Kromozom Anomalilerinin Tanısında Gelişmeler; Kromozomal Karyotipten Moleküler Karyotipe Prof. Dr. Seher Başaran İstanbul Üniversitesi, İstanbul Tıp Fakültesi, Tıbbi Genetik ABD, 2012
Kromozom Anomalilerinin Tanısındaki Aşamalar
Metafaz prometafaz 400 450 500 600 700 bant/haploid set ~ 500 bant çözünürlükte ~ 1 bant 6 milyon nükleotid (~6 Mb ve 10 larca gen)
~500 bant düzeyinde Karyotipleme Tek test tüm genom/kromozomlar Tüm sayısal anomaliler > 6 Mb lık yapısal anomaliler (dengeli ve dengesiz) Klinik yönlendirme varsa bilinen mikrodelesyon sendromları (~ 3-5Mb) Mozaisizm tanınabilir Dezavantajları; Hücre kültürü gerektirir Otomatizasyonu zordur Tanı subjektiftir ve bu nedenle deneyim önemlidir Prenatal tanıda klinik yönlendirme olmadığından ilave test olanağı sınırlıdır. ı Yenidoğanda KROMOZOM ANOMALİ oranı 1:156 Dengeli yapısal anomali oranı %0.4
Fluoresan In Situ Hibridizasyon (FISH) Fluorescence in situ hybridization (FISH) Need to suspect a specific diagnosis! 13. Kromozom 21. Kromozom 18. Kromozom X Kromozomu Y Kromozomu
Spektral karyotipleme Spektral karyotipleme Williams s. del(7)(q11.23) M-FISH
Karşılaştırmalı Genomik Hibridizasyon (CGH)
Moleküler Karyotipleme Olgu Kontrol Cy5 Cy3
Moleküler Karyotipleme İnsan genomundaki farklılıkların karşılaştırılması esasına dayanır DNA Dizisindeki Değişimler Mutasyon DNA dizisindeki patolojik (hastalığa neden olan) değişiklikler Polimorfizm (1) Yaygın olanlar (Bir toplumda > % 1 görülen DNA dizi değişiklikleri) (2) Nadir olanlar/minör alleler (Bir toplumda < % 1 görülen DNA dizi değişiklikleri)
İnsan genomunun organizasyonu 1% 4% protein kodlayan genler 44% RNA genleri, regülator bölgeler 45% tranposon kaynaklı tekrarlar heterokromatin diğer bölgeler 6% İnsan haploid genomu ~ 3100 Mb büyüklüğünde, 1200 Mb Gen ve Genlerle ilişkili sekanslar Genler (exonlar) 48 Mb İlişkili sekanslar 1152 Mb İnsan genomunda ~ 25.000 gen
İnsan Genetik Varyasyonlarının Sınıflandırılması Nükleotid Substitüsyonları (SNPs) Tekrar dizileri İnsersiyon/delesyon varyantları Blok substitüsyonlar İnversiyon varyantları Kopya sayısı varyantları (CNVs) Tüm varyasyonların % 90 ı Tüm varyasyonların % 10 u (yapısal varyantlar) Single nucleotide polimorfizm (SNPs) ; Genomda 300 bp de bir nükleotid polimorfiktir. Halen 12 milyon SNP tanımlanmıştır. Genelde iki formda olur (A ya da G; C yada T gibi). Kopya sayısı varyantları (CNVs); Referans genomla kıyaslandığında, farklı sayıda bulunan, boyutu 1 kb veya daha fazla olan DNA segmentlerine Kopya Sayısı Varyasyonu (CNV) denir.
