢ ve ark., 2007]. Kazanılmış Direnç KazanılmıĢ direnç, intrensek dirençten daha değiģkendir, mevcut DNA daki mutasyonlarla veya plazmid ya da transpozon üzerindeki bir genetik elemanın kazanımıyla ortaya çıkar [Frazzon ve ark., 2010]. Enterococcus lardaki yapısal direnç temel olarak iki ana grup içinde antibiyotikte kendini gösterir; aminoglikozidler ve beta laktamlar. Yapısal direnç yüzünden antibiyotiklerin Enterococcus lar üzerinde zayıf etki etmesi nedeniyle endokardite, menenjite veya özellikle bağıģıklık sistemi baskılanmıģ hastalarda ortaya çıkan diğer sistemik enfeksiyonlarda tedavide beta laktam gibi hücre duvarına etkili bir ajan veya vankomisin ile birlikte bir aminoglikozid verilir. Böylece sinerjistik etki ile hücre duvarına etki eden antibiyotik sayesinde aminoglikozid antibiyotiğin hücre içine girmesi kolaylaģır ve yapısal direncin üstesinden gelinerek Enterococcus lara karģı bakterisidal etki sağlanmıģ olur [Weaver ve ark., 2009; Teixeira ve ark., 2009]. Enterococcus lar ayrıca edindikleri değiģik genetik özellikler ile kloromfenikol, tetrasiklin, makrolid, linkozamid ve streptograminler, aminoglikozidler, beta laktamlar, glikopeptitler ve son olarak da kinolonlar gibi değiģik antibiyotik gruplarına direnç kazanmıģlardır. Enterococcus larda geçtiğimiz son birkaç dekad içerisinde ortaya çıkan kazanılmıģ antibiyotik direncinde, özellikle yüksek düzey

33 aminoglikozid direnci, beta laktamlar ve glikopeptidlere direnç artan oranlarda bildirilmektedir. Hücre duvarına etkili ajanlara dirençli olan ya da yüksek düzey aminoglikozid direncine sahip izolatlar kombinasyon tedavisinin sinerjistik etkisine direnç göstrecekleri için daha da ciddi problem olarak karģımıza çıkmaktadırlar. Dolayısıyla bu grup amtimikrobiyal ajana karģı direnç durumunun belirlenmesi, antibiyotik kombinasyonları ile sinerji elde edilip edilmeyeceğini göstermesi bakımından tedavi stratejisini belirlemeye yardımı olacaktır. Bir veya birden fazla aminoglikozide yüksek düzeyli direnç gösteren Enterococcus izolatları artan sıklıkla bildirilmektedir [Channaiah ve ark., 2010; Teixeira ve ark., 2009]. Enterococcus türlerinde vankomisin direnci, tedavide bir sorun olarak ilk kez Batı Avrupa ve Amerika BirleĢik Devletlerinde ortaya çıkmıģ ve bildirilmiģtir. Bunu takiben VRE izolasyonu yaygın ve değiģik coğrafi bölgelerden sürekli olarak bildirilmiģtir. VRE suģları genotipik ve fenotipik özelliklerine göre sınıflandırılır. Enterococcus larda üç tanesi daha sık olmak üzere altı tip glikopeptit direnci saptanmıģtır [12]. Bunlar VanA, VanB, VanC, VanD, VanE, VanG dir. VanD, VanE, VanG fenotiplerinin epidemiyolojik önemi tam olarak anlaģılamamıģtır. Bilinen fenotipler arasında sadece VanC intrensek olma özelliğine sahiptir. VanA ve VanB tipi direnç E. faecium ve E. faecalis te tanımlanmıģ olup kazanılmıģ dirençlerdir [Radhouani ve ark., 2010; MenteĢ ve ark., 2007]. Glikopeptide dirençli Enterococcus ların sayısının artmasıyla birlikte bu türler dünya çapında önemli bir problem olarak ortaya çıkmaktadır [Ke ve ark., 1999]. Glikopeptidler immun sistemi zayıf ya da bastırılmıģ bireylerde birkaç enfeksiyona karģı en son çare olarak kullanılan antibiyotiklerdir. Günümüzde Enterococcus cinsi bakteriler Amerika da ikinci en sık hastane enfeksiyonu yapan bakteri olarak bildirilmektedir [Klein ve ark., 2003]. Enterococcus enfeksiyonlarda klinik izolatların % 85 ini Enterococcus faecalis, % 10 unu ise Enterococcus faecium oluģturmaktadır [Lu ve ark., 2002; Hammes ve ark., 2001; Erdem ve ark., 2004; Eldin ve ark., 2002]. Meydana gelen enfeksiyonlarda, Enterococcus faecium, antibiyotiklere karģı Enterococcus faecalis ten daha dirençli olmasıyla dikkat

