i YARA ĐYĐLEŞMESĐNDE SĐSTEMĐK EGF UYGULAMASININ KARACĐĞER DOKUSU KOLLAJEN VE PROTEĐN DÜZEYLERĐNE ETKĐSĐ Fatma KÜÇÜK YÜKSEK LĐSANS TEZĐ BĐYOLOJĐ GAZĐ ÜNĐVERSĐTESĐ FEN BĐLĐMLERĐ ENSTĐTÜSÜ HAZĐRAN 2010 ANKARA
ii Fatma KÜÇÜK tarafından hazırlanan YARA ĐYĐLEŞMESĐNDE SĐSTEMĐK EGF UYGULAMASININ KARACĐĞER DOKUSU KOLLAJEN VE PROTEĐN DÜZEYLERĐNE ETKĐSĐ adlı bu tezin Yüksek Lisans olarak uygun olduğunu onaylarım. Doç. Dr. K. Barbaros BALABANLI. Tez Danışmanı, Biyoloji Anabilim Dalı Bu çalışma, jürimiz tarafından oy birliği ile Biyoloji Anabilim Dalında Yüksek Lisans tezi olarak kabul edilmiştir. Prof. Dr. Turan GÜVEN Biyoloji Eğitimi Anabilim Dalı, G. Ü. Doç. Dr. K. Barbaros BALABANLI Biyoloji Anabilim Dalı, G. Ü. Doç. Dr. Şule Coşkun CEVHER Biyoloji Anabilim Dalı, G. Ü.... Tarih: 14 / 06 / 2010 Bu tez ile G.Ü. Fen Bilimleri Enstitüsü Yönetim Kurulu Yüksek Lisans derecesini onamıştır. Prof. Dr. Bilal TOKLU Fen Bilimleri Enstitüsü Müdürü.
iii TEZ BĐLDĐRĐMĐ Tez içindeki bütün bilgilerin etik davranış ve akademik kurallar çerçevesinde elde edilerek sunulduğunu, ayrıca tez yazım kurallarına uygun olarak hazırlanan bu çalışmada bana ait olmayan her türlü ifade ve bilginin kaynağına eksiksiz atıf yapıldığını bildiririm. Fatma KÜÇÜK
iv YARA ĐYĐLEŞMESĐNDE SĐSTEMĐK EGF UYGULAMASININ KARACĐĞER DOKUSU KOLLAJEN VE PROTEĐN DÜZEYLERĐNE ETKĐSĐ (Yüksek Lisans Tezi) Fatma KÜÇÜK GAZĐ ÜNĐVERSĐTESĐ FEN BĐLĐMLERĐ ENSTĐTÜSÜ Haziran 2010 ÖZET Yara, yumuşak dokuların normal anatomik yapı ve fonksiyonunun bozulmasıdır. Yara iyileşmesi, travma ile başlayan ve yeni doku oluşumu ile sonuçlanan hücresel ve biyokimyasal olaylar sürecidir. Operatif veya travmatik olarak dokunun hasar görmesini takiben, her organizmanın öncelikli görevi; kanamayı durdurma, enfeksiyonu önleme, bozulan anatomik bütünlük ile fonksiyonel yapıyı onarmaktır. EGF gibi çeşitli büyüme faktörleri yara iyileşmesi sürecinde önemli rol oynarlar. Yara iyileşmesi sürecinde lokal veya sistemik olarak verilen EGF nin yara dokusundaki etkileri üzerine çok sayıda araştırma bulunurken EGF nin iç organlar üstündeki etkisi üzerine araştırma sayısı oldukça azdır. Bu sebeple sistemik olarak verilen EGF nin karaciğer dokusundaki kollajen ve protein sentezi üzerine etkisini araştırmayı planladık. Deneylerde 200 250 g ağırlıkta 48 adet Wistar-Albino tipi erkek rat kullanıldı. Dorsolateral eksizyonel yara yapılan fareler 2 gruba ayrıldı: 1-Tedavi edilmeyen kontrol grubu 2- Sistemik EGF uygulanan grup. Uygulama grubundaki hayvanlara her gün birer doz olmak koşuluyla intraperitonel (IP) olarak (10ng/ml) EGF verildi. Operasyonun 1, 5, 7 ve 14. günlerinde ratlar anestezi altında kalplerinden kan çekilmek suretiyle feda edildi.
