1 T.C. ERCİYES ÜNİVERSİTESİ ECZACILIK FAKÜLTESİ KAPSAİSİNİN STAPHYLOCOCCUS AUREUS VE ENTEROCOCCUS FAECALIS ÜZERİNE ANTİMİKROBİYAL ETKİSİNİN İNCELENMESİ Hazırlayan İrem ERDAĞLI Danışman Yrd. Doç. Dr. Esma KAYA Farmasötik Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Bitirme Ödevi Haziran 2011 KAYSERİ

2

3 T.C. ERCİYES ÜNİVERSİTESİ ECZACILIK FAKÜLTESİ KAPSAİSİNİN STAPHYLOCOCCUS AUREUS VE ENTEROCOCCUS FAECALIS ÜZERİNE ANTİMİKROBİYAL ETKİSİNİN İNCELENMESİ Hazırlayan İrem ERDAĞLI Danışman Yrd. Doç. Dr. Esma KAYA Farmasötik Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Bitirme Ödevi Haziran 2011 KAYSERİ

i BİLİMSEL ETİĞE UYGUNLUK Bu çalışmadaki tüm bilgilerin, akademik ve etik kurallara uygun bir şekilde elde edildiğini beyan ederim. Aynı zamanda bu kurallar ve davranışların gerektirdiği gibi, bu çalışmanın özünde olmayan tüm materyal ve sonuçları tam olarak aktardığımı ve referans gösterdiğimi belirtirim. İrem ERDAĞLI

ii KAPSAİSİNİN STAPHYLOCOCCUS AUREUS VE ENTEROCOCCUS FAECALİS ÜZERİNE ANTİMİKROBİYAL ETKİSİNİN İNCELENMESİ adlı Bitirme Ödevi, Erciyes Üniversitesi Lisansüstü Tez Önerisi ve Tez Yazma Yönergesi ne uygun olarak hazırlanmış ve Farmasötik Mikrobiyoloji Anabilim Dalı nda BİTİRME TEZİ olarak kabul edilmiştir. Tezi Hazırlayan İrem ERDAĞLI Danışman Yrd. Doç. Dr. Esma KAYA Farmasötik Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Başkanı Doç. Dr. Hatice ÖZBİLGE İmza ONAY : Bu tezin kabulü Eczacılık Fakültesi Dekanlığı nın... tarih ve.. sayılı kararı ile onaylanmıştır. / / Prof. Dr. Müberra KOŞAR Dekan

iii TEŞEKKÜR Bitirme ödevimin yürütülmesi süresince değerli emeklerini ve katkılarını esirgemeyen Danışman Hocam Yrd. Doç. Dr. Esma KAYA ve Anabilim Dalı Başkanım Doç. Dr. Hatice ÖZBİLGE ye teşekkürlerimi sunarım.

iv KAPSAİSİNİN STAPHYLOCOCCUS AUREUS VE ENTEROCOCCUS FAECALIS ÜZERİNE ANTİMİKROBİYAL ETKİSİNİN İNCELENMESİ İrem ERDAĞLI Erciyes Üniversitesi, Eczacılık Fakültesi Bitirme Ödevi, Haziran 2011 Danışmanı: Yrd. Doç. Dr. Esma KAYA ÖZET Botanikte Capsicum annuum L. olarak adlandırılan kırmızı acı biber, halk arasında yüzyıllardan beri hastalıkların tedavisi amacıyla kullanılmakta olup, yapısında kapsaisin bulundurur. Yapılan deneysel ve klinik çalışmalarla kapsaisinin analjezik, antitümoral, antioksidan, antimikrobiyal, antiinflamatuar ve immünmodülatör gibi etkileri olduğu gösterilmiştir. Bu çalışmada kapsaisinin, önemli klinik patojenler olan Staphylococcus aureus ve Enterococcus faecalis üzerine antimikrobiyal etkinliğinin araştırılması ve böylece antimikrobiyal aktivite tayininin öğrenilmesi amaçlanmıştır. Kapsaisinin S. aureus ve E. faecalis standart suşları üzerine antimikrobiyal aktivitesi sıvı mikrodilüsyon yöntemi ile araştırıldı. Bakteri süspansiyonları, 96 kuyucuklu mikrodilüsyon plaklarının kuyucuklarında son inokülum konsantrasyonu 5x10 5 CFU/ml olacak şekilde ayarlandı. Her bir kuyucuğa DMSO da çözünen kapsaisinin 3.9-500 µg/ml arasında hazırlanan ikişer kat konsantrasyonları ilave edildi. Plaklar 37 o C de 24 saat inkübe edildi. İnkübasyon sonunda üremenin görülmediği en düşük konsantrasyon, o suş için minimal inhibitör konsantrasyon (MİK) olarak değerlendirildi. Kapsaisinin S. aureus için MİK değeri 125 µg/ml, E. faecalis için MİK değeri 62.5 µg/ml olarak değerlendirildi. Ayrıca çözücünün her bir bakteri için saptanan MİK değerlerinde mikroorganizmalar üzerine inhibitör etkisi gözlenmedi. Dünyanın pek çok yerinde baharat olarak tüketilen acı biber, içerdiği kapsaisin nedeniyle tıp alanında oldukça yaygın olarak kullanılmaktadır. Antimikrobiyal aktivitesi üzerine yapılan bilimsel çalışmalar, bu etken maddenin enfeksiyon etkenleriyle mücadelede de tedaviye yardımcı olabileceğini düşündürmektedir. Anahtar Kelimeler: Kapsaisin, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, antimikrobiyal aktivite

v INVESTIGATION OF ANTIMICROBIAL EFFECTS OF CAPSAICIN AGAINST STAPHYLOCOCCUS AUREUS AND ENTEROCOCCUS FAECALIS Irem ERDAGLI Erciyes University, Faculty of Pharmacy Graduation Project, June 2011 Advisor: Yrd. Doç. Dr. Esma KAYA ABSTRACT Red chili pepper that called Capsicum annuum L. on botany is being used for treatment of illnesses between the people for centuries and also there is capsaicin in its structure. It has been showed with clinical and experimental studies that there were analgesic, antitumoral, antioxidant, antimicrobial, antiinflammatory and immunomodulatory effects. In this study, it was aimed to research the antimicrobial effects of capsaicin against Staphylococcus aureus and Enterococcus faecalis which is important clinic pathogens and thus it was aimed to learn the of antimicrobial activity tests. Antimicrobial activity of capsaicin on S. aureus and E. faecalis standard strains was determined by broth microdilution method. Bacterial suspensions were adjusted to 5x10 5 CFU/ml in the 96-well microdilution plates. It was added two fold concentrations prepared between 3.9-500 µg/ml of capsaicin that soluted on the DMSO. Plates incubated at 37 o C for 24 hours. The lowest concentration of capsaicin which inhibited the visible bacterial growth was determined as the MIC of the strain. MIC values of capsaicin were evaluated as 125 µg/ml for S. aureus, 62.5 µg/ml for E. faecalis. It hasn t been observed inhibitory effect of solvent on the microorganisms at MIC values determined for each microorganisms. Chilli pepper has been consumed as a spices in many parts of the world. It has been used widely in medicine because of containing capsaisin. Scientific studies on the antimicrobial activity have been suggested that can help treatment at the fight with infection agents of this active substance. Key words: Capsaisin, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, antimicrobial activity

vi İÇİNDEKİLER BİLİMSEL ETİĞE UYGUNLUK...i KABUL ONAY...ii TEŞEKKÜR...iii ÖZET...iv ABSTRACT...v İÇİNDEKİLER...vi KISALTMALAR...viii TABLO VE ŞEKİL LİSTESİ...x 1. GİRİŞ VE AMAÇ...1 2. GENEL BİLGİLER...2 2.1. KAPSAİSİN...2 2.1.1. Kapsaisin Hakkında Genel Bilgiler...2 2.1.2. Kapsaisinin Farmakolojik ve Biyolojik Özellikleri...3 2.1.3. Kapsaisinin Kullanım Alanları...6 2.2. MİKROORGANİZMALAR...8 2.2.1. Staphylococcus aureus...8 2.2.1.1. Mikrobiyolojik Özellikleri...8 2.2.1.2. Epidemiyolojisi...9 2.2.1.3. Virülans ve Patojenite...10 2.2.1.4. Oluşturdukları Enfeksiyonlar...12 2.2.1.5. Antibiyotik Direnç Sorunu...13 2.2.2. Enterococcus faecalis...14 2.2.2.1. Mikrobiyolojik Özellikleri...14 2.2.2.2. Epidemiyolojisi...14 2.2.2.3. Virülans ve Patojenite...15 2.2.2.4. Oluşturdukları Enfeksiyonlar...16

