ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

Transkript

1 ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ Naci Erhan YURDAKUL TAVUK ETLERİNDEN GRAM POZİTİF KOKLARIN İZOLASYONU VE ANTİBİYOTİKLERE KARŞI DİRENÇLİLİKLERİ NİN BELİRLENMESİ GIDA MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI ADANA, 2008

2 ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ TAVUK ETLERİNDEN GRAM POZİTİF KOKLARIN İZOLASYONU VE ANTİBİYOTİKLERE KARŞI DİRENÇLİLİKLERİ NİN BELİRLENMESİ Naci Erhan YURDAKUL YÜKSEK LİSANS TEZİ GIDA MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI Bu tez../../2008 Tarihinde Aşağıdaki Jüri Üyeleri Tarafından Oybirliği/Oyçokluğu İle Kabul Edilmiştir. İmza... İmza... İmza... Prof. Dr. Zerrin ERGİNKAYA Prof. Dr. Fatih KÖKSAL Prof. Dr. Hasan Rüştü KUTLU DANIŞMAN ÜYE ÜYE Bu tez Enstitümüz Gıda Mühendisliği Anabilim Dalında hazırlanmıştır. Kod No : ZF2006YL83 Prof. Dr. Aziz ERTUNÇ Enstitü Müdürü Bu Çalışma Çukurova Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi Tarafından Desteklenmiştir. Proje No: Not: Bu tezde kullanılan özgün ve başka kaynaktan yapılan bildirişlerin, çizelge, şekil ve fotoğrafların kaynak gösterilmeden kullanımı, 5846 sayılı Fikir ve Sanat Eserleri Kanunundaki hükümlere tabidir.

3 ÖZ YÜKSEK LİSANS TEZİ TAVUK ETLERİNDEN GRAM POZİTİF KOKLARIN İZOLASYONU VE ANTİBİYOTİKLERE KARŞI DİRENÇLİLİKLERİ NİN BELİRLENMESİ Naci Erhan YURDAKUL ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ GIDA MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI Danışman: Prof. Dr. Zerrin ERGİNKAYA Yıl : 2008, Sayfa: 72 Jüri : Prof. Dr. Zerrin ERGİNKAYA Prof. Dr. Fatih KÖKSAL Prof. Dr. Hasan Rüştü KUTLU Bu çalışmada Adana daki çeşitli marketlerden temin edilen 50 adet tavuk eti örneğinden, gram pozitif kok izole edilerek, selektif besi yerinde gelişim ve gram boyama özellikleri belirlenmiştir. Tavuk eti örneklerinden izole edilen suşların 30 u gram (+) kok bulunmuştur. Söz konusu suşların, 4 ü Enterococcus spp., 4 ü S. aureus ve 22 si koagulaz negatif stafilakok (KNS ) olarak tanımlanmıştır. Yapılan antibiyotik direnç testleri sonucunda ise; Enterococcus spp. suşlarının %50 si eritromisin, %100 ü tetrasiklin, %50 si vankomisin, %50 si kloramfenikol ve %75 i siprofloksasine karşı dirençli bulunmuştur. Enterecoccus spp. suşlarında teikoplanin direncine rastlanmamıştır. S. aureus suşlarının ise, %25 i eritromisine, %100 ü tetrasikline ve %25 i kloramfenikola dirençli, vankomisin, teikoplanin ve siprofloksasine ise duyarlı bulunmuştur. KNS suşlarının ise; %68,1 i eritromisine, %77,2 si tetrasikline, %59 u vankomisine, %9 u teikoplanine %27,2 si koloramfenikol ile siprofiloksasine dirençli olduğu belirlenmiştir. Anahtar Kelimeler : Gram (+) kok, Enterococcus spp., S. aureus, antibiyotik dirençliliği, tavuk eti I

4 ABSTRACT MSc THESIS THE DETERMİNATİON OF ANTİBİOTİC RESİSTANCE OF GRAM POSİTİVE COCCOİD S AND İSOLATED FROM CHİCKEN MEAT Naci Erhan YURDAKUL DEPARTMENT OF FOOD ENGINEERING INSTITUTE OF NATURAL AND APPLIED SCIENCES UNIVERSITY OF ÇUKUROVA Supervisor: Prof. Dr. Zerrin ERGİNKAYA Year : 2008, Pages: 72 Jury : Prof. Dr.Zerrin ERGİNKAYA Prof. Dr. Fatih KÖKSAL Prof. Dr. Hasan Rüştü KUTLU In this study, 50 chicken meat samples were collected from markets in Adana and Gram positive coc strains were tried to be isolated from these samples. In isolated strains, growth on selective media and gram dye were tested. 30 of isolates that were obtained from chicken meat samples were found gram(+) coccus 4 of described isolates as Enterococcus spp., 4 of them as S. aureus and 22 of them as KNS were defined. In conclision of tests of antibiotic resistant, it was found that %50 of Enterococcus spp. were resistant to erytromycin, %100 of them were resistant tetracycline, %50 of them were resitant to vancomycin, %50 of them were resistant to chloramphenicol and %75 of them were to resistant to ciprofloxacin. No one of them found to be resistant to teicoplanin in isolate of Enterecoccus spp. It was found that, % 25 of S. aureus isolate were resistant to erytromycin, %100 of them were resistant to tetracycline and %25 of them were resistant to chloramphenicol, but also respectively %25 of them, %100 of them and %25 of them were sensitive to vancomycin, teicoplanin and ciprofloxacin. As for isolate of KNS, it was determined that %68.1 of them were resistant to erytromycin, %77,2 of them were resistant to tetracycline, %59 of them were resistant to vancomycin, %9 of them were resistant to teicoplanin, %27,2 of them were resistant to both chloramphenicol and ciprofloxacin. KeyWords : Gram (+) coccus, Enterococcus spp., S. aureus, antibiotic resistance, broiler meat II

5 TEŞEKKÜR Çalışmalarım boyunca değerli yardım ve katkılarıyla beni yönlendiren, her türlü bilgi ve desteğini benden esirgemeyen, her konuda bana yol gösteren, yardımcı olan, yakın ilgisi ile beni her zaman teşvik ve motive eden saygı değer hocam Prof. Dr. Zerrin ERGİNKAYA ya sonsuz teşekkürlerimi sunarım. Çalışmam sırasında ilgi ve yardımlarını esirgemeyen değerli hocam Yrd. Doç. Dr. Işıl VAR, Arş.Gör. Bülent ZORLUGENÇ, Arş.Gör. Feyza KIROĞLU ve Arş.Gör. Adnan BOZDOĞAN a Tezim sırasında destek vermekten kaçınmayan ve her zaman yardımcı olan sevgili arkadaşlarım Arş.Gör. Hasan TANGÜLER, Dr. Emir Ayşe ÖZER, Arş.Gör. Emel ÜNAL ve İbrahim YALANCA ya borç bilirim. Maddi ve manevi destekleriyle beni yalnız bırakmayan aileme teşekkürü bir III

6 Rahmetli Babam Mustafa Saygun YURDAKUL anısına ithaf ediyorum. IV

7 İÇİNDEKİLER SAYFA ÖZ... I ABSTRACT... II TEŞEKKÜR... III İÇİNDEKİLER..V SİMGELER VE KISALTMALAR... VIII ÇİZELGELER DİZİNİ... VIII ŞEKİLLER DİZİNİ...IX RESİMLER DİZİNİ... X 1. GİRİŞ ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Gıda Zincirinde Gram Pozitif Koklar ve Önemi Staphylococcus spp Staphlococcus spp. nin Patojenitesi Enterococcus spp Enterococcus spp. nin Patojenitesi Bakterilerin Antibiyotik Direnç Mekanizmaları Staphylococcus spp nin Antibiyotik Direnci Enterococcus spp. nin Antibiyotik Direnci Kanatlı Eti Florası ve Kesim Teknolojisi S. aureus un Et Ürünlerinden İzolasyonu, Patojenitesi ve Antibiyotik Direnci İle İlgili Yapılan Çalışmalar Enterococcus spp. nin Et Ürünlerinden İzolasyonu, Patojenitesi ve Antibiyotik Direnci İle İlgili Yapılan Çalışmalar MATERYAL VE METOT Materyal Besiyerleri ve Kimyasallar Referans Suşlar Metot Örneklerin Analize Hazırlanması V