v Ardından karaciğerleri hemen çıkartılarak bulaşmayı önleyecek şekilde 30 0 C de saklandı. Dokulardaki kollajen konsantrasyonunun tespiti modifiye Lowry metodu ile protein konsantrasyonunun tespiti ise Lowry metodu ile gerçekleştirildi. Sonuçlar Mann Whitney U testi ile karşılaştırıldı. Sonuç olarak, sistemik EGF uygulaması yara iyileşmesinin fazları da dikkate alındığında, kontrollerle kıyas edildiğinde EGF nin karaciğerdeki kollajen sentezini 7. güne kadar protein sentezini ise 5. güne kadar uyardığı fakat sonraki günlerde bu uyarının ortadan kalktığı ve bu kez EGF nin kollajen ve protein sentezini baskıladığı tespit edilmiştir. Bilim Kodu : 203.1.020 Anahtar Kelimeler : Epidermal büyüme faktörü, Yara iyileşmesi, Kollajen, Protein sentezi Sayfa Adedi : 66 Tez Yöneticisi : Doç. Dr. K. Barbaros BALABANLI
vi THE EFFECT OF SYSTEMIC EGF ON LIVER TISSUE COLLAGEN AND PROTEIN LEVELS IN WOUND HEALING (M.Sc. Thesis) Fatma KÜÇÜK GAZI UNIVERSITY INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY June 2010 ABSTRACT Wound is the impairment of soft tissues anatomic structure and function. Wound healing is the process of the biochemical events that starts with trauma and eventuates with new tissue formation. Followed by operative or traumatic damage of the tissue, the prior mission of all organisms is to cease hemorrhage, prevent infection, repair the impaired anatomic entirety and functional structure. Various growth factors, like EGF, play an important role in wound healing. There are plenty of studies about the effect of local or systemic administration of EGF on wound tissue at wound healing process; however the number of studies about the effect of EGF on internal organs is insufficient. Therefore, we planned to investigate the effects of systemically administered EGF on collagen and protein synthesis of liver tissue. In our study, 48 male Wistar-Albino rats (weight: 200-250g) are used. Dorsolateral excisional wounds are made on the rats and they are divided into 2 groups: 1- Non-treated control group, 2- Systemic EGF administered group. EGF is administered intraperitonally (IP) on post-operation days and the animals are sacrificed on 1, 5, 7 and 14th days by exsanguination under anesthesia. Livers are removed immediately avoiding contamination and stored at 30 0 C. Tissue collagen and protein measurements are performed by
vii modified Lowry method and Lowry method, respectively. Mann Whitney U test is used for statistical analysis of the results. As a result, also taking phases of wound healing into consideration, EGF is found to stimulate collagen and protein synthesis until 7th and 5th days, respectively; however it is found that this stimulation disappeared on the following days and EGF repressed collagen and protein synthesis. Science code : 203.1.020 Key Words : Epidermal growth factor, Wound healing, Collagen, Protein synthesis Sayfa Adedi : 66 Tez Yöneticisi : Assoc. Prof. Dr. K. Barbaros BALABANLI
viii TEŞEKKÜR Çalışmalarım boyunca değerli yardım ve katkılarıyla ben yönlendiren danışmanım Doç. Dr. K. Barbaros BALABANLI ya yine kıymetli tecrübelerinden faydalandığım Doç. Dr. Şule COŞKUN a ve Arş. Gör. Özge Tuğçe PAŞAOĞLU başta olmak üzere laboratuvarda görevli tüm çalışma arkadaşlarıma teşekkürü bir borç bilirim.
ix ĐÇĐNDEKĐLER Sayfa ÖZET... iv ABSTRACT... vi ĐÇĐNDEKĐLER... ix ÇĐZELGELERĐN LĐSTESĐ... xi ŞEKĐLLERĐN LĐSTESĐ... xii 1.GĐRĐŞ... 1 2.GENEL BĐLGĐLER... 5 2.1. Yara... 5 2.1.1. Yara çeşitleri... 5 2.2. Yara Đyileşmesi... 6 2.2.1.Yara iyileşme mekanizmaları... 8 2.2.2. Yara iyileşmesinin histopatolojisi... 9 2.2.3.Yara iyileşmesinin fizyolojisi... 10 2.2.6.Yara iyileşmesini etkileyen faktörler... 22 2.3. Büyüme Faktörleri... 22 2.3.1. Büyüme faktörlerinin reseptörleri... 25 2.3.2. Büyüme faktörleri ve yara iyileşmesi... 26 2.3.3. Epidermal büyüme faktörü (EGF)... 28 2.3.4. EGF etkileşimleri... 31 2.3.5. EGF ve yara iyileşmesi... 32 2.4. Kollajen... 33 2.4.1. Kollajen fibril oluşumuna etki eden faktörler... 38
x Sayfa 3. MATERYAL METOT... 39 3.1. Deney Hayvanları... 39 3.2. Deney Gruplarının Oluşturulması... 39 3.3. Yara Modelinin Oluşturulması... 40 3.4. Yöntemler... 40 3.4.1. Dokuda kollajen tayini... 40 3.4.2. Dokuda protein tayini... 42 3.5. Đstatiksel Değerlendirme... 44 4. BULGULAR... 45 4.1. Karaciğer Dokusu Kollajen ve Protein Düzeyleri... 45 5. SONUÇLAR... 50 KAYNAKLAR... 54 ÖZGEÇMĐŞ... 66
xi ÇĐZELGELERĐN LĐSTESĐ Çizelge Sayfa Çizelge 2.1. Yara iyileşmesinde ekstrasellüler elementler ve hücrelerin rolleri.... 9 Çizelge 2.2. Yara iyileşmesinde büyüme faktörleri.... 27 Çizelge 3.1. Solüsyon içerikleri... 42 Çizelge 4. 1. 1,5,7 ve 14 günlük kesi yarası ve ip uygulanan EGF grubuna ait kollajen sonuçları... 46 Çizelge 4. 2. 1,5,7 ve 14 günlük kesi yarası ve ip uygulanan EGF grubuna ait protein sonuçları... 46 Çizelge 4.3. Kollajen ve protein düzeyleri... 48