vii 2.2.2.5. Antibiyotik Direnç Sorunu...16 2.3. ANTİMİKROBİYAL DUYARLILIK TESTLERİ...17 2.3.1. Disk Difüzyon Testi...17 2.3.2. Dilüsyon testleri...18 2.3.3. E Test...20 2.3.4. Otomatize Sistemler...20 3. GEREÇ ve YÖNTEM...22 3.1. BESİYERLERİNİN HAZIRLANMASI...22 3.1.1. Kanlı Agar Besiyerinin Hazırlanması...22 3.1.2. Mueller Hinton Broth Besiyerinin Hazırlanması...23 3.2. MİKROORGANİZMALARIN HAZIRLANMASI...23 3.2.1. Çalışmada Kullanılan Mikroorganizmalar...23 3.2.2. Mikroorganizmaların Üretilmesi...23 3.2.3. Mikroorganizma Konsantrasyonlarının Ayarlanması...24 3.3. KAPSAİSİN...25 3.3.1. Kapsaisin Eldesi...25 3.3.2. Kapsaisin Konsantrasyonunun Ayarlanması...25 3.4. ANTİMİKROBİYAL DUYARLILIK TESTİ...25 3.4.1. Sıvı Mikrodilüsyon Testi...25 4. BULGULAR...27 4.1. MİKROORGANİZMA GÖRÜNTÜLERİ...27 4.2. SIVI MİKRODİLÜSYON TESTİ SONUÇLARI...28 5. TARTIŞMA ve SONUÇ...30 6. KAYNAKLAR...33 ÖZGEÇMİŞ...40

viii KISALTMALAR Kısaltmalar O C g HPLC DNA RNA IL LD mg kg iv Açıklama Santigrad derece Gram Yüksek basınçlı sıvı kromatografisi Deoksiribonükleik Asit Ribonükleik Asit İnterlökin Letal Doz Miligram Kilogram İntravenöz µm Mikrometre µg Mikrogram µl Mikrolitre mm ml L dk Ig H 2 O 2 MRSA NaCl MHA MHB CFU Milimetre Mililitre Litre Dakika İmmünglobulin Hidrojen peroksit Metisiline Duyarlı Staphylococcus aureus Sodyum klorür Mueller Hinton Agar Mueller Hinton Broth Koloni oluşturan birim

ix MİK V C DMSO ATCC CLSI Minimal inhibitör konsantrasyon Volüm Konsantrasyon Dimetil Sülfoksit American Tip Kültür Koleksiyonu Clinical and Laboratory Standards Institute

x TABLO VE ŞEKİL LİSTESİ Şekil 2.1. Capsicum annuum... 2 Şekil 2.2. Kapsaisinin molekül yapısı... 3 Şekil 2.3. Disk çevresinde mikroorganizmanın üremediği dairesel inhibisyon alanları. 18 Şekil 2.4. Sıvı makrodilüsyon yöntemi... 19 Şekil 2.5. Sıvı mikrodilüsyon yöntemi... 19 Şekil 2.6. E test yöntemi... 20 Şekil 2.7. Otomatize sistem örneği... 21 Şekil 3.1. Bakterilerin inokülasyonu... 24 Şekil 3.2. Çalışmada kullanılan inkübatör... 24 Şekil 3.3. Türbidometre cihazı... 25 Şekil 3.4. Çalışmada kullanılan 96 kuyucuklu mikrodilüsyon plağı... 26 Şekil 4.1. Kanlı agarda üreyen Staphylococcus aureus kolonileri... 27 Şekil 4.2. Kanlı agarda üreyen Enterococcus faecalis kolonileri... 27 Şekil 4.3. Çalışma kuyucuklarında gözlenen üremeler... 29 Tablo 2.1. Kapsaisin içeren müstahzarlar... 7 Tablo 4.1 Sıvı mikrodilüsyon yöntemi sonuçlarına göre kapsaisinin antimikrobiyal etkisi... 28

1 1. GİRİŞ VE AMAÇ Tıbbi açıdan önemli olan bitkiler, yüzyıllardan beri halk arasında hastalıkların tedavisi amacıyla kullanılmaktadır. Bu bitkilerden biri, botanikte Capsicum annuum L.olarak adlandırılan kırmızı acı biberdir (1), Solanaceae familyasının Capsicum cinsinden olan bu bitkinin ana vatanı Güney Amerika olmakla birlikte Güney Asya ülkeleri, ülkemizin Güney Doğu Anadolu Bölgesi gibi dünyanın çeşitli bölgelerinde 7000 yıldır yetiştirilmekte ve baharat olarak tüketilmektedir. Acı biberin yapısında kapsaisin, nordihidrokapsaisin ve homokapsaisin gibi kapsaisinoidler bulunur (2). Kapsaisinin barsaklardan gaz giderici, santral sinir sistemini uyarıcı, metabolizma ürünlerinin atılmasını hızlandırıcı, vücut ısısını arttırıcı ve sindirimi kolaylaştırıcı etkileri bilinmektedir. Yapılan deneysel ve klinik çalışmalarla kapsaisinin analjezik, antitümoral, antioksidan, antimikrobiyal, antiinflamatuar ve immünmodülatör gibi etkileri olduğu gösterilmiştir (3). Günümüzde enfeksiyon etkenlerinin eradike edilmesinde, gerek antibiyotik kullanımında yan etkilerin gözlenmesi gerekse bakterilerin antibiyotiklere direnç geliştirmeleri nedeniyle sorunlar yaşanmaktadır. Bu durum, yeni tedavi arayışlarının ortaya çıkmasına ve böylece bitkisel kaynaklara yönelimin hızlanmasına neden olmuştur. Geliştirdikleri antibiyotik direnci nedeniyle tedavilerinde önemli sorunlar yaşanan iki önemli patojen mikroorganizma, Staphylococcus aureus ve Enterococcus faecalis tir. Bu çalışmada kapsaisinin bu önemli klinik patojenler olan S. aureus ve E. faecalis üzerine antimikrobiyal etkinliğinin araştırılması ve böylece eczacılık mesleğinin bazı alanlarında kullanılması kaçınılmaz olan antimikrobiyal aktivite tayininin öğrenilmesi amaçlanmıştır.

2 2. GENEL BİLGİLER 2.1. KAPSAİSİN 2.1.1. Kapsaisin Hakkında Genel Bilgiler Solanaceae familyasının Capsicum cinsinden olan acı kırmızı biber (Capsicum annuum) anavatanı Güney Amerika olmakla birlikte Güney Asya ülkeleri, ülkemizin Güney Doğu Anadolu Bölgesi gibi dünyanın çeşitli bölgelerinde 7000 yıldır yetiştirilmekte olup keskin ve acı aroması nedeniyle yemeklerde baharat ve sos olarak kullanılmaktadır (Şekil 2.1) (2). Şekil 2.1. Capsicum annuum Acı biberin yapısında kapsaisin, nordihidrokapsaisin, homodihidrokapsaisin, dihidrokapsaisin ve homokapsaisin olarak adlandırılan kapsaisinoidler bulunur (2). Kırmızı acı biberin etken maddesi olan kapsaisin, kuvvetli acı, beyaz, kokusuz, sıcak su, etil alkol, metil alkol ve asetonda kolayca eriyebilen bir maddedir. Kırmızı acı biberin yapısındaki kapsaisin miktarı % 0.12-17 mg arasında değişmektedir. Erime derecesi 57-

