ÇUKUROVA BÖLGESİNDE KORDON KANI GLUKOZ 6 FOSFAT DEHİDROGENAZ AKTİVİTESİ, YAPISI, MOLEKÜLER ÖZELLİĞİ VE YENİDOĞAN HİPERBİLİRUBİNEMİSİ ÜZERİNE ETKİSİ

T.C. ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİ NEONATOLOJİ BİLİM DALI ÇUKUROVA BÖLGESİNDE KORDON KANI GLUKOZ 6 FOSFAT DEHİDROGENAZ AKTİVİTESİ, YAPISI, MOLEKÜLER ÖZELLİĞİ VE YENİDOĞAN HİPERBİLİRUBİNEMİSİ ÜZERİNE ETKİSİ Uzm. Dr. FERDA ÖZLÜ YAN DAL UZMANLIK TEZİ TEZ YÖNETİCİSİ Prof. Dr. Mehmet SATAR ADANA 2007

T.C. ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİ NEONATOLOJİ BİLİM DALI ÇUKUROVA BÖLGESİNDE KORDON KANI GLUKOZ 6 FOSFAT DEHİDROGENAZ AKTİVİTESİ, YAPISI, MOLEKÜLER ÖZELLİĞİ VE YENİDOĞAN HİPERBİLİRUBİNEMİSİ ÜZERİNE ETKİSİ Uzm. Dr. FERDA ÖZLÜ YAN DAL UZMANLIK TEZİ TEZ YÖNETİCİSİ Prof. Dr. Mehmet SATAR DESTEKLEYEN BİRİM: Çukurova Üniversitesi Bilimsel Projeler Araştırma Birimi ADANA 2007

TEŞEKKÜR Neonatoloji yan dal eğitimim sırasında birlikte çalışmaktan büyük mutluluk duyduğum, birikimiyle eğitimimi pekiştiren başta tez yöneticim Sayın Prof Dr Mehmet SATAR olmak üzere Prof Dr Nejat NARLI ya, Doç Dr Hacer Y YAPICIOĞLU na, Uzm Dr Kenan ÖZCAN a, Uzm Dr Erdal TAŞKIN a ve bütün Yenidoğan Yoğun Bakım Ünitesi çalışanlarına, araştırma görevlileri ve intörn doktor arkadaşlara ayrı ayrı teşekkür ederim. Tez çalışmamda biyokimyasal çalışmaları titizlikle gerçekleştiren Sayın Prof.Dr. Kıymet AKSOY a, Dr Şule Menziletoğlu YILDIZ a, Uzm İsa ÜNLÜKURT a teşekkür ederim. Kordon kanı toplanması sırasında destek veren başta Sağlık Bakanlığı olmak üzere Adana Doğumevi, Çukurova Kadın Doğum ve Çocuk Hastalıkları Hastanesi çalışanlarına teşekkür ederim. Yan dal uzmanlık eğitimim süresince desteğini hep hissettiğim sevgili eşime teşekkür ederim. Tez çalışmamı TF2004LTP15No lu proje olarak destekleyen Çukurova Üniversitesi Bilimsel Projeler Araştırma Birimi ne ayrıca teşekkür ederim. Uzm Dr Ferda Özlü Adana / 2007 i

İÇİNDEKİLER TEŞEKKÜR i İÇİNDEKİLER ii ŞEKİL LİSTESİ v TABLO LİSTESİ vi KISALTMALAR vii ÖZET VE ANAHTAR SÖZCÜKLER viii ABSTRACT-KEY WORDS x 1.GİRİŞ VE AMAÇ 1 2.GENEL BİLGİ 3 2.1. Yenidoğan sarılığı 3 2.2. Yenidoğan sarılığının fizyolojisi 3 2.2.1 Bilirubin sentezi 4 2.2.2 Bilirubinin plazma transportu 4 2.2.3 Bilirubin metabolizması ve karaciğerdeki transportu: 5 2.2.4 Alımı 5 2.2.5 Konjugasyon 6 2.2.6 Atılımı 6 2.2.7 Enterohepatik sirkülasyon 6 2.3 Yenidoğan sarılığının epidemiyolojisi 7 2.3.1 Irk, ailesel ve genetik faktörler. 7 2.3.2 Doğuma ait faktörler 8 2.3.3 Bebeğe ait faktörler 8 2.4 Anne sütü ve sarılık 8 2.5 Fizyolojik sarılık 9 2.6 Yenidoğanda patolojik sarılık 10 2.6.1 Rh uyuşmazlığı 11 2.6.2 ABO uyuşmazlığı 12 2.6.3 Eritrosit membran defektleri 12 ii

2.6.4 Hemoglobinopatiler 12 2.6.5 Polisitemi 13 2.6.6 Azalmış bilirubin atılımı 13 2.6.6.1 Criggler Najjar Sendromu 13 2.6.6.2 Gilbert Sendromu 13 2.6.7 Doğuştan metabolizma hastalıkları 14 2.6.7.1 Galaktozemi 14 2.6.8 Hipotiroidizm 14 2.6.9 Eritrosit enzim defektleri 14 2.6.9.1 Pirüvat kinaz eksikliği: 14 2.6.9.2 Glukoz 6 fosfat dehidrogenaz eksikliği ( G6PD enzim eksikliği): 14 2.6.9.2.1 Glukoz 6 fosfat Dehidrogenaz Enziminin Genetik Özellikleri 18 2.6.9.2.3. Türkiye de Saptanan G6PD Varyantları 20 EÇ 3.GEREÇ VE YÖNTEM 22 3.1. Gereçler 22 3.2. Enzim Kinetik Çalışma 23 3.2.1. G6PD Aktivitesinin Kantitatif Ölçümü 23 3.2.1.1. Hemolizat Hazırlanması 23 3.2.1.2. Yöntem 24 3.2.2. G6PD Enziminin Kısmi Saflaştırılması 24 3.2.2.1. Ayıraçlar 25 3.2.2.2 Yöntem 26 3.2.3. Kısmi saflaştırılan enziminin kinetik özelliklerinin incelenmesi 26 3.2.3.1. Ayıraçlar 27 3.2.4. Moleküler Çalışma 31 3.2.4.1. DNA Eldesi 31 3.2.4.1.1. Ayıraçlar 31 3.2.4.1.2. Yöntem 32 3.2.4.2. Polimeraz Zincir Reaksiyonu 33 3.2.4.2.1. Ayıraçlar 33 iii

3.2.4.3. Amplifiye G6PD Gen Ürününün Restriksiyon Endonükleaz ile 34 Kesilmesi (RFLP) 3.2.4.4. Agaroz Jel Elektroforezi 35 3.2.4.4.1. Ayıraçlar 35 3.2.4.4.2. Yöntem 36 3.2.4.5. Mikroarray çalışma 37 4.BULGULAR 38 5.TARTIŞMA 48 6.SONUÇ ve ÖNERİLER 52 7.KAYNAKLAR 53 8.ÖZGEÇMİŞ 61 iv

ŞEKİL LİSTESİ Şekil no Sayfa no Şekil 1: Glukoz- 6-fosfat dehidrogenaz geni 18 Şekil 2: Eritrositlerdeki G6PD nin oksidan ajanlara karşı ana metabolik rolü 19 Şekil 3: Olguların Gd Akdeniz mutasyonunun elektroforetik görünümü 40 Şekil 4a: BEBEK O.K nın KmG6P eğrisi 41 Şekil 4b: BEBEK O.K nın KmNADP eğrisi 41 Şekil 4c: BEBEK O.K nın ph eğrisi 41 Şekil 5a: BEBEK F nin KmG6P eğrisi 42 Şekil 5b: BEBEK F nin KmNADP eğrisi 42 Şekil 5c: BEBEK F nin ph eğrisi 42 Şekil 6a: BEBEK İ nin KmG6P eğrisi 43 Şekil 6b: BEBEK İ nin KmNADP eğrisi 43 Şekil 6c: BEBEK İ nin ph eğrisi 43 Şekil 7a: BEBEK K nin KmG6P eğrisi 44 Şekil 7b: BEBEK K nin KmNADP eğrisi 44 Şekil 7c: BEBEK K nin ph eğrisi 44 Şekil 8a: BEBEK D nin KmG6P eğrisi 45 Şekil 8b: BEBEK D nin KmNADP eğrisi 45 Şekil 8c: BEBEK D nin ph eğrisi 45 Şekil 9a: BEBEK G nin KmG6P eğrisi 46 Şekil 9b: BEBEK G nin KmNADP eğrisi 46 Şekil 9c: BEBEK G nin ph eğrisi 46 v