8 Enterococcus spp. nin İzolasyonu Enterococcus spp. nin Tanımlanması S.aureus un İzolasyonu S.aureus un Tanımlanması Morfolojik ve Biyokimyasal Testler Gram Boyama Katalaz Testi Tuz Toleranslarının Belirlenmesi Sıcaklık Toleranslarının Belirlenmesi Glikozdan Gaz Üretimi Koagulaz Testi Deoksiribonükleaz (DNaz) Testi Mannitol ün Anaerobik Femantasyonu Antibiyotik Direnç Testi ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Enterococcus spp. İzolasyonu ve Tanımlanması Koagulaz Negatif Stafilakok (KNS) ve S. aureus İzolasyonu ve Tanımlanması Enterococcus spp. Suşlarının Antibiyotik Dirençliliği S. aureus ve KNS lerin Suşlarının Antibiyotik Dirençlilikleri Enterococcus spp. nin Vancomycin Dirençleri SONUÇ VE ÖNERİLER KAYNAKLAR ÖZGEÇMİŞ VI

9 SİMGELER VE KISALTMALAR ARE : Antibiotic Resistant Enterococci BHIB : Brain Heart Infusion Broth C 30 : Kloramfenikol 30 µg CIP 5 : Siprofloksasin 5 µg E 15 : Eritromisin 15 µg HLAR : Yüksek Düzeyde Aminoglikozit Direnci KAA : Kanamycin Aesculin Azide Agar KNS : Koagulaz Negatif Staphylococcus kob (cfu) : Koloni Oluşturma Birimi (Colony Forming Unit) LAB : Laktik Asit Bakterileri MRSA : Metisilin Resistant Staphylococcus aureus TE 30 : Tetrasiklin 30 µg TEC 30 : Teikoplanin 30 µg VA 30 : Vankomisin 30 µg VRE : Vancomycin Resistant Enterococcus VREF : Vancomycin Resistant Enterococcus faecium VII

10 ÇİZELGELER DİZİNİ SAYFA Çizelge 3.1. Araştırmada Kullanılan Besiyerleri ve Kullanım Amaçları Çizelge 3.2. Araştırmada Kullanılan Referans Suşlar Çizelge 3.3. Staphylococcus spp. için NCCLS doküman M2-A9 Zon Çapı Yorumlama Standartları Çizelge 3.4. Enterococcus spp. için NCCLS doküman M2-A9 Zon Çapı Yorumlama Standartları Çizelge 4.1. Tavuk Eti Örneklerinden İzole Edilen Gram (+) Koklar Çizelge 4.2. Tavuk Eti Örneklerinden Elde Edilen Enterococcus spp. İzolatlarının Özellikleri Çizelge 4.3. Tavuk Eti Örneklerinden Elde Edilen KNS ve S.aureus İzolatlarının Özellikleri Çizelge 4.4. Enterococcus spp. İzolatlarının Antibiyotik Direnç Testi Sonuçları Çizelge 4.5. KNS İzolatlarının Antibiyotik Direnç Testi Sonuçları Çizelge 4.6. S. aureus İzolatlarının Antibiyotik Direnç Testi Sonuçları VIII

11 ŞEKİLLER DİZİNİ SAYFA Şekil 2.1. Tavuk Eti Üretim Akış Şeması Şekil 3.1. Enterococcus spp nin Tanımlanması Şekil 3.2. S.aureus un Tanımlanması IX

12 RESİMLER DİZİNİ SAYFA Resim 4.1. Enterococcus spp nin KAA Besiyerinde Görünüşü Resim 4.2. S.aureus un Mannitol Salt Agar Besiyerinde Görünüşü Resim 4.3. S.aureus un Kranep Agar Besiyerinde Görünüşü Resim 4.4. KNS 17 Nolu Suşunun Antibiyotik Direnci Resim nolu Enterococcus spp. Suşunun Antibiyotik Direnci X

13 1. GİRİŞ Naci Erhan YURDAKUL 1. GİRİŞ İnfeksiyon etkeni olan mikroorganizmalara karşı etkin mücadele yapılması, eski çağlardan beri tıpta önemli çalışmalar arasında yer almıştır. Bu amaçla, bazı boyaların ve kimyasal maddelerin tedavi amacıyla kullanılması 17'nci yüzyıldan itibaren başlamıştır. Kinin sıtma, emetin ise amebiyaz tedavisinde kullanılmıştır. İlk defa İskoç bakteriyolog Alexander Fleming'in 1929'da gözlediği ve 1940 yılında Chain ve Flarey'in Penicillium notatum'un salgılarından elde ettiği ve penisilin adını verdikleri ilacın birçok mikroorganizmaya öldürücü etkide bulunmasının keşfedilmesi bir devrim olmuştur. Enfeksiyon hastalıklarının tedavisinde antibiyotikler, son 50 yılda son derece faydalı olmuşlar ve eskiden öldürücü olduğu bilinen pek çok hastalığın tedavisi için vazgeçilmez olmuşlardır. Ancak bu maddelerin uzun zaman ve bazen gereksiz yere kullanılmaları sonunda hastalık etkenlerinin ilaçlara karşı direnç kazanmaları son yıllarda çağdaş tıbbın en önemli problemi olarak ortaya çıkmıştır. Günümüzde immun sistemi bozulmuş hasta sayısı ve yoğun bakım ünitelerinin artması, gıda zincirinde özellikle hayvan refahı ve sağlığı alanında antibiyotik kullanımı ve bunların çevreye salınımı ile ortaya çıkan mikroorganizmalardaki antibiyotik direnci, önemli bir sağlık sorunu olarak karşımıza çıkarmaktadır (Demirtürk ve Demirdal, 2004). Tarihteki ilk direnç mekanizması, 1940'lı yılların ortalarında penisilinin yaygın biçimde kullanıma girmesi sonucu S. aureus suşlarında penisilinazların varlığıyla görülmüştür yılı öncesi hastanede izole edilen S. aureus suşlarının %90'ından fazlası penisiline duyarlıyken, 1952 yılında suşların %75'i dirençli olarak saptanmıştır.1960'lı yılların sonunda penisilin dirençli suşların topluma yayılması ve tüm izolatların %90'ından fazlasının penisiline direnç kazanması hayal kırıklığına neden olmuştur. Takip eden yıllarda bulunan her yeni antibiyotiğin kullanıma girmesini takiben, belli bir süre sonra bakterilerin direnç geliştirmesi hemen hemen değişmez bir kural halini almıştır. Nitekim 1980'lerde geniş spektrumlu sefalosporinler ve 1990'larda ise florokinolonlar geliştirilmiş, ancak günümüzde A. 1