Molecular cytogenetics in the postgenomic era: Array-based comparative genomic hybridization Total genome High resolution
Olgu Chromosome 1 Chromosome 15 Anne Chromosome 1 Chromosome 15 Baba Chromosome 1 Chromosome 15
CNVs ler; 1) Patojenik olarak tanımlanmış değişimler 2) Zararsız (benign) olarak tanımlanmış değişimler 3) Klinik anlamı henüz kesin olarak bilinmeyen (Variants of uncertain significance (VOUS)) değişimler Buchanan ve Scherer, Nat Rev Gen, 2008
Wapner R, ISCA (International Standarts for Cytogenomic Arrays) 2012 Mikroarray Çalışma Sonuçları; Normal karyotip saptanan prenatal olgu n:3822 1) Klinik anlamı kesin bilinmeyen CNVs n: 94 (%2.5) Rapor edilmeyen CNVs n: 33 (%0.9) Rapor edilen CNVs n: 61 (%1.6) 2) Patolojik CNVs n: 35 (%0.9) Klinik ile ilişkili CNVs %2.5 Endikasyon gruplarına göre klinik ile ilişkili CNVs İleri anne yaşı n: 1966 CNV n:34 %1.7 Positiv Tarama Testi n:729 n:12 %1.6 Patolojik USG n:755 n:45 %6
Wapner R, ISCA (International Standarts for Cytogenomic Arrays) 2012 Mikroarray Çalışma Sonuçları; 4391 olgudan 51 olguda array sonuçsuz, başarı %98,8 4282 nonmozaik karyotip ve 58 mozaik karyotip Anomaliler Kromozom n Array tanıyabilir Anöploidiler (tri 21,18,13,X,Y ve 45,X) Diğer anomaliler Array tanıyamaz 374 374 0 82 24 58 (%1.4) Dengeli yapısal Dengesiz yapısal 40 0 40 22 22 0 Marker kromozom Triploidi 3 2 17 0 1 heterokromatin 17 (7 si SNP array ile tanınabilirdi 1989-2011 PRETAM+PREMED 2453 CVS 386 kromozom anomalisi 71 anomali %2.9 (20 poliploidi+51 dengeli yapısal) 22813 AS 889 kromozom anomalisi 234 anomali %0.1 (17 poliploidi+217 dengeli yapısal)
Schaffer LG, et al, 2012;Prenat Diagn, 32, 979-985 Karyotipi Normal prenatal olgularda array sonuçları; Endikasyon Arraynormal Arrayşüpheli Arraypatolojik Toplam olgu Pat-USG 2462 (%88.5) 135 (%4.9) 184 (%6.6) 2781 Pat-USG (soft markers) MS-ST Aile öyküsü İleri Anne Yaşı Psikolojik Diğer/? 72 (93.5) 3 (%3.9) 2 (%2.6) 77 68 (%88.3) 5 (%6.5) 4 (%5.2) 77 461 (%94.7) 11 (%2.3) 15 (%3.1) 487 337 (%97.4) 8 (%2.3) 1 (%0.3) 346 94 (%98.9) 1 (%1.1) 0 95 12 (%92.3) 0 1 (%7.7) 13 Toplam (canlı fetuslar 3506 (%90.5) 163 (%4.2) 207 (%5.3) 3876