TABLO LİSTESİ Tablo no Sayfa no Tablo I: Patolojik indirekt hiperbilirubinemi nedenleri 10 Tablo II: Hemolize yol açan ilaç ve kimyasallar 16 Tablo III: İnsan G6PD sinin Moleküler Özellikleri 19 Tablo IV: En yaygın gözlenen G6PD varyantlarının kinetik özellikleri 20 Tablo V: Türkiye de saptanan G6PD varyantları 21 TabloVI: G6PD ölçümü 24 Tablo VII: Kısmi saflaştırılan G6PD ait Km NADP değerinin saptanması 28 Tablo VIII: Kısmi saflaştırılan G6PD ait Km G6P değerinin saptanması 29 Tablo IX: Kısmi saflaştırılan G6PD ye ait analog çalışması 30 Tablo X: PCR karışımı 34 Tablo XI: RFLP karışımı 35 Tablo XII: Olguların klinik bulguları 39 Tablo XIII: Olguların Kinetik Bulgularının GdB+ ve Gd Akdeniz mutasyonu ile 47 karşılaştırılması vi

KISALTMALAR CO DNA Ig G6P G6PD Gal-6-P Gd A - Gd A + Gd B Gd Akdeniz GSH GSSH HMY MgCl 2 NAD NADP NADPH PCR SDS-PAGE UDPGT-1 Karbonmonoksit Deoksiribonükleik asit İmmünglobulin Glukoz-6-fosfat Glukoz 6 fosfat dehidrogenaz Galaktoz-6-fosfat A - tipi glukoz-6-fosfat dehidrogenaz varyantı A + tipi glukoz-6-fosfat dehidrogenaz varyantı B tipi glukoz-6-fosfat dehidrogenaz varyantı Akdeniz tipi glukoz-6-fosfat dehidrogenaz varyantı Redükte glutatyon Okside glutatyon Heksoz monofosfat yolu Magnesyumdiklorür Nikotinamit adenin dinükleotit Nikotinamit adenin dinükleotit fosfat Redükte nikotinamit adenin dinükleotit fosfat Polimeraz zincir reaksiyonu Sodyum dodesül sülfat poliakrilamit jel elektroforezi Üridindifosfoglukuronat glukuronil transferaz-1 vii

ÖZET Çukurova Bölgesinde Kordon Kanı Glukoz 6 Fosfat Dehidrogenaz Aktivitesi, Yapısı, Moleküler Özelliği ve Yenidoğan Hiperbilirubinemisi Üzerine Etkisi Yenidoğan indirekt hiperbilirubinemisinin en sık nedenleri kan grubu uyuşmazlıkları ve eritrosit enzim defektleridir. Daha önce Çukurova bölgesinde yapılan çalışmalarda indirekt hiperbilirubinemi olgularında glukoz 6 fosfat dehidrogenaz (G6PD) eksikliği %10-11,5 arasında tesbit edilmiştir. İlaç alımına bağlı hemolitik anemi, enfeksiyona bağlı hemolitik anemi ve yenidoğan sarılığı, glukoz 6 fosfat dehidrogenaz eksikliği ile ilgili patolojilerdir. Kinetik çalışmalar, glukoz 6 fosfat dehidrogenaz enzim eksikliği olan yenidoğanlarda şiddetli hiperbilirubinemiye eğilim olduğunu göstermektedir. Gd Akdeniz mutasyonu elektroforetik olarak normal bir hareketliliğe sahip %0-10 arasında bir aktivite gösteren ve Akdeniz bölgesindeki beyazlarda daha sık olarak gözlenen bir mutasyondur. Bu çalışmada glukoz 6 fosfat dehidrogenaz eksikliği olan hastaların enzim kinetiklerinde ve mutasyondaki farklılıkların yenidoğan döneminde ortaya çıkabilen hiperbilirubinemiye etkisi, glukoz 6 fosfat dehidrogenaz kinetiğindeki farklılıklarının hiperbilirubineminin şiddetindeki rolü ve Çukurova bölgesindeki glukoz 6 fosfat dehidrogenaz varyasyonlarını araştırmayı amaçladık. Çukurova Üniversitesi Balcalı Hastanesi, Adana Meydan Doğumevi, Çukurova Kadın Doğum ve Çocuk Hastalıkları Hastanesi nde 1 Kasım 2004-30 Kasım 2007 tarihleri arasında doğan 200 sağlıklı term erkek bebek alındı. Enzim eksikliği X e bağlı ressesif geçişli olduğu, heterozigot kızlarda enzim aktivitesi oldukça geniş farklılıklar gösterdiği ve bu nedenle tarama testleri ile tanı alamayabilecekleri için kız bebekler bu çalışmaya alınmadı. Ayrıca prematür doğanlar, konjenital malformasyonu olan, mekonyum aspirasyonu olan, doğumun birinci saattindeki kan gazlarına göre perinatal asfiksisi olan, doğum haftasına göre ağırlığı düşük olan bebekler çalışma dışında tutuldu. Laboratuvara gelen kan örneklerinden glukoz 6 fosfat dehidrogenaz düzeyleri belirlendi. Enzim düzeyi düşük olan örneklerde kinetik çalışma yapıldı. Ayrıca saflaştırılan örneklerin DNA ları izole edilerek moleküler çalışma yapıldı. Çalışmaya alınan glukoz 6 fosfat dehidrogenaz enzim eksikliği saptanan bebeklerin ve annelerinin kan grupları, bebeklerin kord kanında tam kan sayımı, direkt Coombs testi, total bilirubin, direkt bilirubin, retikülosit düzeyleri çalışıldı. Bebeklerin total bilirubin ve direkt bilirubin, hematokrit düzeyleri 3., 5., 7., 10. ve 15. günde kapiller kanda takip edildi. Amerikan Pediatri Akademisinin önerileri doğrultusunda bilirubin düzeylerine göre tedavi alması gerekenlere fototerapi veya kan değişimi uygulandı. 200 erkek bebekten altısında G6PD eksikliği saptandı (%3). Üç olguda Gd Akdeniz mutasyonu saptandı. Gd Akdeniz mutasyonu saptanan iki hastanın hiperbilirubinemi için tedavi gerektirecek kadar bilirubin düzeyleri yükselirken, bir hastanın bilirubin takiplerinde yükselme olmadı. Bu farklı klinik seyirde mutasyonun yanında kinetik farklılığında rolu olduğu düşünüldü. Mutasyonu saptanamayan diğer üç olgudan birinde kan değişimi gerektirecek kadar yükselen hiperbilirubinemi gelişirken, diğer iki olguda tedavi gerekmedi. Tüm olguların takibinde hemoliz saptanmadı. Bu viii

konuda daha fazla olgu çalışması ve mutasyon analizlerinin yapılmasına ihtiyaç olduğu düşünüldü. Anahtar Sözcükler: enzim kinetiği ve mutasyonu, glukoz 6 fosfat dehidrogenaz eksikliği, hiperbilirubinemi, yenidoğan. ix

ABSTRACT Glucose 6 Phosphate Activity, Structure, Molecular Property and Effect On Neonatal Hyperbilirubinemia in Cord Blood in Çukurova Region The most common factors in etiology of the neonatal hyperbilirubinemia are blood group incompatibility and erythrocyte enzyme defects. The incidance of glucose 6 phosphate dehydrogenase deficiency in Çukurova region was 10-11, 5% in the former reports. Hemolytic anemia caused by medications and infections and neonatal hyperbilirubinemia are the main pathologies related to G6PD deficiency. Kinetic studies demonstrated a tendency to severe hyperbilirubinemia in G6PD deficient neonates. Gd Mediterranean, a common mutation in white race native to Mediterranean region, has a normal motility in electrophoretic studies and presents 0-10% activity. The aim of this study is to demonstrate the effect of variations in the enzyme kinetics and mutations on the neonatal hyperbilirubinemia in the G6PD deficient patients, the role of kinetic variations on the severity of neonatal hyperbilirubinemia and the glucose 6 phosphate dehydrogenase variations in Çukurova Region. 200 healthy term male neonates born at Çukurova University Balcalı Hospital, Adana Meydan Maternity Hospital, Çukurova Maternity and Children Hospital between1 November 2004-30 November 2007 were enrolled in this study. The female neonates were not involved in this study because the enzyme is inherited X linked recessive, enzyme activity shows great difference in heterozygote females and the probability of failure to diagnose the enzyme deficient females with this scanning tests. In addition, premature infants, with congenital malformations, meconium aspiration, perinatal asphyxia due to arterial blood gases results at the first hour of life, small neonates for gestational age are excluded in this study. In the laboratory G6PD levels evaluated from blood specimens. Kinetic studies are done in the enzyme deficient neonates. Also DNA of these neonates are purified and molecular studies performed. Blood groups of the neonates and the mothers, complete blood count, direct coombs, total bilirubin, direct bilirubin levels, reticulocyte counts of the enzyme deficient neonates evaluated. Total bilirubin, direct bilirubin and hemotocrit levels of the neonates were followed in 3rd, 5th, 7th, 10th and 15th days of life from capillary blood. Phototherapy or blood exchange performed according to the American Academy of the Pediatrics protocol for hyperbilirubinemia. Enzyme deficiency was detected in six out of 200 neonates (3%). Gd Med mutation was being detected in three enzyme deficient neonates. Two of these three enzyme deficient neonates had increased bilirubin levels needed for treatment, but one of neonates did not need treatment because of lower bilirubin levels. It is supposed that kinetic variation can play role in this different clinical progress. One of three enzyme deficient neonates without mutation had severe hyperbilirubinemia and blood exchange was being performed. Two of the neonates without mutation did not need any treatment for hyperbilirubinemia. Hemolysis is diagnosed in none of the enzyme deficient neonates. More studies about this subject for mutation analysis in a larger population is needed. x