xii ŞEKĐLLERĐN LĐSTESĐ Şekil Sayfa Şekil 2.1. Yara iyileşmesinin fazları... 21 Şekil 2.2. Büyüme faktörlerinin hücresel fonksiyon yolları... 23 Şekil 2. 3. EGF nin yapısı... 28 Şekil 2.4. EGF sinyalizasyon yolu... 31 Şekil 2.5. Kollajen fibrilin ince yapısı... 34 Şekil 2.6. Tavuk embriyosu korneasında tip I ve tip V kollajen moleküllerinin transmisyon elektron mikroskobu görüntüsü... 36 Şekil 2. 7. Tip I ve tip V kollajen moleküllerinin oluşturduğu heterotipik fibril yapısı.... 37 Şekil 2.8. Tip IX ve tip II kollajen moleküllerinin oluşturduğu heterotipik fibril yapısı... 37 Şekil 4.1. Kollajen ölçümüne ait standart grafik... 45 Şekil 4.2. EGF ve kontrol grubuna ait kollajen düzeylerinin günlere göre değişimi 49 Şekil 4.3. EGF ve kontrol grubuna ait Protein düzeylerinin günlere göre değişimi. 49
xiii SĐMGELER VE KISALTMALAR Bu çalışmada kullanılmış bazı simgeler ve kısaltmalar, açıklamaları ile birlikte aşağıda sunulmuştur. Simgeler G Ng Nmol Ng Mg Da µmol Açıklama Gram Nanogram Nanomol Nanogram Miligram Dalton Mikromol µl Mikrolitre kg nm NaOH Na 2 CO 3 Kilogram Nanometre Sodyum hidroksit Sodyum karbonat Kısaltmalar EGF FGF IP PDGF Açıklama Epidermal büyüme faktörü Fibroblast büyüme faktörü Đntraperitonel Platelet kaynaklı büyüme faktörü
xiv Kısaltmalar TNF VEGF Açıklama Tümör nekroz faktör Vasküler endotelyal büyüme faktörü
1 1.GĐRĐŞ Yara, yumuşak dokuların normal anatomik yapı ve fonksiyonunun bozulmasıdır [1]. Yara iyileşmesi, travma ile başlayan ve yeni doku oluşumu ile sonuçlanan hücresel ve biyokimyasal olaylar sürecidir [2]. Operatif veya travmatik olarak dokunun hasar görmesini takiben, her organizmanın öncelikli görevi; kanamayı durdurma, enfeksiyonu önleme, bozulan anatomik bütünlük ile fonksiyonel yapıyı onarmaktır [3-5]. Lokal yaralanmaya karşı organizmanın cevabı ilk olarak inflamasyon süreciyle başlar ve rejenerasyon ve reparasyon ile sonuçlanır [6]. Rejenerasyon ve reparasyon, doku ve hücre bütünlüğünün yeniden tesis edilmesinde iki temel süreçtir. Rejenerasyon, orijinal yapıdan hem yapı, hem de fonksiyon olarak ayrıt edilemeyen yeni dokunun meydana gelmesidir. Reparasyon ise ekstrasellüler matriksin yeniden sentezlenip birikmesiyle, yani bağ doku oluşumu ile doku devamlılığının sağlanmasıdır [6-8]. Büyüme faktörleri yara iyileşmesinde etkileri olan proteinlerdir [9]. Normal yara iyileşmesi ve gecikmiş yara iyileşmesi üzerine büyüme faktörlerinin etkileri ve sistemik ya da topikal olarak epidermal büyüme faktörü (EGF) nün uygulanmasının yara iyileşmesine olumlu katkılarının bulunduğu bilinmektedir [10, 11]. EGF ilk kez Dr. Stanley Cohen tarafından erkek fare submandibular tükürük bezinden izole edilmiştir [12, 13]. Cohen erkek fare submandibular tükrük bezinde Sinir Büyüme Faktörünü (NGF) izole etmeye çalışırken bu bezlerden elde ettiği ekstrenin yeni doğan farelere enjekte edildiğinde erken diş sürmesi ve erken gözkapağı açılışına neden olduğunu gözleyerek etken maddeyi izole etmiş ve bu maddeyi epidermisin gelişimini hızlandırıcı etkisinden dolayı Epidermal Growth Factor (EGF) adını vermiştir [12, 14-19]. EGF böbrek, tükürük bezleri ve lakrimal bez tarafından da üretilir, bu yüzden idrar, tükürük ve gözyaşında bol miktarda bulunur [12]. Ayrıca duedonum brunner bezleri,
2 troid, pankreas, adrenal bez, ovaryum, parotis bezi, karaciğer, özefagus, mide, ince bağırsak, kolon, kalp, böbrek, prostat, iskelet kası, düz kas, akciğerler, timus bezinde de bulunur. EGF birçok ektodermal ve mezodermal kökenli hücre için mitojenik özelliktedir [12, 19-21]. Etkili olduğu hücrelerde iyon alınımı, glikolizisi, DNA ve RNA ile protein yapımını arttırıcı özellik gösterir [20, 21]. EGF nin mide asit sekresyonunu azalttığı [22, 23] ve stres ülseri oluşturulmuş ratlarda mide dokusunda lipit peroksidasyonunu yine azalttığı gözlenmiştir [24]. EGF nin korneal endotelial hücreler, fibroblastlar, sinir sistemi destek dokusu hücreleri üzerinde mitojenik aktiviteye sahip olması [12, 21, 25], gastrik asit sekresyonunu inhibe etmesi [12, 26] yanında embriyonun gelişmesi ve yeni kan damarlarının oluşması üzerinde etkili bulunması sonucu yara iyileşmesi üzerinde yoğun çalışmalar yapılmıştır ve yara iyileşmesini hızlandırdığı bildirilmiştir [27]. Topikal olarak EGF uygulamasının yara iyileşmesi üzerine etkilerinin incelendiği araştırmalarda EGF nin epitelizasyonu uyardığı, yara iyileşmesinin erken safhalarında dermis oluşumunun üzerine kesin etkisinin olduğu ve kronik yaraların iyileşmesini uyardığı bildirilmiştir [12, 28]. EGF nin sistemik yoldan uygulanması ile ilgili yapılan çalışmalarda EGF nin epitelizasyon ve granulasyon dokusu oluşumunu ve yeni damar oluşumunu uyararak yara iyileşmesini hızlandırdığını bildirmiştir [29-32]. Memeli hücrelerinin çoğu dokulara yerleşmiş olup çoğunlukla bağ dokusu adı verilen karmaşık bir hücre dışı yatakla çevrelenmiştir [33]. Bağ doku, hücrelerin aralarını doldurmak suretiyle dokuların şekillenmelerini sağlar. Diğer önemli bir görevi ise organizmadaki doku kayıplarının önlenmesidir. Doku kayıplarının önlenmesinde bağ dokusu hücreleri çoğalıp yeni hücrelerarası madde yaparak, hem bağ dokunun hem de rejenere olamayan dokuların kayıplarını kapatır [31]. Bağ dokusunu oluşturan ekstrasellüler makromoleküler ara madde kollajen, retikülin, elastin ve proteoglikanlardan meydana gelir [2].