3 66 o C arasındadır. Bekletme, dondurma ve pişirmeye rağmen kapsaisin orijinal potensini korur. Acı kırmızı biberin yapısında başlıca; acılık veren etken madde kapsaisin ve bunun yanı sıra, bazı vitaminler, kırmızı karotenoidler, yağ, mineraller ve aromatik bileşikler bulunur. Trans-8-metil-N-vanil-6-nonamid olarak adlandırılan kapsaisinin kapalı formülü C 18 H 27 NO 3 (Molekül Ağırlığı: 305.41 g) olup molekül yapısı Şekil 2.2 de gösterilmiştir. Meyvaların tatlı tiplerinde kapsaisin yoktur (4). Şekil 2.2. Kapsaisinin molekül yapısı Sadece Capsicum meyvelerinden elde edilen kapsaisin molekülü kristal formda ilk olarak 1816 yılında Bucholz ve 30 yıl sonra da Thresh tarafından izole edilmiştir. Kapsaisinin yapısı kısmen 1919 yılında Nelson tarafından açıklanmış ve 1930 yılında ilk defa Spath ve Darling tarafından sentezlenmiştir (2). Yüksek basınçlı sıvı kromatografisi (HPLC) ve gaz kromatografisi kapsaisinoid bileşiklerinin ayrıştırılması ve miktar tayininde en çok kullanılan yöntemlerdir (5). Kapsaisinin aşırı miktarda alınması zehirlenmeye sebep olur. Ancak öldürücü tesirinin ortaya çıkması için çok yüksek miktarda alınması gerekir (6). Kırmızı biberler C vitaminince çok zengin olup limondan daha fazla C vitamini içerirler Kapsaisin, kırmızı biberin tatlı tiplerinde bulunmamaktadır. Bileşiminde uçucu yağ, sabit yağ ve acı madde olarak kapsaisin alkoloidi (C18H24O8) bulunur (1). 2.1.2. Kapsaisinin Farmakolojik ve Biyolojik Özellikleri Kapsaisinoidler, intragastrik olarak sıçanlara verilişini takiben kolaylıkla absorplanır. Genel dolaşıma ve ekstra hepatik organlara ulaşmadan önce karaciğerde metabolize edilir. Yapılan in vitro ve in vivo çalışmalar kapsaisinoidlerin sitokrom P450 enzimleri

4 tarafından farklı yolaklarla metabolize edildiğini göstermiştir. Sıçanlarda yapılan in vivo ve in situ çalışmalarda kapsaisinin mide ve ince barsaklardan hızlı bir şekilde absorplandığı gözlenmiştir (7). Kapsaisin ve kapsaisinoid grubunun diğer üyelerinin gastrointestinal sistem, kardiyovasküler sistem, solunum sistemi, limbik sistem ve termoregülatör sistem üzerinde etkileri mevcuttur. Kapsaisin, kardiyovasküler sistemde doz ve uygulama hızına göre farklılık gösteren etkilere neden olmaktadır. Kapsaisinin 1µg dozda sıçanlara intravenöz yolla uygulanması sonucu, kan basıncında tekrarlanabilir trifazik bir etki gözlenmiştir. Kan basıncı ve kalp hızındaki düşüşü takiben, kan basıncında önce geçici, daha sonra ise kalıcı bir artış gözlenmiştir (2). Kapsaisinin metabolik olarak lipid peroksidasyonunu arttırarak yağ doku miktarını azalttığı, serum trigliseridlerinin seviyesini düşürdüğü ve in vitro ortamda iskelet kaslarında glikojen metabolizmasını inhibe ettiği gösterilmiştir. Ayrıca serum kolesterolü ve trigliserid düzeylerini azaltmak yoluyla ateroskleroz gelişme riskini azalttığı gösterilmiştir (8). Kanser fizyolojisinde oynadıkları rol, kapsaisin bileşiklerinin tıbbi amaçlı kullanımını sağlayan bir diğer özelliğidir. Ancak yapılan bazı çalışmalar kapsaisinin kanserojen etkisi olduğu, bazıları ise tümör oluşumunu engelleyici özelliğinin olduğu fikrini desteklemektedir (9). Kapsaisin, tükürük ve ter salgısını arttırır. % 10 acı biber içeren ve protein değeri düşük bir diyetle beslenen sıçanlarda % 54 sıklıkta hepatom oluştuğu ifade edilmektedir. Bu, kapsaisinin özellikle diyet proteinin düşük olduğu yörelerde karaciğer kanseri etyolojisinde rolü olabileceğini düşündürmektedir (4). Kapsaisinin kanser hücrelerinde apoptoza neden olduğunu gösteren çalışmalar mevcuttur. Bu çalışmalarda kapsaisinin bazı prostat kanser hücrelerindeki apoptoz oranını artırdığı gösterilmiştir. Ayrıca doğal kapsaisinin lösemi hücrelerinin büyümesini inhibe ettiği, akciğer kanser hücrelerinde ve insan hepatoma HepG2 hücrelerinde apoptoza neden olduğu bulunmuştur (2). Bu etkiden protein, lipid, DNA ve RNA gibi hücresel makromoleküller üzerindeki oksidatif strese bağlı geri dönüşümsüz hasarın neden olduğu düşünülmektedir (10). Bununla birlikte yapılan çalışmalarda kapsaisinin

5 ağız boşluğu, farinks, yemek borusu ve gırtlak kanseri riskini doza bağlı olarak 2-3 kat arttırdığı belirtilmiştir (11). Ayrıca kapsaisinin sindirim sisteminde antimikrobial etkileri bildirilmektedir (12). Salmonella enteritis ile enfekte kanatlılarda diyet ile verilen kapsaisinin iyileştirici etkisi olduğu gösterilmiştir (13). Safra taşları oluşumunun önlenmesindeki olası etkisinin incelenmesi amacıyla hamster ve fare için hazırlanan diyetlere değişik konsantrasyonlarda kapsaisin ilavesi yapılmıştır. Araştırmada safra/kolesterol konsantrasyonu ile kolesterol/fosfolipid oranı belli dönemlerde değerlendirilerek, bu oranlarda belirgin şekilde azalma olduğunu saptamışlardır. Bu durumda kapsaisin safra taşı oluşumunu önleyebilecek potansiyel bir ajan olarak bildirilmiştir (14). Biber; sinir, mide ve salgı bezlerini uyararak, onların iyi çalışmasını sağlar, idrar söktürür. Dahili olarak iştah açıcı, haricen kızartıcı ve kan toplayıcı etkileri bulunmaktadır (1). Kapsaisinoid bileşiklerinin antioksidan özellikleri de vardır. Ancak bu etkinin kapsaiisinoid bileşiklerinin acılığı ile ilişkisi yoktur (15). Kapsaisin molekülleri hücre içinde ve hücre zarı üzerinde bulunan serbest radikalleri parçalayabilir (16). Son zamanlarda yapılan araştırmalardan elde edilen veriler, kapsaisin moleküllerinin hücre ölümünü uyarıcı etkisinin, genellikle mitokondriyal elektron taşıma sistemine etkisi sonucu, oksijene duyarlı moleküller aracılığı ile gerçekleştiğini belirlemiştir (17). Kapsaisinin proinflamatuar sitokinleri baskılamak suretiyle antiinflamatuar etkili olduğu da bildirilmiştir (18). Yağ dokusu hücre kültürleri üzerinde yapılan bir çalışmada IL-6 salınımını azalttığı, Helicobacter pylori ile enfekte gastrik epitel hücrelerinden ise IL-8 salınımını engellediği gösterilmiştir (19, 20). Kapsaisin, nöronlarda bulunan ve ağrı uyarılarının periferden santral sinir sistemine iletilmesinde görev yapan P maddesini tüketerek lokal ağrı uyarılarının beyine ulaşmasını engeller ve böylece cilt ve eklem dokusunun ağrıya karşı duyarlılığını azaltır (2). İntragastik olarak uygulanan kapsaisinin, deneysel olarak oluşturulan gastrik hasara karşı koruyucu bir etkinliğinin olduğu bulunmuştur. Bu etkisinin gastrik mukus üretimini artırmasından ve mukozal mukus tüketimini azaltmasından