Key Words: enzyme kinetics and mutation, glucose 6 phosphate deficiency, hyperbilirubinemia, neonate xi

1.GİRİŞ Yenidoğan indirekt hiperbilirubinemisinin en sık nedenleri kan grubu uyuşmazlıkları ve eritrosit enzim defektleridir. Daha önce Çukurova bölgesinde yapılan çalışmalarda indirekt hiperbilirubinemi olgularında glukoz 6 fosfat dehidrogenaz (G6PD) eksikliği %10-11,5 arasında tesbit edilmiştir 1. Glukoz 6 fosfat dehidrogenaz pentoz fosfat yolunun ilk ve hız sınırlayıcı enzimidir. Glukoz 6 fosfat dehidrogenaz eksikliği bilinen en yaygın kalıtsal enzim defektidir ve dünyada 400 milyondan fazla insanı etkilemektedir. Glukoz 6 fosfat dehidrogenaz eritrositlerin stabilitesinin ve yaşama kabiliyetinin teminatıdır. Eritrositlerde G6PD eksikliğinin ortaya çıkarılması hematoloji adına 1950 li yıllarda atılmış büyük bir adımdır. Glukoz 6 fosfat dehidrogenaz eksikliği, eritrositlerin genel özellikleri ile çevresel faktörlerin birbirini etkileyerek hemolize nasıl yol açtıklarını araştırmada bir model oluşturmaktadır. İlaç alımına (ör: antimalaryal ilaçlar) bağlı hemolitik anemi, enfeksiyona bağlı hemolitik anemi ve yenidoğan sarılığı, G6PD eksikliği ile ilgili patolojilerdir. Kinetik çalışmalar, G6PD enzim eksikliği olan yenidoğanlarda şiddetli hiperbilirubinemiye eğilim olduğunu göstermektedir 2. Dünyada da 400 milyon insanda bu enzim eksikliği olduğu bilinmektedir. Özellikle Akdeniz ülkelerinde bu enzim eksikliğine daha sık rastlanmaktadır. Dünya Sağlık Örgütünün kriterlerine göre (biyokimyasal, kinetik ve klinik) 442 farklı G6PD varyantı tanımlanmıştır. Dünyada en yaygın olarak bulunan enzim tipi diğer varyantların tanımlanmasında ölçüt olarak kullanılan GdB+dir. Tüm populasyon gruplarında çalışılmış en genel enzim tipidir. Gd Akdeniz elektroforetik olarak normal bir hareketliliğe sahip %0-10 arasında bir aktivite gösteren ve Akdeniz bölgesindeki beyazlarda daha sık olarak gözlenen bir mutasyondur 3. Bölgemizden Adana, Balcalı ve Samandağ isimleriyle rapor edilen varyantlar elektroforezde kat ettikleri yol, optimum ph, Km değerleri, substrat analoglarını kullanabilme yetenekleri, inhibitörleri ve sıcaklık stabiliteleri normal enzim ile karşılaştırılarak saptanmıştır 4. 1

Kord kanında enzim mutasyonu araştırmak amacıyla Malezya dan yapılan bir çalışmada sarılığı olan olgularda G6PD Viancghan, G6PD Mahidol ve G6PD Akdeniz mutasyonları sık bulunmuş ancak sarılık kliniği açısından üç mutasyon arasında fark gösterilememiştir 5. Bölgelerindeki G6PD mutasyon farklılıklarını araştırmak amacıyla Hindistan dan yapılan başka bir çalışmada G6PD Akdeniz mutasyonu sık bulunmuş ve G6PD Kerala-Kalyan ve Orissa mutasyonlarının Hint orijinli olgularda belirgin olduğu gösterilmiştir 6. Glukoz 6 fosfat dehidrogenaz geni 13 eksondan ve 12 introndan oluşmaktadır. Enzimin fonksiyonunu belirleyen G6PD genini 515 amino asit kodlamakta olup mrna sı 18 500 baz çifti uzunluğundadır. Genel olarak birden fazla alt birimden oluşan G6PD nin sentezinden yalnız bir yapısal gen sorumlu olduğu için enzim tek tip alt birim içermektedir. İnsana ait G6PD enziminin aktif formda iken moleküler ağırlıkları 59 265 dalton olan 2 veya 4 alt birimden oluşmaktadır 7,8. Ancak son yıllarda bu yöntemlere ilaveten enzimin amino asit dizisinden ve oligonükleotit probların hazırlanması ile cdna dizisindeki nükleotit farklılığından yararlanılarak moleküler düzeyde varyant analizi yapılmaya başlanmıştır 4. Bölgemizde daha önce kord kanındaki enzim düzeyleri ile ilgili çalışma yapılmış olmasına rağmen ve enzim kinetik farklılığının hiperbilirubinemi üzerine etkisi hakkında yapılmış bir çalışma bulunmamaktadır. Bu çalışmada glukoz 6 fosfat dehidrogenaz eksikliği olan ve olmayan hastaların enzim kinetiklerinde ve mutasyondaki farklılıkların yenidoğan döneminde ortaya çıkabilen hiperbilirubinemiye etkisi, G6PD kinetiğindeki farklılıklarının hiperbilirubineminin şiddetindeki rolü ve Çukurova bölgesindeki G6PD varyasyonlarını araştırmayı amaçladık. 2

2. GENEL BİLGİLER 2.1 YENİDOĞAN SARILIĞI Sarılık yenidoğan döneminin en yaygın sorunlarından biridir. Günümüzde de hala hekimler ve aileler için önemli bir sorun olmaya devam etmektedir. Sarılıklı bebeklerin büyük bir kısmı tamamen sağlıklı olmasına karşın, konjüge olmayan bilirubinin santral sinir sistemine toksik etkileri nedeniyle endişe yaratmaktadır. Yenidoğan bebeklerin hemen tümünde serum bilirubin düzeyleri erişkinlere göre yüksektir ve bunların yarısından çoğu da hayatın ilk haftasında klinik olarak sarıdırlar. Fizyolojik yenidoğan sarılığı bilirubin metabolizmasındaki temel basamakların aktivite düzeylerindeki normal gelişimsel farklılıklar sonucunda oluşan aşırı bilirubin yükü nedeniyle ortaya çıkar 9. Bu tip sarılıklar bir araştırma ve tedaviyi gerektirmezken, term bebeklerde 12,9 mg/dl yi aşan durumlar patolojik olarak kabul edilir ve etiyolojiye yönelik ileri araştırma yapılması gerekir. Maisels in 1981 de ilk tariflediği şekilde, sarılığın hayatın ilk 24 saatinde başlaması, serum bilirubininin saatte 0,5 mg/dl den fazla bir artış hızı göstermesi, term bebekler için serum total bilirubin düzeyinin 12,9 mg/dl yi aşması ya da sarılığın bir haftadan daha uzun sürmesi gibi durumlarda patolojik sarılıktan bahsedilir 10. Patolojik sarılıkların çoğunda anne sütü ile beslenme dışında sarılığa yol açan etiyolojik bir faktör gösterilememiştir 11. 2.2 YENİDOĞAN SARILIĞININ FİZYOLOJİSİ Bilirubin metabolizmasındaki ana basamaklar; bilirubin sentezi, plazmada taşınması, karaciğere alımı, hepatik konjugasyon, safraya atılması ve barsaktan geri emilmesidir. 3