3 Kollajen vücuttaki çoğu organın stabilizasyonunu sağlamakta ve kornea, dermis, kemik gibi dokuların ana bileşenini oluşturmaktadır. Kollajen fibriller her bir canlı türünün değişik dokularında göstereceği işleve bağlı olarak farklı düzenlenmeye sahiptir. Tendonda yer alan kollajen fibriller paralel sıralar halinde uzanarak tendona büyük bir dayanıklılık sağlamakta, aynı zamanda esneme yeteneğini azaltmaktadır. Deride yer alan kollajen proteinleri tamamen dağınık düzenleniş göstererek ağsı bir yapı oluşturur. Fibriller arasında meydana gelen kovalent bağlar da bu yapıyı kuvvetlendirmektedir. Gözün korneasındaki organik materyal hemen hemen saf kollajenden ibarettir [34, 35]. Yara onarımında tip I ve tip III kollajen rol oynar [36]. Organ ve dokuların bütünlüğü ile dayanıklığını sağlayan tip I kollajen, vücuttaki kollajenin %90 ını oluşturur ve başlıca deri, kemik ve tendonda bulunur. Tip III kollajen ise deri, kan damarları ve iç organlarda bulunur ve dokulara esneklik sağlar [37, 38]. Yetişkin memelilerin derisinde %80 tip I ve %20 tip III kollajen bulunur [7, 39, 40]. Yara iyileşme evresinin başlangıç sürecinde tip III kollajen fazlaca bulunur. Kollajen, fibroblastların ribozomlarında üretildikten sonra endoplazmik retikuluma geçerek heliks yapısını alır. Heliks formasyonu hidroksiprolin ve hidroksilizinden arta kalan prolin ve lizinin hidroksilasyonu sonucu oluşur. Hidroksilasyon için oksijen ve askorbik asite ihtiyaç vardır. Heliks yapısını alan bu oluşuma prokollajen adı verilir. Fibroblastlardan hücre dışına verilen prokollajen, prokollajen peptidaz enzimi tarafından, tropokollajen adı verilen yapıya dönüştürülür. Bu tropokollajen molekülleri fibril yapısına polimerize olur. Ardından kollajen fibrilleri birbirleriyle birleşerek kollajen fiberlerini oluştururlar [38, 39]. Yara iyileşmesinin ilk birkaç günlük sürecinde, geçici olarak tip III kollajen artışı vardır. Daha sonraki yara iyileşme sürecinde tip I kollajen baskındır [38,41]. Normal bir deride tip I ve tip III kollajen oranı 4/1 dir [38]. Kollajen sentezi tam kalınlıktaki yaralarda 5 7. günlerde en yüksek seviyeye ulaşır ve 3 4 hafta artış devam eder. Dört haftadan sonra yavaş yavaş azalır ve sonunda kollajenazın neden olduğu yıkımı dengeleyen bir düzeye iner [7].
4 Ekstrasellüler fragmentlerden ve inflamatuar hücrelerden salınan interlökin-1 (IL-1), tümör nekroz faktör (TNF-α), PDGF, epidermal büyüme faktörü (EGF), fibroblast büyüme faktörü (FGF) özellikle transforme edici büyüme faktörü β1 (TGF-β1) ve transforme edici büyüme faktörü β2 (TGF-β2) gibi bir çok şemoatraktanlar, fibroblastların yara bölgesine göç etmesinde ve proliferasyonunda rol oynarlar [42-45]. Yara bölgesine ulaşan fibroblastlar, yara olgunlaşmasında önemli olan elastin, fibronektin ve glikozaminoglikan gibi geçici matriksin yerini alacak şekilsiz temel madde komponentleri ile kollajenaz gibi proteazların senteziyle, eş zamanlı olarak yaraya gerilim kuvveti kazandıran glikoprotein yapısında olan kollajen sentezini de yaparlar [4,44,46]. Fibroblastlar yaralanmadan sonraki 3 4. günlerde görülürler [5, 43-45, 47, 48] ve 7. günde en yüksek seviyeye ulaşarak [5, 49] 15 21. güne kadar yarada aktif olarak kalırlar [44]. Fibroblastlar onarım sürecinin esas elementidir ve dokuların yeniden yapılanması sürecinde kullanılan yapısal proteinlerin büyük bir bölümünün üretilmesinden sorumludurlar [5]. Tüm bu bilgiler ışığında bu çalışmada, fizyolojik yara iyileşme sürecinde ve sistemik uygulanan EGF ye bağlı olarak, rat karaciğer dokusundan sentezlenen kollajen ve total protein düzeyinde meydana gelen değişikliklerin araştırılması amaçlanmıştır.