6 kaynaklanabileceği belirtilmiştir. Kapsaisinin akut toksisitesi uygulama yoluna göre değişkenlik göstermektedir. Erkek farelere intragastrik entübasyon yoluyla kapsaisin uygulandığında LD50 değerleri 0.56 mg/kg (i.v.) dan 60-75 mg/kg (etanol içinde) ile 190 mg/kg (dimetil sülfoksit içinde) arasında değişkenlik göstermiştir. Muhtemel ölüm nedeni olarak ise solunum felci öngörülmüştür (2). 2.1.3. Kapsaisinin Kullanım Alanları Acı kırmızı biber, ılıman iklimlerde bir yıllık olarak yetişen bir kültür bitkisidir. Bu türün bir çok kültür formları, meyvesi için yetiştirilmektedir. Ülkemizde daha çok Kahramanmaraş, Kayseri ve Bursa illerinde üretimi yapılmaktadır. Özellikle yurdumuzun güney üretim bölgelerinde yetişen kırmızı biber tipleri acıdır. Askorbik asit ve karoten içeriği yönünden zengin olan kırmızı biberlerin tüketimde kullanılması; baharat, yem maddesi ve antibiyotik hammaddesi şeklindedir. Bunun yanında yemeklerde, salatalarda, turşularda, mezelerde ve konserve içeriğinde aromatik besin maddesi olarak kullanılmaktadır (1). Kırmızı biberin etken maddesi olan kapsaisinin barsaklardan gaz giderici, santral sinir sistemini uyarıcı, metabolizma ürünlerinin atılmasını hızlandırıcı, vücut ısısını arttırıcı, sindirimi kolaylaştırıcı ve kan damarlarını daraltıcı etkileri bilinmektedir. Halk arasında astım, romatizma, nevralji, lumbago, faranjit ve yaraların tedavisinde kullanılabilmektedir. Çeşitli araştırmalarda olgun acı meyvaların düzenli kullanımının, iştahsızlık, hemoroid, karaciğerde kan toplanması ve varise karşı da olumlu etkilere sahip olduğu bildirilmektedir (4). Kapsaisinin topikal yolla uygulanması ciltte yanma, batma ve sıcaklık duyumsaması gibi hislere neden olabilmektedir. Kapsaisinin %0.025-0.075 oranında kullanıldığı topikal olarak uygulanan merhemler, periferal nöropati ağrılarının hafifletilmesinde kullanılmaktadır (Tablo 2.1) (2). Ayrıca artrit, hafif ağrı olguları, kas ve eklem ağrılarının semptomatik tedavisi için reçeteli ve/veya reçetesiz satılan preparatların bileşiminde yer almaktadır. Herpes zoster (zona) ve nörojenik tipteki diğer ağrıların (örneğin mastektomi sonrası ağrılar gibi) tedavisinde de endikedir (21). Kapsaisin primer senzorik nöronlar aracılığı ile etkili olan ağrı kesici maddeler grubunda yer

7 almaktadır. Bu nöronların duyarlılığı ortadan kaldırılarak posthepatik nöropati, diabetik ve diğer nöropatik ağrılarda kullanılabilirliğinin sağlandığı bildirilmiştir (22). Tablo 2.1. Kapsaisin içeren müstahzarlar İlaç Adı Farmasötik Form Kapsaisin İçeriği Ülke Üretici Firma Roll Yakı Yakı 3.8 mg Türkiye Kurtsan Algipan Krem % 0.1 İrlanda Wyeth Antiphlogistine Rub A-535 Capsaicin Krem % 0.05 Kanada Carter Horner Arthricare for Women Ultra Krem 0.75 mg/ml Kanada Del Arthritic Pain Relief Krem, jel. Kanada Mentholatum Atomo Desinflamante C Krem. Arjantin İmvi Axsain Krem % 0.25 Kanada GenDerm Capsicin Krem % 0.075 İspanya Vinas Capsicolle Yama 25 mg/cm 2 Çek Cum. Chemopharma Capsicum Farmaya Krem % 0.025 İspanya Alacan Capsidol Krem % 0.025 Meksika Janssen- Cilag Capsig Krem. Avustralya Schering Cliptol Sport Jel. Fransa Pierre Fabre Sante Disalgil Pomad İtalya Also Dolorac Krem. ABD GenDerm Dr Theiss Rheuma Creme Krem. Çek Cum. Naturwaren Gelcen Krem % 0.025 Yunanistan Intramed Infrarub Merhem Brezilya Whitehall Katrum Krem % 0.025 İspanya Smaller Midalgan Krem Hollanda Sanofi Midy Presyc Krem % 0.025 Şili Pasteur R-Gel Jel. ABD Healthline Rati Salil Crema Krem. Arjantin Gramon Thermazet Krem Almanya Zwintscher Zacin Krem % 0.025 İngiltere Zeneus Zostrix Krem % 0.025 Kanada Medicis

8 Kapsaisinin vagal siniri inaktive ederek asit üretimini inhibe etmesinden dolayı ülsere karşı kullanımı araştırılmaktadır (23). Kapsaisinin yapılan araştırmalarda obezite tedavisinde etkili olabileceği ortaya konmuştur. Epidemiyolojik veriler kapsaisin içeren besinlerin tüketilmesine bağlı olarak obezite prevelansının azaldığını göstermektedir. Kemirgen hayvanlar, %0.014 oranında kapsaisin içeren bir diyetle beslendiğinde kalori alımında bir fark gözlenmezken visseral yağ ağırlığında önemli oranda azalma bulunmuştur (2, 24). Biber boya endüstrisinde de kullanılmaktadır. Kırmızı biberde, polyen alkol grubundan önemli renk maddeleri bulunduğundan çeşitli gıda maddelerinin boyanmasında, yumurta sarısını koyulaştırıcı etkisinden dolayı ise tavuk yemlerinde kullanılmaktadır (25). Kapsaisinoid bileşikleri bazı özgün özelliklerinden dolayı farmakolojik amaçlı uygulamaların yanı sıra besin katkı maddesi üretiminde ve böcek ilacı endüstrisinde kullanılmaktadır (17). Kapsaisinin tahriş edici özelliğinden yararlanılarak hazırlanan bazı spreyler, çeşitli ülkelerde sokak ve park hayvanlarını insanlardan uzaklaştırmakta kullanılmaktadır (6). 2.2. MİKROORGANİZMALAR 2.2.1. Staphylococcus aureus 2.2.1.1. Mikrobiyolojik Özellikleri Staphylococcus aureus bakterileri küçük, kok şeklinde ve gram pozitiftirler. Çapları 0.5-1.5 µm olup, tek, çift veya kısa zincirler şeklinde görülebilir. Stafilokokların çoğalırken üç boyuta da bölünebilmeleri ve bölünmeden sonra tam ayrılmanın olmaması nedeniyle katı besiyerinden alındıklarında mikroskobik görünümleri üzüm salkımı şeklindedir (26). Kanlı agarda ve basit besiyerlerinde 37 o C sıcaklıkta kolayca üretilebilirler. Kolonileri düz, opak ve konvekstir. Koloni rengi genellikle krem rengi ile altın sarısı arasındadır (26). Pigmentleri karatenoid yapıda olup hücre zarında yer almaktadır. Fakültatif

9 anaerobdurlar. Koagülaz pozitif olan bu bakteriler, β-hemoliz yapar. Sporsuz, kapsülsüz ve hareketsizdirler. Dış çevre şartlarına, kuruluğa, yüksek tuz konsantrasyonuna dayanıklıdırlar. Hücre duvarlarında pepdidoglikan, teikoik asit ve türe özgü presipitinojen protein birimleri taşırlar (27, 28). Başta glikoz olmak üzere karbonhidratları parçalarlar ve son ürün olarak laktik asit oluştururlar. Mannitolü parçalayabilirler. Kristal viyole ve malaşit yeşili gibi boyaların düşük konsantrasyonlarında dahi dayanamayıp ölürler. S. aureus un DNAse testi pozitiftir (27). 2.2.1.2. Epidemiyolojisi Stafilokoklar çok yaygın bakterilerdir. S. aureus un geçici kolonizasyonu nemli deri bölgelerinde sık olarak görülür. Yenidoğanların göbek kordonu kalıntısında, deri ve perianal bölgelerinde S. aureus kolonizasyonu sık olarak saptanır. Sağlıklı yetişkinlerin %30 unda uzun süreli nazofarinks S. aureus taşıyıcılığı saptanır, hastanede yatan insanlarda, sağlık personelinde, ekzematöz deri hastalığı olanlarda, ilaç bağımlılığı ya da tıbbi amaçla (insüline bağımlı diyabet, alerji testleri için enjeksiyon yapılan hastalar, hemodiyaliz hastaları) sık iğne kullananlarda bu oran daha yükseklere çıkmaktadır (29). Toplumun %30-50 si S. aureus ile kolonizedir (30). S. aureus, insanda başta burun (%20-40 arasında) olmak üzere, derinin kıvrım yerleri, perine, aksilla ve vajende kolonize olmakta ve kolaylıkla çevreye yayılabilmektedir. S. aureus, insan normal florasının önemli bir kısmını oluşturmasına rağmen, uygun şartlarda, deri enfeksiyonlarından yaşamı tehdit eden sistemik enfeksiyonlara kadar çeşitli klinik tablolara yol açabilmektedir. Özellikle immünsüpresif ve yoğun bakım hastalarında önemli morbidite ve mortalite sebebidir (31, 32). S. aureus kişiden kişiye esas olarak temas yoluyla geçer. Kaynak ise çoğunlukla S. aureus ile enfekte ya da kolonize hastalar ile sağlık personelidir (30). Bu nedenle sağlık personelinin stafilokokları kendilerinden ya da diğer hastalardan yeni bireylere bulaştırmamak için el yıkama tekniklerini uygulamaları gerekmektedir (29). S. aureus, stafilokoklar arasında en önemli insan patojeni olup, gerek toplum gerekse hastane kökenli enfeksiyonların en sık rastlanan etkenlerinden biridir (33, 34). Hastane ortamlarında yüksek taşıyıcılık oranı, etkenin çeşitli antibiyotiklere direnç geliştirme