14 1. GİRİŞ Naci Erhan YURDAKUL baumanii, B. cepacia, E. faecium gibi bakteriler bu antibiyotiklere de direnç geliştirmişlerdir (Berzeg, 2005). Gıdalarda rastlanan en önemli gram pozitif koklar, Staphylococcus, Enterococcus, Lactococcus, Streptococcus, Leucnostoc, Pedicoccus ve Vagococcus olarak bilinmektedir. Gıda güvenliği ve antibiyotik dirençliliği dikkate alındığında bu cinslerden Staphylococcus lar ve Enterococcus lar ön plana çıkmaktadır. Özellikle de Stapylococcus aureus, Enterococcus feacalis ve Enterococcus faecium suşları antibiyotik direçlilikleri açısından son zamanlarda hastane (nozokomiyal) enfeksiyonlarının tedavisinde ciddi sorunlara neden olan önemli türlerdir. Enterokoklar, 1980'li yılların ortalarında, moleküler tanı ve tiplendirme yöntemlerinin bakteri tanımlama alanında da başarı ile kullanılmaları sonucunda ayrı bir cins olarak streptokoklardan ayrılmış, Enterococcus cinsi olarak taksonomide yerlerini almışlardır. Gerek doğal olarak taşıdıkları klindamisin, florokinolon, trimetoprim-sülfametoksazol, düşük düzey penisilin ve düşük düzey aminoglikozid direnç özellikleri gerekse mutasyon ya da genetik madde aktarımı sonucu kazandıkları eritromisin, tetrasiklin, kloramfenikol, rifampin, nitrofurantoin, fusidik asit, florokinolon, vankomisin, yüksek düzey aminoglikozid, yüksek düzey penisilin direnç özellikleri ve beta-laktamaz aktiviteleri; her tür ortamda canlılıklarını sürdürebilme yeteneklerinden dolayı hastane enfeksiyonlarda risk taşımaktadırlar (Berzeg, 2005). Enterococcus faecium genellikle gıdalarda bulunan zararsız mikroorganizmalar olarak bilinmesine karşın, hastane enfeksiyonlarında etkin olması nedeni ile gıda mikrobiyolojisinde ve gıda proseslerinde kontrolü önem taşımaktadır. Antibiyotiklerin uygunsuz bir şekilde hayvan beslenmesinde büyüme uyarıcı olarak kullanılması, dirençli Enterococcus faecium türlerinin ortaya çıkmasında selektif ajan rolü taşımaktadır (Gaukel ve Spieβ, 1998; Quednau ve ark., 1999; Butaye ve ark., 2000; Giraffa, 2002; Cocconcelli ve ark., 2003). Kullanılan bu antibiyotiklerden bazıları insan tedavisinde de kullanılmaktadır (Gaukel ve Spieβ, 1998; Butaye ve ark., 1999). İnsan tedavisinde ve hayvanlarda gelişim arttırıcı olarak kullanılan antibiyotikler arasında çapraz direnç bulunmaktadır. Çapraz direnç sonucunda hayvan gelişiminde kullanılan antimikrobiyellere direnç, insanlarda 2

15 1. GİRİŞ Naci Erhan YURDAKUL tedavi amacıyla kullanılan ilaçlara dirençle sonuçlanmaktadır (Emborg ve ark., 2003). Enterococcus cinsi bakteriler genellikle düşük virulansa sahip olmalarına rağmen, Enterococcus faecium ve Enterococcus faecelis kullanılan antibiyotiklere karşı dirençli olmaları nedeniyle, klinik terapilerde önemli problemlere neden olmaktadır (Panagea ve Chadwick, 1996; Giraffa ve ark., 2000; Bodil ve ark., 2002; Peters ve ark., 2003). Amerika da sağlıklı bireylerin ortalama % 5-20 sinde Enterococcus kolonizasyonu ya da enfeksiyonu rapor edilmiştir (Namdari, 1998). Enterococcus faecalis enfeksiyonların % ından sorumlu iken, Enterococcus faecium ise % 5-15 inden sorumlu olduğu bildirilmiştir (El-Din ve ark., 2002; Erdem ve ark., 2004). Amerika da Enterococcus faecium, hastane enfeksiyonlarına en sık neden olan ikinci bakteridir (Wegener ve ark., 1997; Klare, 2003). Bu bakteriler klinik uygulamalarda kullanılan bir çok antibiyotiğe karşı dirençlidirler (Quednau ve ark., 1999). S. aureus hastane kökenli enfeksiyonlarının önde gelen diğer etkenlerindendir. Yıllar boyunca, metisilin bu enfeksiyonların sağaltımında başarı ile kullanılmış ancak metisiline dirençli S. aureus (MRSA) suşlarının ortaya çıkması ile bu antibiyotiğin etkinliği kısıtlanmıştır. Aslında MSRA suşları sadece metisiline değil, diğer β-laktamlar, makrolidler, aminoglikozidler, tetrasiklinler, kloramfenikol gibi diğer birçok antibiyotiğe de dirençlidirler. Dolayısıyla, bu suşlarla gelişen sistematik enfeksiyonlerın tedavisinde vankomisin tek seçenek olarak karşımıza çıkmaktadır. Bu nedenle S.aureus un vankomisine karşı direnç kazanıp kazanmadığı çok önemlidir (Ustaçelebi, 1999). Tavuk eti ucuz, sağlıklı ve besleyici bir gıdadır. Yüksek protein ve düşük yağ içeriğine sahip olması ve uygun bir doymamış yağ asidi kompozisyonu sergilemesi tavuk etinin beslenme değerini artırmaktadır. İnsan beslenmesinde önemli bir yer tutan tavuk, hayvansal gıdalar arasında uygun bileşimi ve çevre koşulları nedeniyle bozulma etmeni mikroorganizmalar ve patojen mikroorganizmaların gelişimi açısından önemli bir kaynak oluşturmaktadır. Tavuk etinin yiyecek olarak hazırlanması ve pazarlanması da kolaydır ve bu nedenle özellikle fast-food restoranlarda çok yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu ve benzeri nedenlere bağlı 3

16 1. GİRİŞ Naci Erhan YURDAKUL olarak tavuk eti tüketimi günümüzde hızlı bir artış göstermiş bu da tavuk etine olan talebi artırmıştır. Bu talep tavuk üretim çiftlikleri ile tavuk kesimhane ve işletmelerinin kurulması ve faaliyete geçmesini teşvik etmiş ve hızlandırmıştır. Bugün ülkemizde oldukça yüksek sayıda tavuk üretim çiftliği ve işletme bulunmaktadır(şener ve Temiz, 2004). Tavuk ve tavuk ürünlerinde en sık rastlanılan mikroorganizmalar Enterobacter, Alcaligenes, Esherichia, Bacillus, Alteromonas, Flavobacterium, Micrococcus, Salmonella, Proteus, Pseudomonas, Acinetobacter-Moraxella, Corynebacterium, Staphylococcus ve Campylobacter türleridir. Gerçekleştirilen bir çok araştırma tavuk eti ve ürünlerinden gıda kaynaklı enfeksiyon ve zehirlenmelerinin başlıca etmenleri olan Salmonella, Campylobacter, Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens, patojenik Escherichia coli suşları ve Bacillus cereus un sıkça izole edildiğini göstermektedir (Şener ve Temiz, 2004). Tavuklardan izole edilen patojenler arasında önem verilen ve üzerinde en çok durulanlar Salmonella serotipleri, Campylobacter jejuni ve diğer Campylobacter türlerinin yanı sıra Listeria monocytogenes ve diğer Listeria türleri, Clostridium perfringens ve Staphylococcus aureus tur. Çiğ tavuk etinden izole edilen diğer patojen bakteriler ise Aeromonas, Shigella ve Enterococcus türleri ile Yersinia enterocolitica dır (Şener ve Temiz, 2004). Kesim yerlerindeki kötü hijyen koşulları sonucunda karkaslar fekal kontaminasyonla kontamine olarak hayvansal gıdalar bu dirençli türler için bir vektör olmaktadır (Lemcke ve Bülte, 2000). Vankomisin dirençli Enterococcus faecium (VREF) suşları biftek, kümes hayvanları, domuz ve diğer et ürünlerinden izole edilmiştir (Emborg ve ark., 2003). Enterococcus cinsine ait bakteriler, genelde fekal çevrelerde yoğun olarak bulunmalarına karşın, gıdalarda üretim aşamalarında hijyenik olmayan koşullar sonucunda ortaya çıkarlar (Giraffa, 2003; Lukaskova ve Sustackova, 2003). Ayrıca intestinal ve çevresel kontaminasyonla da süt ve et gibi çiğ gıdalarda kolonize olabilirler. Sıcaklık, ph ve tuza karşı olan dirençleri sayesinde, gıda üretimi sırasında canlı kalarak son ürünü de kontamine edebilirler. Bu sebeple gıdalarda, özellikle de fermente gıdalarda bulunmaları, kötü üretim koşulları ve kontaminasyon seviyesinin bir göstergesi olarak bilinir (Hugas ve ark., 4

