Farmakogenetikte Kullanılan Temel Yöntemler Dr. Melih Ö. Babaoğlu Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi Farmakoloji A.D. XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 1 Hastalık derecesi Fizyolojik durum İlaç etkileşmeleri Kültürel faktörler Çevresel etkiler Genetik faktörler İlaç yanıtında bireyler arası değişkenlik XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 2 1
XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 3 Genetik faktörler İlaç yanıtındaki bireyler arasındaki değişkenliğin, %20-40 ından advers etkilerin yaklaşık %50 sinden sorumlu XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 4 2
Farmakogenetik İlaç yanıtında bireyler arasında gözlenen farklılıkların oluşumunda genetik faktörlerin katkısını inceleyen bilim dalı XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 5 Farmakogenetik Genetik polimorfizm Farmakokinetik Taşıyıcı proteinler Plazma proteinleri Metabolizma Farmakodinamik Reseptörler İyon kanalları Enzimler XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 6 3
Farmakogenomik Daha geniş bir kavram Birçok genetik faktörün ve genomik yapının hastalık oluşumu ve ilaç yanıtı üzerindeki etkilerini inceleyerek yeni ilaç hedefleri saptama çalışmaları XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 7 Tek nükleotid polimorfizmi (SNP) İnsan genomu 2.900.000.000 baz çifti 10.000 000.000 tek nükleotid polimorfizmi 300.000 000 haplotip 10.000 000 farmakogenetik ile ilişkili XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 8 4
Emilim Yavaş Hızlı İlaç etki yeri (reseptörler) Tam Yetersiz Metabolizma İlaç-ilaç, ilaç-besin etkileşmeleri Yavaş Hızlı Çok hızlı İlaç-ilaç etkileşmeleri Atılış (itrah) Yavaş Hızlı İlaç-ilaç, ilaç-besin etkileşmeleri XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 9 Farmakogenetik: Yöntemler Klinik gözlem: ilaca verilen cevapta farklılık Fenotipik polimorfizmi (> %1) saptamak için uygun bir belirteç ilaç ile popülasyon dağılımı Aile ve ikiz çalışmaları (dominant, resesif) Genin ve mutasyonların belirlenmesi Genotip ve fenotip karşılaştırılması XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 10 5
Normal DağılımD Frekans Aktivite XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 11 Polimorfik Dağılım Frekans Aktivite XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 12 6
Farmakogenetiğin amacı Her bir hasta için en uygun dozun uygulanması ve en uygun ilacın seçimi. XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 13 XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 14 7
TPMT Genotip-Fenotip Korelasyonu TPMT aktivitesi TPMT genotipleri XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 15 XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 16 8
İlaç metabolizması- Fenotipik polimorfizm Yavaş Metabolizör (YM) Hızlı Metabolizör (HM) (Çok Hızlı Metabolizör - ÇHM) XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 17 Türkiye: %6 Birey sayısı Çok hızlı yıkan bireyler Kırılma noktası Türkiye: % 4 Yavaş yıkan bireyler Debrizokin/metabolit oranı Şekil: Alvan G ve diğ., Drug Metab Dispos 29: 580 XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 18 9
Diğer CYP polimorfizmleri 2D6 Yavaş metabolizör Kodein Ağrı kesici etki oluşmaması 2C9 Yavaş metabolizör Varfarin Kanama 2C19 Yavaş metabolizör Omeprazol Tedavinin hızlanması Diazepam Sedasyon XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 19 CYP enzimleri Faz I * * * Evans ve Relling, Science, 286, 487 XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 20 10
Faz I enzimleri CYP2D6*1*2 familya alt-familya enzim/gen alel XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 21 Genetik sinyalin amplifikasyonu Polimeraz zincir reaksiyonu PCR 22 11
PCR- Amaç Nükleik asitleri in vitro çoğaltma yöntemi Kopyalama ile DNA amplifikasyonu Genelde genom üzerindeki görece küçük bir bölgeyi (100-3000 baz çifti -bp-) milyonlarca kez çoğaltma Sinyalin tanınmasını kolaylaştırma (sekanslama, nokta mutasyon analizi, v.b.) XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 23 PCR- Avantajları Kısa zaman içinde (birkaç saat) milyonlarca kopya oluşması Hücresiz ortam XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 24 12
