Syphilis Total Ab 1 plaka - 96 72530 5 plaka - 480 72531

Syphilis Total Ab 1 plaka - 96 72530 5 plaka - 480 72531 ENZİM İMMÜNO TEST TEKNİĞİ KULLANARAK İNSAN SERUMUNDA VEYA PLAZMASINDA TREPONEMA PALLIDUM ANTİ BADİSİNİN KALİTATİF TESPİT KİTLERİ 883679-2014/11 [TR] 1

İÇİNDEKİLER 1. KULLANIM AMACI... 3 2. TESTİN ÖZETİ VE AÇIKLAMASI... 3 3. PROSEDÜRÜN PRENSİPLERİ... 3 4. REAKTİFLER... 4 5. UYARILAR VE ÖNLEMLER... 5 6. ÖRNEKLER... 6 7. PROSEDÜR... 7 8. TEST KISITLAMALARI... 9 9. PERFORMANS KARAKTERİSTİKLERİ... 10 10. BİBLİYOGRAFİ VE REFERANSLAR.... 13 [TR] 2

1. KULLANIM AMACI Bu kitler, uygun eğitime ve niteliğe sahip personel tarafından insan serumunda ve plazmasında Treponema pallidum antibadilerinin kalitatif tespitine yöneliktir. Ürün, kan donörlerinin taranmasında ve sifilis enfeksiyonundan şüphelenilen hastalara teşhis konulmasına yardımcı olmak için kullanılabilir. 2. TESTİN ÖZETİ VE AÇIKLAMASI Sifilis, farklı enfeksiyon aşamalarından; birinci, ikinci, üçüncü ve dördüncü aşamalardan geçerek ilerleyen kronik bir enfeksiyondur. Bu aşamalar farklı klinik semptomlar oluşturur; tipik olarak önce şankr olarak bilinen ilk yaralara, daha sonra ise sifilitik döküntülere ve bunu takip eden uzun durgunluk sürelerine yol açar. Tedavi edilmeyen enfeksiyon nihai olarak kardiyovasküler sorunlara ve nörosifilize yol açabilir. Enfeksiyona genellikle spirochaete Treponema pallidum yol açar ve çoğunlukla cinsel temas ile bulaşır ancak enfekte kan nakli yoluyla da bulaşabilir. Anne karnında bebeğe geçiş de gerçekleşir. Organizmanın yapay ortamda üretilmesi neredeyse imkansızdır ve enfeksiyonun teşhisi çoğunlukla ilk enfeksiyondan kısa süre sonra ortaya çıkan ve uzun yıllar boyunca varlığını koruyabilen kandaki anti badilerin gösterilmesine bağlıdır. Sifilis testleri dört kategoriye ayrılır: doğrudan mikroskobik muayene, treponemal anti badi testleri, tereponemal olmayan anti badi testleri ve doğrudan antijen testleri. Uzun süre durağan kalmaya ve treponemal olmayan testlerin nonspesifik yapısına bağlı olarak, kan örneklerindeki spesifik antitreponemal anti badileri algılayan yöntemler tarama için gittikçe daha popüler hale gelmiştir. Syphilis Total Ab, böyle bir testtir. 3. PROSEDÜRÜN PRENSİPLERİ Syphilis Total Ab bir sandviç testteki üç rekombinant antijeni kullanır. Antijenler T. pallidum'a özgü IgG, IgM, ve IgA'yı tespit ederek testin enfeksiyonun bütün aşamalarında anti badileri tespit etmesine olanak sağlayacaktır. Çukurcuklar 15Kd, 17Kd ve 47Kd T. pallidum rekombinant antijenleri karışımı ile kaplıdır. Örneğin inkübe edildiği bir çukurcuğa konjuge edildiğinde serumdaki veya plazmadaki spesifik anti badiler bu antijenlerle ve kara turp peroksidaza konjuge olan aynı antijenlerle birleşir. Reaksiyona girmeyen materyal yıkanarak temizlendikten sonra, örnekte spesifik anti badilerin mevcut olduğunu gösteren bağlı enzimin mevcudiyeti substratın/kromojen karışımının renk değiştirmesi ile ortaya çıkar. Rengin kontrol çukurcuklarındaki renge kıyasla yoğunluğu spesifik anti badilerin mevcut olup olmadığını belirlemek için karşılaştırılır. [TR] 3