5 2.GENEL BĐLGĐLER 2.1. Yara Herhangi bir ajanın fiziksel bir hasar yaratmasıyla vücuttaki normal büyüklüğün bozulmasına yara denir. Yara deyiminin karşılığı olarak erozyon, ülser, fissür deyimleri de kullanılır. Erozyon, dermise geçmeyen fokal (odaksal) epidermis kayıplarını belirleyen bir deyimdir, iz bırakmaz, kronik değildir. Fissür, çatlak şeklindeki dikey yaraları belirleyen doku kayıplarıdır. Epidermisi veya dermisi tutabilir. Ülser ise dermis ve epidermiste doku kayıplarıyla seyreden lokal yaralardır. [50] Yaraların iyileşmesi için kesin süreler verilemez ancak makul sürede iyileşmeyen, yavaş ve az ilerleme gösteren yaralar için kronik deyimi kullanılır [51-53]. Kronik yaraların %70 i venöz ülserler ve diyabetik yaralardır [54]. 2.1.1. Yara çeşitleri Yara çeşitleri aşağıdaki gibi sınıflandırılmıştır [55]: 1. Mekanik travmalara bağlı yaralar a) Künt travmatik yaralar Abrazyon / sıyrık Kontüzyon / bere Laserasyon / yırtık Kemik kırıkları b) Kesici alet yaraları c) Kesici-Delici alet yaraları d) Kesici-Ezici alet yaraları e) Delici alet yaraları f) Ateşli silah yaraları 2. Fiziksel travmalara bağlı yaralar a) Isı yaraları b) Işık yaraları
6 c) Elektrik yaraları d) Barotravma yaraları 3. Kimyasal travmalara bağlı yaralar a) Asit b) Baz 4. Biyolojik etkilere bağlı yaralar a) Hayvan ısırık yaraları b) Böcek sokmalarına bağlı yaralar c) Toksinler 2.2. Yara Đyileşmesi Yara iyileşmesi kompleks bir biyolojik olaydır. Pıhtı oluştuktan sonra inflamatuar hücreler hızla yara bölgesine çekilir ve bunu bölünüp çoğalan fibroblastlar ve epitel hücrelerin göçü izler. Vasküler endotel hücreler ise yeni kapiller ağ oluşturarak bölgenin kanlanmasını sağlar. Daha sonra fibroblastlar ekstraselüller matriks sentezleyerek hasarlı dokunun skar dokusuyla değiştirmesini sağlar. Ardından da yaradaki hücresellik azalır ve ekstrasellüler matriks yeniden şekillenir [56]. Normal yara iyileşmesi, birçok hücresel aktivitenin düzenli ve ardarda çalışması ile gerçekleşir. Bu aktiviteler arasında, 1. Fagositoz; polimorf nüveli makrofaj ve lökositler, primer fogositik hücrelerdir. 2. Kemotaksis; hücrelerin bir engele karşı göçü olup inflamatuar hücreler, fibroblast ve anjiogenezde rol oynayan hücreleri etkileyen kemotaktik ajanlar, iyileşme olayına katkıda bulunur. 3. Mitogenez; mitogenezi uyaran ajanlar yara iyileşmesi için gerekli hücre bölünmesini sağlar.
7 4. Kollajen sentezi; esas olarak fibroblastlarca sentezlenen protein ve glikoproteinler, kollajen ve ara maddeyi oluşturarak yara iyileşmesinde kritik bir noktanın tamamlanmasını sağlar. 5. Diğer matriks kompenentlerinin sentezi; yara kontraksiyonu ve nedbe oluşumu yara iyileşmesinin son basamaklarını oluşturur [57, 58]. Yaralanmayı hemen takiben trombositler hasarlanan dokuya yapışıp pıhtılaşma faktörleri ve granülleri içindeki büyüme faktörlerini salgılarlar. Ortaya çıkan vazodilatasyonu, vazokontraksiyon takip eder. Fibrin olgunlaştıkça yaralanan bölge kurumuş pıhtı ile hem daha fazla sıvı ve elektrolit kaybını, hem de çevreden gelebilecek kontaminasyonu önler. Trombositlerce salgılanan büyüme faktörleri iyileşme olayını başlatır [57]. Kısa bir süre içinde polimorf çekirdekli lokositler çevredeki kan damarlarının endoteline yapışmaya ve damar duvarından geçmeye (diapedez) başlarlar. Polimorf nüveli lokositleri yara bölgesine çeken; hasarlanan doku, bakteri ve inflamatuar ürünlerin oluşturdukları kemotaktik sinyallerdir [57]. Polimorf nüveli lökositlerin ana görevi; yaralanan bölgeden bakteri ve yabancı cisimleri uzaklaştırıp enfeksiyon gelişimini engellemektir. Bu sürede epitelyal hücreler pıhtının altına doğru hareket eder ve çoğalarak epitel yüzeyini yeniden oluşturmaya başlarlar [57]. Doku iyileşmesinin bir sonraki aşaması, makrofajlar ile karekterizedir. Makrofajlar sadece hücre enkazı, bakteri ve konağın dejenere hücrelerinin ortamdan uzaklaştırılmasından sorumlu değil, ayrıca zengin bir büyüme faktörü kaynağıdır. Makrofajlar yara iyileşmesi olayında hücrelerin, büyüme faktörlerinin ve matriks komponentlerinin düzenli bir şekilde davranmalarını sağlar [57]. Đyileşmenin bir sonraki basamağında, epitelyal köprüler tamamlanınca, epitel hücrelerden enzimler salınıp, olgunlaşmış kabuğun hareketlenmesini sağlar. Epitel
8 hücreler çoğalmaya devam edip epitel katlarını oluşturur. Doku tamirinin son fazı yeniden oluşumdur (remodeling); yaralanma öncesi doku bütünlüğü sağlanıncaya dek yıllar boyunca sürebilir [57]. Yaralar yeniden oluşum sürecinde ilerliyorsa ve bu ilerleme sürecinde devamlı anatomik yapı ve fonksiyon sağlanıyorsa akut adını alır. Buna örnek olarak birkaç gün içinde kapanan kesik örneği verilebilir. Eğer sonuç devamlı değilse ya da yeniden oluşum süreci kesiliyor veya tamamlanamıyorsa yara kronik adını alır. Buna örnek olarak da kapanması uzun süren ve sürekli olarak açılıp kapanan kesik örnek verilebilir [59]. Yara iyileşme sürecini anlama konusunda çok önemli ilerlemeler kaydedilmiştir. Hücre tipleri ve bunların yara iyileşme sürecinde açığa çıkma sıraları belirlenmiştir. Birçok büyüme faktörü ve bunların fonksiyonları açıklanmıştır. Yara iyileşmesi bilimini anlamadaki gelişmelere, ilerlemelere rağmen hala söz konusu süreçteki birçok aşama keşfedilmeyi ve açıklanmayı beklemektedir [59]. 2.2.1.Yara iyileşme mekanizmaları Yara iyileşmesindeki mekanizmalar, epitelizasyon, büzülme, bağlayıcı doku (matriks), yer değişimidir. Bu mekanizmaların her birinin gerçekleşmesi, yaranın tipine, lokalizasyonuna ve çevre faktörlerine bağlıdır. Epitelizasyon, keratinositlerin alt deriden göçü ve bölünmesi; büzülme ise yaranın daralması ve kapanması süreçleri olarak tanımlanmaktadır. Bunların yanı sıra fibroblastların bölgeye gelmesi, yeni matriks oluşturması ve kollajenlerin bu şekilsiz madde üzerinde ve arasında açığa çıkması, bağlayıcı doku yer değişimi olarak ifade edilen süreçtir. Matriks oluşumundan sonra kollajen, elastin, fibronektin, laminin, proteoglikan içeren tamir sistemi oluşturulur. Bu yapılar ve kimyasallar yara bölgesine güç ve destek sağlar, büyüme ve büzülmeye izin verir, hücre hareketi için yüzey oluşturur ve gerekli kimyasal reaksiyonların oluşmasına yardım ederler [60].