PCR- Üç basamak Denatürasyon: DNA nın iki zincirinin birbirinden ayrılması (94-95 C de) XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 25 PCR- Üç basamak Primer bağlanması (Annealing): Kısa komplementer nükleik asitlerin hedeflerini tanıması (55-65 C de) XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 26 13
PCR- Üç basamak DNA polimerazın primerleri uzatması (uzama) (70-75 C de) XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 27 PCR 95 C, 5 dak 72 C, 10 dak XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 28 14
XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 29 XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 30 15
Amplifikasyon XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 31 PCR bileşenleri Tipik bir PCR tüpünün içeriği Reaksiyon tüpündeki Bileşen (50 μl) konsantrasyon 5 μl 10X Taq buffer 1X 2-10 μl MgCl 2 (25 mm stok çözelti) 1-5 mm 5 μl dntp karışımı (her birinden 2 mm) 200 μm (her biri) 0.5-1.25 μl Primer 1 (20 μm stok çözelti) 0.2-0.5 μm 0.5-1.25 μl Primer 2 (20 μm stok çözelti) 0.2-0.5 μm 0.25-0.50 μl Taq polimeraz 1.25-2.5 ünite 1-4 μl genomik DNA (1-1000 ng) Distile su (hacmi 50 μl ye tamamlayacak miktar) XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 32 16
PCR bileşenleri Reaksiyon tüpündeki Bileşen (50 μl) konsantrasyon 5 μl 10X Taq buffer 1X Magnezyum içerebilir veya içermeyebilir XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 33 PCR bileşenleri Tipik bir PCR tüpünün içeriği Bileşen Reaksiyon tüpündeki (50 μl) konsantrasyon 2-10 μl MgCl 2 (25 mm stok çözelti) 1-5 mm Magnezyum konsantrasyonu ürün kalitesini etkileyen en önemli unsurlardan biri XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 34 17
PCR bileşenleri Bileşen Reaksiyon tüpündeki (50 μl) konsantrasyon 5 μl dntp karışımı (her birinden 2 mm) 200 μm (her biri) Genelde datp, dctp, dgtp, dttp karışımı olarak 10-25 mm olarak sağlanır. XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 35 PCR bileşenleri 0.5-1.25 μl Primer 1 (20 μm stok çözelti) 0.2-0.5 μm 0.5-1.25 μl Primer 2 (20 μm stok çözelti) 0.2-0.5 μm Liyofilize olarak hazırlanır (ticari), su veya TE tamponu ile çözülür XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 36 18
PCR bileşenleri 0.25-0.50 μl Taq polimeraz 1.25-2.5 ünite Gliserollü tampon içinde sağlanır Kendi tamponu ile kullanılmalı XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 37 PCR bileşenleri 1-4 μl genomik DNA (1-1000 ng) Yoğun tuz ile çöktürme yöntemi klasik bir yöntem, ucuz, her kitapta ve internet sitelerinde var Filtre kullanan kitler pahalı ama zamandan kazandırabilir, kalitede biraz ödün veriliyor XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 38 19
PCR bileşenleri Tipik bir PCR tüpünün içeriği Reaksiyon tüpündeki Bileşen (50 μl) konsantrasyon 5 μl 10X Taq buffer 1X 2-10 μl MgCl 2 (25 mm stok çözelti) 1-5 mm 5 μl dntp karışımı (her birinden 2 mm) 200 μm (her biri) 0.5-1.25 μl Primer 1 (20 μm stok çözelti) 0.2-0.5 μm 0.5-1.25 μl Primer 2 (20 μm stok çözelti) 0.2-0.5 μm 0.25-0.50 μl Taq polimeraz 1.25-2.5 ünite 1-4 μl genomik DNA (1-1000 ng) Distile su (hacmi 50 μl ye tamamlayacak miktar) Karışımın üzerine bir damla mineral yağı XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 39 Kapağı ısıtmalı modeller veya mineral yağı kullanılması XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 40 20
PCR DİKKAT!! Kontaminasyon (Çapraz kontaminasyon) Negatif kontrol tüp konmalı Önleme yolları (kitapçık) XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 41 İyi bir primerin özellikleri 18-30 nükleotid uzunluğunda olmalı Dört baz (A, C, G, T) olabildiğince eşit ve heterojen sırada olmalı Peş peşe aynı bazın uzun tekrarlarından kaçınılmalı Primerin kendi içinde komplementer bazlar içermemesine dikkat edilmelidir. Primer çiftinin 3 -uçlarının birbirlerine komplementer olmamasına dikkat edilmeli (aksi halde primer-dimer oluşumu) Primerin insan genomu üzerinde yalnızca tek bir bölgeyi tanıdığından emin olunması (BLAST) XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 42 21