10 yeteneği ve dış etkenlere dirençli olması, hastane enfeksiyonlarından sık rastlanmasının nedenleri olarak rol oynar (27). 2.2.1.3. Virülans ve Patojenite S. aureus un virülansı, farklı suşlarda çeşitli kombinasyonları bulunan pek çok virülans faktörüne bağlıdır. Protein A, hücre duvarının majör bileşenlerinden biri olup, önemli virülans faktörlerinden biridir. Protein A, IgG nin Fc kısmına bağlanır ve antiopsonin etki gösterir (35). S. aureus un teikoik asit, protein A gibi yapısal özelliklerinin yanı sıra ürettiği birçok enzim ve toksini de virulansına katkıda bulunur. A. Enzimler Katalaz: Toksik etkili hidrojen peroksiti (H 2 O 2 ) ve serbest radikalleri inaktive eden bir enzimdir. Fagositoza uğramış mikroorganizma, bu enzimi sayesinde bakterisidal etkiden korunur. Koagülaz: S. aureus u diğer stafilokoklardan ayıran bir enzimdir. S. aureus ları fibrin bir tabaka ile kaplayarak, opsonizasyon ve fagositoza karşı korunmalarını sağlar. Hyalüronidaz: Bağ dokusunun temel maddesi dokuda ilerlemesini sağlayan enzimdir. olan hyalüronik asidi parçalayarak Lipaz: Stafilokokların patogenezinde lipid dokuyu parçalayarak etkili olan enzimdir. Stafilokinaz: Fibrin dokuyu eriten enzimleridir. Deoksiribonükleaz: Nükleik asitlere etkilidir. Beta-laktamaz: S. aureus un, beta laktam antibiyotiklere direncinde rol oynayan enzimidir (36-38). B. Toksinler S. aureus enzimlere ek olarak, konak hücrenin fonksiyon ve yapısını etkileyen protein yapıda birçok toksin salgılamaktadır:

11 Alfa toksin: Eritrositler, lökositler, trombositler ve fibroblastlar gibi ökaryotik hücre membranları üzerinde litik etkiye sahiptir. Aynı zamanda dermonekrotik ve nörotoksiktir. S. aureus un koyun kanlı agarda oluşturduğu beta hemolizden bu toksin sorumludur (36, 37, 39). Beta toksin: Stafilokokal sfingomiyelinazdır (36, 37, 39). Gama toksin: İnsan, tavşan ve koyun eritrositleri üzerinde litik etkiye sahiptir (37, 39). Delta toksin: Birçok hücre tipi üzerine litik etki gösterir. Ayrıca adenilat siklazı aktive ederek camp üretimine neden olur. Bu enzimatik aktivitesiyle toksik şok sendromu ve besin zehirlenmesi gibi stafilokokal hastalıklarda görülen diyareden sorumludur (36). Lökosidin: Polimorfonükleer hücre membranına direkt toksik etkilidir (36). Enterotoksin: Isıya dirençli, polipeptid yapıda ve stafilokokal besin zehirlenmelerinden sorumlu toksinlerdir (37, 39). Eksfolyatif toksin: Genellikle yenidoğanlarda görülen büllöz ve eksfolyatif deri lezyonları ile karakterize stafilokokal haşlanmış deri sendromuna yol açar. Antijenik özelliktedir. Koruyucu antikor oluşturur (36). Toksik şok sendromu toksini (Enterotoksin F ): Daha çok hastane kaynaklı S. aureus suşları tarafından salgıdığı bildirilmektedir. Ateş, deri lezyonları, hipotansiyon ve çoklu organ yetmezliği tablosu ile karakterize toksik şok sendromuna yol açar (36, 37, 39). Stafilokok enfeksiyonlarının patolojisi, bakterinin fagositozdan kaçabilmesi, konak dokularına tutunmayı sağlayan yüzey proteinlerini oluşturması, spesifik toksin ve hidrolitik enzimler oluşturabilmesine bağlıdır. Teikoik asit ve yüzey proteinleri konak dokuların matriks proteinlerine bağlanmaları için önemlidirler (29). Hem konakçıya ait biyolojik yüzeylerde hem de implante edilmiş cihazlar üzerinde kolaylıkla kolonize olabilir (40). Stafilokok kolonizasyon riski, özellikle hospitalize edilmiş yenidoğanlar ve hastane çalışanlarında olmak üzere tip1 diabetik hastalar, iv ilaç kullananlar, hemodiyaliz hastaları, cerrahi hastalar ve AIDS li hastalarda artmıştır (38, 41, 42).

12 Enfeksiyonların patogenezinde konakçı savunma mekanizması ile bakteri virulansı arasındaki denge önemlidir (37, 40). Konakçının savunma sistemi bozuklukları, yanıklar, cerrahi insizyon gibi deri bütünlüğünün bozulduğu durumlar, mikroorganizmanın tutunmasına ve kolonizasyonuna sebep olabilecek yabancı cisim varlığı (damar içi kateterler ve protezler gibi), altta yatan başka enfeksiyonların olması stafilokok enfeksiyonları için önemli predispozan faktörlerdir (36). 2.2.1.4. Oluşturdukları Enfeksiyonlar S. aureus ya toksin oluşturarak ya da dokulara yayılıp zarar vererek hastalık yapmaktadır. Genel olarak oluşturdukları enfeksiyonlar deri ve mukoza enfeksiyonları, salgıladığı toksinler ile ilişkili sendromlar ve invaziv hastalıklar şeklinde sınıflandırılabilir. Bazı stafilokok hastalıkları sadece toksin etkisinin bir sonucu olarak, diğer bazıları ise bakterilerin çoğalmasına ve doku yıkımına bağlı olarak ortaya çıkmaktadır (29). Bütünlüğü bozulmuş deriye, kıl folikülleri veya ter bezi ağızlarına invaze olarak impetigo, follikülit, fronkül, karbonkül, hidroadenit ve apse gibi enfeksiyon tablolarına neden olabilir (31). S. aureus, cerrahi yara enfeksiyonlarından ve yeni doğanlarda epidemik deri hastalıklarından izole edilen en önemli ajandır (33). Stafilokoksik besin zehirlenmesi en sık görülen gıda kaynaklı hastalıklardandır. Hastalık bakterilerden çok gıdalarda bulunan toksinler tarafından oluşturulur (29). Ayrıca haşlanmış deri sendromu, toksik şok sendromu ve çocuklarda görülen Kawasaki hastalığı, toksinleri aracılığı ile meydana getirdiği diğer klinik tablolardır (30, 33). İnvaziv enfeksiyonları içerisinde en önemlisi bakteriyemidir. İntravasküler kateterizasyon, intravenöz ilaç kullanımı, prostetik aletler, invaziv girişimler, mekanik ventilasyon ve altta yatan malignite varlığı S. aureus bakteriyemisi için önemli risk faktörleridir. S. aureus bakteriyemisi; sepsis, osteomiyelit, septik artrit, metastatik abse, endokardit ve nadiren perikardit gibi ciddi komplikasyonlara yol açabilir. S. aureus, prostatik kapak endokarditi ve nozokomiyal endokarditlerin en önemli etkenidir (30). S. aureus tarafından oluşturulan akut endokardit, mortalitesi %50 lilere varan ciddi bir hastalıktır (29).