34 çekmekte ve patojenik Enterococcus faecium un çok çabuk antibiyotik direnç mekanizması geliģtirebilmesinin ve bu özelliğini transfer edebilme kabiliyetinin sağlık açısından önemli bir risk olduğu düģünülmektedir [Lund ve ark., 2002; Rinkinen ve ark., 2003]. Bunun dıģında Enterococcus spp. nin biyojen amin üretimi ile gıda intoksikasyonlarına neden olabilecekleri düģünülmektedir [Durlu-Özkaya ve ark., 2005; Yerlikaya ve ark., 2002]. Çoklu direnç Mikroorganizmalar yalnız bir ilaca karģı değil birçok ilaca karģı direnç kazanabilmektedir. Direnç mekanizması kemoteröpatiklerin mikroorganizmalara olan etki mekanizmalarına karģı oluģturmaktadır. Enterococcus ların birçok antimikrobiyal ajana karģı intrinsik dirençli olmaları ve bazı türlerinin bu bakterilere etkili az sayıdaki antibiyotiğe çoklu direnç göstermeleri tedavide güçlüğe neden olmaktadır [Meriç ve ark., 2004]. Antibiyotiklerin uygunsuz bir Ģekilde hayvan beslenmesinde geliģim arttırıcı olarak kullanılması, dirençli Enterococcus türlerinin ortaya çıkmasında elektif ajan rolü taģımaktadır. Kullanılan bu antibakteriyeller arasında insan tedavisinde de kullanılan antibiyotikler bulunmaktadır [Butaye ve ark., 1999]. Ġnsan tedavisinde ve hayvanlarda geliģim arttırıcı olarak kullanılan antibakteriyeller arasında çapraz direnç bulunmaktadır. Çapraz direnç sonucunda hayvan geliģiminde kullanılan antimikrobiyellere direnç, insanlarda tedavi amacıyla kullanılan ilaçlara dirençle sonuçlanmaktadır [Emborg ve ark., 2003]. 1980 li yılların sonunda ilk defa glikopeptidlere karģı dirençli Enterococcus (GRE) tespit edilmiģ ve bunun neden olduğu enfeksiyon güçlükle tedavi edilebilmiģtir [Peters ve ark., 2003]. Vankomisin ve teikoplanine karģı direnç, gıda kaynaklı Enterococcus lar arasında en sık izole edilen direnç fenotipidir [Giraffa, 2002]. Enterococcus faecium ve Enterococcus faecalis bu glikopeptidlere karģı direnç kazanmıģlardır [BaĢustaoğlu ve ark., 2001]. Teikoplanin ve vankomisin gibi glikopeptidlerin önemi, çoklu ilaç direnci gösteren türlere ya da penisilin, ampisillin gibi antibiyotiklere karģı alerji gösteren kiģilerin

35 klinik tedavisinde kullanılmalarından kaynaklanmaktadır [Giraffa, 2002]. Bu antibiyotikler immun sistemi zayıf ya da bastırılmıģ bireylerde birkaç enfeksiyona karģı en son çare olarak kullanılan antibiyotiklerdir [Salminen ve ark., 1998]. Bu nedenle vankomisine dirençli Enterococcus lar (VRE) halk sağlığı için global bir tehdit olarak ortaya çıkmaktadır [Gelsomino ve ark., 2003]. VRE ler çoklu ilaç direnci gösteren bakterilerin yol açtığı enfeksiyonların tedavisinde ve vankomisin ile tedaviye ihtiyaç duyulan hastalarda tedavinin baģarısız olmasına neden olmaktadırlar [Lukasova ve ark., 2003]. Bu nedenle hastanelerde vankomisine dirençli Enterococcus ların ortaya çıkması endiģe vermektedir [Gelsomino ve ark., 2003]. VRE lerin ortaya çıkmasıyla Enterococcus lar kullanılan bütün antibiyotiklere karģı direnç kazanmıģ durumdadırlar [Wegener ve ark., 1997]. VRE lerin sebep olduğu enfeksiyonlar, Avrupa ve Amerika da önemli bir problem haline gelmiģtir [Eaton ve ark., 2001]. Son yıllarda Enterocccus faecium en sık ortaya çıkan VRE olarak tanımlanmaktadır [Salminen ve ark., 1998; De Vuyst ve ark., 2003]. Vankomisine dirençli Enterococcus faecium (VREF) suģları, hastane ortamları, insanlar, hayvansal kaynaklar, akuatik habitatlar ve tarımsal ürünlerden izole edilmiģtir [Lukasova ve ark., 2003]. Yapılan çalıģmalar vankomisine yüksek derecede direnç gösteren Enterococcus faecium suģlarının hayvansal orjinli gıdalarda bulunduğunu göstermiģtir [Robredo ve ark., 2000]. Vankomisine dirençli Enterococcus faecium suģları lağım suları ile sulanmıģ bitkiler, atık sular ve dıģkılar gibi çeģitli kaynaklardan çevresel kontaminasyon yoluyla gıdalara ulaģabilmektedir [Giraffa, 2002]. Kesim yerlerindeki kötü hijyen koģulları sonucunda karkaslar fekal kontaminasyonla kontamine olarak hayvansal gıdalar bu dirençli türler için bir vektör olmaktadır [Lemcke ve ark., 2000]. VREF suģları biftek, kümes hayvanları, domuz ve diğer et ürünlerinden izole edilmiģtir [Emborg ve ark., 2003]. Kontamine gıdalar aracılığı ile VRE lerin insanlara transfer edilebilme riski endiģe doğurmaktadır [Klare ve ark., 2003]. Direnç genlerinin gıda zinciri aracılığı ile insanları da etkileyebileceği düģünülmektedir [Peters ve ark., 2003].