2.2.1 Bilirubin sentezi: Bilirubin hem katabolizması sonucunda oluşan yeşil bir pigment olan biliverdinin indirgenmesi sonucunda oluşan yeşil-turuncu bir pigmenttir. Ferrik iyonu çevreleyen bir iyonik halkası olan hem hemoglobin, myoglobin, katalaz, peroksidaz, nitrik oksit sentetaz ve sitokromlardan oluşan çeşitli hemoproteinlerin non-aminoasit bölümüdür. Yenidoğanlarda üretilen bilirubinin yaklaşık %80 i dolaşan eritrositlerin hemoglobininden gelen eritropoetik hem metabolizmasından kaynaklanır. Kalan %20 ise noneritropoetik hemin yıkılması ile ortaya çıkar. Bilirubin sentezinin büyük kısmından sorumlu olan eritrositlerin yıkımını arttıran herhangi bir süreç eritropoetik hem yıkımında ve bilirubin yükünde artışa yol açar. Bir gram hemoglobinin katabolizması 34 mg bilirubin oluşumuna neden olur. Yenidoğanda doğumu takiben yıkım altında olan kemik iliği, dalak ve karaciğer dokusundaki eritrosit prekürsörleri bilirubin oluşumuna erişkindekinden daha fazla oranda katkıda bulunur. Hem molekülünün katabolik yolundaki ilk basamak aynı zamanda hız kısıtlayıcı basamak olan biliverdin oluşumudur. Mikrozomal bir enzim olan hem oksijenazın etkisiyle gerçekleşen bu basamakta hemin alfa metilen bağı açılır, böylece vücutta yeniden kullanılabilen demir ve solunum yoluyla uzaklaştırılan karbon monoksit (CO) açığa çıkar 12. Sonuçta biliverdin redüktaz aktivitesi ile hemen indirgenecek olan biliverdin oluşur. Biliverdin suda eriyebilen ve kolayca atılabilen bir moleküldür. Memelilerde biliverdin enerji gerektiren bir basamak olan sitozolik NADPH bağımlı biliverdin redüktaz enzimi ile hızla bilirubine dönüştürülür. Sonuçta ortaya çıkan bilirubin ankonjuge veya indirekt bilirubindir ve lipofilik olduğu için lipid hücre membranlarını kolayca geçebilme ve normal ph da suda erimeme özelliklerine sahiptir 13,14. 2.2.2 Bilirubinin plazma transportu: Hemin yıkılması ile oluşan ankonjuge bilirubin serumda taşınamaz, karaciğer ya da böbrek tarafından atılamaz, çünkü serbest bilirubinin çözünürlüğü 7,8 in altındaki ph larda oldukça düşüktür. Ancak ankonjuge bilirubin plazma albumini veya hepatik ligandin gibi nonpolar, hidrofobik bileşikler için yüksek afiniteli proteinlere 4

bağlandığında plazma gibi su içeren solüsyonlarda çözünür hale gelir. Albuminin ankonjuge bilirubin molekülüne yüksek afinitesi olsa da diğer bileşikler bağlanma bölgeleri için yarışa girerler. Her bir albumin molekülü yüksek afinite ile bilirubinin bir molekülünü ve daha zayıf bir afinite ile de ikincisini bağlama kapasitesine sahiptir. Bilirubinin albumine bağlanması reversibldır. Bilirubin bağlanması dinamik bir süreçtir ve her zaman albumine bağlı olan ve olmayan bilirubin miktarı dengedir. Term bir yenidoğanın normal serum albumin konsantrasyon sınırları içerisinde (3,5-5 mg/dl) maksimum 25-30 mg/dl konsantrasyondaki bilirubini taşıyacak albumin bağlanma bölgesi vardır. Yenidoğanlar diğer yaş gruplarından daha düşük ph ya ve özellikle hayatın ilk günlerinde daha düşük serum albumin konsantrasyonuna sahip oldukları için yenidoğan döneminde albuminin bilirubine afinitesinin daha düşük olması beklenir. Düşük ph bilirubinin albumin bağlanma bölgesinden ayrılmasını kolaylaştırır. Ayrıca serbest bilirubinin çözünürlüğünü de azaltarak kolayca hücrelere girişine olanak sağlar. 2.2.3 Bilirubin metabolizması ve karaciğerdeki transportu: Hepatik sinüzoidlerde bulunan delikler bilirubin-albumin kompleksinin disse aralığına geçişine ve böylece hepatosit membranı ile temasına izin verir. Hepatositte bilirubinin alımı, konjugasyonu ve atılımı olmak üzere 3 ana basamak meydana gelir. Her bir basamak erişkinle karşılaştırıldığında yenidoğanda yetersiz kapasitededir. Hepatik alım ve konjugasyon basamakları fizyolojik sarılığın oluşum mekanizmasına önemli ölçüde katkıda bulunur. 2.2.4 Alımı: Albuminden ayrılan ankonjuge bilirubinin hepatosit içine alınışı enerji gerektirmeyen bir basamaktır. Hücre duvarını geçtikten hemen sonra suda erimeyen ankonjuge bilirubin hücre içi proteinlere bağlanır. Sitoplazmik bu proteinlerin en önemlisi glutatyon-s transferaz (Y proteini) olarak bilinen ligandindir, diğer bağlayıcı protein Z-proteinidir. Ligandinin bilirubin bağlama kapasitesi albuminden düşük olmasına rağmen toplam bilirubin bağlama kapasitesi fazla olduğundan hepatosit içine alınmada da etkili olmaktadır. Bilirubin bu proteinlere gerek duyulmaksızın membranmembran transferi ile de endoplazmik retikuluma geçebilir 13,14. 5

2.2.5 Konjugasyon: Bilirubin konjugasyonu endoplazmik retikulumda üridindifosfat (UDP)- glukuronil transferaz enziminin katalizörlüğü ile oluşur. Bir dizi enzimatik reaksiyon sonucunda UDP-glukuronik asitten bilirubine glukuronil asit transfer edilerek konjugasyon sürecinin ilk aşamasında bilirubin monogluglukuronid oluşur. Oluşan monoglukuronid ya ekskrete edilir ya da depolanarak diglukuronid haline dönüştürülür 13,14. Konjuge bilirubin suda çözünen bir maddedir. 2.2.6 Atılımı: Bilirubin konjuge olduktan sonra büyük konsantrasyon farkına karşın enerji gerektiren aktif bir süreçle safraya atılır. Bilirubinin transhepatik taşınmasında konjuge bilirubinin hepatositten kanaliküllere taşınması hız kısıtlayıcı bir basamaktır. Artmış bilirubin yapımı hallerinde ekskresyon kapasitesindeki fizyolojik kısıtlanma nedeniyle orta derecede konjuge bilirubin artışı görülebilir. 2.2.7 Enterohepatik sirkülasyon: Barsağa ulaşan konjuge bilirubin geri emilemez. Konjuge bilirubin stabil olmayan ester olarak intestinal lümende kolayca ankonjuge şekle hidrolize olabilir. Yenidoğanlarda başlangıçta mukozal bir enzim olarak bulunan ve daha ileri dönemlerde bakterilerce oluşturulan beta glukuronidaz enzimatik dekonjugasyona, yenidoğanın üst intestinal sistemindeki alkali ph da nonenzimatik hidrolize neden olur. Ayrıca erişkinlerde barsak lümenindeki bakteriler konjuge bilirubini sterkobilin gibi geri emilemeyen son ürünlere çevirirken yenidoğanların barsak lümeni sterildir. Oluşan ankonjuge bilirubin muhtemelen pasif mekanizma ile geri emilir. Geri emilen bilirubin portal sirkülasyon ile tekrar karaciğere gelmektedir. Bilirubin sentezindeki artış ile birlikte enterohepatik dolaşımdaki artış immatür yenidoğan karaciğerinin metabolize ve ekskrete edebileceğinin üzerinde bir bilirubin yüküne yol açar. Distal barsak kesimlerine gelen bilirubin ise burada bir seri hidroksilasyon ve redüksiyon işlemleri ile ürobilinoidlere (ürobilin, ürobilinojen, sterkobilinojen, sterkobilin) dönüşür. Bu aşamada E.coli ve Clostridyum perfringens rol oynamaktadır. Oluşan ürobilinojenin de bir kısmı karaciğer tarafından reabsorbe olup enterohepatik 6