Schaffer LG, et al, 2012;Prenat Diagn, 32, 1-10 USG bulgusu Array-normal Array-şüpheli Array-patolojik toplam Çoklu sistem anomalileri 492 (%85) 29 (%5) 58 (%10) 579 Çoklu sistem + yapısal olmayan anomaliler 196 (85.6) 14 (%6.1) 19 (%8.3) 229 Tek sistem anomalileri 1370 (%90.2) 68 (%4.5) 81 (%5.3) 1519 Tek sistem + yapısal olmayan anomaliler 220 (%86.6) 16 (%6.3) 18(%7.1) 254 İzole poli/oligohidramnios 6 (%66.7) 2 (%22.2) 1 (%11.1) 9 İzole IUGG Tek soft marker 74 (%97.4) 0 2(%2.6) 76 55 (%93.2) 2(%3.4) 2(%3.4) 59 Çoklu soft marker 17 (%94.4) 1(%5.6) 0 18 Toplam 2534 (%88.7) 138 (%4.8) 186 (%6.5) 2858
Schaffer et al., 2012; Prenat Diagn, 32, 1-10 Tek sistem MSS- anomalileri n:326 MSS+yapısal olmayan anomaliler n:56 normal a-cgh n: 286 (%87.7) normal a-cgh n: 51 (%91.1) şüpheli a-cgh n: 17 (%5.2) şüpheli a-cgh n: 3 (%5.4) patolojik CNV n: 23 (%7.1) patolojik CNV n: 2 (%3.6) Merkezi Sinir Sistemi Anomalisi Saptanan Prenatal Olgularda a-cgh Sonuçları; Roche- NimbleGene Platformu 1.4 milyon prob (SNP+CNV) ile İstanbul Deneyimlerimiz Fetal Kromozom analizi normal 49 olgu A- CGH ile CNV değişimi saptanan olgu 49 %100 CNV (benign) olgu n:44 (%89.8) Şüpheli CNV olgu n: 5 (~%10) (~%20 ek maliyet) Parental a-cgh n:3 çift (6 test) - İki olgudaki CNV parental kalıtıldığı saptandı (benign) - Bir olgudaki CNV patolojik olarak değerlendirildi (~%2)
Olgu1: NAG. 28 yaşındaki anne ve 35 yaşındaki baba sağlıklı 4. gebelik 36 (+) GH: Endikasyon: PATUSG (alobar HPE (talamik füzyon, monoventrikül), mikrosefali, arini, bilateral yarık dudak ve bilateral hidronefroz) Kordosentez: 46,XY A-CGH sonucu: arr 7q35q36.3(147,250,584-158,816,094)x1, 9p24.3p21.3(199,254-20,231,750)x3 Konfirmasyon: I-FISH ikişer sinyal Anne-baba a-cgh normal Sonuç; Anomali de novo Delesyon ve duplikasyon intersisyel
7q35q36.3 delesyon bölgesinde toplam 161 gen Sonic hedgehog (SHH) geni bu bölgede SHH geni (MIM*600725) embriyonun erken döneminde önbeyin, spinal kord, ekstremite, diş ve orta hat yapılarının gelişiminde önemli bir rol oynar. 9p24.3p21.3 duplikasyon bölgesinde 117 gen VLDLR (MIM*192977) geni; serebral ve serebellar gelişimde ve migrasyonda rol oynar.bu gen mutasyonlar ı serebellar hipoplazi, lizensefali, Alzheimer hastalığı, otizm ve böbrek anomalileri ile ilişkilendirilmektedir. GLIS3 (MIM*610192) geni; embriyonun erken döneminde akciğer, böbrek, trakea ve genital dokularda eksprese olur. Bu gen mutasyonları diabet, konjenital hipotiroidizm, yüz anomalileri, konjenital glokom, karaciğer fibrosizi ve polikistik böbrek hastalıkları ile ilişkilendirilmektedir. Olgumuzun USG bulguları arasında yer alan blt hidronefrozun bu iki genin duplikasyonlarıyla ilişkili olup olamayacağı sorusu da akla gelmektedir.