17 1. GİRİŞ Naci Erhan YURDAKUL 2003). Bu özelliklerinden dolayı Enterococcus ların sularda ve bazı gıda ürünlerinde hijyen indikatörü olarak kullanılmaktadır (Arizcun ve ark.,1997; Frahm ve Obst, 2003; Klein, 2003). Tavuk yetistiriciliginde enfeksiyonlardan korunmak amacıyla bilinçsiz olarak antibiyotik kullanılmaktadır. Ayrıca insan ve hayvanlarda Staphylococcus lardan ileri gelen hastalıkların sagaltımında önemli yer tutan antibiyotiklere karsı kazanılan direnç ve bu direncin aktarımı önemli bir husustur. Bu durumun ortaya konması amacıyla, tavuk karkaslarından izole edilen Staphylococcus ların antibiyotiklere karsı duyarlılık ve dirençlilik düzeylerinin saptanması üzerinde birçok çalışma yapılmış ve sonuçta, dirençlilik düzeyinin gittikçe arttıgı gözlenmistir (Duman, 2007). Antibiyotikler, hayvansal yemlerde hastalıkları önlemek ve performansı geliştirmek için elli yılı aşkın süredir kullanılmaktadır. Hayvansal yemlerde antibiyotiklerin sürekli kullanımı ile oluşan büyük endişe, yemi tüketen türlerde direncin oluşumu ve gıda zincirinde kalıntı ve insan hekimliğinde de ilgili antibiyotiklerin kullanılması nedeniyle patojenik bakterilerde direncin gelişmesidir (Lange ve Brokking, 2005). İnsanlarda Salmonella, Campylobacter ve E.coli enfeksiyonlarında artış ve bu hastalıkların antibiyotik tedavilerine karşı direnç göstermesi antibiyotiklerin yasaklanmasını gündeme getirmiştir. Antibiyotiklerin büyütmeyi ilerletici olarak kullanımı ile ilgili yapılan ilk kontrol adımı 1969 da, İsveç Komitesi tarafından yapılmştır. İngiltere 1970 lerde penicilin ve tetrasiklini yasaklamıştır. Sonuçta 1971 de birçok mikroorganizmaya karşı antibiyotikler ve tetrasiklinlerin yemde kullanılması yasaklanmıştır lerde, yeni insan hastalıklarının yayılmasında, antibiyotiklere karşı direnç doğmasının etkili olduğuna dikkat çekilmiştir. İsveç, 1986 da çiftlik hayvanlarında antibiyotik büyütme faktörlerini yasaklamayı yerine getiren ilk ülke olmuştur ların başında, tüketicilerin artan ilgisi ve Staphylococcus lara karsı dirençli türlerin çıkması, büyütme faktörlerinin güvenligi konusundaki tartışmaları şiddetlendirmiştir. İsveç, 10 yıl sonra 1997 de Avrupa Birliğine katılmış ve avoparsin in kullanımı Avrupa Birliğinde yasaklanmıstır. Avoparsin insan hekimliğinde kullanılan vankomisin ile ilgili bulundugundan 5

18 1. GİRİŞ Naci Erhan YURDAKUL yasaklanmıştır. Avrupa Birligi tarafından Aralık 1998 de, 2821/98 sayılı Avrupa Birligi kararı ile tylosin, virginiamycin, zinc bacitrasin ve spiramycin adlı antibiyotikler yasaklanmıstır. Antibiyotik dirençliliği ile ilgili eğilimleri kırmak için gözetim proğramlarına 1999 da başlanmıstır. Avrupa Birliği Komitesi, 2003 yılında son adımı atmış ve antibiyotik büyütme faktörlerini (avilamycin, flavophospholipol, monensin sodyum ve salinomycin sodyumu) Avrupa Birliğinde 1 Ocak 2006 dan sonra tümüyle yasaklanmasına karar vermiştir (Nollet, 2005). Türkiye de ise antibiyotik büyütme faktörlerinin tümü 21/01/2006 (Resmi Gazete:sayı:26056) tarihinden itibaren yasaklanmıstır (Tuncer, 2007). Danimarka da yemde antibiyotik büyütme faktörlerinin yasaklanmasından önce, Enterococcus spp. türlerinin % i antibiyotik büyütme faktörlerine karsı dirençli iken, yasaktan sonra bu oranın % 5-35 azaldıgı kaydedilmistir (Nollet, 2005). 1 Ocak 2006 dan sonra, Dünya daki toplam kanatlı yem üretiminin % 80 den fazlasının hala antibiyotik büyütme faktörü içereceği belirtilmektedir. Bunun nedeni ise dünyadaki en büyük kanatlı üreticileri ABD, Tayland ve Brezilya gibi ülkeler olması ve bu ülkelerde henüz resmi bir yasaklamanın söz konusu olmamasıdır (Tuncer, 2007). Kontamine gıdalar aracılığı ile antibiyotiklere dirençli bakterilerin insanlara transfer edilebilme riski endişe doğurmaktadır (Robredo ve ark., 2000; Klare, 2003). Direnç genlerinin gıda zinciri aracılığı ile insanları da etkileyebileceği düşünülmektedir (Peters ve ark., 2003). Bu araştırmada, farklı firmalar tarafından piyasada satılan tavuk etlerinden gıda güvenliği açısından önem taşıyan gram pozitif koklardan Enteroccus spp., S. aureus ve koagulaz negatif stafilakoklar izole edilerek, özellikle insan tedavisinde de kullanılan eritromisin, tetrasiklin, vankomisin, teikoplanin, kloramfenikol ve siprofloksasin antibiyotiklerine karşı dirençleri belirlenmiş ve söz konusu suşların gıda kaynaklı risk taşıyıp taşımadıkları tartışılmıştır. 6

19 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Naci Erhan YURDAKUL 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR 2.1. Gıda Zincirinde Gram Pozitif Koklar ve Önemi Gıda mikrobiyolojisi açısından, Staphylococcus, Enterococcus, Lactococcus, Leunostoc, Streptococcus, Pedicoccus ve Vagococcus en önemli gram pozitif kok bakteriler olarak bilinmektedir. Staphylococcus spp. ilk kez 1884 yılında Micrococcaceae familyası içerisinde tanımlanmıştır. Yeni klasifikasyonda ise stafilokoklar Staphylococcaceae familyası içerisinde yer almaktadır. Gıda güvenliği açısından bu familya içerisinde en önemli patojen tür Staphylococcus aureus olup, doğada yaygın olarak bulunmaktadır. S. aureus patojen bir tür olmasına karşın sağlıklı insanların burun mukozası ve deri doğal florasında sıkça rastlanan bir bakteridir (Erol, 2007). Enterococcus spp., taksonomide 1984 yılından önce Streptococcus cinsi altında yer almaktaydı dan sonra Thiercelin tarafından bu cinsin ilk tanımlaması yapılmış ve 1993 yılında Thiercelin ve Jouhaud tarafından Enterococcus olarak tanımlanmıştır. Daha önce Streptococcus faecalis ve Streptococcus faecium olarak bilinen bakteriler, yeni sınıflandırmada Enterococcus faecalis ve Enterococcus faecium olarak adlandırılmıştır (Klein, 2003; Doming ve ark., 2003). Lactococcus, laktik asit bakterilerinden olup, gram (+), katalaz (-), hareketsiz kok şeklindedir. Hücreleri küresel ve oval olup, tekli, ikili veya zincir şeklinde diziliş gösterebilmektedirler. Daha önce yapılan sınıflandırmamada Streptococcus cinsinin Lancefield serolojik N grubunda olan koklar, sonraki sınıflandırmada Lactococcus cinsine dahil edilmiştir. Bu cinse ait mikroorganizmaların herhangi bir enfeksiyon hastalığına neden olduğu saptanmamıştır. Lactococcus spp. asit oluşturabilmekte ve Cottage gibi çok yumuşak peynirler ile yayıkaltı, krema ve tereyağı üretiminde kullanılabilmektedir (Hayaloğlu ve Erginkaya, 2001). Leunostoc, kok veya oval şekilde, gram (+), spor oluşturmayan, katalaz (-), zincir ve grup şeklinde pleomorfik hareketsiz bakterilerdir. Çoğu türleri %3 hatta %6.5 tuz konsantrasyonuna dayanabilmektedirler. Optimum gelişme sıcaklıkları o C arası olup, fakültatif anaerob koşullarda aktivite gösterebilmektedirler. 7