9 Çizelge 2.1. Yara iyileşmesinde ekstrasellüler elementler ve hücrelerin rolleri [61]. Yara Elemanları Yaralanmadan Sonra Görülme Zamanları Yara Đyileşmesinde Major Etkileri Trombositler Hemen Hemostaz, büyüme faktörlerinin (PDGF, TGF-β, EGF ve TGF-á) ve proteolitik enzimlerin salınımı Nötrofiller 6.saat, 24-48. saatte en yüksek Yara enkazı, bakteri ve yabancı cisimlerin temizlenmesi Makrofajlar 3-5. günde en çok Yara enkazı, büyüme faktörlerinin (PDGF, TGF-β, TGF-á, FGF, IL-1, EGF, ve TNFá) salınımı Fibroblastlar 48-72. saat arası Kollajen, proteoglikanlar ve elastin sentezi; büyüme faktörlerinin (TGF-β, PDGF, KGF, FGF, IGF-1 ve IFN) salınımı; yara kontraksiyonu; yaranın yeniden yapılanması Keratinositler Epidermal migrasyon başlayınca Mitoz ve migrasyona sekonder epidermal iyileşme; fibronektin sentezi; büyüme faktörlerinin (TGF-β, TGF-á, EGF) üretimi Endotel hücreleri 48-72. saat arası Fibronektin sentezi; büyüme faktörlerinin (PDGF, TGF-β, IGF-1) üretimi Fibronektin Erken Hücre migrasyonu için yapısal destek; kollajenin organizasyonu Kollajen Tip III: 2 gün sonra Tip I: birkaç hafta sonra Yapısal destek ve güç; hücreler arası etkileşimi düzenleme Proteoglikanlar 2. haftada maksimum sentez Kolajen sentezinin regülasyonu; hücreler arası etkileşimler; matriks komponenti Hyaluronik asit Erken; 4. günde maksimum Hücre motilitesinin artırılması 2.2.2. Yara iyileşmesinin histopatolojisi Yaralanma sonrası ortaya çıkan doku defekti fibrin, eritrosit ve lokosit içeren kan pıhtısı ile dolar. Đyileşme erken dönemde inflamasyon ile başlar. Makrofajlar mikroorganizmaları, ölü parankim hücreleri ve nötrofillerin nekrotik enkazını ortadan kaldırır. Genellikle 3.-5. güne kadar, bazense 24 saat gibi çok kısa bir süre sonra fibroblastlar ve vasküler endotel hücrelere prolifere olarak yara iyileşmesinin temel özelliği olan özel bir tip dokuyu granulasyon dokusunu meydana getirirler.