R1 R2 4. REAKTİFLER Etiket üzerindeki tanıtıcı 4.1. Açıklama Microplate Concentrated Washing Solution (20X) Açıklama Mikro Plaka Her biri 8 çukurcuktan oluşan 12 şerit, T. pallidum rekombinant Antijenler (rag) ile kaplı Spesifik ID numarası = 97 Konsantre Yıkama Çözeltisi (20X) Tris NaCl Tampon ph 7,4 Koruyucu: ProClin 300 (%0,04) Sunum / hazırlama 72530 1 plaka 70 ml Seyreltilecek Sunum / hazırlama 72531 5 plaka 235 ml Seyreltilecek R3 Negative control Negatif kontrol BSA (Bovin Serum Albümin) içeren Tris Tamponu Koruyucu: ProClin 300 (%0,1) 2,1 ml 2,1 ml R4 Positive control Pozitif kontrol (İnsan) T.pallidum için anti badiler içeren, HIV1/2, HBs Ag ve HCV için negatif olan, BSA (Bovin Serum Albümin) içeren bir Tris tamponunda seyreltilmiş insan serumu Koruyucu: ProClin 300 (%0,1) 1,6 ml 1,6 ml R6 Conjugate Konjuge T.pallidum rag / Peroksidaz Koruyucu: ProClin 300 (%0,05) 8 ml 30 ml R8 Substrate buffer Substrat tamponu H 2 O 2 (%0,015) ve DMSO (%4) içeren sitrik asit ve sodyum asetat çözeltisi ph 4,0 60 ml Tekrar sulandırılacak 60 ml Tekrar sulandırılacak R9 Chromogen: TMB solution (11X) Kromojen: TMB çözeltisi (pembe) 3,3, 5,5 tetrametilbenzidin (TMB) içeren çözelti 5 ml Seyreltilecek 5 ml Seyreltilecek R10 Stopping solution Durdurma Çözeltisi Sülfürik asit çözeltisi (H 2 SO 4 1N) 28 ml 28 ml 4.2. Saklama ve kullanma için gerekenler Bu kit +2-8 C arasında saklanmalıdır. Kitin +2-8 C arasında korunan her kalemi (aksi ifade edilmediği takdirde) ambalaj üzerinde belirtilen son kullanma tarihine kadar kullanılabilir. Açıldıktan sonra ve kontaminasyon söz konusu olmadığı takdirde, +2-8 C arasında saklanan R3, R4, R6, R8, R9 ve R10 reaktifleri etikette gösterilen son kullanma tarihine kadar kullanılabilir. [TR] 4

Tanımlama R1 R2 R8+R9 Saklama +2-8 C arasında saklanan mikro çukurcuk şeritleri vakumlu torba açıldıktan sonra dikkatle yeniden kapatılan orijinal torbalarında 1 ay boyunca kullanılabilir. Seyreltilmiş yıkama çözeltisi 2 hafta boyunca +2-30 C arasında saklanabilir. Konsantre yıkama çözeltisi (R2) +2-30 C arasında saklanabilir. Yeniden sulandırma sonrasında, karanlıkta saklanan reaktifler oda sıcaklığında (18-30 C) 6 saate kadar kullanılabilir. 5. UYARILAR VE ÖNLEMLER Yalnız in vitro teşhis içindir. Yalnız sağlık profesyonelleri tarafından kullanılmak içindir. 5.1. Sağlık ve Güvenlik önlemleri: Bu test kiti sadece laboratuar prosedürleri konusunda eğitimli ve olası tehlikeleri bilen kalifiye personel tarafından kullanılmalıdır. Uygun kıyafetler, eldivenler ve göz/yüz koruma kullanın ve İyi Laboratuar uygulamaları kurallarına uygun şekilde çalışma yapın. Test kiti insan kanı bileşenleri içerir. Reaktiflerin hazırlanmasında kullanılan insan kaynaklı materyaller test edilmiştir ve hepatit B yüzey antijeni (HBs Ag), insan immün yetmezliği (HIV- 1 ve HIV-2) virüslerine karşı anti badiler ve hepatit C virüsüne (HCV) karşı anti badiler için reaktif olmadıkları bulunmuştur. Bilinen hiçbir test yöntemi enfeksiyona yol açan maddelerin yokluğunu tam garanti edemez. Bu nedenle tüm insan kanı türevleri, reaktifler ve insan kanı örnekleri, enfeksiyon hastalık bulaştırma kapasitesine sahip olarak kullanılmalı, yerel, bölgesel ve ulusal yönetmeliklerde tanımlanmış kan yoluyla bulaşan patojenler için Evrensel Önlemler alınarak kullanılmalıdır. Biyolojik döküntüler: İnsan kaynaklı malzemeler döküldüğünde, potansiyel bulaşıcı oldukları kabul edilmelidir. Asit içermeyen döküntüler derhal kontaminasyondan arındırılmalıdır: Döküntü gerçekleşen bölge, malzemeler ve kontaminasyona maruz kalan yüzeyler ve ekipmanlar, dökülen numunelerin içerebileceği potansiyel biyolojik tehlikeler üzerinde etkili olan uygun bir kimyevi dezefektan (1:10 seyreltilmiş çamaşır suyu, %70-80 Etanol veya İzopropanol ve iodofor örn. %0,5 Wescodyne Plus, vd.) ile kontaminasyondan arındırılmalı, ardından silinerek kurulanmalıdır. Asit içeren döküntüler uygun bir şekilde emilmeli (silinmeli) veya nötralize edilmeli, alan suyla yıkanmalı ve silinerek kurutulmalıdır; döküntüyü temizlemek için kullanılan malzemeler biyolojik atık işlemine tabi tutulması gerekebilir. Daha sonra, bu alan kimyasal dezenfektanlardan biri ile kontaminasyondan arındırılmalıdır. NOT: Çamaşır suyu içeren çözeltileri otoklava koymayın! Tüm örnekleri ve test için kullanılan malzemeleri enfeksiyon unsuru içeriyormuşçasına bertaraf edin. Laboratuar kimyasalları ve biyolojik olarak tehlikeli atıklar yerel, bölgesel ve ulusal yönetmeliklere uygun şekilde atılmalıdır. Bu test kitinde bulunan kimyasal komponentlerle ilgili tehlikeler ve bunlardan korunma yöntemleri konusunda öneriler için lütfen etiketler üzerinde bulunan ve ayrıca bu kullanım talimatlarının sonunda yer alan resimli grafiklere başvurun. Güvenlik Veri Sayfası www.bio-rad.comadresinde bulunabilir. [TR] 5