20 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Naci Erhan YURDAKUL Heterofermantatif olan bu bakteriler, karbonhidratları parçalayarak laktik asit yanında asetik asit, etil alkol ve CO 2 meydana getirirler (Hayaloğlu ve Erginkaya, 2001). Streptococcus, gram pozitif, çoğu türü fakültatif anaerobik, oral Streptococcus türlerinin bazı suşları mikroaerofiliktir ve gelişimleri için karbondioksitli ortama ihtiyaç gösterirler. Streptococcus türleri çeşitli karbonhidratları fermantatif yolla kullanarak homofermantatif olarak gaz üretmeden laktik asit üretirler. Katalaz negatif, genellikle hareketsiz ikili veya zincir halinde dizilmiş kok şeklinde bakterilerdir. Streptococcus cinsine ait bakteriler serolojik presipitin reaksiyonlarına göre Lancefield tarafından A, B, C, D, E, F ve G gibi büyük harfle gösterilen serolojik gruplara ayrılmıştır(hayaloğlu ve Erginkaya, 2001). Laktik asit bakterilerinden Pedicococus, gram (+), hareketsiz, mikroaerofilik ve fermentatif, katalaz (-) kok şeklinde tekli, çiftli kısa zincir veya tetrad oluşturan bakterilerdir. Bu cinsin türleri, tuza dayanıklı homofermantatif türlerdir ve doğal olarak bitkilerde bulunur ve turşu, bira, şarap gibi fermente ürünlerin üretiminde kullanılmaktadır (Hayaloğlu ve Erginkaya, 2001). N grubu Lactococcus cinsinden ayrılan bir grup mikroorganizma Vagococcus olarak tanımlanmıştır. Gram (+), katalaz (-), hareketli (peritrik flagella) koklardır. Vagococcus türleri fermente süt ürünlerinin üretiminde starter olarak kullanılmaktadır Staphylococcus spp. İlk olarak 1878 yılında Robert Koch tarafından insan cerahatinde tanımlanan Staphylococcus lar, Pasteur tarafından 1880 yılında sıvı besiyerinde üretilmiştir. Ongston 1882 yılında bu mikroorganizmaları Staphylococcus olarak isimlendirmiş ve kobaylarda patojen olduğunu göstermiştir. Çoğalmaları esnasında birbirlerinden ayrılmayarak üzüm salkımına benzeyen, düzensiz kümeler oluşturmalarından dolayı bu isim kullanılmıştır (Kloos ve Bennerman, 1995). Rosenbach, 1884 yılında Staphylococcus ların ilk kez kültürünü yapmış ve karakteristik özelliklerini incelemiş. Katı besiyerinde beyaz ve sarı koloniler oluşturan iki farklı 8

21 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Naci Erhan YURDAKUL Staphylococcus tespit edilmiştir. Sarı koloni oluşturan mikroorganizmalara Staphylococcus aureus, beyaz koloni oluşturan mikroorganizmalara ise Staphylococcus albus adını vermiştir (Kloos, 1990). Baird-Parker yılında Staphylococcus ları koagülaz reaksiyonlarına göre üç tür olarak (Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus) tanımlamıştır. Daha sonraki yıllarda ise DNA homoloji çalışmaları, immunokimyasal ve biyokimyasal özellikler temel alınarak 22 tür daha tanımlanmıştır (Kutlu, 2006). Staphylococcus lar gram pozitif, katalaz pozitif, oksidaz negatif, hareketsiz ve sporsuz bakterilerdir. Gram pozitif kok görünümünde olan streptokokların stafilokoklardan laboratuvarda ayrımındaki en önemli farkları, streptokokların katalaz enzimlerinin olmamasıdır. Bazı suşlarında mikrokapsül bulunabilmektedir. Kolonileri düz parlak ve sirküler olup seçici olmayan besi ortamında 6-8 mm çapında olabilmektedir. Kolonilerin oluşturduğu pigment sarı bir zonla çevrili, sarı ve beyaz arasında değişmektedir. Sıvı besiyerlerinde homojen ve belirli bir bulanıklık oluşturmaktadır. Kanlı agarda saatte yuvarlak, düzgün, hafif konveks koloniler oluştururlar. Anaerobik koşullarda ve sıvı besiyerlerinde pigment oluşturmazlar (Karapınar ve Gönül, 1998). Stapylococcus aureus, fakültatif anaerop, seçici olmayan besiyerlerinde düz, parlak, dairesel, konveks koloniler oluştururlar. Genellikle koagülaz üreten S. aureus %10 a kadar olan NaCl konsantrasyonlarında iyi gelişirken, %15 NaCl konsantrasyonlarında gelişimi zayıftır. S. aureus suşları optimum o C de ve 7,0-7,5 ph da gelişirler. Glukoz, laktoz, maltoz ve mannitolden aerobik ve anaerobik koşullarda asit üretme özelliğine sahiptirler (Tunail, 2000; Tükel ve Doğan, 2000) Staphlococcus spp. nin Patojenitesi Stafilokoklar sıcak kanlı hayvanların vücut yüzeylerinde yaygın olarak bulunurlar. Bu mikroorganizmaların neden oldukları hastalıklar septisemi, stafilokokkal gıda zehirlenmesi gibi akut enfeksiyonlardır. S. aureus formları 9

22 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Naci Erhan YURDAKUL özellikle ekzotoksin ve aggresinlerle hastalık yapmaktadırlar (Brock ve Madigan 2006). S. aureus un yol açtığı enfeksiyonların büyük çoğunluğu, fronkül, sellülit, impetigo ve operasyon sonrası yara enfeksiyonları gibi cilt enfeksiyonlarıdır. Bu mikroorganizma bakteriyemi, pnömoni, osteomiyelit, akut endokardit, perikardit, serebrit, menenjit ve bir çok doku ve organda apse formasyonu gibi ciddi enfeksiyonlara yol açabilmektedir (Çakır 2007). S. aureus tarafından oluşturulan toksinler sindirim sisteminde etkisini gösterdiği için bunlara enteretoksin denilmiştir. Enterotoksinler pirojenik olarak ta bilinen immun sistem hücrelerine etkili, düşük molekül ağırlıklı ( Da) suda çözülebilen tek zincirli proteinlerdir. Enterotoksinler suşa özgü olmakla birlikte bir suş birden fazla toksin üretebilmektedir. Antijenik özellikleri dikkate alındığında enterotoksinler beş büyük serolojik gruba ayrılırlar (SEA, SEB, SEC, SED, SEE). Ayrıca son yıllarda yapılan araştırmalarla dokuz yeni enterotoksin tanımlanmıştır (SEG-O). Gıda zehirlenmelerine daha çok A ve D enterotoksinleri neden olmaktadır. Yapılan araştırmalarda enterotoksin A nın çoğunlukla insan kaynaklı suşlar tarafından üretildiği, enterotoksin C ve D nin ise diğer memelilerden izole edilen suşlar tarafından üretildiği belirtilmiştir (Normanno ve ark. 2005; Pinto ve ark. 2005; Villard ve ark ). S. aureus tarafından üretilen enterotoksinler sıcaklığa ve proteaz, tripsin, kimotripsin, papain, rennin gibi proteolitik enzimlere dirençli bir ekzotoksindir ve süperantijenik bir karakter taşırlar. Enterotoksin içeren gıdaların tüketiminden yaklaşık 2-6 saat sonra mide bulantısı, karın ağrısı, ishal gibi belirtiler görülür (Wang ve ark. 2003). Görülen diğer belirtiler baş ağrısı, terleme, üşüme, kramplar, düşük nabız, halsizlik ve şok durumlarıdır. Vücutta su kaybı oldukça fazladır. Hasta 1-2 günde normale dönmektedir. Genellikle tam iyileşme görülür. Enterotoksinlerin inaktivasyonu için gerekli ısıl işlem 100 o C de 1-3 saat veya 120 o C de dakika maruz bırakma olarak verilmektedir (Tükel ve Doğan 2000). 10