10 Granulasyon deyimi, yara yüzeyindeki dokunun pembe granüler görünümünden gelmektedir. Her bir granül yeni bir kapiller vasküler yumağı temsil eder. Eski damarlardan tomurcuklanma ile yeni damarlar oluşur [52]. Đnterendotelyal junction ların gevşek olması nedeniyle bu damarlar geçirgendirler, protein ve kırmızı kürelerin ekstrasellüler aralığa çıkmasına izin verirler [53]. Đyileşen dokularda akut inflamasyon boş bulduğu halde görünen ödemin sebebi bu geçirgenliktir. Granulasyon dokusundaki prolifere fibroblastlar artmış miktarda Granüler Endoplazmik Retikulum içerir ve histolojik kesitlerde iri ve tombul yapıda izlenir. Granülasyon dokusundaki prolifere fibroblastların görevi proteoglikan ve kollajen sentezlemektir. Bazısı ise çentikli nukleus yapısı, periferde yoğunlaşan stoplazmik fibril demetleri ve kontraktil proteinler gibi düz kas hücre özellikleri kazanırlar ve miyofibroblast olarak isimlendirilirler [62]. Granulasyon dokusundaki hemen her zaman makrofajlara ek olarak uygun kemotaktik stimulus varlığında nötrofillere, eozinofiller, mast hücreleri ve lenfositler de görülür. Đyileşme ilerledikçe kollajende artma, fibroblast ve damar sayısında azalma gerçekleşir. Damarların büyük bir kısmında dejenerasyon ve trombozis gelişir. Sonuçta granülasyon dokusu inaktif görünümünde iğsi şekilli fibroblastlar, yoğun kollajen demetleri, elastik doku fragmanları, ekstrasellüler matriks ve az sayıda damardan oluşan nedbe dokusuna dönüşür. 2.2.3.Yara iyileşmesinin fizyolojisi Yara iyileşmesi inflamasyon, hücre migrasyonu, anjiogenez, matriks sentezi, yeni kollajen oluşumu ve reepitelizasyon gibi çeşitli sellüler ve moleküler basamakları içeren kompleks bir süreçtir [63, 64]. Zarar görmüş dokunun onarımı yani yara iyileşmesi hayatta kalmada kritik olan biyolojik bir cevaptır [65]. Yaralanma olayı bir şekilde lokal ve sistemik immün yanıtları aktive etmektedir. Doku bütünlüğünün bir travma sonucu bozulması, travma tipine bağlı olmaksızın yara bölgesinin fonksiyonel ve morfolojik özelliklerinin
11 yeniden kazanılmasını sağlayacak bir seri fizyolojik olayı başlatır. Yara iyileşmesinde en önemli özellik bir faz tamamlanmadığı takdirde takip eden fazın başlamaması ve iyileşmesinin durmasıdır [66]. Yara iyileşmesi ayrı, ancak birbiriyle iç içe üç ayrı aşamadan oluşur [67]. 1. Hemostaz ve inflamasyon (substrat hazırlık fazı) 2. Proliferasyon (kollajen yapım fazı) 3. Maturasyon (remodilizasyon fazı) [68] 1-Đnflamasyon evresi Cerrahi müdahale veya travma sonucu oluşan doku hasarına karşı organizmanın cevabı, inflamasyonla başlar. Đnflamasyon; organizmayı kan kaybına karşı korumak, yabancı maddelerin invazyonunu önlemek ve yarayı onarım için hazır hale getirmek için gelişen, organizmanın gösterdiği vasküler, humoral ve hücresel bir reaksiyondur. Đnflamasyon vazodilatasyon ve permeabilite artışıyla sonuçlanır [4, 44, 48, 69]. Yaralanma sonrası kan damarlarının bütünlüğü bozularak kanama meydana gelir [4, 40, 46, 69]. Kanama ile eş zamanlı başlayan hemostazisle yara iyileşmesinin ilk aşaması başlamış olur [7, 40, 48, 69]. Yara meydana geldikten sonra hücre membranları tromboksan A2 ve prostaglandin F2α gibi vazoaktif komponentler salgılayarak [49], hasar gören damarlarda 5 ila 10 dakikalık geçici bir vazokonstrüksiyona neden olurlar [45, 48, 49]. Şekillenen vazokontrüksiyon, kan kaybını önlemek için kan akım miktarını azaltarak hemostazın sekilenmesine katkıda bulunur [41, 70, 71]. Vazokontrüksiyonla eş zamanlı olarak damardan çıkan trombositlerin endotel altı kollajen ile teması sonucu trombositlerin kümeleşmesi, kümeleşen trombositlerin damarı tıkaması ve hageman faktörün aktivasyonuna yol açmasıyla pıhtılaşma mekanizması harekete geçer [5, 40, 72]. Trombositlerin kollajenle temasında, kollajenin yapısında bulunan prolin ve hidroksiprolin aminoasitleri, trombositleri aktive ederler. Aktive olan trombositler ise granüllerinde bulunan trombosit kaynaklı büyüme faktörü (PDGF), transforme edici büyüme
12 faktörü-beta (TGF-β), trombosit faktör IV, fibronektin, serotonin, tromboksan A2, fibrinojen, von Willebrand faktör ve trombozpondin gibi faktörler ile, tümör nekroz faktörü-alfa (TNF-α) ve interlökin-1 (IL-1) gibi sitokininler salgılanır. Bu salgılanan faktör ve sitokinler yara iyileşmesinin erken ve geç döneminde önemli rol oynarlar [40, 72, 73]. Vazokontraksiyonu takiben yaklaşık 20 dakika sonra histamin, serotonin, prostaglandin E1, prostaglandin E2 aracılığı ile şekillenen vazodilatasyon ve permeabilite artışı sonucu, kan hücrelerinin diapedezi, sıvı ve proteinlerin damar dışına çıkışı şekillenir [3, 5, 38, 42, 72]. Fibrinojen, trombin ve diğer pıhtılaşma faktörleri yardımı ile pıhtılaşma meydana gelir ve kanama durur. Oluşan pıhtı; fibrin, fibronektin, trombin, trombosit, vitronektin, von Willebrand faktör ve trombozpondin gibi kan proteinleri ile eritrosit ve lökosit gibi şekilli elementlerden oluşur [4, 42, 44, 45]. Pıhtıyı oluşturan bu faktörler ise inflamatuar reaksiyonu başlatan sitokin ve büyüme faktörlerini salgılarlar. Bu pıhtı ile kontaminasyon ve vücut sıvısı kaybı önlendiği gibi yara iyileşmesi için de geçici bir matriks sağlanmış