sirkülasyona girer. Böylece total hepatik bilirubin ekskresyonun hemen hepsi fekal yolla atılırken, çok küçük bir kısmı idrarla ürobilinojen olarak atılır 15. 2.3 YENİDOĞAN SARILIĞININ EPİDEMİYOLOJİSİ Yenidoğan sarılığı bilirubin metabolizmasındaki şu mekanizmalardan bir veya daha fazlasının sonucu olarak ortaya çıkar: 1. Bilirubinin aşırı yapımı 2. Bilirubinin hepatosit içine yetersiz alımı ve taşınması 3. Hepatik mikrozomlarda yetersiz konjugasyon 4. Bilirubin atılımında yetersizlik 5. Bilirubinin artmış enterohepatik dolaşımı Her ne kadar yenidoğanların tamamına yakını yukarda tanımlanan mekanizmalarla fizyolojik sarılığa sahip olsa da epidemiyolojik çalışmalar hiperbilirubineminin şiddet ve süresinin; gestasyon yaşı, doğum ağırlığı, ırk, coğrafi bölge, genetik yapı, beslenme durumu ve beslenme tipine göre belirgin olarak değişebileceğini göstermektedir 16. 2.3.1 Irk, ailesel ve genetik faktörler: Siyah ırkta beyazlara göre fizyolojik sarılığın pik serum bilirubin konsantrasyonu daha düşüktür. Asya ırkında fizyolojik sarılık daha belirgin ve daha uzamıştır 13. Japon, Çinli, Kızılderili ve Yunanlılarda maksimum bilirubin düzeyinin diğer milletlere göre iki kat daha fazla olduğu bildirilmiştir 17,18. Term yenidoğanlarda sarılıklı kardeş öyküsünün hiperbilirubinemi riskini anlamlı olarak arttırdığı bilinmektedir 19. Criggler-Najjar ve Gilbert sendromu ile de ortaya konulduğu gibi genetik faktörler de hiperbilirubineminin gelişmesinde etkilidir 20. 7

2.3.2 Doğuma ait faktörler İndüksiyonla doğum sırasında anneye oksitosin verilmesinin hiperbilirubinemi riskini arttırdığı gösterilmiştir. Ancak mekanizması tam olarak ortaya konulamamıştır 21. Normal spontan vajinal yolla doğanlarda sezaryen ile doğanlara göre daha yüksek bilirubin düzeyleri tespit edilmiştir 22. 2.3.3 Bebeğe ait faktörler: Doğum ağırlığı ve prematürelik hiperbilirubinemi için kuvvetli risk teşkil eden faktörlerdir. Kırk haftalık doğanlarla kıyaslandığında 36-38 haftalık doğanlar 7-8 kez, 36 haftadan erken doğanlar ise 13 kez artmış ciddi hiperbilirubinemi riski taşırlar 23. Çalışmalar erkek infantlarda hiperbilirubinemi riskinin kızlardan daha yüksek olduğunu göstermiştir 24. 2.4 ANNE SÜTÜ VE SARILIK Yenidoğan fizyolojik sarılığının şiddetini ve paternini değiştiren en sık ikinci değişken beslenme metodudur. Yapılan meta analiz çalışmaları, anne sütü ile beslenenlerde formüla ile beslenenlere göre 12 mg/dl üzerindeki bilirubin yüksekliği riski 3 kat, 15 mg/dl üzerindeki bilirubin yüksekliği riski 6 kat arttığını göstermiştir 25. Burada iki farklı fakat ilişkili olay tanımlanmıştır: Birincisi erken başlangıçlı anne sütü sarılığı; hayatın ilk günlerinde ortaya çıkan anormal bir durumdur. Bunun oluşumunda sütün kendisi değil yetersiz alımı etkendir. Dehidratasyon, gecikmiş ve azalmış mekonyum pasajı, buna bağlı artmış intestinal geri emilim ve azalmış kalori alım mekanizmaları ile sarılığa yol açar 26. İkincisi geç başlangıçlı anne sütü sarılığı; hayatın beşinci gününden sonra başlayan ve birkaç hafta hatta hayatın üçüncü ayına dek sürebilen ve yenidoğan fizyolojik sarılığının normal bir varyasyonu olarak kabul edilen bir durumdur 27. Araştırmalar anne sütü içinde ya hepatik glukuronil transferazı inhibe eden ya da bilirubinin enterohepatik dolaşımını arttıran bir maddeyi tanımlamaya odaklanmıştır. Anne sütünde bulunan pregnan-3alfa,20beta-diol adlı bir steroidin hepatik glukuronil 8

transferazı inhibe ettiğini belirten ilk çalışmalar daha sonraki bulgularla desteklenmemiştir 27. İkinci teori anne sütündeki serbest yağ asitlerinin hepatik glukuronil transferazı inhibe ettiği yönünde olmuş ancak bu teoride daha sonraki çalışmalarda destek görmemiştir 28. Sonuç olarak anne sütü sarılığının mekanizması tam olarak aydınlatılamamıştır. Ancak son yıllarda anne sütü sarılığı ile Gilbert sendromuna yol açan gen polimorfizmi arasında kurulan ilişki genetik faktörlerin de etkili olabileceğini göstermektedir 29. 2.5 FİZYOLOJİK SARILIK Yenidoğanda sarılık plazma bilirubin düzeyinin deri ve skleralarda gözle görülebilir sarı renge neden olacak kadar yükselmesidir. Yaşamın ilk haftasında ortaya çıkan geçici hiperbilirubinemi fizyolojik sarılık olarak adlandırılır. Fizyolojik sarılık iki fazda gözlenir. Faz I ilk üç gün içinde pik değerine ulaşan beşinci güne kadar bilirubinin azaldığı dönemi kapsar. Bu dönemden sonra bilirubinin iki hafta kadar 2 mg/dl civarında sabit kaldığı dönem faz II olarak adlandırılır. Faz I fazla miktarda olan bilirubin yapımının konjugasyon eksikliği ile birlikte olması nedeniyle görülür 30. Faz II fizyolojik sarılığın mekanizması daha az bilinmekle birlikte bilirubinin hepatik alımındaki eksiklik ile birlikte devam eden aşırı bilirubin yükünden kaynaklandığı düşünülmektedir 13. Fizyolojik sarılık tanı kriterleri: 30 1. Sarılığın ilk 24 saatten sonra başlaması 2. Total bilirubin artış hızının günde 5 mg/dl den fazla olmaması 3. Total bilirubin düzeyinin term bebeklerde 12.9 mg/dl yi, preterm bebeklerde 15 mg/dl yi geçmemesi 4. Direkt bilirubin düzeyinin 2 mg/dl yi geçmemesi 5. Sarılığın term bebeklerde bir haftadan, preterm bebeklerde iki haftadan uzun sürmemesi 9

2.6 YENİDOĞANDA PATOLOJİK SARILIK Yenidoğanda patolojik indirekt hiperbilirubinemi nedenleri Tablo I de özetlenmiştir 10 Tablo I: Patolojik indirekt hiperbilirubinemi nedenleri A- Artmış bilirubin yapımı 1-Hemolitik hastalıklar a. İmmün mekanizmalı Rh uyuşmazlığı ABO uyuşmazlığı Subgrup uyşmazlığı b.kalıtsal Eritrosit membran defektleri ( herediter sferositoz, eliptositoz, stomatositoz) Eritrosit enzim defektleri ( glukoz-6 fosfat dehidrogenaz eksikliği, pirüvat kinaz eksikliği) Hemoglobinopatiler ( alfa talasemi, beta talasemi) Anstabil hemoglobin 2- Diğer nedenler Sepsis Dissemine intravasküler koagülasyon Kanama; pulmoner, abdominal, serebral, ekstravazyon Polisitemi Makrozomik, diabetik anne bebeği 3-Artmış bilirubinin enterohepatik dolaşımı B-Bilirubin atılımında azalma 1- Prematürite 2-Glukoz 6 fosfat dehidrogenaz eksikliği 3- Doğuştan metabolizma hastalıkları a. Crigler Najjar sendromu tip1 ve tip 2 b. Gilbert sendromu c. Tirozinemi d. Hipermetioninemi 10