5.2. Prosedüre ilişkin önlemler 5.2.1. Hazırlama Sonuçların güvenilirliği aşağıdaki İyi laboratuar Uygulamalarının uygulanmasına bağlıdır: Son kullanma tarihi geçmiş reaktifleri kullanmayın. Bir test çalışması içinde farklı lotlardan gelen reaktifleri karıştırmayın veya ilişkilendirmeyin. Kullanmadan önce, reaktiflerin oda sıcaklığında (18-30 C) stabilize olması için 30 dakika bekleyin. Testin adı ile test için spesifik tanımlama numarası her mikroplakanın çerçevesinde yazılıdır. Bu spesifik tanımlama numarası ayrıca her şeritin üzerinde belirtilir. Syphilis Total Ab: Spesifik ID numarası = 97 Kullanmadan önce spesifik tanımlana numarasını doğrulayın. Tanımlama numarası eksikse ya da test edilecek analize karşılık gelen numaradan farklı ise, şerit kullanılmamalıdır. AÇIKLAMA: Yıkama çözeltisi (R2, etiket tanımlama: 20X yeşil renkli), peroksidaz substrat tamponu (R8, etiket tanımlama: TMB tamponu, mavi renkli), kromojen (R9, etiket tanımlama: TMB 11X, mor renkli) ve durdurma çözeltisi (R10, etiket tanımlama: 1N kırmızı renkli) için, belirli bir test çalışmasında aynı lotun kullanılması kaydıyla kitte bulunanlardan başka lotlar kullanılabilir. Bu reaktifler şirketimizin bazı diğer ürünleriyle kullanılabilir. Ayrıntılı bilgi için teknik servisimize ulaşın. Reaktifleri kontaminasyona sebep olmadan dikkatle sulandırın. Deiyonize su ile güzelce yıkanmış ve durulanmış cam kaplar veya tercihen tek kullanımlık kaplar kullanın. Mikro plakanın yıkama işleminin sonu ile reaktif dağıtımı arasında kurumasına izin vermeyin. Enzim reaksiyonu metal iyonlarına karşı çok hassastır. Buna bağlı olarak, çeşitli konjuge veya substrat çözeltilerinin herhangi bir metal ile temas etmesine izin vermeyin. Geliştirme çözeltisi (substrat tamponu + kromojen) pembe renkli olmalıdır. Bu pembe rengin sulandırmadan sonra birkaç dakika içerisinde değişmesi reaktifin kullanılamayacağı ve değiştirilmesi gerektiği anlamına gelir. Geliştirme çözeltisi, temiz tek kullanımlık plastik tepside veya önceden 1N HCl ile yıkanmış ve distile su ile tamamen çalkalanmış ve kurutulmuş cam kapta hazırlanabilir. Bu reaktif karanlıkta saklanmalıdır. Konjuge ve geliştirme çözeltisinin dağıtımı için asla aynı kabı kullanmayın. 5.2.2. İşleme Test prosedürünü değiştirmeyin. Testleri reaktif buhar (asit, alkalin, aldehit buharları) veya konjugenin enzim aktivitesini değiştirebilecek tozların bulunduğu ortamlarda yapmayın. Her örnek için yeni dağıtım ucu kullanın. Çukurcuk yıkaması bu prosedürün kritik bir adımıdır: tavsiye edilen sayıda yıkama döngüsüne uyun ve tüm çukurcukların önce tamamen dolduğundan, sonra tamamen boşaldığından emin olun. Yanlış yıkamalar doğru olmayan sonuçlara yol açabilir. Maksimum test performansını elde etmek için tarif edilen yıkama prosedürlerini dikkatle takip edin. Negatif numune için kabul edilebilir bir optik yoğunluk altyapısı elde etmek amacıyla yıkama prosedürünün bazı araçlar ile iyileştirilmesi (yıkama adımı döngüsü sayısının ve/veya her döngü için yıkama tamponu hacminin artırılması) gerekebilir. Uyarlamalar ve özel prosedürler için şirketimize ulaşın. 6. ÖRNEKLER Güncel uygulamalara göre bir kan numunesi alın. Testler, (EDTA, Sodyum Sitrat, Sodyum Heparin veya ACD üzerinde toplanan) seyreltilmemiş serum veya plazma üzerinde gerçekleştirilmelidir. Agregalar içeren örnekler test öncesinde santrifüj ile arıtılmalıdır. Numuneler, test 7 gün içerisinde gerçekleştirilecekse +2-8 C'de, daha uzun süreler için ise -20 C'de saklanmalıdır. Beşten fazla dondurma/eritme döngüsü tekrarlamayın. 1/2 saat boyunca 56 C'de ısıl işlem gören numuneler kullanılabilir. [TR] 6