13 Oral sekresyonların aspirasyonu ya da vücudun diğer bölgelerinden hematojen yayılım ile S. aureus a bağlı solunum yolu enfeksiyonları gelişmektedir. Viral bir enfeksiyonu takiben erişkin bireylerde bronkopnömoni tablosu oluşturabilir. Ayrıca obstrüktif akciğer hastalığı, trakeostomi ve aspirasyon gibi risk faktörleri varlığında nozokomiyal pnömoniye yol açabilir (43). Çocuklarda göz enfeksiyonlarının ve akut servikal adenitin önemli bir etkenidir (30). Santral sinir sistemi ile ilgili travma, cerrahi girişim, malignite, hidrosefali gibi risk faktörleri bulunan kişilerde stafilokokal menenjit gelişebilir ve bu mikroorganizma, ventriküloperitoneal şantın ikinci en sık izole edilen etkenidir (43). S. aureus, hematojen yolla kemiklere ulaşarak, travma sonrası sekonder enfeksiyon ya da komşu bölgelerden enfeksiyonun kemiklere yayılması sonucu osteomiyelite neden olabilir (29). 2.2.1.5. Antibiyotik Direnç Sorunu Stafilokoklar penisilinin keşfinden sonra bu ilaca karşı hızla direnç geliştirmişlerdir ve günümüzde bu ilaca duyarlı olan stafilokokların oranı %10 un altına düşmüştür. Bu direnç ürettikleri penisilinaz enzimine bağlı olup, bu enzim penisilinin beta laktam halkasını hidrolize etmektedir (29). Stafilokoklarda penisilinaz üretiminin ilk kez 1944 yılında gösterilmesinin ardından, penisiline dirençli klinik izolatların prevalansı hızla artmaya başlamıştır. 1960 ların başlarında penisilinaza dirençli semisentetik penisilinlerin (metisilin, oksasilin, nafsilin, kloksasilin vb.) klinik kullanıma girmesi ile stafilokok enfeksiyonlarının tedavisinde önemli bir aşama kaydedilmiştir. Ancak bu yeni antibiyotiklere de kısa sürede direnç gelişmiş ve bir yıl içinde metisilin dirençli S. aureus (MRSA) suşları bildirilmeye başlanmıştır. Günümüzde toplum kökenli ya da hastane enfeksiyonu etkeni stafilokokların çoğu bu semisentetik penisilinlere dirençlidir (33). Amerika Birleşik Devletleri nde 1975 yılında bildirilen MRSA oranı % 2.4 iken 1991 de bu oranın % 29 a yükseldiği rapor edilmiştir. Hastane enfeksiyonu etkeni olarak izole edilen S. aureus ların 1987 de % 14.3 ü metisiline dirençli iken, 1997 de bu oran % 39.7 olarak bildirilmiştir (44). 2000 li yıllarda ise yoğun bakım ünitelerinden izole edilen S. aureus ların % 47 si metisiline dirençli bulunmuştur (45).

14 S. aureus ların metisiline direnç oranları İskandinav ülkelerinde % 1 den az iken, Güney Avrupa ülkelerinde % 40 a kadar çıkmaktadır. Japonya da % 60 olarak bildirilen MRSA prevalansı, Türkiye de % 10-70 arasında değişen oranlarda bildirilmektedir (46-48). Metisiline dirençli bakterilerin yayılmasının önlenmesi nazofaringeal taşıyıcılığın çok yaygın bir kaynak olması nedeniyle oldukça zordur (29). Stafilokoklar, antibiyotiklerin çoğuna direnç geliştirebilme yeteneğine sahiptir. Son yıllara kadar vankomisin, metisiline dirençli stafilokoklar için etkili olma özelliğini sürdürmüş ve ciddi stafilokok enfeksiyonlarında kullanılan tek antibiyotiktir. Ancak son zamanlarda S. aureus suşlarında vankomisine karşı da düşük ve yüksek düzeyli olmak üzere direnç bulunmuştur. Bu nedenle stafilokok enfeksiyonlarının tedavisi oldukça zordur (29). 2.2.2. Enterococcus faecalis 2.2.2.1. Mikrobiyolojik Özellikleri Enterokoklar, tekli, ikili ya da kısa zincirler halinde görülen, fakültatif anaerop, gram pozitif koklardır. Sitokrom enzimleri içermediklerinden katalaz negatiftirler, fakat bazı türler zayıf psödokatalaz reaksiyonu verebilir (49, 50). Enterokokların çoğu grup D antiserumla reaksiyon verdiklerinden geçmişte grup D streptokoklar olarak sınıflandırılmışlardır. Klinik açıdan en önemli türler Enterococcus faecalis ve Enterococcus faecium dur. Çoklu antibiyotik dirençliliği özellikleriyle nozokomiyal infeksiyonların önemli etkenleri arasında yer alırlar (35). İdeal üreme ısısı 35 o C olmakla birlikte 10-45 o C arasında değişen bir üreme aralığına sahiptir. Eskülini % 40 safra varlığında hidrolize etmeleri, % 6.5 NaCl lü buyyonda üreyebilmeleri, ısıya karşı dirençli olmaları ve PYR (pyrrolidonyl-β-naphthylamide) pozitif olmaları tipik özellikleridir. Kanlı agarda alfa, beta veya gama hemoliz yapabilirler (51). 2.2.2.2. Epidemiyolojisi Enterokoklar barsağın normal flora üyelerindendir. Ancak, oral mukoz membranlara ve deriye de yerleşebilirler (35). İnsan gastrointestinal sisteminde, kadın genital yollarında,

15 nadiren oral kavite ve dental plaklarda bulunurlar (26). Kuruluk, yüksek ısı gibi çevresel koşullara ve bazı antiseptiklere dayanıklı olup, cansız yüzeylerde uzun süre yaşayabilirler (49, 51). İnsanlarda, esas olarak gastrointestinal florada bulunmaları nedeni ile gerek hastane gerekse hastane dışı ortamda endojen kaynaklı enfeksiyonlara yol açmaktadırlar. İnfantlar doğumdan hemen sonra kolonize olmaktadır. E. faecalis diğer enterokok türlerine göre dışkıda daha yüksek oranda bulunmaktadır. Hastane ortamında bulunan steteskop, kapı tokmağı, yatak gibi cansız maddeler üzerinde uzun süre yaşayabilmektedir. Dirençli enterokokların yayılımına elektronik termometreler de yardım edebilir. Bu nedenle enterokoklar gerek cansız maddeler aracılığı ile, gerekse sağlık personeli ile hastadan hastaya taşınarak hastane enfeksiyonu etkeni olarak salgınlara yol açabilmektedir. Son yıllarda yapılan epidemiyolojik çalışmalar, enterokokların hastadan hastaya ve hatta hastaneler arası yayılabilmesinde bu bakterilerin normal barsak florasında bulunmasının temel risk faktörü olduğunu göstermiştir (49). Genel olarak, E. faecalis tüm klinik enterokokkal enfeksiyonların en sık nedenidir. Son 20 yılda enterokokal enfeksiyonlarda artış dikkat çekicidir. Enterokoklar genellikle nozokomiyal enfeksiyon yapmaktadır ve son yıllarda nozokomiyal enfeksiyonlarda ve bakteriyemilerde üçüncü, üriner sistem ve yara enfeksiyonlarında da ikinci en sık etken olarak öne çıkmıştır. 1980 li yıllardan itibaren giderek artan vankomisin direnci ile birlikte nozokomiyal enterokokal enfeksiyonlarda 34 kat artış olmuştur. Epidemiyolojik çalışmalarda enterokok bakteriyemisine bağlı mortalite %30 un üzerinde tespit edilmiştir. Polimikrobiyal enfeksiyonların önemli bir parçası olduklarından tek başlarına morbidite ve mortaliteye olan etkilerini kestirmek zordur (26). 2.2.2.3. Virülans ve Patojenite Enterokoklar, klasik virulans faktörlerine veya toksinlere sahip değildirler. Ancak, çoklu antibiyotik dirençleri onlara antibiyotik tedavisi altında yaşama ve çoğalma olanağı sağlamaktadır. Bu nedenle sıklıkla süperenfeksiyon etkeni olarak ortaya çıkmaktadırlar. Enterokoklar, kalp kapakları ve renal epitelyum hücrelere bağlanma, böylece endokardit ve üriner enfeksiyon oluşturma yeteneğine sahiptirler.