Tablo I: Patolojik indirekt hiperbilirubinemi nedenleri (DEVAMI) 4-Metabolik nedenler a. Hipotiroidism b. Hipopitüiterizm 2.6.1 Rh uyuşmazlığı: Rh immünizasyonun olabilmesi için Rh (-) bir anne Rh (+) bir bebek taşımalıdır. Maternal immünizasyon için fetal eritrositlerin anne kanına geçmesi gerekmektedir. Rh sistemindeki antijenler C,c,D,d,E,e olarak isimlendirilir. Eritrositler üzerinde D antijeni varsa ( homozigot DD veya heterozigot Dd) Rh (+) olarak isimlendirilir. D antijeni fetal eritrosit üzerinde 11. haftadan itibaren belirmeye başlar. Anti D antikoru 19S ve 7S yapısında olup 7S yapısında olanlar plasentayı geçerek fetusta hemolize neden olurlar. Anti D antikoru ile kaplanan eritrositler karaciğer ve dalakta parçalanır. Fetal hücreler gebeliğin herhangi bir döneminde anne dolaşımına geçebilir. Ancak en fazla geçiş doğum sırasında ya da anmiyosentez sırasındaki travma ile olur. İlk gebelik sırasında anti D antikoru oluşan annelerin genellikle Rh (+) annelerden doğdukları saptanmıştır. Bu anneler fetüs iken kendi annelerinden geçen Rh (+) eritrositlerle sensitize oldukları düşünülmektedir. Rh (-) annenin Rh (+) gebelik sayısı arttıkça annenin sensitizasyonu artmaktadır 31. Hastalığın şiddeti klinik bulgu vermeyen minimal hemolizden derin anemi, eritroblastozis fetalis ve hidrops fetalis tablosuna kadar değişkenlik göstermektedir. İntrauterin dönemde anemi, doğumdan sonra hiperbilirubinemi önemli sorunlardır. Etkilenen bebek hemolize eritrosit yapımını arttırarak cevap verir. Bu nedenle kan periferik yaymasında çekirdekli eritrositler ve retikülosit düzeyinde yükselme görülür. Kemik iliği dışında aktif eritropoezis olur ve hepatosplenomegali gelişir. Sarılık genellikle doğumda yoktur, çoğunlukla ilk 24 saat içinde, özellikle de ilk 4-5 saat içinde belirgin olur. Sarılığın ciddiyeti hemolizin ciddiyetini ve karaciğerin konjugasyon kapasitesini gösterir. 11

2.6.2 ABO uyuşmazlığı: Anti A ve anti B antikorları Ig A, Ig M, Ig G yapısındadır. A ve B kan grubunda olanlarda bulunan anti A ve anti B antikorlar çoğunlukla Ig M yapısında, O kan grubunda olanlarda ise çoğunlukla Ig G yapısındadır. Bu nedenle ABO hemolitik hastalığı olan bebeklerinin annelerinin hemen tamamı O grubundadır. ABO hemolitik hastalığında spesifik tanı koydurucu bir test yoktur. Sarılığın ilk 24 saat içinde ortaya çıkması, anne serumunda yüksek titrede Ig G yapısında anti A/B antikor varlığının gösterilmesi, periferik yaymada sferositlerin görülmesi tanıda önemlidir. Vakaların ancak %33 ünde Coombs testi pozitifliği saptanabilir 32. Klinik olarak belirgin hemolitik hastalık bulguları göstermeyen bebeklerde ABO uyuşmazlığı olmayan bebeklere göre hiperbilirubinemi insidansı, maksimum bilirubin değeri ve retikülosit sayısı daha yüksek, hemoglobin değeri daha düşük bulunmuştur. Bu bebeklerde takipte uzamış anemi saptanmıştır. Bu durum ABO uyuşmazlıklarında belirgin hemolitik hastalık bulguları görülmese de eritrosit yıkımının olduğunu göstermektedir 32. 2.6.3 Eritrosit membran defektleri: Herediter sferositoz, eliptositoz, piropoikilositoz, piknositoz ve stomatositoz sendromlarının tanıları yenidoğan döneminde zordur, çünkü bu dönemde eritrosit şekil ve boyutları oldukça farklılık gösterebilir. Herediter sferositozluların %75 i otozomal dominant kalıtım gösterdiği için ailede anemi, sarılık, safra kesesi taşı varlığı, splenektomi öykülerinin pozitifliği tanıyı destekler. Ağır anemi ve hidrops fetalis, herediter sferositoz ile band 3 ve spektrin proteinine ait defektif genler birlikteliğinde karşımıza çıkabilir 10. 2.6.4 Hemoglobinopatiler: Genellikle yenidoğan döneminde ortaya çıkmazlar. Homozigot alfa talasemi erken yenidoğan döneminde anemi, hemoliz, hidrops fetalis, ölü doğum veya doğumdan kısa bir süre sonra ölüme neden olabilir. Hemoglobin F de beta zinciri bulunmadığı için beta talasemi yenidoğanlarda kendini göstermez. 12

Orak hücreli anemi de, hemoglobin F in Hb S üzerinde polimerizasyonu ve oraklaşmada inhibitör etkisi olduğundan yenidoğan döneminde klinik bulgu vermez 10. 2.6.5 Polisitemi: Bir gram hemoglobinin yıkımı sonucunda 35 mg bilirubin açığa çıkar. Bu bilgi ışığında yüksek hemotokrit değerleri yenidoğan sarılığı için bir risk faktörüdür. Artmış eritrosit hacmi karaciğere artmış bilirubin yüküne neden olur 10. 2.6.6 Azalmış bilirubin atılımı 2.6.6.1 Criggler Najjar sendromu: Tip 1 ve 2 UGT1A1 geni üzerindeki beş eksonundan herhangi birinde bir veya daha fazla mutasyon ile veya genin kodonlamayan veya intron bölgelerindeki mutasyonlar ile ortaya çıkar. Tip 1 de uridindifosfoglikuronat glukuronil transferaz aktivitesi hemen tamamen yoktur. Yaşamın ilk 2-3 gününde ağır hiperbilirubinemi neden olur ve genellikle etkilenen bebeklerde kan değişimine ihtiyaç vardır. Beyin hasarı riski vardır. Karaciğer transplantasyonu tek tedavi yöntemidir. Fenobarbital tedavisi tip 1 de etkisizdir veya çok az etki gösterir. Tip 2 de ise fenobarbital tedavisi total serum bilirubin konsantrasyonunu %30-80 oranında azaltabilir. Tip 2 hafif hiperbilirubinemi ile karakterizedir. Enzim eksikliği parsiyeldir. Ancak bu tipte de kernikterus geliştiğini bildiren yayınlar vardır 10. 2.6.6.2 Gilbert sendromu: Gilbert sendromu olanlarda hafif, benign, kronik, tekrarlayan indirekt hiperbilirubinemi vardır, ancak karaciğer hastalığı veya aşırı hemolizi destekleyen kanıtlar yoktur. Otozomal dominant veya resesif olarak kalıtım gösterir. Tipik olarak klinik bulguları puberteden sonra ortaya çıkar ve açlık veya araya giren hastalıklarla bulgular belirir. UGT1A1 promotor bölgesindeki mutasyonun neden olduğu gösterilmiştir 10. Yenidoğan döneminde anne sütü, G6PD eksikliği, ABO uyuşmazlığı ve pilor stenozu gibi yenidoğan sarılığında etkili faktörlerin Gilbert sendromlu vakalarda hiperbilirubinemi şiddetini etkilediği düşünülmektedir. 13

2.6.7 Doğuştan metabolizma hastalıkları 2.6.7.1 Galaktozemi Nadir görülen bu hastalıkta sarılık yenidoğan döneminde ilk bulgu olabilir. Galaktozemi olgularında genellikle sarılılığa emmeme, kusma, kilo kaybı, irritabilite ve letarji gibi diğer bulgular da eşlik eder. Aile öyküsünün pozitifliği, eşlik eden diğer bulgular, idrarda redüktan madde pozitifliği ve E coli sepsisi tanıyı destekler 10. 2.6.8 Hipotiroidizm: Uzamış indirek hiperbilirubinemi konjenital hipotiroidizmin bulgularından biridir. Patogenezi tam olarak bilinmemekle birlikte term ve preterm bebeklere iodotironin verilmesi tepe serum bilirubin düzeylerini azaltmamaktadır 33. 2.6.9 Eritrosit enzim defektleri 2.6.9.1 Pirüvat kinaz eksikliği: Otozomal resesif olarak geçiş gösterir. Klinik olarak sarılık, anemi ve retikülositoz vardır. 2.6.9.2 Glukoz 6 fosfat dehidrogenaz eksikliği ( G6PD enzim eksikliği): Glukoz 6 fosfat dehidrogenaz eksikliği dünyada en sık rastlanan eritrosit enzim eksikliğidir ve dünyada 400 milyondan fazla insanı etkilemektedir. Bu enzim eksikliği insidansı Akdeniz ülkelerinde, Afrika da ve Çin de daha yüksek olmakla birlikte bütün ırklarda ve etnik gruplarda tanımlanmıştır 34,35. Kernikterus gelişen yenidoğan bebeklerin % 31,5 inde hiperbilirubineminin nedeninin G6PD eksikliği olduğu son yapılan çalışmalarda bildirilmiştir 10. Glukoz 6 fosfat dehidrogenaz geni X kromozomu üzerinde bulunur ve etkilenen erkek bebeklerde enzim eksikliği komplettir. Tarama testleri ile enzim eksikliği olan erkek bebekler bulunabilirler. Fakat heterozigot kızlarda enzim aktivitesi oldukça geniş farklılıklar gösterir, bu nedenle tarama testleri ile tanı alamayabilirler. Glukoz 6 fosfat dehidrogenaz eksikliği olan bazı bebeklerdeki hemoliz çok belirgin değildir, anemi ve retikülositoz gelişmeyebilir. Yapılan çalışmalarda G6PD eksikliği olan bebeklerde hem döngüsünde belirgin bir artış olmasına rağmen, akut hemolizi olanlar dışında, 14