En fazla 120 g/l albümin, 200 mg/l bilirubin, 33 g/l triolein veya 2 g/l of hemoglobin içeren numuneler sonucu etkilemez. Bununla beraber, hiperlipemik veya hiperhemolize serum veya plazma kullanılması önerilmez. Numuneler test edilmeden önce eritilmelidir ve iyice karıştırılmalıdır. Numuneler nakledilecekse, etiyolojik ajanların taşınmasıyla ilgili olarak geçerli düzenlemeler uyarınca paketlenmelidir ve tercihen donmuş halde nakledilmelidir. 7. PROSEDÜR 7.1. Gerekli olan ama sağlanmamış malzemeler Distile su. Sodyum hipoklorit (çamaşır suyu) ve sodyum bikarbonat. Emici kağıt. Tek kullanımlık eldivenler. Koruyucu gözlük. Tek kullanımlık tüpler. Otomatik veya yarı otomatik, ayarlanabilir veya önceden ayarlı, pipetler ya da çoklu pipetler, 50 μl, 1 ml ve 10 ml ölçmek ve vermek için. 100 ml ve 1L kapasiteli dereceli silindirler. Otomatik, yarı otomatik veya manuel mikro plaka yıkama sistemi (*). Termostatik olarak 37 C±1 C şeklinde ayarlanmış mikro plaka inkübatörü (*). Biyolojik olarak tehlikeli atıklar için konteyner. 450 nm, 490 nm ve 620-700 nm filtrelere sahip mikro plaka okuyucu (*). (*) Teknik departmanımız tarafından önerilen ekipman hakkında ayrıntılı bilgi için bize ulaşın. 7.2. Reaktif hazırlama 7.2.1. reaktifler Reaktif 1 (R1): Mikro Plaka 12 şerit içeren her çerçeve desteği kilitli bir folyo torbaya sarılıdır. Bir makas veya bisturi kullanarak kilidin 0,5 ila 1 cm üstünden torbayı kesin. Torbayı açın ve çerçeveyi çıkartın. Kullanılmayan şeritleri yeniden torbaya koyun. Torbayı dikkatlice kapatın ve yeniden +2-8 C sıcaklığında saklayın. Reaktif 3 (R3): Negatif kontrol Reaktif 4 (R4): Pozitif kontrol Reaktif 6 (R6): Konjuge Kullanmadan önce ters çevirerek homojenize edin. Reaktif 10 (R10): Durdurma Çözeltisi 7.2.2. Sulandırılacak reaktifler Reaktif 2 (R2): Konsantre yıkama çözeltisi (20X) yıkama çözeltisi elde etmek için 1:20 distile suda seyreltin. 12 şeritlik bir plaka için 800 ml hazırlayın. Reaktif 8 (R8) + Reaktif 9 (R9): Enzim geliştirme çözeltisi 12 şerit üzerinde işlem yapmak için 10 ml gerekli ve yeterli olduğunu dikkate alarak Substrat Tamponunda 1:11 kromojen (R9) seyreltin (ör. 1 ml reaktif R9 +10 ml R8 reaktif). Homojenize edin. 7.3. Test Prosedürü Prosedüre harfiyen uyun. Test kalitesini doğrulamak üzere her bir test için negatif ve pozitif kontrol serumu kullanın. [TR] 7