36 Enterococcus cinsi bakteriler genellikle düģük virulansa sahip olmalarına rağmen, Enterococcus faecium ve Enterococcus faecalis kullanılan antibiyotiklere karģı dirençli olmaları nedeniyle, klinik terapilerde önemli problemlere neden olmaktadır [Gomes ve ark., 2008; Bodil, 2003; Giraffa ve ark., 2000]. Pastörize ve çiğ sütlerde antibiyotiğe dirençli Enterococcus ların (ARE) varlığı tespit edilmiģtir. ARE ler et ürünleri, yemeye hazır gıdalar ve hatta probiyotik kültürlerde bulunmaktadır. Bu ürünlerde antibiyotik direnç bulunması, direncin gıda zincirine yayılması riskini doğurmaktadır. Kanamisin ve gentamisine yüksek direnç gösteren Enterococcus faecium türleri Fransız peynirlerinden ve hastanedeki hastalardan izole edilmiģtir [Giraffa, 2002]. Gıda kaynaklı Enterococcus lar, taģıyıcıya adapte olabilen antimikrobiyel direnç ve virülans özellikler taģıyabilirler [Hayes ve ark., 2003]. Bu bakteriler, genetik materyallerini değiģtirebilmeleri ve genetik bilgilerini diğer türlerle bile paylaģabilmeleri nedeniyle, mevcut genomun degiģmesine yol açmakta ya da plazmidler aracılığıyla genetik materyallerin hücreler arası transferine neden olmaktadır [Yaman ve ark., 2004]. Böylece bu organizmalar kendisi bile virülans faktör taģımazken, zararsız bir türü patojen haline dönüģtürebilmektedir [De Vuyst ve ark., 2003; Quednau ve ark., 1999]. Yapılan konjugasyon çalıģmaları klinik Enterococcus türlerindeki transfer sıklığının, gıda kaynaklı veya probiyotik türlere göre daha baģarılı olduğunu göstermiģtir [Klein, 2003]. Yapılan araģtırmalar klinik örneklerdeki Enterococcus türlerinin, gıda kaynaklı türlerden daha fazla virulans faktör taģıdığını ve ayrıca starter kültür olarak kullanılan Enterococcus türlerinin, klinik izolatlara göre daha düģük patojeniteye sahip olduklarını göstermektedir [Franz ve ark., 2001]. Klinik izolatlardaki virulans faktörlerin etkileri, gıdalardan izole edilen türlerinkinden çok daha fazladır. Gıdalardan izole edilen Enterococcus faecium suģları genellikle virulans faktör taģımamaktadır. Ancak halen güvenli olarak bilinen bir suģun konjugasyonla bilinen virulans faktörlerden birini kazanma riski vardır. Probiyotik ve starter kültür olarak

37 yüksek sayılarda Enterococcus tüketilmesi sonucunda, virulans gen taģıyan plazmidlerin yayılabileceği düģünülmektedir [Eaton ve ark.,2001]. Çünkü gıdalarda bulunan Enterococcus faecalis ve Enterococcus faecium un antibiyotik direnç taģıyabildikleri tespit edilmiģtir [Semedo ve ark., 2003]. Ayrıca gıda endüstrisinde starter kültür olarak kullanılan Enterococcus faecium suģlarının, klinik örneklerden izole edilen medikal orijinli patojenlerden in vitro koģullarda transkonjugasyon yoluyla virulans faktörler elde edilebildikleri tespit edilmiģtir [De Vuyst ve ark., 2003; Quednau ve ark., 1999]. Bu nedenle antimikrobiyel dirençli Enterococcus faecium populasyonları taģıyan gıdaların tüketimi, muhtemel transferlere aracı olabilir ve taģıyıcıda direnç determinantlarının oluģması ve kolonizasyonu ile sonuçlanabilir [Hayes ve ark., 2003]. Günümüzde halen Enterococcus ların fermente gıdalardaki virülans faktörleri ve antibiyotik direnci hakkında çok az veri bulunmaktadır. Gıda ortamındaki gen transferinin ve fermentasyon sırasındaki antibiyotik direnç dinamiklerinin nasıl meydana geldiği ile ilgili bilgilere ihtiyaç duyulmaktadır. Patojen olan Enterococcus türleri ile gıdalarda güvenli olarak kullanılan kültürler arasındaki fark tam olarak bilinmemektedir [Eaton ve ark.,2001]. Virülans faktörlerin ortaya çıkması ve fermente gıdalarda kullanılan bakteriyosin üreten ya da koruyucu, starter veya probiyotik olarak kullanılan kültürlerin güvenliği suģa özgüdür. Günümüzde halen Enterococcus ların starter kültür olarak kullanılmalarının güvenilir olup olmadığına cevap vermek güçtür. Çünkü bu mikroorganizmalar henüz GRAS (generally recognised as safe) yani güvenilir olarak kabul edilmemiģlerdir [Nováková ve ark., 2010; De Vuyst ve ark., 2003; Sarantinopolulos ve ark., 2002; Dağdemir ve ark., 2006]. Enterococcus cinsi bakterilerin klinik olaylara neden olması sebebiyle, bu bakterilerin gıda fermentasyonlarında ve probiyotik olarak kullanılmaları günümüzde sorgulanmaktadır [Sarantinopoulos ve ark., 2002; Erdem ve ark., 2004].