hiperbilirubinemiden sorumlu tek mekanizma hemoliz değildir. Glukoz 6 fosfat dehidrogenaz eksikliği olan bebeklerde bozulmuş konjugasyon da hiperbilirubinemi patogenezinde rol oynar 10. Glukoz 6 fosfat dehidrogenaz pentoz fosfat yolunun ilk ve hız sınırlayıcı enzimidir. Eritrositlerin temel enerji kaynağı glukozdur. Glukoz heksokinaz ile fosfatlanıp glukoz 6 fosfatı oluşturduktan sonra iki metabolik yoldan birini seçer: a. Embdem Meyerhof yolu b. Pentoz Fosfat yolu Pentoz fosfat yolunun temel görevi organizmaya NADPH ve riboz fosfatları sağlamaktır. Bu metabolik yolda ATP ne üretilir ne de kullanılır. Sitozolde gerçekleşen pentoz fosfat yolunda her bir glukoz 6 fosfata karşılık 2 mol NADPH üretilir. GLUKOZ 6 FOSFAT DEHİDROGENAZ EKSİKLİĞİNİN KLİNİK BULGULARI: Yenidoğan Sarılığı Klinik çalışmalar G6PD eksikliği olan yenidoğanlarda şiddetli hiperbiluribinemiye eğilim oluğunu göstermiştir. Sarılık oldukça ciddidir ve eğer tedavi edilmezse kernikterus ile sonuçlanabilir. Yenidoğan sarılığı ölüme veya kalıcı nörolojik hasarlara neden olabilmektedir 36,37. Glukoz 6 fosfat dehidrogenaz eksikliği olan yenidoğanın immatur karaciğerleri bilurubini yetersiz olarak metabolize eder. Bu nedenle yenidoğanda anemi görülmez, CO düzeyinde artış ve eritrosit ömürleri kısalır. Yenidoğanda üridindifosfoglukuronat glukuronil transferaz 1 (UDPGT-1) geninin promotor yöresindeki bir mutasyon yetişkinlerde Gilbert sendromu ile ilişkilidir 38,39. İlaç Alımına Bağlı Hemolitik Anemi İlaçların bir kısmı ve bazı kimyasallar G6PD enzim eksikliği olan bireylerde hemolitik anemiye yol açmaktadır (Tablo II). Kloramfenikol gibi bazı ilaçlar G6PD 15

Akdeniz varyantında ılımlı hemolize neden olurken G6PD A- ve G6PD Kanton varyantlarında etkisizdir. Yani farklı G6PD varyantı taşıyan bireylerde aynı ilaç farklı reaksiyon göstermektedir. Glukoz 6 fosfat dehidrogenaz eksik olan bireylerde ilaç alımına bağlı olarak hemoliz, ilaç alımından 1-3 gün sonra başlar. Eritositlerde oksidan varlığında özellikle hemoglobin ve stromal proteinlerin denatürasyonu sonucu Heinz cisimcikleri görülür. Hemoglobin düzeyi hızlı bir şekilde azalır. İdrar rengi koyulaşır hatta siyah olabilir. 4-6 gün sonra retikülosit sayısında artış olur 10. Tablo II: Hemolize yol açan ilaç ve kimyasallar Akotanilid Anilin Antistin Asetil salisilik asit Asetofenitidin Askorbik asit ( 1500mg ) Bakla Benemid Daraprim Diaminodifenilsülfan Dimerkaprol Fenilhidrazin Furaltadone Furazoladon Kinakrin ( Atabrin ) Kinin Kloramfenikol Klorokin Kuinidin Kuinosidin Metilen mavisi Naftalan Nitrit Nitrofurantian Nitrofurazon Pamakin Paraaminobenzoik asit Paraaminofenol Parahidroasetanilid Pentakuin Pnimakin Primakin Salisilazosülfapiridin Sülfametoksipiridazin Sülfadiazin Sülfamerazin Sülfametaksazol (Bactrim ) Sülfanitamid Sülfapiridin Sülfasetamid Sülfisoksazol Sülfokzon Sülfotiozol Tiazolsülfan Trinitrotoluen Vitamin K1 Favizm Bakla ( vicia faba ) bitkisinin neden olduğu hemolitik anemi favizm olarak adlandırılır ve G6PD eksikliği olan bireylerde hemolitik anemiye yol açan tek bitkidir. M.Ö. 2000 yıllarında Heredot un yazdığına göre istenmeyen bir takım etkilerinden dolayı bakla yenilmesi Mısırlı rahipler tarafından yasaklanmıştır. Hatta Yunanlı matematikçi Pythagoras un bakla tarlasından geçerek kaçmayı reddettiği için öldürüldüğü düşünülmektedir. Bakla bitkisinin polenlerinin teneffüsü bile bazı kişilerde hemolize yol açabilmektedir. Favizm oluşumuna özellikle ilkbaharda Akdeniz ülkelerinde rastlanmaktadır. Süt veren annelerin bebeklerinde de hemoliz rapor 16

edilmiştir. Favizm li tüm bireyler G6PD enzim eksikliğine sahipken, her G6PD eksikliği olan bireyde bakla yenilmesi sonrasında hemoliz görülmeyebilir. Hemolitik krize neden olan G6PD enzim eksikliği ile birlikte genetik faktörlerin varlığı söz konusudur. Favizm sadece Akdeniz tipini etkiler, Afrika tipi genelde etkilenmez. Yetişkinlere göre çocuklarda daha sık favizm olgusuna rastlanmaktadır 40,41. Bakla, kuru ağırlığının yaklaşık % 2 sini oluşturan iki glikozidik bileşik olan visin ve konvisinden zengindir. Bakla yenilmesinden sonra glikozidler enzimatik olarak hidroliz olur, pirimidin aglikon, divisin ve izouramil oluşur. Favizm nedeni olarak öne sürülen mekanizmada bu yeni bileşikler redoks siklüsüne girip redükte glutatyonu tüketir, bu sayede serbest radikal ve H 2 O 2 oluşumuna yol açar 42. Enfeksiyona Bağlı Hemolitik Anemi Glukoz 6 fosfat dehidrogenaz eksikliği olan hastalarda spontan veya enfeksiyona bağlı hemolizin mekanizması çok anlaşılır değildir. Hemolitik reaksiyonların bu tipinde rol alan lökositlerin fagositozu ile H 2 O 2 in oluşumu tartışmalıdır. Glukoz 6 fosfat dehidrogenaz eksikliği gözlenen bireylerde ateşli hastalık sonrası hafif anemi aniden gelişebilir. Hatta bazı olgularda ağır anemi yani hemoglobin düzeyi 3-4g/dL ye düşebilir. Birçok virüs ve bakterinin hemolize neden olduğu rapor edilmişse de en önemli olanları hepatit, pnömoni ve tifodur. Üst solunum yolları veya sindirim sistemini etkileyen viral enfeksiyonların G6PD eksikliği olan çocuklarda bakteriyel enfeksiyonlara göre daha şiddetli hemolize neden olduğu rapor edilmiştir 38,43. Herediter Non-Sferositik Hemolitik Anemi Herediter non-sferositik hemolitik anemi, G6PD eksikliğinin oldukça nadir gözlenen bir sonucudur ve nadir mutasyonlara sahip bireylerde ortaya çıkmıştır. İlk defa yenidoğan ve çocukluk çağında rapor edilmiştir. Gd Akdeniz varyantını taşıyan bazı hastalarda da herediter non-sferositik hemolitik anemiye rastlanmış ve bazılarında da hemoliz gözlenmiştir. Oldukça hafif seyreden olguların olmasına rağmen transfüzyona bağımlı hastalar da rapor edilmiştir. Morfolojik olarak anemi, normokrom ve normositerdir. Retükülositoz gözlenirken aşırı miktarda sferosite rastlanmadığı için herediter non-sferositik hemolitik anemi adını almıştır 39,44,45. 17