Aşağıdaki İyi Laboratuvar Uygulamalarına uyun: 1) Numune dağıtım ve tanımlama planını dikkatli bir şekilde oluşturun. 2) Seyreltilmiş R2 yıkama çözeltisini hazırlayın 3) Destek çerçevesini ve gereken sayıda şeridi (R1) koruyucu ambalajdan çıkarın. Kullanılmayan şeritleri yeniden ambalajlarına koyun. Ambalajı kapatın ve yeniden +2-8 C arasında saklayın. 4) Aşağıdaki sırada çukurcuğa dağıtın (tavsiye edilen plaka dağılımı): A1, B1, C1'e 50 μl negatif kontrol (R3) D1, E1'e 50 μl pozitif kontrol (R4) F1, G1, vb. her çukurcuğa 50 µl seyreltilmemiş numune Her çukurcuğa 50 μl konjuge (R6) Kullanılan sisteme bağlı olarak kontrollerin pozisyonunun veya dağıtım sırasının değiştirilmesi mümkündür. Reaksiyon karışımını en az 3 aspirasyonla veya mikroplaka çalkalayıcı ile 5 saniye homojenize edin. AÇIKLAMA: Numune ve kontrol dağılımı manipülasyonun bu aşamasında görsel olarak kontrol edilebilir, boş çukurcuk ve numune içeren çukurcuk arasında bir renk farkı vardır. Numune dağıtımından sonra konjugeyi 5 dakika içerisinde verin. Boş bir çukurcuk ve kırmızı konjuge çözeltisini (R6) içeren çukurcuk arasında açık bir renk farkı vardır (Bkz. 7.7) 5) Mümkün olduğunda plakayı yeni yapışkan bant ile kaplayın. 6) Mikroplakayı 30-35 dakika boyunca 37 C ± 1 C'e inkübe edin. 7) Gerektiği takdirde yapışkan bandı çıkarın. Bütün çukurcukların içeriğini bir sıvı atık konteynerine aspire edin ve her çukurcuğa minimum 370 µl yıkama çözeltisi ilave edin. Yeniden aspire edin ve yıkamayı en az 4 kez tekrar edin (Toplam 5 yıkama döngüsü). Kalıntı hacim 10 µl'den düşük olmalıdır (gerektiği takdirde şeritleri emici kağıt üzerinde ters çevirerek kurutun). Otomatik bir yıkayıcınız varsa, aynı çalışma döngüsünü izleyin. AÇIKLAMA: 20 dakika içerisinde yıkama adımına geçin. 8) Geliştirme çözeltisini (reaktif R8 + R9) hazırlayın. 9) Her çukurcuğa hızla kullanmadan önce taze olarak hazırlanmış, 50 μl hazır geliştirme çözeltisi (R8+R9) verin. Reaksiyonun karanlık ortamda ve oda sıcaklığında (18-30 C) 25-35 dakika gelişmesine izin verin. Bu inkübasyon sırasında yapışkan bant kullanmayın. AÇIKLAMA: Pembe geliştirme çözeltisinin dağıtılması manipülasyonun bu aşamasında görsel olarak kontrol edilebilir. Boş bir çukurcuk ve pembe substrat çözeltisini içeren çukurcuk arasında açık bir renk farklı vardır. (Bakınız 7.7). 10) Substrat çözeltisi ile aynı diziyi ve dağıtım hızını kullanarak 50 μl durdurma çözeltisi (R10) ilave edin. Reaksiyon karışımını homojenize edin. AÇIKLAMA: Renksiz durdurma çözeltisinin dağıtılması bu işleme aşamasında görsel olarak kontrol edilebilir. Substrat rengi olan pembe (negatif numuneler için) veya mavi (pozitif numuneler için), durdurma çözeltisi ilave edildikten sonra renksiz (negatif numuneler için) veya sarı (pozitif numuneler için) hale gelen çukurcuklardan kaybolur. 11) Her bir plakanın altını dikkatle silin. Durdurma çözeltisinin ilavesinden sonra en az 4 dakika bekleyin ve reaksiyonun durdurulmasından itibaren 30 dakika içerisinde bir plaka okuyucu kullanarak 450/620-690 nm'deki optik yoğunluğu okuyun. 12) Spektrometrik ve görsel okumalar ile uyuşma için ve plakaya ve numune dağıtımına ve tanımlama planına karşı kontrol gerçekleştirin. 7.4. Kalite Kontrol Testlerin sonuçlarını doğrulamak üzere her çalıştırma için negatif (R3) ve pozitif (R4) kontrolleri kullanın. (Bkz. 7.5) [TR] 8