38 Gousa ve ark. (2010), çiğ ve iģlenmiģ etlerdeki bakteri kontaminasyonunu ve bu bakterilerin 19 antibiyotiğe karģı antibiyotik dirençliliğini araģtırmıģlardır. Bu çalıģmaya göre, izole edilen 428 izolatın, 57 si Enterococcus spp. olarak tanımlanmıģtır. Toplam Enterococcus izolatının, %42.1 inin antibiyotik dirençliliği yüksek olarak tespit edilmiģ ve %21.1 inin vankomisine karģı dirençli olarak tespit edilmiģtir. [Gousa ve ark., 2010]. Riboldi ve ark. (2009), çiğ et, süt ürünleri ve sebzeden izole edilen E. faecium, E. faecalis ve Enterococcus spp. nin antimikrobiyal direnci araģtırılmıģtır. Ampisilin, gentamisin, eritromisin, vankomisin, tetrasiklin, siproflaksasin, streptomisin, norfloksasin, kloromfenikol, basitrasin ve linkomisin antibiyotiklerine dirençli bulmuģlardır [Riboldi, 2009]. Tuncer ve ark. (2009), yapmıģ olduğu bir araģtırmada, tulum peynirlerinden izole edilen 39 Enterococcus izolatının tamanında vankomisine duyarlı olarak tespit etmiģlerdir [Tuncer ve ark., 2009]. Çıtak ve ark. (2005), yapmıģ olduğu çalıģmada beyaz peynir ve çiğ sütten izole edilen 158 E. faecalis suģunun %67 si vankomisin, %58.2 si teikoplanin, %91.1 i eritromisin, %94.9 u okzasilin, %93.7 si streptomisin antibiyotiklerine dirençli olarak saptanırken, izole edilen 76 E. faecium suģunun %85.5 i vankomisin, %46 sı teikoplanin, %92.1 i eritromisin, %94.7 u okzasilin, %92.1 i streptomisin antibiyotiklerine dirençli olarak saptamıģtır [Çıtak ve ark., 2005]. Çıtak ve ark. (2005), yapmıģ oldukları çalıģmada çiğ sütten izole edilen 177 Enterococcus izolatının antibiyotik dirençlilikleri araģtırılmıģtır. Bu suģların %42 si ampisilin, %68 i seftriakson, %59 u kloramfenikol, %48 i siproflaksasin, %86 sı eritromisin, %68 i gentamisin, %67 si imipenem, %95 i okzasilin, %73 ü rifampin, %97 si streptomisin, %44 ü teikoplanin, %45 i tetrasiklin, %37 si vankomisin antibiyotiklerine dirençli olarak saptamıģtır [Çıtak ve ark., 2005].

39 Çıtak ve ark. (2004), yapmıģ oldukları çalıģmada izole edilen Enterococcus suģlarının antibiyotik dirençlilikleri Kirby-Bauer disk difüzyon yöntemi ile saptanmıģtır. Bu suģların %86.1 i vankomisin, 66.3 ü teikoplanin, %93 ü eritromisin, %89.1 i streptomisin, %43.5 i gentamisin, %88.1 i okzasilin, %30.6 sı ampisilin, %32.6 sı imipenem, %55.4 ü tetrasiklin, %79.2 si kloroamfenikol, %56.4 ü rifampin antibiyotiklerine dirençli olarak saptamıģtır [Çıtak ve ark., 2004]. Erdem ve ark. (2004), hastanede yatan hastalardan izole edilen 17 Enterococcus faecalis ve 10 Enterococcus faecium suģunun aminoglikozidlere karģı yüksek derecede dirençli olduğunu tespit etmiģlerdir [Erdem ve ark., 2004]. Lukasova ve ark. (2003), sucuk ve çiğ sütten izole edilen Enterococcus türlerinin, tetrasiklin, kloromfenikol, gentamisin, eritromisin antibiyotiklerine karģı direnç tespit edildiğini belirterek, bir çalıģmada Enterococcus faecium ve Enterococcus faecalis in tetrasiklin direnç genlerini Lactococcus lactis sub species lactis var diacetylactis in kromozomuna transferinin gösterildiğini bildirmiģlerdir. Yaptıkları çalıģmada ise Mısır Dominati peynirlerinden izole ettikleri Enterecoccus faecium suģlarının okzasilin, sephazoline karģı dirençli, ampisillin, amoksisillin ve sefaklora hassas olduğunu tespit etmiģlerdir [Lukasova ve ark., 2003]. Cocconcelli ve ark. (2003), model peynir ve fermente sucuk üretiminde klinik kaynaktan alınan Enterococcus faecalis in antibiyotik direnç ve virülans genlerini fermentasyon sırasında gıda kaynaklı Enterococcus faecalis e transfer edebildiğini göstermiģlerdir [Cocconcelli ve ark., 2003]. Giraffa ve ark. (2002), Ġsveç te perakende satıģa sunulan tavuklardan izole edilen Enterococcus türlerinde tetrasiklin, eritromisin ve vankomisin gibi antibiyotiklere karģı direnç tespit edildiğini ve basitrasin, kloramfenikol, eritromisin, gentamisin, penisilin, rifampisin, tetrasiklin ve streptomisin antibiyotiklerine karģı dirençli Enterococcus türlerinin dilimlenmiģ et, sucuk, biftek, domuz eti ve çiğ etlerden izole edildiğini bildirmiģtir [Giraffa ve ark., 2002].