16 Bazı E. feacalis türlerinin plazmidler aracılığı ile ürettiği hemolizlerinin de virulansta rol oynadığı öne sürülmüştür (26). 2.2.2.4. Oluşturdukları Enfeksiyonlar Enterokoklar, normal koşullarda sağlıklı kişilerde nadiren hastalık yaparlar. Ancak, konak direncinin zayıfladığı veya gastrointestinal ya da genitoüriner sistemin invaziv işlemlerden sonra zarar görmesi sonucu steril vücut bölgelerine yayılarak gelişebilen enfeksiyonlara neden olurlar (44). Enterokokların en sık neden olduğu enfeksiyon, çoğu nozokomiyal olarak gelişen üriner sistem enfeksiyonlarıdır. Özellikle invaziv girişim yapılan, yapısal anomalisi olan ve antibiyotik kullanan hastalarda üriner sistem enfeksiyonlarına yol açarlar (26). Genellikle altta yatan hastalığı olanlarda daha sık olmak üzere bakteriyemilere neden olurlar ve enterokokal bakteriyemilerin % 78 i nozokomiyaldir (52). Enterokoklar polimikrobiyal bakteriyemilerde en sık rastlanan gram pozitif bakterilerdir (26). Enterokokların oluşturduğu önemli bir enfeksiyon da infektif endokardittir. En sık genitoüriner sorunların ve dejeneratif kalp hastalığının arttığı 50 yaş üzeri populasyonda görülür. Prostetik kapak endokarditlerinin % 6-7 sinden sorumludur (26). Septisemi, hastane kaynaklı pnömoni, safra yolu enfeksiyonları, intraabdominal ve pelvik enfeksiyonlar ile yara ve dekübitus enfeksiyonları da sık oluşturdukları tablolardır (52, 53). 2.2.2.5. Antibiyotik Direnç Sorunu Penisilin G, ampisilin, vankomisin ve teikoplanin gibi hücre duvarına etkili ilaçlar, enterokokların çoğuna bakteriyostatik etkilidir. Enterokok enfeksiyonlarında bakterisidal etki, bu hücre duvarına etkili ajanlardan biri ile streptomisin veya gentamisinin kombine kullanımı ile elde edilir. Enterokoklar, sefalosporinler, monobaktamlar ve antistafilokokkal penisilinlere intrensek (türe özgü) direnç gösterirken, düşük veya orta derecede klindamisin ve aminoglikozid direnci göstermektedirler. E. faecalis için penisilinin minimal inhibitör konsantrasyonları streptokoklara göre 10-1000 misli yüksektir (49, 50). Bu bakteriler geleneksel tedavi

17 seçeneklerine gittikçe artan oranlarda direnç geliştirmektedirler. Beta-laktamaz üretimi, yüksek düzeyli aminoglikozid ve penisilin direnci geliştirmeleri ve glikopeptidlere direnç görülmesi, klinisyenin tedavi seçeneklerini kısıtlamaktadır (54). 2.3. ANTİMİKROBİYAL DUYARLILIK TESTLERİ Bir enfeksiyonun tedavisi ile ilgili uygun antimikrobik ajanın seçiminde; olası enfeksiyon etkeni, infeksiyon etkeninin antibiyotik duyarlılığı, ilacın in vivo aktivitesini etkileyebilecek konak faktörleri, infeksiyonun yeri, ilacın farmakodinamik ve farmakokinetik özellikleri gibi bir dizi faktörün değerlendirilmesi gereklidir (55). Bir antibiyotiğin ya da etken maddenin antimikrobik aktivitesinin saptanması için uygulanan in vitro işlemlere genel olarak duyarlılık testleri adı verilmektedir. Antimikrobik ilaçlara karşı duyarlılık birçok yöntem ile saptanabilmektedir (56). Bu amaçla uygulanan yöntemler: 1.Disk difüzyon testi 2.Dilüsyon testleri a. Agar dilüsyon testi b. Sıvı (broth) dilüsyon testi Makrodilüsyon Mikrodilüsyon 3. E Test 4. Otomatize Sistemler 2.3.1. Disk Difüzyon Testi Mueller-Hinton agar (MHA) besiyerine, doğrudan koloni süspansiyonu yöntemi ile 0.5 McFarland (10 8 CFU/ml) standart bulanıklığa ayarlanmış inokülumun, eküvyon kullanılarak yayılması ve test edilecek antibiyotik / etken madde emdirilmiş disklerin yerleştirilmesi ile yapılır. Mikroorganizmanın türüne göre uygun koşullarda (sıcaklık, süre) inkübe edilir. Bu süreçte, diskteki antibiyotik / etken madde agar içerisine yayılır ve mikroorganizmaya etkili olduğu düzeylerde üremeyi engeller. Bunun sonucunda, disk çevresinde mikroorganizmanın üremediği dairesel bir inhibisyon alanı oluşur (Şekil

18 2.3). Bu alanın çapı ölçülerek duyarlı, orta ve dirençli olacak şekilde duyarlılık kategorileri belirlenir (57). Şekil 2.3. Disk çevresinde mikroorganizmanın üremediği dairesel inhibisyon alanları 2.3.2. Dilüsyon testleri a. Sıvı Dilüsyon Testi Dilüsyon testlerinde standart sayıda mikroorganizma içeren inokulum (son konsantrasyon 5x10 5 CFU/ml), iki katlı dilüsyonlar şeklinde değişen yoğunluklarda antimikrobik ajan ya da etken madde ile karşılaştırılır. İnkübasyon süresi sonunda gözle görünür üremeyi engelleyen en düşük antimikrobik ilaç / etken madde yoğunluğu saptanır. Buna Minimum İnhibitör Konsantrasyon (MİK) denir ve (mg/l) şeklinde ifade edilir. MİK değerinin duyarlılığı mı yoksa direnci mi temsil ettiğini belirlemek için, bulunan konsantrasyon duyarlılık sınırı adı verilen bir değer ile karşılaştırılır. MİK, bu sınırdan düşük ise mikroorganizma söz konusu ajana duyarlı olarak değerlendirilir. Dilüsyon testleri kantitatif sonuç verdiği için tercih edilmektedir (55). Sıvı besiyerindeki seyreltme yöntemleri, tüpte uygulanılıyorsa makrodilüsyon (Şekil 2.4), mikroplateler kullanılıyorsa mikrodilüsyon olarak adlandırılır (Şekil 2.5).

19 Şekil 2.4. Sıvı makrodilüsyon yöntemi Şekil 2.5. Sıvı mikrodilüsyon yöntemi b. Agar Dilüsyon Testi Sıvı mikrodilüsyon yöntemine benzemektedir. Antibiyotik / etken maddenin dilüsyonları, eritilmiş ve 48-50 o C ye getirilmiş sıvı agar ile karıştırılıp petrilere dökülür. Antibiyotik ya da etken madde içeren bu agarın donmasından sonra bakteri süspansiyonu son konsantrasyonu 10 4 CFU/ damla olacak şekilde inoküle edilir. Plaklar mikroorganizmanın türüne göre uygun koşullarda (sıcaklık, süre) inkübe edilir. İnkübasyon sonunda üremenin durduğu en düşük konsantrasyon MİK olarak belirlenir. Antibiyotik ya da etken madde içermeyen MHA plakları, kontrol olarak kullanılır (58).

20 2.3.3. E Test Difüzyon temeline dayanan ancak diskler yerine belirli ve sürekli bir konsantrasyon değişimi olacak şekilde antibiyotik ya da etken madde emdirilmiş plastik striplerin kullanldığı bir yöntemdir. Test stripleri inokülumla kaplı agar yüzeyine yerleştirilir. Antimikrobiyal / etken madde agara diffüzyonla yayılır. İnkübasyon süresi sonunda eliptik bir inhibisyon zonu oluşur, bu zonun stripi kestiği konsantrasyon MİK olarak belirlenir (Şekil 2.6) (59, 60). Şekil 2.6. E test yöntemi 2.3.4. Otomatize Sistemler Antibiyotik duyarlılık testleri konvansiyonel yöntemler dışında hızlı otomatize sistemlerle de yapılabilir. Bu sistemlerde duyarlılık sonuçları konvansiyonel yöntemlerinden daha erken alınır ve iş gücü ihtiyacını azaltır. Ayrıca manuel giriş yapılmadan sonuçlar bilgisayara aktarılabildiğinden, hatalı sonuç girilmesi engellenir. Pahalı olması otomatize sistemlerin en önemli dezavantajını oluşturur (Şekil 2.7) (61).