7.5. Test Doğrulama kriterleri Aşağıdaki şartlara uyulursa bu test doğrulanır: 1) Negatif kontrol R3 için: OD R3 0,080 Bir kontrol değeri bu değerin üzerindeyse, bunu dikkate almayın ve kalan iki negatif kontrol değeri ile hesaplamayı gerçekleştirin. 2) R4 pozitif kontrolü için: OD R4 0.700 7.6. Sonuçların Hesaplanması / Yorumlanması Kesme, R3 negatif kontrolü ile belirlenir: Negatif kontrol R3 için ortalama ölçülen absorbans değerini ve Kesme Değerini (COV) aşağıdaki şekilde hesaplayın: COV = Ortalama OD R3 + 0,100 COV'den düşük OD'ye sahip numuneler Syphilis Total Ab tarafından negatif sayılır. Ancak kesme değerinin hemen altındaki sonuçlar (COV -%10 < OD < COV) dikkatle yorumlanmalıdır. Sistemler ve laboratuvar prosedürleri izin verdiğinde karşılık gelen numunelerin iki kez yeniden test edilmesi tavsiye edilir. OD'nin COV'a eşit veya COV'dan yüksek olduğu numuneler Syphilis Total Ab tarafından pozitif sayılır ve nihai yorumlama öncesinde iki kere test edilmelidir. En az bir tekrarda COV'den yüksek çıkan tekrar test edilmiş numuneler pozitif sayılır ve daha ayrıntılı incelenmelidir. Her iki tekrarda Kesme değerinin altında çıkan numuneler negatif sayılır. Test edilen numuneler için çok düşük optik yoğunluk (negatif OD) halinde ve numuneler ile reaktifin mevcudiyeti kontrol edildiğinde, sonuçlar negatif olarak yorumlanabilir. Pozitif numunelerin güncel ulusal tavsiyelere ve algoritmalara uyarak doğrulanması önerilir. 7.7. Numune ve konjuge pipetlemenin (isteğe bağlı) spektrometrik doğrulaması Numuneler ve kontroller Çukurcukta numunelerin ve kontrollerin mevcudiyeti 450 / 620 nm'de otomatik okuma ile doğrulanabilir. Bir numunenin ilave edildiği bir çukurcuk 0,050 ve 1,100 arasında bir OD'ye sahip olacaktır. Konjuge Konjuge kırmızı renklidir. Çukurcukta konjugenin mevcudiyeti 450 / 620 nm'de otomatik okuma ile kontrol edilebilir. Bir numunenin ilave edildiği bir çukurcuk 1,200'den yüksek veya buna eşit bir OD'ye sahip olacaktır. Geliştirme çözeltisi pipetleme doğrulaması Çukurcukta pembe geliştirme çözeltisi mevcudiyetinin 492 nm'de otomatik okuma yoluyla doğrulanması mümkündür. Geliştirme çözeltisi içeren bir çukurcuğun optik yoğunluk değeri 0,100'den büyük veya buna eşit olmalıdır (düşük bir optik yoğunluk geliştirme çözeltisinin zayıf dağılımını gösterir). 8. TEST KISITLAMALARI Sifilis için yapılan bütün serolojik testlerde olduğu gibi, genel bir klinik teşhis oluşturmak için Syphilis Total AB EIA testi ile elde edilen sonuçların yorumlanması hastanın klinik semptomları, tıbbi geçmişi ve diğer laboratuvar bulguları ile beraber kullanılmalıdır. [TR] 9

Hastalığın her aşaması için tek bir test veya belirli bir referans standardı mevcut değildir. Dolayısıyla, sifilis teşhisi ağırlıklı olarak hem nontreponemal hem de treponemal yöntemlerden elde edilen sonuçları gerektiren serolojik teste dayanır. Hiçbir teşhis testi bir numunenin enfeksiyonun çok erken aşamalarında mevcut olanlar gibi düşük seviyelerde T. pallidum anti badileri içermediğine dair mutlak teminat vermez. Dolayısıyla, herhangi bir zamanda elde edilen negatif bir sonuç sifilis enfeksiyonuna maruz kalma olasılığını ortadan kaldırmaz. Herhangi bir ELISA tekniği yalancı pozitif sonuçlar verebilir. Tekrarlanabilir pozitif olduğu bulunan herhangi bir numunenin reaksiyonunun spesifikliğinin uygun bir yöntem kullanılarak Syphilis Total Ab kiti kriterlerinin yorumlanmasına göre kontrol edilmesi önerilir: Treponema pallidum Hemaglütinasyon testi. Treponemal enfeksiyondan sonra bütün treponemal test sonuçları reaktif kalma eğilimindedir, dolayısıyla terapiye yanıtı değerlendirmek için bunlar kullanılmamalıdır. Reaktifliğin sürekliliğinden dolayı, genellikle hastanın ömrü boyunca treponemal testler reaktif sonuç elde edilmiş bir hastada yineleme veya yeniden enfekte olma tespiti konusunda değersizdir. Bu durumda, diğer testlerin kullanılması önerilir: Sifilis IgM EIA, RPR ve TPHA. Numuneyi, konjuge geliştirme solüsyonu birikimini doğrulama amaçlı spektrometrik yöntem, numunelerin ve konjugenin dağıtılan hacminin doğruluğunu teyit etmeye izin vermez. Bu yöntem yalnızca numunenin ve konjugenin mevcudiyetini gösterir. Bu yöntem ile hata oranı kullanılan sistemin doğruluğu ile yakından bağlantılıdır (dağılım ve okuma için %10'un üzerinde bir toplu sapma katsayısı bu adımın kalitesini önemli ölçüde düşürecektir). 9. PERFORMANS KARAKTERİSTİKLERİ 9.1. Hassasiyet Ölçümü Farklı konsantrasyonlarda Sifilis anti badileri içeren numuneler kullanılarak tekrarlanabilirlik ve ara hassasiyet belirlenmiştir. Tekrarlanabilirliği belirlemek üzere numuneler aynı test serisi boyunca 30 kere test edilmiştir. Numuneler ayrıca 20 gün boyunca günde 2 test hızı ile ikişer kez test edilmiştir. Oran ortalaması, standart sapmalar ve Sapma Katsayıları (CV) hesaplanmıştır. 9.1.1. Tekrarlanabilirlik: Numuneler N Oranların ortalaması Standard sapma %CV Düşük Negatif 30 0,14 0,014 %9,5 Yüksek Negatif 30 0,68 0,051 %7,5 Düşük pozitif Sifilis ab 30 1,90 0,070 %3,7 Pozitif Sifilis ab 30 3,76 0,130 %3,5 Pozitif numunelerden elde edilen CV'ler %10'dan düşüktür. [TR] 10