40 Gıdalarda, Enterococcus ların glikopeptit direnci oluģumu ve yayılımının, bir glikopeptit olan avoparsin antibiyotiğinin besi hayvanlarında büyüme ve geliģmeyi uyarıcı bir ajan olarak kullanılmasından kaynaklandığı öne sürülmektedir. Çiftlik hayvanları için özellikle tavuk yemlerinde glikopeptitlerin antimikrobiyal büyüme hızlandırıcı olarak kullanılmasıyla Avrupa da gıda kaynaklarından, çiftlik hayvanlarından ve çevreden VRE izole edilmesi arasında bir iliģki olduğu tespit edilmiģtir [Devriese ve ark., 1996]. Ġsveç te yapılan baģka bir çalıģmada da tavuklarda E. faecium, E. gallinarum, E. faecalis türleri izole edilmiģ olup en fazla E. faecium da vankomisin dirençliliği %50 oranında tespit edilmiģtir. Bu ülkelerde avoparsin kullanımı 1995 yılına kadar devam etmiģtir [Teuber ve ark., 1996]. Ġtalya da avoparsin yasağından önce (1997 Mart) ve yasaktan 18 ay sonra (1998 Ekim) olmak üzere iki ayrı dönemde tavuk örneklerin çalıģılmıģ ve van A geni aranmıģtır. Bu geni içeren suģlar yasağın uygulanmasından 18 ay sonra yetiģtirilen tavuk örneklerinden izole edilen suģlarda %14.6 dan %8 e varan bir düģüģ gözlemlenmiģtir. Ġzole edilen türler; E. faecium, E. durans ve E. hirae dir. En sık rastlanan suģ E. faecium olup oran %9.3 ten %7 ye düģmüģtür [Schroeder ve ark., 2004]. Avoparsinin büyütme faktörü olarak kanatlı yetiģtiriciliğinde yaygın olarak kullanılmasıyla, Enterococcus larda vankomisine karģı çapraz direnç geliģtiği ve bu direncin de S. aureus a aktarıldığı bildirilmiģtir [Can ve ark., 2008].

41 3. MATERYAL METOD AraĢtırmamızda ġubat 2009 Aralık 2009 tarihleri arasında Ankara nın çeģitli marketlerinden toplanan 80 fermente et örneği (20 sucuk, 20 sosis, 20 salam, 20 pastırma) materyal olarak kullanılmıģtır. Fermente et örneklerinden Enterococcus türlerinin izolasyonu, Bergey s of Manuel Systematic Bacteriology [Hardie, 1986] ve Manuel of Clinical Microbiology de [Faclam ve ark., 1995] belirtilen biyokimyasal testler esas alınmıģtır, ayrıca doğrulanması için Becton Dickinson (BD) BBL Crystal Identification Systems ve Gram-Positive ID kit kullanılmıģtır [Washington ve ark., 2006]. Tanımlamaları yapılan Enterococcus türlerinde 7 0 C deki ve 25 0 C deki proteolitik enzim aktiviteleri, lipolitik enzim aktiviteleri ve Kirby-bauer disk difüzyon yöntemiyle antibiyotik duyarlılıkları araģtırılmıģtır. 3.1. Fermente Et Örneklerinden Enterococcus ların Ġzolasyonunda Kullanılan Yöntemler 3.1.1. Örnek alma ve örnekleri analize hazırlanması AraĢtırmamızda Türk Standardı (TS) TS 3135 de [TS-3135, 1998] belirtilen esaslara göre et ve et örnekleri toplanmıģtır. Ankara nın çeģitli marketlerinde satıģa sunulan 20 sucuk, 20 sosis, 20 salam ve 20 pastırma gibi fermente etler tat ve koku değiģimine neden olmayacak ve örneklerin mikrobiyal yükünü etkilemeyecek steril kaplara alınarak 0 o C - +2 o C sıcaklık koģullarında laboratuvar ortamına getirilerek aynı gün içerisinde çalıģılmıģtır. 10 g. fermente et örneği, 90 ml çift kuvvetle hazırlanmıģ Azid dekstroz broth besiyerine ilave edilerek blenderda 2 dakika parçalanarak 10ˉ¹ dilüsyon hazırlanmıģtır. ÖnzenginleĢtirme amacı ile 37 C de 48-72 saat inkübe edilmiģtir. ÖnzenginleĢtirme sonucunda 10ˉ¹ dilüsyondan 100 µl Slanetz- Bartley besiyerine ekim yapılarak 48-72 saat inkübe edilmiģtir.

42 3.1.2. Fermente etlerde Enterococcus izolasyonu Fermente et örneklerinden 37 0 C de 48-72 saat inkübasyon sonucunda Slanetz Bartley besiyerinde üreyen tipik kırmızı ve pembe renkteki koloniler koyun kanlı agara pasajlanarak 24-48 saat 37 0 C de inkübasyona bırakılmıģtır ve bu kolonilere Enterococcus izolasyonu için çeģitli biyokimyasal testler uygulanmıģtır. Yapılan gram boyama ve katalaz testleri sonucunda; gram pozitif, katalaz negatif özellik gösteren kolonilere 10 0 C de ve 45 0 C de üreme, % 6,5 luk NaCl de üreme, eskülin hidrolizi ve PYR testi uygulanmıģtır. Gram pozitif (+), katalaz negatif (-), 10 0 C de ve 45 0 C de üreme pozitif (+), % 6,5 luk NaCl de üreme pozitif (+), eskülin hidrolizi pozitif (+) ve PYR testi pozitif (+) olan kolonilere Enterococcus ön tanısı konmuģtur. Ön tanısı yapılan Enterococcus izolatlarının tür seviyesinde adlandırılması için %10 luk karbonhidrat fermentasyon testi (mannitol, sorbitol, sorboz, L-arabinoz, D- raffinoz, sukroz, laktoz), arjinin hidrolizi ve hareket testi uygulanmıģtır. Enterococcus türlerinin tanımlanmasında Bergey s of Manuel Systematic Bacteriology [Hardie, 1986] ve Manuel of Clinical Microbiology [Faclam ve ark., 1995] belirtilen biyokimyasal testler esas alınmıģtır. Ayrıca doğrulanması için Becton Dickinson (BD) BBL Crystal Identification Systems ve Gram-Positive ID kit [Washington ve ark., 2006] kullanılmıģtır. Ayrıca olarak Enterococcus faecalis ATCC 29212 ve Enterococcus faecium CCM 2518 (Karadeniz Teknik Üniversitesi Tıp Fakültesi Mikrobiyoloji Bölümü) referans suģları kullanılmıģtır. 3.2. Gıda örneklerinde Enterococcus Ġzolasyonu ve Ġdentifikasyonunda Kullanılan Besiyerleri ve Testler 3.2.1. Azide dekstroz broth (Oxoid CM 868) Pepton: 40 g. Glukoz: 10 g. Sodyum klorid: 10 g. Dipotasyum hidrojen fosfat: 5,4 g. Sodyum azid: 0,4 g.