Şekil 2.7. Otomatize sistem örneği 21

22 3. GEREÇ ve YÖNTEM 3.1. BESİYERLERİNİN HAZIRLANMASI 3.1.1. Kanlı Agar Besiyerinin Hazırlanması İçeriği (g/ L): Enzymatic digest of casein...7.5 Enzymatic digest of animal tissue...7.5 Liver digest...2.5 Yeast extract...5.0 Sodium chloride...5.0 Agar...2.0 ph...7.4 Kanlı agar besiyeri (Acumedia, USA), ticari toz besiyerinden üreticinin tarif ettiği şekilde hazırlandı. 39.5 gram toz 1 litre distile suda çözüldü. Otoklavda (Hirayama, Japonya) 121 o C de 15 dk sterilize edildi. Besiyeri sıcaklığı 45-50 o C ye düştükten sonra %5 (v/v) steril defibrine koyun kanı ilave edildi. 90 mm lik petrilere 25 ml dökülerek kanlı agar besiyeri hazırlandı. Kullanılıncaya kadar +4 o C de saklandı.

23 3.1.2. Mueller Hinton Broth Besiyerinin Hazırlanması İçeriği (g/ L): Beef infusion solids...4.0 Starch...1.5 Casein hidrolisate...17.5 Mueller Hinton Broth (MHB) besiyeri (Fluka, Spain) ticari toz besiyerinden üreticinin tarif ettiği şekilde hazırlandı. 23 gram toz 1 litre distile suda çözüldü. Otoklavda 121 o C de 15 dk sterilize edildi. Kullanılıncaya kadar +4 o C de saklandı. 3.2. MİKROORGANİZMALARIN HAZIRLANMASI 3.2.1. Çalışmada Kullanılan Mikroorganizmalar Çalışmada kullanılan mikroorganizmalar şunlardır: Staphylococcus aureus American Type Culture Collection (ATCC) 25923 Enterococcus faecalis ATCC 29212 3.2.2. Mikroorganizmaların Üretilmesi Farmasötik Mikrobiyoloji Laboratuvarı nda mevcut bulunan ve -20 C de muhafaza edilen mikroorganizma stok kültürlerinden, steril koşullar altında öze yardımıyla taze hazırlanmış kanlı agar besiyerlerine pasaj yapıldı (Şekil 3.1). Bakteri inokülasyonu yapılan petriler 37 C lik inkübatörde (Nüve, Türkiye) 18-24 saat süre ile inkübasyona bırakıldı (Şekil 3.2).

24 Şekil 3.1. Bakterilerin inokülasyonu Şekil 3.2. Çalışmada kullanılan inkübatör 3.2.3. Mikroorganizma Konsantrasyonlarının Ayarlanması İnkübasyon sonunda kanlı agar besiyerlerinde üremiş kolonilerden öze yardımıyla birkaç adet alınarak serum fizyolojik içeren steril cam tüplerde mikroorganizma süspansiyonları hazırlandı. Tüpler yaklaşık 2 saat 37 C lik inkübatörde inkübe edildi. Logaritmik faza kadar üretilmiş her bir bakteri inokülumu, türbidometre cihazı (BD, PhoenixSpec, Nephelometer, USA) kullanılarak 0.5 McFarland (1.5 x 10 8 CFU/ml) standart bulanıklıkta olacak şekilde ayarlandı (Şekil 3.3) (58). Bu süspansiyon, MHB ile 1/100 oranında dilüe edilerek, 10 6 CFU/ml konsantrasyonu elde edildi.

25 Şekil 3.3. Türbidometre cihazı 3.3. KAPSAİSİN 3.3.1. Kapsaisin Eldesi Çalışmada ticari olarak hazır formda bulunan toz kapsaisin (Sigma-Aldrich, USA) kullanıldı. 3.3.2. Kapsaisin Konsantrasyonunun Ayarlanması Kapsaisinin toz formundan 10 mg tartılarak 10 ml % 40 lık DMSO da çözüldü. Böylece 1 mg/ml stok konsantrasyon elde edilmiş oldu. Bu çözelti, çapı 0.2 µm olan steril membran filtreden süzülerek steril hale getirildi. Stok solüsyondan aşağıdaki formül kullanılarak 3.9-500 µg/ml arasında ikişer kat kapsaisin konsantrasyonları hazırlandı. C 1 x V 1 = C 2 x V 2 3.4. ANTİMİKROBİYAL DUYARLILIK TESTİ 3.4.1. Sıvı Mikrodilüsyon Testi Çalışmada kapsaisinin, S. aureus ve E. faecalis e karşı antimikrobiyal etkinliğinin araştırılmasında Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) nın önerileri doğrultusunda sıvı mikrodilüsyon testi uygulandı. Bu amaçla Steril U tabanlı, 96 kuyucuklu mikrodilüsyon plakları kullanıldı (Şekil 3.4). Her bir kuyucuğa 50 µl Mueller-Hinton sıvı besiyeri konuldu. İlk kuyucuğa kapsaisinin stok solüsyonundan 50

26 µl konularak son kuyucuğa kadar seri dilüsyonlar yapıldı. Hazırlanan bakteri süspansiyonundan (10 6 CFU/ml) her kuyucuğa 50 µl inoküle edildi. Böylece kuyucuklardaki son inokülum konsantrasyonu 5x10 5 CFU/ml oldu. Plaklar 37 o C de 24 saat inkübe edildi. İnkübasyon sonunda üremenin görülmediği en düşük konsantrasyon, o suş için minimal inhibitör konsantrasyon (MİK) olarak değerlendirildi (58). Her bir bakteri için MİK saptanan değerlerde, kapsaisin içermeyip sadece DMSO içeren kuyucuklar hazırlanarak çözücünün inhibitör etkisinin olup olmadığı araştırıldı. Şekil 3.4. Çalışmada kullanılan 96 kuyucuklu mikrodilüsyon plağı Çalışılan her bir mikroorganizmanın inkübasyon süresince üreyip üremediğinin kontrolü amacıyla (üreme kontrolü) kapsaisin içermeyen bakteri inokülumu inkübasyona bırakıldı. Ayrıca kullanılan sıvı besiyerinin sterilite kontrolü amacıyla her plakta iki kuyucukta saf besiyeri inkübasyona bırakıldı. Test yapılırken bakteri üremesine inhibitör etkinin gösterilmesi (pozitif kontrol) amacıyla gentamisin (2 µg/ml) kullanıldı.

27 4. BULGULAR 4.1. MİKROORGANİZMA GÖRÜNTÜLERİ Farmasötik Mikrobiyoloji Laboratuvarı nda mevcut bulunan ve -20 C de muhafaza edilen S. aureus ve E. faecalis standart suşlarına ait stok kültürlerden, kanlı agar besiyerlerine yapılan ekimler sonucu üreyen mikroorganizma kolonileri Şekil 4.1 ve 4.2 de gösterilmiştir. Şekil 4.1. Kanlı agarda üreyen Staphylococcus aureus kolonileri Şekil 4.2. Kanlı agarda üreyen Enterococcus faecalis kolonileri

28 4.2. SIVI MİKRODİLÜSYON TESTİ SONUÇLARI Çalışmada kapsaisinin, S. aureus ve E. faecalis e karşı antimikrobiyal etkinliğinin araştırılmasında sıvı mikrodilüsyon testi uygulandı. S. aureus için kapsaisinin 3.9-62.5 µg/ml konsantrasyonlarında üreme gözlenirken, 125 µg/ml ve üzeri konsantrasyonlarda üreme gözlenmedi. O nedenle, kapsaisinin S. aureus için MİK değeri 125 µg/ml olarak değerlendirildi (Tablo 4.1). E. faecalis için kapsaisinin 3.9-31.25 µg/ml konsantrasyonlarında üreme gözlenirken, 62.5 µg/ml ve üzeri konsantrasyonlarda üreme gözlenmedi. O nedenle, kapsaisinin E. faecalis için MİK değeri 62.5 µg/ml olarak değerlendirildi (Tablo 4.1). Tablo 4.1 Sıvı mikrodilüsyon yöntemi sonuçlarına göre kapsaisinin antimikrobiyal etkisi Mikroorganizmalar Kapsaisin (µg/ml) 31.25 62.5 125 250 500 + + - - - Staphylococcus aureus + + - - - + - - - - Enterococcus faecalis + - - - - +; Üreme var, -; Üreme yok Not: Çalışılan tüm mikroorganizmalar için 31.25 µg/ml nin altındaki tüm konsantrasyonlarda üreme saptandı Çalışma sonucunda kuyucuklarda gözlenen üremeler Şekil 4.3 te gösterilmiştir.