9.1.2. Ara Hassasiyet Numuneler N Oranların ortalaması Test içi Testler / operatörler arası Günler arası Toplam tekrarlanabilirlik SS %CV SS %CV SS %CV SS %CV Düşük Negatif 80 0,15 0,035 %22,5 0,023 %14,7 0,017 %10,9 0,045 %29,0 Yüksek Negatif 80 0,74 0,038 %5,1 0,074 %10,0 0,006 %0,8 0,084 %11,2 Düşük pozitif Sifilis ab 80 2,30 0,112 %4,9 0,312 %13,5 0,099 %4,3 0,346 %15,0 Pozitif Sifilis ab 80 4,13 0,180 %4,3 0,543 %13,1 0,195 %4,7 0,604 %14,6 Pozitif numunelerden elde edilen CV'ler %15'ten düşüktür veya %15'e eşittir. 9.2. Klinik Performans Syphilis Total AB testinin klinik performansı, prospektif ve retrospektif çalışmalardan elde edilen test numuneleri ile belirlenmiştir: Prospektif çalışma: - Rastgele kan donörlerinden alınan 5195 numune; - Sifilis şüphesi bulunan hastalardan 460 numune Retrospektif çalışma: - STD hastalarından 350 pozitif. Çalışmalar 2 kan verme alanında, bir STD (Cinsel Yolla Bulaşan Hastalık) merkezinde ve Bio-Rad sahasında yürütülmüştür. 9.2.1. Teşhis Spesifikliği Çalışma, Fransa'daki 2 kan bankasından veya rastgele donörlerden alınan serum ve EDTA plazma numuneleri üzerinde yürütülmüştür. Ayrıca, hastalardan alınan numuneler üzerinde bir spesifiklik çalışması yürütülmüştür. Sonuçların tamamı CE işaretli Sifilis testleri kullanılarak elde edilenlerle kıyaslanmıştır. Tablo 1: Spesifiklik Testi (IR = Başlangıçta Reaktif; RR= Tekrarlayan Reaktif) Merkeze göre Kan donörleri Tesis #1 + #2 Numune tipi Toplam örnek sayısı Başlangıçt a Reaktif (IR) Tekrarlaya n Reaktif (RR) RR Spesifikliği (%) Serum SST 3127 2 2* 3125/3125 Plazma EDTA K2 2068 2 2* 2066/2066 Toplam 5195 4 4* Hasta #3 Serum 351 1 1 %100 5191/5191 %99,72 350/351 %95 CI (%) %99,93 - %100 %98,42 100 *Diğer CE işaretli EIA Sifilis testleri ile pozitif bulunan Tekrarlayan Reaktif numuneler teşhis spesifikliği hesaplamasının dışında tutulmuştur [TR] 11