23 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Naci Erhan YURDAKUL Enterococcus spp. Enterococcus, aerobik ya da fakültatif anaerobik, katalaz negatif, kok şeklindedirler (Gelsomino ve ark., 2001). Besin gereksinimleri kompleks olup, gelişebilmeleri için gerek B vitaminleri ve gerekse bazı temel amino asitler açısından pek çok gram pozitif bakteriden daha fazla besin maddesine gereksinim duyarlar (Holt ve ark., 1994; Hayaloğlu ve Erginkaya, 2001). Bu bakteriler Lancefield D grubu içinde yer almaktadırlar (Giraffa, 2003). Laktozu fermente edebilirler, arabinoz pozitif ve pürivat negatiftirler (Willey ve ark., 1999). Karbonhidratları fermente ederek L (+) laktik asit oluştururlar ve bu özelliklerinden dolayı tipik homofermentatif laktik asit bakterileri olarak bilinirler, ancak gaz oluşturmazlar (Klein ve ark., 1998; De Vuyst, 2000; Doming ve ark., 2003; Linaje ve ark., 2004). Karbonhidrat metabolizmaları için Embden-Mayerof-Parnas yolunu kullanırlar (Morgen ve Hill, 2002). Akdeniz ülkelerinde birçok küçük işletmelerde, çiftlik ve yerel kasaplarda, geleneksel veya ev yapımı fermente et ürünlerinin üretimi, starter kültürler kullanılmadan, doğal floraya bağlı olarak gerçekleştirilmektedir. Ev yapımı bu ürünler yüksek ph ya sahip olmaları nedeniyle, Enterococcus lar için iyi bir gelişme ortamı sağlamaktadır. Böylece Enterococcus faecium ve Enterococcus faecalis bu ürünlerin fermantasyonu süresince yüksek sayılarda bulunabilmekte ve fermantasyona katkıda bulunmaktadır. Doğal yolla üretilen bu ürünler birçok ülkede eskiden beri beğenilerek tüketilmektedir (Hugas ve ark., 2003). Enterococcus faecium türleri çiftliklerde hayvanların gelişiminde ve hastalıkların önlenmesinde ve hayvan yemi üretiminde probiyotik olarak kullanılmaktadır (Devriese ve ark., 1995; Çakır ve ark., 2002). Hayvan yetiştiriciliğinde bu bakterilerin probiyotik olarak kullanılması hem hastalıklara karşı direncin, hem de hayvanların gelişiminin arttırılmasında pozitif sonuçlar vermektedir. Ayrıca ürettikleri ve diğer bakterilerin gelişmesini inhibe eden bileşikleri sayesinde intestinal kas tabakasında hızla çoğalarak patojenik bakterilere karşı ilk savunma tabakasını oluşturmaktadırlar (Yaman ve Esendal, 2004). 11

24 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Naci Erhan YURDAKUL Enterococcus faecium, hayvan beslenmesinde antibiyotiklerin kullanılmasına alternatif olarak gösterilmektedir (Hammes ve Hertel, 2001). Enterococcus faecium intestinal ve çevresel kontaminasyonla et ve süt ürünleri gibi hayvansal orijinli gıdalarda kolonize olmaktadır. Enterococcus faecium un aside olan toleransı ve indikatör olarak kullanılan koliformların aside karşı bu bakterilerden daha hassas olmaları nedeniyle Enterococcus faecium un gıdaların üretimi sırasında yetersiz hijyenik uygulamaların ve kontaminasyon seviyesinin tespitinde daha iyi sonuç vereceği bildirilmektedir (Birollo ve ark., 2001; Mannu ve ark., 2003). Bu organizmalar, gıda üretimi ile gıdaların dondurulması aşamalarında ve işletmelerde yetersiz sanitasyonu göstermede önemli indikatörler olarak kullanılmaktadırlar (Karapınar, 1995; Giraffa, 2002; Doming ve ark., 2003) Enterococcus spp. nin Patojenitesi Gıdalarda sıklıkla kullanılan Enterococcus faecium un virülans faktörleri tam olarak bilinmemektedir (Lukasova ve Sustackova, 2003; Semedo ve ark., 2003). Enterococcus faecalis in Enterococcus faecium dan daha fazla virulans faktör taşıdığı bildirmektedir (Franz ve ark., 2001). Enterococcus ların virulans faktörleri taşıyıcı dokusuna yapışma, invazyon, hemoliz, agregasyon maddeleri, fermente gıdalarda biyojenik amin üretimi ve gelatinase, hyaluronidase, cytolycin, Esp (enteroccal surface protein) gibi yüksek moleküler ağırlıklı ekstraselüler yüzey proteini ve diğer toksik maddeleri salgılamaları ile plazmid üretimi olarak sayılabilir (Giraffa, 2002; De Vuyst ve ark., 2003; Semedo ve ark., 2003). Enterococcus faecium un patojenitelerindeki en önemli faktör ise bu organizmaların antibiyotiklere karşı olan dirençleridir (Butaye ve ark., 1999; Franz ve ark., 2001). Antibiyotiklere karşı direnç hem doğal olarak bulunabilmekte, hem de antibiyotiğe karşı duyarlı türlerin yeni genler kazanması ya da mutasyona uğramaları sonucunda sonradan da kazanılabilmektedir. Enterococcus faecium türlerinin virulansı kullanılan antibiyotiklere olan direnç nedeniyle artmaktadır (Giraffa, 2002; Ünlü ve ark., 2002; Lukasova ve Sustackova, 2003). 12

25 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Naci Erhan YURDAKUL Enterococcus larda hemolitik aktivite ise, önemli virulans faktör olarak ortaya çıkmaktadır (Linaje ve ark., 2004). Beta-hemoliz daha çok Enterococcus faecalis ve Enterococcus faecium türlerinde meydana gelmektedir. Hemolitik aktivitenin bulunmaması süt ürünlerinde kullanılacak bakteriyosin üreten starter kültürleri için bir seçim kriteridir. Ancak bir suşun hemolitik aktiviteye sahip olmaması bu suşun virulans özellik taşımadığını göstermemektedir (De Vuyst ve ark., 2003) Bakterilerin Antibiyotik Direnç Mekanizmaları Direnç, bir bakterinin antimikrobiyal bir ajanın öldürücü veya çoğalmayı durdurucu etkisine karşı koyabilme yeteneğidir. Direnç gelişimi ve yayılımı genellikle gereksiz ve uygunsuz antibiyotik kullanımına bağlanmakla birlikte 1940 lı yıllarda antibiyotiklerin kullanılmadığı bazı adalarda toprak ve dışkı örneklerinde tetrasiklin ve streptomisine dirençli bakteriler bulunduğu; antibiyotik direncinin yalnızca yaygın antibiyotik kullanımı sonucu ortaya çıkmadığı, bakterilerinin olumsuz çevre koşullarında yaşamını sürdürmek için kullandığı savunma sürecinin bir parçası olduğu da belirtilmektedir. Ancak antibiyotiklerin yoğun şekilde kullanıma girmesiyle birlikte yıllar içinde farklı ve gittikçe artan sayıda dirençli mikroorganizmalar ortaya çıkmış ve bunlarla oluşan enfeksiyonların tedavisinde büyük sorunlar yaşanmaya başlanmıştır. Günümüzde tüm dünyada bir yandan hızla yeni ilaçlar geliştirilmekte, diğer yandan bunlara süratle direnç kazanan mikroorganizmaların neden olduğu enfeksiyonlar artmakta ve sorunun boyutları giderek büyümektedir. Dirençler doğal direnç, kazanılmış direnç ve çapraz direnç olmak üzere üç çeşittir. Doğal Direnç: Bakteriler antibiyotiklere doğal olarak dirençli olabilir. Bu tür direnç bakterinin temel özelliğidir ve ilaç kullanımı ile ilişkisi yoktur kalıtsal değildir. Doğal direnç, bu mikroorganizmaların tür özelliği olarak ilacın hedefi olan yapıyı taşımamalarının veya ilacın yapısal bir özellikten dolayı hedefine 13