43 Distile su: 1000 ml. ph=6,8±0,2 e ayarlanıp besiyerindeki maddeler 2 katı tartılarak 1000 ml distile suda eritilip tüplere 10 ml pipetlendikten sonra pamuklanarak otoklavda 121 0 C de 15-20 dakika steril edilmiģtir. 3.2.2. Peptonlu su (Oxoid CM 9) Pepton: 10 g. Sodyum klorid: 5 g. Distile su : 1000 ml ph=7,2±0,2 e ayarlanıp besiyerindeki maddeler tartılarak distile suda eritilip tüplere 9 ml pipetlendikten sonra pamuklanarak otoklavda 121 0 C de 15-20 dakika steril edilmiģtir. 3.2.3. Slanetz Bartley besiyeri (LAB 166) Tripton: Maya özütü: Glukoz: Disodyum fosfat 2H2O: Sodyum azid : Tetrazollium klorid: Agar : Distile su : 20 g 5 g 2 g 4 g 0,4 g 0,1 g 10 g 1000 ml ph=7,2±0,2 e ayarlanıp besiyerindeki maddeler otoklavlanmadan bek alevinde iyice eridikten sonra steril plaklara 10 ar ml dağıtılmıģtır.

44 3.2.4. Blood agar base (Oxoid CM 331) Pepton: NiĢasta: Sodyum klorid: Agar : Distile su: 23 g 1 g 5 g 10 g 1000ml ph=7,3±0,2 ye ayarlanıp besiyerindeki maddeler tartılarak distile suda eridikten sonra otoklavda 121 0 C de 15-20 dakika steril edilmiģtir. Daha sonra 50 0 C ye kadar soğutulup, %5 lik koyun kanı ilave edilerek homojenize olması sağlanarak steril plaklara 10 ar ml dağıtılmıģtır. 3.2.5. Gram boyama yöntemi Klasik gram boyama yöntemi ile boyanarak gram pozitif (+), kok ve zincir Ģeklinde üreme gösteren koloniler çalıģılmıģtır. 3.2.6. Katalaz testi Stok kültür üzerinde üreyen koloniler temiz bir lam üzerinde serum fizyolojik içinde süspanse edilerek üzerine %3 lük hidrojen peroksit (H 2 O 2 ) damlatılmıģtır. Kabarcıklarının görülmesi halinde test pozitif kabul edilmiģtir. Katalaz negatif olan gram pozitif koklar çalıģılmaya esas teģkil edecek izolatlar seçilmiģtir. 3.2.7. %6,5 luk NaCl de üreme %6,5 NaCl lu buyyon Brain heart infusion broth: NaCl: 37 g 60 g

45 Distile su: 1000 ml Besiyerindeki maddeler tartılarak distile suda eritilip tüplere 5 ml pipetlendikten sonra pamuklanarak otoklavda 121 0 C de 15-20 dakika steril edilmiģtir. %6,5 luk NaCl lu buyyon içeren tüplere 3-4 koloni inoküle edilerek 37 0 C de 24-72 saat inkübe edilmiģtir. Bu süre sonunda buyyonda bulanıklığın görülmesi testin pozitif olduğunu göstermiģtir. A B A: %6,5 luk NaCl de üreme pozitif B: %6,5 luk NaCl de üreme negatif Resim 3.1. %6,5 luk NaCl de Üreme Testi 3.2.8. 10 0 C de ve 45 0 C de üreme Todd Hewit Broth (LAB M 75) 450 g yağsız kıyma karıģımı: 10 g Tripton: 20 g Sodyum bikarbonat: 2g Sodyum klorid: 2 g Dipotasyum fosfat: 0,4 g

46 Distile su: 1000 ml ph=7,8±0,2 e ayarlanıp besiyerindeki maddeler tartılarak distile suda eritilip tüplere 5 ml pipetlendikten sonra pamuklanarak otoklavda 121 0 C de 15-20 dakika steril edilmiģtir. Todd Hewit Broth a ekilen koloninin 2 ayrı ekimi yapılarak 10 0 C de 7 gün, 45 0 C de 1 gün inkübe edilmiģtir. Bulanıklığın görülmesi durumunda test pozitif olarak kabul edilmiģtir. A B A: 10 0 C de ve 45 0 C de üreme pozitif B: 10 0 C de ve 45 0 C de üreme negatif Resim 3.2. 10 0 C de ve 45 0 C de üreme testi 3.2.9. Eskülin hidrolizi Heart infusion agar: Eskülin : Ferrik klorid : Distile su : 40 g 1g 0,5 g 1000 ml