Taq Ucuz, yaygın kullanım, hızlı reaksiyon Yanlış eşleşmeyi düzeltme (3-5 ekzonükleaz)aktivitesi yok 1/9000 oranında yanlış eşleştirme yapar. Ancak PCRda nadiren bir sorun olur (yüzlerce kalıptan başlayan çoğalma). Toplam ürünün binde bir kaçı. Tli / Pfu / Vent tama yakın doğruluk. Pahalı. XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 43 Genetik sinyalin görüntülenmesi Agaroz jel elektroforezi Daha düşük rezolüsyon ama hazırlanması daha kolay (%0.8-6) %6 dan daha yoğun hazırlanması zor, ürünler arasındaki fark küçüldükçe ayrımları zorlaşır. Poliakrilamid jel elektroforezi Daha yüksek rezolüsyon Çok yoğun hazırlanabilir (%>10) XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 44 22
PCR ürünlerini görüntülemek Tampon çözeltiler TAE (tris-asetik asit-edta): Daha düşük tampon kapasitesi TBE (tris- borik asit-edta): (kitapçık) XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 45 PCR ürünlerini görebilmek DNA yı görebilmek için flüoresan ışık yayan boyalar: Etidyum bromür Çift zincirde bazlar arasına girerek sıkışır UV altında flüoresan ışık yayar XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 46 23
DNA - küçük büyük + V XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 47 Agaroz XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 48 24
Agaroz jel hazırlanması XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 49 % kaçlık? TBE örn: %2 = 2g/100 ml TBE Flask for boiling Agaroz XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 50 25
Elektroforez tankı Güç kaynağı Tank Kapak Jel tepsisi Jel tarağı XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 51 Jel tarakları XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 52 26
Seal the edges of the casting tray and put in the combs. Place the casting tray on a level surface. None of the gel combs should be touching the surface of the casting tray. XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 53 XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 54 27
Agarozun eritilmesi Kısa aralıklarla karıştırarak taşmasına izin vermeden yüksek ısıda kaynatılır XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 55 Jelin dökülmesi Jel üzerinde veya içinde hava kabarcığı olmamasına dikkat edilmeli XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 56 28
XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 57 XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 58 29
30-45 dakika beklenir XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 59 XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 60 30
DNA TBE kuyucuklar Katot (negatif) Anot (pozitif) Add enough electrophoresis buffer to cover the gel to a depth of at least 1 mm. Make sure each well is filled with buffer. XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 61 PCR ürünlerinin yüklenmesi 6X yükleme tamponu kullanılır, boyalar jel yürümesini izlemeyi sağlar. 6X yükleme tamponu: Bromofenol mavisi Gliserol XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 62 31
XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 63 Örneklerin yüklenmesi Pipet ucunu jelin içine batırmamaya dikkat edilmeli XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 64 32
Jelin yürütülmesi Place the cover on the electrophoresis chamber, connecting the electrical leads. Connect the electrical leads to the power supply. Be sure the leads are attached correctly - DNA migrates toward the anode (red). When the power is turned on, bubbles should form on the electrodes in the electrophoresis chamber. XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 65 Katot (-) DNA (-) Gel wells Bromofenol mavisi Anode (+) Boyanın doğru yöne (!) yürüdüğüne dikkat etmeli XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 66 33
- 12,000 bp 5,000 elektroforez yönü 2,000 1,650 + 1,000 850 650 500 400 300 200 100 XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 67 PCR ürününün gözlenmesi Etidyum bromür ***CAUTION! Ethidium bromide is a powerful mutagen and is moderately toxic. Gloves should be worn at all times. XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 68 34