Olgu 2; DA Endikasyon; MKA/MR ( A/T; WAGR) 46,XY,t(3;15;21) (p13;q21.2;q22.3),t(4;16)(q31;p31.1)dn a-cgh Endikasyonu; Görünürde Dengeli de novo resiprokal translokasyon 46,XY,t(3;15;21) (p13;q21.2;q22.3),t(4;16)(q31;p31.1)dn.arr 11p14.1p13 (30,031,595-33,045,209)x1 11p14.1p13 bölgesinde 15 gen bulunmaktadır Bu genlerden WT1 ve PAX6 genleri WAGR sendromu ile ilişkilidir
Olgu 3; KS 112 Karyotip endikasyonu; PATUSG (ventrikulomegali, CCA, ikiz eşi) Karyotip; 47,XX,+mar a-cgh endikasyonu; marker kromozomun aydınlatılması 47,XX,+mar. arr 9p24.3-q21.11 (0-71,226,556)x4/ 9p24.3-p23(0-10,016,576)x6
Konfirmasyon; FISH wcp 9 arm spesifik 9 p ve q subtelomerikp 47,XX,+mar1/48,XX,+mar1,+mar2 [56/4]. ish 47,XX,+i(9)(p?)/ 48,XX,+i(9)(p?), +idic(9)(q21) 9ptel30(43N6x6, wcp9p++/wcp9q+, D9Z3++)[56/4]. arr 9p24.3-q21.11 (0-71,226,556)x4/ 9p24.3-p23(0-10,016,576)x6
Olgu 4; GD Prenatal tanı endikasyonu; İleri anne yaşı+2 li testte artmış risk+icsi (donuk embriodan) CVS Karyotipi 13.GH; 46,--,t(2;4)(p23;q31.1)dn a-cgh endikasyonu; görünürde dengeli de novo resiprokal translokasyon a-cgh sonucu normal 22. GH, 2. düzey USG; Ense plisi kalınlığında artış PTPN11 dizi analizi; 13. ekzonda heterozigot c.1529a>c de novo (Leopard sendromu nda tanımlanmış bir mutasyon)
ACOG (2009; Obstet and Gynecol, 114:5,1161-1163) SIGU çalışma grubu (2012;Ultrasound Obstet Gynecol, 39:384-388) 1) konvensiyonel karyotipin yerini almaması gerektiği, 2) tüm gebeliklerde genel tarama için değil seçilmiş gebeliklerde özel tanı amacıyla kullanılması gerektiğini, 3) prenatal tanıda özel endikasyonlarda; i) izole veya multiple USG anomalisi saptanan gebelikler ii) karyotip analizinde dengeli bile görünse de novo yapısal kromozom anomalilerinde iii) marker kromozomların karakterizasyonunda tamamlayıcı ikinci bir test olarak kullanılmasını önermektedir 4) hedefe yönelik array testi öncesinde ve sonrasında verilecek danışmalarla, anne babalar a-cgh in tüm patolojileri yakalayamayabileceği ve a-cgh sonuçlarının yorumunun zor olabileceği konusunda bilgilendirilmeli 5) Array faydalı bir test olmakla birlikte, ilave çalışmalar (parental testler, konfirmasyonlar) gerekebilir ve maliyet artar
Table 4a: The number of cases with chromosome abnormality according to the indication for chromosome analysis in CVS series Chromosome anomalies (inc. mosaics) CVS CBCR Others LR AMA ST P-USG 45,X n:42 0 1 0 1 4 36 polysomy X/Y n:6 0 2 0 2 0 2 tri 21 and robt n:131 6 0 2 7 28 88 tri 18 n:61 1 0 0 1 4 55 tri 13 and robt n:27 1 0 0 1 2 23 uncommon tri. n:21 0 2 1 1 9 8 poliploidies, n:20 1 0 0 0 2 17 balanced structural n:51 35 5 1 2 1 7 unbalanced structural n:27 15 0 0 0 3 9 total n:386 59 10 4 15 53 245 Table 4b: The number of cases with chromosome abnormality according to the indication for chromosome analysis in AC series Chromosome anomalies (inc. mosaics) AC CBCR Others LR AMA ST P-USG 45,X n:58 0 1 0 6 18 33 polysomy X/Y n:68 0 0 0 32 18 18 tri 21 and robt n:339 1 0 5 82 78 173 tri18 n:87 1 0 0 13 7 66 tri13 and robt n:23 0 0 1 5 2 15 uncommon tri n:20 0 0 0 5 4 11 polyploidies n:17 0 0 0 1 1 15 balanced structural n:217 64 5 6 73 47 22 unbalanced structural n:60 10 0 0 15 11 24 total n:889 76 6 12 232 186 377