9.2.2. Teşhis Duyarlılığı Retrospektif çalışma: Çalışma, arasında 2 numunenin negatif ilan edildiği ve 348'inin pozitif olduğunun doğrulandığı 350 donmuş numune üzerinde CE işaretli Sifilis testleri ile gerçekleştirilmiştir. Bu 348 pozitif numune arasında, 7 numune enfeksiyonun başlangıç aşamasındaki hastalardan alınmıştı. 348 numunenin tamamı Bio-Rad Syphilis Total Ab testi ile pozitif bulunmuştur. Prospektif çalışma: Bio-Rad Syphilis Total Ab testi ile toplam 460 taze numune değerlendirilmiştir ve CE işaretli Sifilis testleri ile karşılaştırılmıştır. 348'i hem Bio-Rad hem de referans testler ile negatif bulunmuştur (iki numune referans EIA testi ile yalancı pozitif çıkmıştır) 109'u her iki test ile pozitif bulunmuştur. 3 numune çelişkili sonuçlar göstermiştir (Bio-Rad test ile yeniden test etme sonrasında): 1 numune Bio-Rad Testi ile pozitif, referans testlerle ise yüksek negatif. Düşük sifilis oranına sahip bu numune her iki EIA testi için limit kesme değerindeydi: 1 numune referans testler ile pozitif, Bio-Rad testi ile negatif (belirti göstermeyen 1 hastadan) 1 numune referans testler ile pozitif, Bio-Rad testi ile negatif IR ve yeniden testtte pozitif, Retrospektif ve Prospektif çalışmalar: Global teşhis hassasiyeti %99,56'ya eşit olup (457/459) güven aralığı %95'tir [%98,44 - %99,95]. Klinik hassasiyet 3 ticari panel ve 1 serokonversiyon paneli üzerinde klinik hassasiyet çalışması da yapılmıştır. Bio-Rad Syphilis Total Ab testi bir CE işaretli sifilis testi ile karşılaştırılmıştır. Her bir panel numunesinin tespiti Bio-Rad testi ve sifilis referans testi arasında eşdeğerdir. 9.3. Analitik Hassasiyet Analitik hassasiyet 2 NIBSC Standardı üzerinde değerlendirilmiştir ve regresyon kullanılarak kesme değeri üzerinden hesaplanmıştır: 1. IgG / IgM için tespit limiti 3 lot Syphilis Total Ab testi üzerinde değerlendirilmiştir ve WHO Standardı IgM/IgG (NIBSC kodu: 05/132) kullanılarak CI %95 [0,10 miu/ml 1,30 miu/ml] ile 0,53 miu/ml olarak öngörülmüştür. 2. IgG için tespit limiti 1 lot Syphilis Total Ab testi üzerinde değerlendirilmiştir ve WHO Standardı IgM/IgG (NIBSC kodu: 05/122) kullanılarak CI %95 [0,02 miu/ml 0,27 miu/ml] ile 0,11 miu/ml olarak öngörülmüştür. 9.4. Analitik Spesifiklik / Çapraz Reaktivite Çalışması Enfeksiyon hastalıklara (Lyme, Toksoplazmoz, EBV, Leptospiroz, SLE (lupus), Hepatit A Anti badi, Hepatit B Anti badi, Hepatit C Anti badi, HTLV I/II, ve HIV) yol açabilecek patojenlere karşı anti badiler içeren toplam 125 potansiyel interferans testi risk altındaki hasta grubundan (hamile kadınlar veya çok doğurkan kadınlar) alınan numuneler veya immün sistem bozuklukları (romatoid faktörler) bulunan hastalardan alınan numuneler Syphilis Total Ab testi ile test edilmiştir. Test edilen 125 numune arasında Syphilis Total Ab testi ile 1 örnek pozitif tekrarlanabilir olarak bulunmuştur; bu numune diğer CE Syphilis EIA ve doğrulayıcı testleri ile gerçek pozitif olarak doğrulanmıştır. Bu hedef kitlede gözlemlenen spesifiklik %100'e (124/124) eşit olup güven aralığı %95'tir [%97,1 - %100,0]. 9.5. Kanca Etkisi 6 Sifilis pozitif numuneyi farklı seyreltilerde yüksek titrasyonla test ederek olası bir kanca etkisinin mevcudiyeti araştırılmıştır. Seyreltilmemiş ve seyreltilmiş numuneler arasında gözlenen sonuçların eşdeğerliği test edilen numunelerde kanca etkisinin bulunmadığını gösterir. [TR] 12

10. BİBLİYOGRAFİ VE REFERANSLAR. 1. Levinson SS. The Nature of Heterophilic Antibodies and Their Role in Immunoassay Interference. J. Clin. Immunoassay 15: 108-115,1992. 2. Norris S.J. Plypeptides of Treponema pallidum: Progress toward understanding their structural, functional and immunological role. Microbiological Reviews, Setpt. 1993 Vol 57. 3. Larsen SA, Steiner BM, and Rudolph AH. Laboratory diagnosis and interpretation of tests for syphilis. Clin Microbiol Rev. 1995 Jan; 8(1):1 21. 4. Zrein M, Maure I, Boursier F, Soufflet L. Recombinant antigen-based enzyme immunoassay for screening of Treponema pallidum antibodies in blood bank routine. J Clin Microbol. 1995 Mar; 33(3):525 7. 5. Singh AE and Romanowski. Syphilis: Review with emphasis on clinical, epidemiological, and some biologic features. Clin Microbiol Rev. 1999 Apr; 12(2):187 209. 6. Stability of selected serum proteins after long-term storage in the Janus Serum Bank. Clin Chem Lab Med. 2009. 47:596-606. 7. International Journal of STD & AIDS 2009; 20: 300 309. 8. Screening donated Blood for Transfusion-Transmissible infections. World Health Organization. 2009 9. M. J. Loeffelholz, and M. J. Binnicker, It Is Time to Use Treponema-Specific Antibody Screening Tests for Diagnosis of Syphilis, J Clin Microbiol, 50 (2012), 2-6. [TR] 13

[TR] 14

[TR] 15

[TR] 16

Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré 92430 Marnes-la-Coquette France Tel.: +33 (0) 1 47 95 60 00 Faks: +33 (0) 1 47 41 91 33 2014/11 www.bio-rad.com 883679 [TR] 17