Jelin boyanması Jelin 20-30 dakika EtBr içeren çözeltide tutulması Birkaç defa yıkanması XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 69 UV transiluminatör ile gözlenmesi 70 35
XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 71 1 2 3 4 5 6 7 8 kuyucuklar PCR ürünü Primer dimerleri 5,000 bp 2,000 1,650 1,000 850 650 500 400 300 200 100 XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 72 36
Mutasyonun belirlenmesi Dizi analizi (sekanslama) XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 73 Mutasyonun belirlenmesi SSCP Heteroduplex oluşumu... v.b. XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 74 37
Mutasyonun belirlenmesi Restriksiyon Enzimleriyle Kesme İşlemi (RFLP) Pratik Ucuz Temel donanım yeterli XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 75 PCR ürününün kesimi XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 76 38
PCR ürününün kesimi XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 77 Endonükleaz kesimi ABCB1 3435C>T m CT TT CC nk MboI 197 bp 158 bp...gatc.....gatt... 39 bp %3 lük agaroz jel Babaoglu et al., Clin Pharmacol Ther, 2005 XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 78 39
Endonükleaz kesimi ADH3 Babaoglu XIII. TFD Eğitim et al., Sempozyumu Methods Find Van Exp Clin Pharmacol 2006 79 Endonükleaz kesimi ABCB1 3435C>T m CT TT CC nk MboI 197 bp 158 bp...gatc.....gatt... 39 bp %3 lük agaroz jel Babaoglu et al., Clin Pharmacol Ther, 2005 XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 80 40
Akut Antiemetik Etkinlik * Akut antiemetik etkinlik (%) 100 80 60 40 20 0 CC CT TT CC CT TT CC CT TT Tropisetron Ondansetron Granisetron Babaoglu et al., Clin Pharmacol Ther, 2005 XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 81 5-HT3 Antagonistlerinin Antiemetik Etkinliği Sonuç: Granisetron ile tedavi edilen ABCB1 3435C>T homozigot hastalarda kemoterapiye bağlı daha az bulantı ve kusma görülüyor XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 82 41
Endonükleaz kesimi BChE Genotyping for BChE K-variant PCR based endonuclease (Mae III) method (Jensen et. al. 1996). 222 bp 179 bp 126 bp 75 bp 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Babaoglu XIII. TFD Eğitim et al., Sempozyumu Eur J ClinVan Pharmacol (2004) 59: 875 877 83 Endonükleaz kesimi BChE Babaoglu XIII. TFD Eğitim et al., Sempozyumu Eur J ClinVan Pharmacol (2004) 59: 875 877 84 42
Neler gerekli? XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 85 Neler gerekli? XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 86 43
Neler gerekli? XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 87 Neler gerekli? XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 88 44
XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 89 Neler gerekli? XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 90 45
Neler gerekli? XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 91 Neler gerekli? XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 92 46
Neler gerekli? XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 93 Neler gerekli? XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 94 47
SNP.CSHL.ORG XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 95 XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van Goodman Gilman 2006 96 48
XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 97 Genetik bağlantı (linkage) XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 98 49
XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 99 Amplichip CYP450 TM 2003 İlk P450 mikrodizini XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 100 50
XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 101 Kredi kartı XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 102 51
Teşekkür Prof. Dr. Atila Bozkurt Doç. Dr. Ümit Yaşar Dr. E Karginova Dr A Schulte TÜBİTAK HÜ Bilimsel Araştırmalar Birimi COST B15 ve B25 XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 103 52