47 Besiyerindeki maddeler tartılarak 1000 ml distile suda eritilip tüplere 5 ml pipetlendikten sonra pamuklanarak otoklavda 121 0 C de 15-20 dakika steril edilmiģtir. Stok kültür üzerinden alınan koloniler ekim yapılarak 24-48 saat inkübe edilmiģtir. Besiyerinde siyah pigment oluģumu eskülin hidrolizi testinin pozitif olduğunu göstermiģtir. A B A: Eskülin hidrolizi pozitif B: Eskülin hidrolizi negatif Resim 3.3. Eskülin Hidrolizi Testi 3.2.10. PYR (pyrolidonyl arylamidase) testi (Oxoid ID0580) PYR agar Todd-hewit broth: 22g L-pyroglutamik asit beta-naphtylamide: 0.1g Agar: 7g Distile su: 1000ml

48 Kimyasal maddeler ısıtılarak eritildi ve 121 0 C de 15-20 dakika sterilize edildikten sonra 10 ml steril petrilere dağıtılmıģtır. PYR ayıracı p-dimethylaminocinnamaldehyt: 0.2g Sodyum dodesil sülfat: 2.5 ml Glasiyal asetik asit : 2.5ml 2-metoksi etanol: 5ml Distile su: 90ml p-dimethylaminocinnamaldehyt diğer maddeler içinde eritilerek +4 0 C de saklanmıģtır. Bütün izolatlar PYR agara ekimleri yapılarak 35 0 C de inkübe edilmiģtir. Üreyen kolonilerin üzerine %2 lik PYR ayıracı damlatıldı. Kırmızı ve pembe renk oluģtuğunda test pozitif sarı ve turuncu renk oluģtuğunda test negatif olarak değerlendirilmiģtir. 3.2.11. Hareket testi SIM besiyeri (Oxoid CM:435 ) Tripton: 20g Pepton: 60,1g Ferroz amonyum sülfat: 0.2 g Sodyum trisülfat: 0.2 g Agar: 3.5g ph=7.3±02 ye ayarlanıp besiyerindeki maddeler tartılarak 1000 ml distile suda eritilip tüplere 5 ml pipetlendikten sonra pamuklanarak otoklavda 121 0 C de 15-20 dakika steril edilmiģtir.

49 Enterococcus kültürlerinden alınan koloniler iğne öze ile besiyerinin dip kısmına kadar dik bir Ģekilde batırılarak ekilmiģtir. 37 0 C de 48 saatlik inkübasyon sonucunda ekim çizgisi boyunca ters çam ağacı biçiminde gösteren koloniler hareket pozitif olarak değerlendirilmiģtir. Resim 3.4. Hareket Testi (Pozitif Sonuç) 3.2.12. Arjinin hidrolizi Arjinin dihidroliz besiyeri (Thornley) Pepton: 1g NaCl: 5gr K 2 HPO 4 : 0.3 g Fenol kırmızısı: 0.01g L-arjinin monohidroklorid: 10 g Agar: 3g Distile su: 1000ml ph=7.2±0.2 ye ayarlanıp besiyerindeki maddeler tartılarak 1000 ml distile suda eritilip tüplere 4 ml pipetlendikten sonra pamuklanarak otoklavda 121 0 C de 15-20 dakika steril edilmiģtir.

50 Stok kültürden alınan koloniler besi yerine ekim yapılarak 27 0 C de 24-48 saat inkübasyona bırakılmıģtır. Bu süre sonunda besiyerinin rengi portakal kırmızısından mor renge dönüģmesi pozitif olarak değerlendirilmiģtir. A B A: Arjinin hidrolizi negatif B: Arjinin hidrolizi pozitif Resim 3.5. Arjinin Hidrolizi Testi 3.2.13. Karbonhidrat fermentasyon testi Purple broth base (BD Difco 211558 ) Proteaz pepton no:3: 10g Sığır özütü : 1g Sodyum klorid: 5g Brom krezol moru : 0.02g Distile su: 1000ml Besiyeri ph=6.8±0,2 ye ayarlanıp indikatör madde ilave edildikten sonra tüplere 9 ml pipetlenerek 121 0 C de 15-20 dakika steril edilmiģtir.

51 Karbonhidrat solüsyonu Karbonhidrat (mannitol, sorbitol, sorboz, arabinoz, raffinoz, sukroz, laktoz: Distile su : 1 g 10ml Solüsyon hazırlandıktan sonra membran filtreden geçirilerek steril edilmiģtir. Karbonhidrat temel besiyeri : Karbonhidrat solüsyonu: 9 ml 1ml Ġzolatların %10 luk mannitol, sorbitol, sorboz, L-arabinoz, D-raffinoz, sukroz ve laktoz içeren karbonhidrat fermentasyon besiyerine ekim yapılarak 37 0 C de 7 gün inkübe edilmiģtir. Besiyerindeki brom krezol moru indikatörünün rengini sarıya dönüģtüğü görüldüğünde test pozitif olarak değerlendirilmiģtir. A B A: Karbonhidrat fermentasyon testi negatif sonuç B: Karbonhidrat fermentasyon testi pozitif sonuç Resim 3.6. Karbonhidrat fermentasyon testi