Ana endikasyon gruplarında 2 dekatta (1989-1999 ve 2000-2011) saptanan fetal kromozom anomali oranları; PRETAM+PREMED CVS Series 1. Period (1989-1999) 2. Period (2000-2011) n n ano ano % n n ano ano % Overall rate % CBCR 53 34 64,2 48 25 52,1 58,4 Others 308 2 0,7 533 8 1,5 1,2 LowR 42 4 9,5 13 0 0 7,3 AMA 112 4 3,6 223 12 5,4 4,8 ST 6 1 16,7 276 52 18,8 18,8 P-USG 110 19 17,3 714 226 29,7 28,7 total 631 64 10,1 1822 323 17,7 15,8 AC Series 1. Period (1989-1999) 2. Period (2000-2011) Overall rate % n n ano ano % n n ano ano % CBCR 43 26 60,5 93 50 53,8 55,9 Others 267 1 0,4 358 5 1,4 1 LowR 577 8 1,4 379 4 1,1 1,3 AMA 3891 93 2,4 6539 139 2,1 2,2 ST 2056 52 2,5 4693 134 2,9 2,8 P-USG 536 55 10,3 3906 321 8,2 8,5 total 7370 235 3,2 15443 654 4,2 3,9
Kromozom Anomalierinin Tanısında Kullanılan Teknikler Tüm genomu inceler Dengeli kromozom anomalilerini tanır Düşük oranlı mozaikler saptanır 3n/4n tanısı mümkün Lokusa /kromozoma özeldir Rezolüsyonu yüksektir <3Mb) Otomatizasyona uygundur 3n/4n tanısı mümkün Tüm genomu inceler Rezolüsyonu en yüksek (>100 Kb) Hücre kültürü gerekmez Otomatizasyona uygundur Rezolüsyon daha düşüktür (5-10 Mb) Hücre kültürü gerektirir Tanı subjektiftir Otomatizasyon zordur Endikasyona göre hücre kültürü gerekir Endikasyona göre kullanılır Dengeli kromozomal değişimleri tanıyamaz Düşük oranlı (<%10) mozaikleri tanıyamaz Bioinformatik çalışma gerektirir Henüz pahalı
Genetik Hastalıkların Tanısı Sitogenetik testler Klasik karyotipleme metafaz kromozomlarını inceler HRBT karyotipleme prometafaz kromozomlarını inceler FISH bilinen kromozom ve özgün kromozom bölgelerini seçici olarak inceler Moleküler testler Tek bir genin ekzon ve introndaki değişimleri (patojenik veya polimorfikzararsız) inceler; tek bir genin, ilişkili genlerin ya da genomdaki tüm ekzomların dizilenmesi olasıdır, Genin ürünü olan m-rna daki değişimleri inceler; hücrenin tüm m-rna ları da incelebilir (transkriptomiks) Tüm kromozom anomalileri ve mikrodelesyon sendromları Tek Gen Hastalıkları ve Multigenik Hastalıklar Sitogenetik Moleküler Mikroarray
Postnatal Uygulamalar The International Standard Cytogenomic Array (ISCA) Consortium Miller DT, 2010, American J Hum Genet. Açıklanamayan gelişme geriliği, MKA/MR ve otizm spektrumu endikasyonunda; Sitogenetik %3-36 (%17,4 Karaman et al., 1999) Moleküler karyotipleme, anomali saptama oranı en yüksek olan (%15-20) tanı testidir. Bilinen sayısal ve gros yapısal anomalilerin yanısıra submikroskobik delesyon ve duplikasyonları saptayabildiğinden Moleküler karyotipleme birinci tanı testi olarak uygulanmalıdır! Dengeli yeniden düzenlenmeler ve düşük oranlı mozaisizmler saptanamaz ancak bu popülasyonda bu anomalilerin saptanma oranı %1 den az olduğundan göz ardı edilebilir.