Diyabetik Ketoasidoz Diyabetik ketoasidozun G6PD eksikliği olan bireylerdeki hemolizin bir nedeni olabileceği düşünülmektedir. Ancak G6PD eksikliği olan diyabetik ketoasidozlu 36 olgudan sadece 10 unda hemoliz görülmüştür 38. 2.6.9.2.1 Glukoz 6 fosfat dehidrogenaz Enziminin Genetik Özellikleri G6PD nin yapısını oluşturan gen X kromozomunun subtelomerik yöresinde q28 lokusunda yerleşmiştir. G6PD geninin X kromozomu üzerindeki genel yerleşimi Şekil 1 de gösterilmiştir 46,47. Şekil 1: Glukoz-6-fosfat dehidrogenaz geni Glukoz 6 fosfat dehidrogenaz geni 13 eksondan ve 12 introndan oluşur. Enzimin fonksiyonunu belirleyen G6PD geninin bu genin kodladığı mrna amino asit dizisi ve büyüklüğüdür. Glukoz 6 fosfat dehidrogenaz geni 18,5 kb ve genin kodladığı mrna ise 2269 baz çifti uzunluğundadır 48,49. Kodlama dizisi ekson 2 den başlar, ekson 2 ve 3 arasındaki intron 9857 baz çiftinden oluşmuş olup çok uzundur. Bir düzenleme fonksiyonu olduğu düşünülen sitidinlerin metilasyonu 3 ı ucunda gerçekleşmektedir. Genin kodlama dizilimi 1545 baz çifti uzunluğunda olup 515 amino asitlik G6PD proteinini üretmektedir. Aktif enzim formunda her biri 59,265dalton moleküler ağırlığa sahip 2 veya 4 aynı alt birimden oluşabilir. G6PD sülfidril gruplarınca zengindir ve her alt birim 11 sülfidril grubu içerir 50,51. 18

Tablo III de insan G6PD sinin moleküler özellikleri verilmiştir. Tablo III: İnsan G6PD sinin Moleküler Özellikleri DNA Gen uzunluğu 18,5 Ekson sayısı 13 Kodlanan eksonlar 12 mrna Nükleotit sayısı 2269 5 ı kodlanmayan bölge 69 Kodlanan bölge 1545 3 ı kodlanmayan bölge 655 Protein Amino asit sayısı 515 Moleküler ağırlık 59,265 Aktif enzimin moleküllerinin subünit sayısı 2 veya 4 Her subünitteki NADP ye bağlanan molekül sayısı 1 Moleküler spesifik aktivite ( IU/ nmol ) 13 G6P NADP GSH H 2 O 2 KATALAZ 6PG NADPH GSSG H 2 O GSSG Redüktaz Glutatyon Peroksidaz Şekil 2: Eritrositlerdeki G6PD nin oksidan ajanlara karşı ana metabolik rolü Eritrositlerdeki oksidan ajanlara karşı G6PD nin oynadığı metabolik rol Şekil 2 de verilmiştir. Dünya Sağlık Örgütü (WHO), G6PD enzim eksikliklerini hemoliz düzeyine göre beş sınıfa ayırmıştır 52. Sınıf I: G6PD aktivitesi normalin %10 kadar altında ve kronik hemolitik anemiye neden olan varyantlar Sınıf II: Şiddetli enzim eksikliği olan ve ılımlı hemoliz görülen varyantlar Sınıf III: Normalin %10-60 ının altında aktiviteye sahip, ilaçlarla ve enfeksiyonla birlikte ılımlı hemoliz görülen varyantlar Sınıf IV: Enzim eksikliği olan fakat hemoliz görülmeyen varyantlar Sınıf V: Enzim aktivitesi yüksek olan varyantlar Sınıf IV ve V varyantları klinik olarak belirti vermezler. Bunun için daha çok biyologların, genetikçilerin ve antropologların ilgisini çekmiştir. 19

Tablo IV: En yaygın gözlenen G6PD varyantlarının kinetik özellikleri Kinetik Özellikler Gd B + Gd A + Gd A - Gd Akdeniz % Eritrosit aktivitesi 100 90±10 14±6 <10 Elektroforetik göç 100 110 110 100 Km NADP (µm) 2,9-4,4 2,9-4,4 2,9-4,4 1,4±0,2 Km G6P (µm) 60±10 60±10 60±10 22,5±3,5 Analog kullanımı 2dG6P <4 <4 <4 25±2 Gal6P 7-15 - - 20 dnadp 55-60 55 55 350 Ki NADP 9 6,7 13 16 Isı kararlılığı Normal Normal Normal Düşük ph kararlılığı Normal Normal Normal Bifazik 2.6.9.2.3. Türkiye de Saptanan G6PD Varyantları G6PD enzim eksikliği dünya genelinde yaygın olduğu için en çok çalışılan kalıtsal hastalıklardan birisidir. Türkiye de G6PD üzerine ilk çalışmalar 1949 yılında Demirağ, 1951 yılında Fakacelli ve Konstantinidu tarafından yapılmış ve favizm olguları olarak bildirilmiştir. Glukoz 6 fosfat dehidrogenaz eksikliği ile ilgili tarama çalışmalarında Türkiye genelinde enzim eksikliği %0,5, Eti Türklerinde ise %8,2 olarak saptanmıştır. Sipahioğlu Ege bölgesinde enzim eksikliğinin %2-9 oranında olduğunu rapor etmiştir. Çukurova da 1979 yılında sıtmanın yaygınlaşması ve 30 000 dolayında sıtma olgusunun görülmesini takiben hastalığa karşı koruyucu bir ilaç olarak primakinin kullanımı sonucu ortaya çıkan hemolitik anemi olguları dikkati G6PD enzimi üzerine çekmiştir. Bölgede yapılan kalitatif tarama çalışmalarında G6PD enzim eksikliğinin yaygın olduğu gözlenmiştir. Bu güne kadar değişik araştırma gruplarının yaptığı tarama çalışmalarında enzim eksikliğinin frekansı farklı olarak rapor edilmiştir. Yüregir ve arkadaşlarının sayıca büyük bir grup üzerinde yaptığı çalışmada ise G6PD eksikliğinin %8,2 olduğunu bildirilmiştir. Tufanbeyli (%3,7) ve Ceyhan (%1,2) yörelerinde oran düşük olmasına karşılık Tarsus ve Antakya da %17 ye varan enzim eksikliği saptanmıştır. Akoğlu ve arkadaşları tarafından yürütülen çalışmalarda da benzer sonuçlar alınmıştır 52. 20

Dünyada en yaygın gözlenen Glukoz 6 fosfat dehidrogenaz enziminin varyantların kinetik özellikleri Tablo IV de verilmiştir. Aksoy ve arkadaşları 1987 de Çukurova bölgesinde yaptıkları kinetik çalışmada Gd Adana, Gd Samandağ ve Gd Balcalı varyantlarını tarif etmişlerdir. Daha sonra Gd Adana varyantının Gd Akdeniz ve 1311 polimorfik yöre mutasyonu taşıdığını göstermişlerdir. Aynı çalışma grubu 1989 yılında birisi ısıya dayanıklı üç yeni varyant daha tanımlamıştır. Türkiye de ve Türk ailelerinde saptanan varyantlar Tablo V de gösterilmiştir 4,53,54. Tablo V: Türkiye de saptanan G6PD varyantları Varyant Yıl Yazar G6PD-B - 1967 Berkal G6PD-B - 1973 Altay G6PD-Ankara 1975 Kohn G6PD-Tarsus 1976 Gahr G6PD-Antalya 1979 Sipahioğlu G6PD-Mersin 1981 Akoğlu G6PD Samandağ 1987 Aksoy G6PD-Balcalı 1987 Aksoy G6PD-Adana 1987 Aksoy G6PD-Antakya 1988 Aksoy Isıya dayanıklı G6PD 1988 Aksoy G6PD Hacettepe 1989 Kuş G6PD-Korkuteli 1989 Alıcıgüzel G6PD-Aksu 1989 Alıcıgüzel G6PD-Serik 1989 Yücel G6PD-Çorum 1989 Kuş Gal6P- kullanımı yüksek 1989 Dikmen G6PD-Siirt 1992 Dikmen 21