52 3.3. Enterococcus Ġzolatlarının Tür Seviyesinde Tanımlanması Enterococcus cinsine ait izolatların saflık kontrolleri yapıldıktan sonra, tür seviyesindeki tanımlamalarının doğrulanması Becton Dickinson (BD) BBL Crystal Identification Systems ve Gram-Positive ID kit [Washington ve ark., 2006] ile yapılmıģtır. Tryptic Soy Agar besiyerine tek koloni yöntemine göre ekimleri yapılan Enterococcus izolatları, 37 C de 18-24 saat inkübe edilmiģtir. Ġnkübasyon sonucunda üreyen Enterococcus kültürleri, tanımlama kitlerinin ait solüsyonlara 0,5 Macfarland bulanıklığına eģdeğer Ģekilde ekilip, solüsyonun tamamı kit paneline aktarılmıģtır. Paneller, 18-24 saat 35-37 C de inkübe edildikten sonra, BBL Crystal Panel Viewer cihazı ve Gram-Positive ID kit e ait renkli okuma kartı ile değerlendirilmiģtir. Değerlendirme sonuçları bilgisayar ortamında, BBL Crystal Identification System programına göre yapılarak Enterococcus türleri tanımlanmıģtır. 3.4. Fermente Etlerden Ġzole Edilen Enterococcus ların Proteolitik Enzim Aktivitelerinin Belirlenmesi 3.4.1. 7 0 C deki proteolitik enzim aktivitesinin belirlenmesi Yöntem Fermente etlerden izolasyon ve identifikasyonu yapılan Enterococcus türlerinin 7 0 C deki proteolitik enzim aktivitelerinin belirlenmesinde skim milk agarda kuyu difüzyon yöntemi ile ekim yapılarak 7 0 C de 10 gün inkübasyona bırakılmıģtır. Ġnkübasyon sonucunda kuyu çevresinde Ģeffaf zon oluģturan Enterococcus türlerini proteolitik enzim aktivitelerinin zon çapı görülen izolatlar, pozitif olarak değerlendirilmiģtir.

53 Resim 3.7. 7 0 C de Proteolitik Enzim Aktivitesi Testi (Pozitif Sonuç) Besiyerleri Skim milk agar (oxoid L 31) Solüsyon A Agar: Distile su: 5g 250ml ph=6.3±0.2 ye ayarlanıp besiyerindeki maddeler tartılarak 1000 ml distile suda eritilip otoklavda 121 0 C de 15-20 dakika steril edilmiģtir. Solüsyon B Skim milk tozu : Distile su: 25 g 250 ml

54 Besiyeri hazırlandıktan sonra 1 atm basınç da 5 dakika steril edilerek 50 0 C ye kadar soğutulduktan sonra solüsyon A ilave edilerek steril petrilere 10 ml taksim edilmiģtir. 3.4.2. 25 0 C deki proteolitik enzim aktivitelerinin belirlenmesi Yöntem Enterococcus türlerinin 25 0 C deki proteolitik enzim aktivitelerinin belirlenmesinde %10 luk skim milk powder ilave edilen Standart Plate Count Agar kullanılmıģtır. 25 0 C de 48 saat üreme sonunda kolonilerin üzerine %10 luk asetik asit solüsyonundan 1 damla damlatılarak 1 dakika içinde oluģan zon gösteren izolatlar pozitif olarak değerlendirilmiģtir. - + - + Resim 3.8. 25 0 C de Proteolitik Enzim Aktivitesi Testi (Pozitif (+) Negatif(-)) Besiyerleri %10 luk skim milk agar Skim milk powder: 50 g.

55 Distile su: 500 ml Besiyeri hazırlandıktan sonra 1 atm basınçta 5 dakika steril edilerek 50 0 C ye kadar soğutulduktan sonra steril edilen Standart Plate Count Agar ilave edilerek steril petrilere 10 ml taksim edilmiģtir. Plate Count Agar standart (LAB M 10) Maya özütü: 2,5 g Pancreatik digest of casein: 5 g. Glukoz: 1g. Distile su: 1000ml ph=7,0±0,2 e ayarlanıp besiyerindeki maddeler 500 ml için hazırlanarak otoklavda 121 0 C de 15-20 dakika steril edilmiģtir. %10 luk asetik asit solüsyonu Asetik asit: Distile su: 10 ml 1000ml 3.5.Fermente Etlerden Ġzole Edilen Enterococcus ların Lipolitik Enzim Aktivitelerinin Belirlenmesi Yöntem Enterococcus türlerinin lipolitik enzim aktivitelerinin belirlenmesi Tributyrin Agar (TA) da değerlendirilmiģtir. 30 0 C de 24 saat inkübasyona bırakılmıģtır. Ġnkübasyon sonucunda ekimi yapılan bölge etrafındaki Ģeffaf alanlar belirlenerek lipolitik zon çapı görülen izolatlar pozitif olarak değerlendirilmiģtir.

56 + - Resim 3.9. Lipolitik Enzim Aktivitesi Testi (Pozitif (+) Negatif (-)) Besiyeri Tributyrin Agar (Merck VM461557) Pepton et: 2,5 g Kazein pepton: 2,5g Maya özütü: 3g Agar: 12 g Distile su: 1000ml ph=6,3±0,2 e ayarlanıp 121 0 C de 15-20 dakika steril edilmiģtir. Hızla karıģtırılan besiyeri üzerine 10 ml Tributyrin ilave edilir. 3.6. Enterococcus Türlerinin Antibiyotik Duyarlılıklarının Belirlenmesi Antibiyotik duyarlılık testi CLSI da (Clinical and Laboratory Standarts Instute) [CLSI, 2006] belirtilen kriterlere göre Kirby-Bauer disk difüzyon yöntemi izlenerek yapılmıģtır. Kanlı agar besiyerine ekilip 30-35 o C de 24 saat inkübe edilen