26 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Naci Erhan YURDAKUL ulaşmamasının bir sonucudur. Örneğin ilacın dış membrandan geçmemesi nedeniyle gr (-) bakteriler vankomisine doğal olarak dirençlidir. Kazanılmış Direnç: Bir bakteri genetik özelliklerindeki değişimlere bağlı olarak eskiden duyarlı olduğu bir antibakteriyel ajandan etkilenmeyebilir. Bu durumda o bakteri direnç kazanmış olur. Genetik kaynaklı direnç kromozomal veya kromozom dışı maddelere bağlı olabilir. Kromozomal direnç, bakteri kromozomunda kendiliğinden (spontan) oluşan mutasyonlar sonucu ortaya çıkar. Spontan mutasyonlar bazı fiziksel ve kimyasal faktörlerle oluşabilir ve sonuçta bakteri hücresinde yapısal değişimler oluşur. Böylece hücrenin ilaca permealibitesi azalabilir veya hücre içinde ilacın hedefinde değişiklikler olabilir. Ekstrakromozomal direnç, çeşitli yollarla aktarılan plazmid, transpozon ve integron adı verilen genetik elemanlara bağlıdır. Plazmidler, bakterilerde antibiyotik uygulamasından önce var olan ve kromozomdan bağımsız olarak replike olabilen ekstrakromozomal DNA parçacıklarıdır. R (rezistans) faktörleri bir ya da birkaç antimikrobiyal ilaca ve ağır metallere karşı direnç genlerini taşıyan plazmidlerdir. Plazmid genleri, genellikle ilaçları parçalayan enzimlerin üretilmesinden sorumludurlar. Transpozonlar ise bakteri kromozomunun değişik yerlerine yerleşebilen veya kromozomdan plazmide, plazmidden plazmide, plazmidden DNA veya bakteriyofaja aktarılabilen; kendi kendilerine replike olamayan, o nedenle kromozom, plazmid veya bakteriyofaj gibi bir replikon üzerinde bulunan DNA dizileridir. Direnç genlerini taşıyan genetik materyal ve plazmidler bir bakteriden diğerine transdüksiyon, transformasyon, konjugasyon ve transpozisyon gibi mekanizmalarla aktarılırlar. Kromozom veya plazmid üzerindeki direnç genleri, bakterinin bölünmesi ile yavru hücrelere aktarılır (vertikal geçiş). Bu yeni hücrelerin çoğalması ile de dirençli suşun ve direnç genlerinin yayılımı gerçekleşir (klonal yayılım) Plazmidler konjugasyon ile de yatay olarak aktarılabilir. Konjugasyon, iki bakteri hücresinin teması sonucunda genetik eleman aktarımıdır ve türler arası plazmid aktarımı nın in vivo koşullarda da oluşabilmesi önem taşımaktadır. Ayrıca direnç plazmidleri Gram (+) ve (-) bakteri türleri arasında 14

27 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Naci Erhan YURDAKUL da aktarılabilirler. Direnç genlerinin yeni konaklara aktarımında tek mekanizma plazmid transferi değildir. Transpozisyon ile transpozon veya transpozabl elementler diye bilinen kısa DNA sekansları aktarılabilir. Özellikle Gram (+) bakterilerde bulunan konjugatif transpozonlar, plazmid olmaksızın gen aktarımını sağlayabilir. Son yıllarda direnç genlerinin özellikle transpozonlarca taşındıkları anlaşılmıştır. Bir diğer önemli nokta ise bu tip aktarım olaylarının düşük yoğunluklu antibiyotik varlığında hızlanmasıdır. Transformasyon, ortamda serbest bulunan DNA nın bakteri hücresi içine alınması olup bu şekilde de direnç genleri aktarılabilir. Neisseria türleri ve streptokoklarda patojen ve nonpatojen türler arasında gen aktarımı sonucu penisilin başlayan protein (PBP) değişimlerinin transformasyon ile gerçekleştiği düşünülmektedir. Transdüksiyon ise direnç genlerinin bakteriyofaj aracılığı ile transferi olup, sıklıkla laboratuvar koşullarında direnç aktarımı için uygulanır. Bu aktarımın klinik direnç açısından önemi bilinmemektedir. Kromozom veya plazmid üzerindeki antibiyotik direnç genlerinin birbirleri ile bağlantılı olduğu ve başlangıç bölgesinin yakınında özel integrasyon birimleri bulunduğu gizlenmiştir. Bunlara integron adı verilir. İntegronlar rekombinasyonun çok sık görüldüğü sıcak noktaları oluştururlar. Çapraz Direnç: Belli bir ilaca karşı dirençli olan bazı mikroorganizmaların, aynı veya benzer mekanizma ile etki eden diğer ilaçlara karşı da dirençli olma halidir. Bu durum genellikle yapıları benzer ilaçlar arasında gözlenmektedir. Erythromycin, neomiycin, kanamiycin gibi. Ancak bazen tümüyle ilgisiz ilaçlar arasında da görülebilir. Eritromisin-linkomisin arasındaki çapraz direnç buna örnek olarak verilebilir. Kromozomal veya ekstrakromozomal orijinli olabilir (Yüce, 2001). Antibiyotiklerin klinikte kullanımı enfeksiyonlu hastalıkla meydana gelen ölüm oranları önemli bir azalma sağlamıştır. Antibiyotikler cerrahi müdahele ve kanser terapisinde derin bir etkiye sahiptir (Ammor ve ark., 2007). Antibiyotiklerin kullanımı hayvansal ilaçlara da yayılmıştır. Hayvansal üretimde, hayvan ve bitki hastalıklarından korunmak için tarımda koruyucu ve iyileştirici olarak antibiyotikler kullanılmaktadır (Martins da costa ve ark.,2006; Ammor ve ark., 2007). 15

28 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Naci Erhan YURDAKUL 1990 yılında Hollanda da 80 bin kg antibiyotik insanda, 300 bin kg ise hayvanlar için veteriner reçetelerinde kullanılmıştır. Antibiyotik kullanımı vücut ağırlığı yaş,ve aktif madde açısından hesaplandığında her iki populasyonda da eşdeğerdir (Van den Bogaard ve 2002). Son 60 yıl civarında biyosfere 1-10 milyon ton antibiyotik bırakılmış olduğu tahmin edilmektedir(european Commision, 2005). Bu durum dirençli türlerin ortaya çıkmasında güçlü bir baskı oluşturmaktadır. Dünyada antibiyotiklerdeki mikrobiyal direnç, insanda ve veteriner ilaçlarında önemli bir problemdir. Genellikle Antibiyotik kullanımının yayılımı antibiyotik direçlerindeki artış için temel risk faktörü olduğu kabul edilmektedir. Bu durum insan ve hayvanlarda direnç genleri ve bakteri dirençlerinin yayılımı ve ortaya çıkması için öncülük etmektedir (Lukasova ve Sustackova, 2003). Dirençler bir bakteri türü için doğal ya da kazanılmış, ya başka bir bakteriden diğerine geçmiş yada bir çok ardışık mutasyonlar ya da genlerin birleşmesiyle oluşmuş olabilir (Amor ve ark..2007). Antibiyotik direnci farklı mekanizmalardan biri tarafından başarılabilir Bunlar; Antibiyotiğin dışa salınımını arttırmak, Antibiyotik hedefinin modifikasyonu ya da inaktivasyonu, Gen transferi ile yeni bir antibiyotik direncinin tanıtımı, Antibiyotiğin hidrolizi, Antibiyotiğin modifikasyonu, Antibiyotik aktivasyonunun önlenmesi ve Antibiyotiğin alımını azaltmak (Ammor ve ark., 2007) Staphylococcus spp. nin Antibiyotik Direnci Stafilokoklar hekimliğin büyük sorunlarından biri olma özelliğini korumaktadır. Antimikrobiklere karşı değişik mekanizmalarla etkili bir direnç oluşturan bu bakterinin neden olduğu enfeksiyonların tedavisi özen ister. Metisilin e direnç adı altında beta-laktam antibiyotiklerin çok büyük bir bölümü ve ayrıca diğer gruplarda bazı antibiyotikleri etki spektrumu içine alan intrinsik direnç, bugün bir 16

29 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Naci Erhan YURDAKUL sorun haline gelmiştir. Çoğul dirençli stafilokok denilen bu bakterilerin neden olduğu enfeksiyonlar gitgide artan sıklıkta görülmektedir (Yüce, 1992). Staphylococcus larda esas sorun son yıllarda giderek artan oranlarda görülen metisilin direncidir yılında ABD de, nozokomiyal enfeksiyonlardan izole edilen susların %15 inin metisiline dirençli oldugu belirtilmistir. Diger gelismis ülkelerde de bu oran benzerdir. Ülkemizde yapılan çalısmalarda ise bu oran %16-52 arasında degismektedir. S. aureus larda antibiyotiklere direnç kazanma yetenegi, antibiyotiklerin kullanılmasından hemen sonra gözlenmistir (Duman, 2007). S. aureus lar, diger mikroorganizmaların pek çoguna göre, antimikrobiyal ajanlara daha fazla direnç gösterirler. Özellikle MRSA larda multiresistanslıga daha fazla rastlanır ve önem kazanır. Bir çok çalısmada MRSA ların gentamisin, tobramisin, netilmisin, streptomisin, eritromisin (%90), tetrasiklin (%86), minosiklin (%76), trimetoroprimsulfametasaksazol (%69), klindamisin (%60), kloramfenikol (%39), rifampisin (%26), siprofloksasin (%17), fusidik asit (%12), gibi pek çok antibiyotige dirençli oldugu vurgulanmıstır (Duman, 2007). Daha önce de vurgulandıgı gibi metisiline dirençli Staphylococcus lar tüm betalaktam antibiyotiklere kesinlikle dirençli olmaları yanında makrolidler, linkozamidler, kinolonlar, tetrasiklin ve aminoglikozidler gibi birçok antibiyotige de yüksek oranlarda direnç göstermektedirler. Staphylococcus lardaki metisilin direnç oranları özellikle hastane kökenlerinde çok yüksektir. Ortalama %50 civarında olan bu direnç yogun bakım ünitesi gibi yerlerde %80-90 lara kadar çıkabilmektedir (Duman, 2007). Bu tür Staphylococcus ların duyarlı oldukları tek antibiyotik grubu çogunlukla glikopeptit antibiyotiklerdir. Günümüzde klinik kullanımda olan iki glikopeptit antibiyotik bulunmaktadır. Bunlar vankomisin ve teikoplanindir (Duman, 2007). Vankomisin, penisilinaz üreten veya üretmeyen, metisiline duyarlı veya dirençli tüm Staphylococcus kökenlerine etkilidir. Ancak, daha önce de belirtildigi gibi henüz çok yaygın olmasa da vankomisine dirençli S. aureus kökenleri saptanmaya baslamıstır yılında klinik kullanıma giren vankomisinin ilk yıllarda sık görülen yan etkileri daha sonraki yıllarda ilacın saflastırılmasıyla çok aza 17

30 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Naci Erhan YURDAKUL indirilmistir. Gram pozitif bakterilere çok güçlü etkinligi olan vankomisinin aerop veya anaaerop gram negatif bakterilere karsı etkinligi yoktur. Bu nedenle vakomisinin majör kullanım alanı metisiline dirençli ciddi Staphylococcus enfeksiyonlarıdır (Duman, 2007). Teikoplanin, yapısal olarak vankomisine çok benzeyen bir baska glikopeptit antibiyotiktir. Etki alanı vankomisin gibidir. Metisiline duyarlı ve dirençli tüm Staphylococcus lara etkindir. S. aureus a etkisi vankomisine göre esit veya biraz daha azdır. Ancak KNS lere karsı etkinligi vankomisine göre daha azdır. Hem intravenöz, hem de intramüsküler kullanılabilmesi, daha uzun yarılanma ömrü nedeniyle günde iki kez, hatta tek doz kullanım olanağının bulunması vankomisine üstünlükleridir. Nefrotoksisite olasılıgı da vankomisine göre daha azdır. Buna karsın, KNS lere karsı etkinliginin vankomisine göre daha az olması en önemli dezavantajıdır. Kullanım alanları vankomisinde oldugu gibi metisiline dirençli ciddi Staphylococcus enfeksiyonlarıdır (Duman, 2007) Enterococcus spp. nin Antibiyotik Direnci Enterococcus cinsi bakteriler genellikle düşük virulansa sahip olmalarına rağmen, Enterococcus faecium ve Enterococcus faecelis kullanılan antibiyotiklere karşı dirençli olmaları nedeniyle, klinik terapilerde önemli problemlere neden olmaktadır (Panagea ve Chadwick, 1996; Giraffa ve ark., 2000; Bodil ve ark., 2002; Peters ve ark., 2003). Amerika da sağlıklı bireylerin ortalama % 5-20 sinde Enterococcus kolonizasyonu ya da enfeksiyonu rapor edilmiştir (Namdari, 1998). Enterococcus faecalis enfeksiyonların % ından sorumlu iken, Enterococcus faecium ise % 5-15 inden sorumlu olduğu bildirilmiştir (El-Din ve ark., 2002; Erdem ve ark., 2004). Amerika da Enterococcus faecium, hastane enfeksiyonlarına en sık neden olan ikinci bakteridir (Wegener ve ark., 1997; Klare, 2003). Bu bakteriler klinik uygulamalarda kullanılan bir çok antibiyotiğe karşı dirençlidirler (Lukasova ve Sustackova, 2003). Bazı kaynaklarda Enterococcus faecium un antibiyotiklere karşı Enterococcus faecalis ten daha dirençli olduğu belirtilmektedir (Quednau ve ark., 1999). 18

31 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Naci Erhan YURDAKUL 1980 li yılların sonunda ilk defa glikopeptidlere karşı dirençli Enterococcus (GRE) tespit edilmiş ve bunun neden olduğu enfeksiyon güçlükle tedavi edilebilmiştir (Peters ve ark., 2003). Vankomisin ve teicpoplanine karşı direnç, gıda kaynaklı Enterococcus lar arasında en sık izole edilen direnç fenotipidir (Giraffa, 2002). Enterococcus faecium ve Enterococcus faecalis bu glikopeptidlere karşı direnç kazanmışlardır (Willey ve ark., 1999; Başustaoğlu ve ark., 2001). Teicoplanin ve Vankomisin gibi glikopeptidlerin önemi, çoklu ilaç direnci gösteren türlere ya da penicilin, ampicillin gibi antibiyotiklere karşı alerji gösteren kişilerin klinik tedavisinde kullanılmalarından kaynaklanmaktadır (Giraffa, 2002). Bu antibiyotikler immun sistemi zayıf ya da bastırılmış bireylerde birkaç enfeksiyona karşı en son çare olarak kullanılan antibiyotiklerdir (Salminen ve ark., 1998). Bu nedenle Vankomisin e dirençli Enterococcus lar (VRE) halk sağlığı için global bir tehdit olarak ortaya çıkmaktadır (Gelsomino ve ark., 2003). VRE ler çoklu ilaç direnci gösteren bakterilerin yol açtığı enfeksiyonların tedavisinde ve vancomyicin ile tedaviye ihtiyaç duyulan hastalarda tedavinin başarısız olmasına neden olmaktadırlar (Lukasova ve Sustackova, 2003). Bu nedenle hastanelerde Vankomisin e dirençli Enterococcus ların ortaya çıkması endişe vermektedir (Gelsomino ve ark., 2003). VRE lerin sebep olduğu enfeksiyonlar, Avrupa ve Amerika da önemli bir problem haline gelmiştir (Eaton ve Gasson, 2002; Barton ve Gary, 1995). Son yıllarda Enterocccus faecium en sık ortaya çıkan VRE olarak tanımlanmaktadır (Roberts, 1997; Salminen ve ark., 1998; De Vuyst ve ark., 2003). Vankomisin e dirençli Enterococcus faecium (VREF) suşları, hastane ortamları, insanlar, hayvansal kaynaklar, akuatik habitatlar ve tarımsal ürünlerden izole edilmiştir (Lukasova ve Sustackova, 2003). Yapılan çalışmalar Vankomisin e yüksek derecede direnç gösteren Enterococcus faecium suşlarının hayvansal orjinli gıdalarda bulunduğunu göstermiştir (Robredo ve ark., 2000). Vankomisin e dirençli Enterococcus faecium suşları lağım suları ile sulanmış bitkiler, atık sular ve dışkılar gibi çeşitli kaynaklardan çevresel kontaminasyon yoluyla gıdalara ulaşabilmektedir (Giraffa, 2002). Kesim yerlerindeki kötü hijyen koşulları sonucunda karkaslar fekal kontaminasyonla kontamine olarak hayvansal gıdalar bu dirençli türler için bir vektör 19