olur. Ayrıca fibrin pıhtıları bölgede yaralanan lenfatikleri tıkayarak sıvının yaralanmış bölgeden drene olmasını önler. Böylece inflamasyon bölgesel bir olay olarak kalır [44, 45, 47]. Yangının lokalize olmasıyla bölgede kızarıklık, şişlik, ısı artışı ve yaradan salınan nöropeptitlerden kaynaklanan ağrı şekillenir. Dikiş uygulanan yaralarda ise, oluşan pıhtı yarayı yeterli bir şekilde doldurur ve yara dudaklarını birbirine yapıştır ve yaraya sınırlı bir direnç kazandırır. Sonraki süreçte pıhtı dehidre olarak yara kabuğuna dönüşür. Yara kabuğu ise yarayı tıpkı pansuman materyali gibi dış kontaminasyondan korur, sekonder kanamaları önler, iç hemostazı sürdürür ve pıhtı yüzeyi altında epitel migrasyonun gelişmesini sağlar [45, 47, 70]. Pıhtılaşma sürecinde aktive olan komponentlerden, mast hücrelerinden, yaralı ve aktive olmuş mezenşimal hücrelerden, fibrinojen ve fibrin yıkımlanma ürünlerinden salgılanan çeşitli vazoaktif mediatörler ve şemoatraktanlar aracılığı ile kan dolaşımından yara bölgesine ilk olarak inflamatuar lökositler gelirler. Travmayı
13 takiben ilk birkaç saat ile 6 saat içinde yara bölgesine gelen ilk lökositler nötrofillerdir ve kısa sürede sayıları artar [8, 42, 73]. Yarada mikroorganizma varlığında ise yaralanmadan sonraki birkaç dakika içinde nötrofiller bölgeye gelirler. Yara bölgesinde nötrofillerin sayısı 24 ila 48. saatlerde pik seviyeye ulaşır. Nötrofiller yaralanma boyunca yara bölgesine giren bakterileri, ölü dokuları ve yabancı cisimleri fagosite ederler Bu mekanizmada proinflamatuar sitokininler olarak bilinen IL-1 ve TNF-α da önemli rol oynar [8, 48, 74, 75]. Nötrofiller farklı tiplerde çeşitli proteazlara sahiptirler. Bunlardan serin proteazlar geniş bir özelliğe sahipken, metalloproteinazlar (çinko iyonu içeren) özellikle kollajeni sindirirler. Her iki proteazda yara bölgesinde önceden var olan ekstrasellüler matriksi yıkımlarlar Ayrıca nötrofiller prostaglandin E ve çeşitli enzimler salgılayarak nekrotik dokunun kolay yıkımlanmasına katkıda bulunurlar. Yara bölgesindeki sağlam dokular matriks proteaz inhibitörlerinden yapılmış bir armor tarafından korunur. Enfeksiyon bulunmadığı takdirde nötrofillerin yaradaki sayısı üçüncü günden sonra hızla azalır. Enfeksiyon varlığında ise nötrofil infiltrasyonu enfeksiyon kontrol altına alınıncaya kadar devam eder, yara bölgesinde kalma süreleri ve sayıları artar. Nötrofiller bilinmeyen bir uyarıcı ile ölürler ve yerini makrofajlara terk ederler. Yara bölgesinde ölen nötrofillerin lizozomal enzimleri, ölü dokuları yıkımlayarak yangısal reaksiyona katkıda bulunur ve ölü nötrofiller doku makrofajları tarafından fagosite edilir veya eskar ile atılırlar [44, 69, 70, 76]. Yara iyileşmesinde yara bölgesine gelen immun hücrelerinden biri de makrofajlardır. Yara bölgesine 48 96. saat içinde ulaşan makrofajlar sistemik dolaşımdaki monositlerden kaynaklanan mononükleer fagositik hücrelerdir. Ayrıca monositler birleşerek çok çekirdekli epitelioid veya histiosit gibi dev hücrelere dönüşürler. Monositlerin yangılı bölgeye gelmelerinde, fibrin, alginat, hipoksik ortam, artmış laktat konsantrasyonu, matriks yıkımlanma ürünleri, trombin, inflamatuar proteinler, bakteri endotoksinleri, yangısal hücre ürünleri, nötrofil ve trombositlerden salınan birçok şemoatranktant madde aracılık eder. Yara bölgesine gelen makrofajlar özellikle IL 1 ve IL 8 gibi proinflamatuar pepditler ve TNF salınımı ile inflamasyonu sürdürürler [8, 73, 77, 78].
14 Makrofajlar, patolojik organizmaları, doku artıklarını ve nonfoksiyonel nötrofilleri fagosite ederler. Ayrıca makrofajlar hem nitrik oksit sentezleyerek, hem de serbest oksijen radikalleri vasıtasıyla patojenleri yok ederler. Hasarlı ekstraselüler matriks ise keratinositler, fibroblastlar ve makrofajlar tarafından sentezlenen matriks metalloproteinazları tarafından temizlenir. Bu metalloproteinazlar inflamatuar debrisi de temizleyerek yara hücrelerinin matrikse doğru hareket etmelerine olanak sağlar. Aktive olan makrofajların en önemli görevleri; inflamatuar evre ile onarım evresi arasında geçiş görevi üstlenir ve epitelizasyon, anjiogenezis, fibroplaziayı kapsayan mezenşimal hücrelerin aktivasyonunu ve yara iyileşmesi için gerekli TGF-β, TNF-α, IL 1 PDGF, fibroblast büyüme faktörü (FGF) gibi faktörleri sentezleyerek salgılamalarıdır [5, 36, 70, 75, 79]. Özetle bu büyüme faktörleri fibroblastlar tarafından ekstraselüler matriksin organizasyonu ve endotel hücreleri ile düz kas hücrelerinin proliferasyonunu düzenlerler. Makrofajlar yaralanmanın erken döneminde aktive olarak nitrik oksit sentezlerler. Endotelyal hücreler, fibroblastlar, monosit ve lenfositler de nitrik oksit sentezini hızlandırırlar. Trombosit ve nötrofiller tarafından başlatılan yara onarımı makrofajlar tarafından devam ettirilir. Aşırı kontamine yaralarda makrofajların maksimum stimülasyonu, inflamatuar fazın uzamasına dolayısıyla iyileşmenin gecikmesine ve daha fazla skar dokusu oluşumuna neden olabilir. Ponilerde inflamasyon evresinin başlangıçta daha güçlü ve kısa süreli olduğu, atlarda ise başlangıçta zayıf fakat süresinin daha uzun olduğu bildirilmektedir [77, 80]. 2-Hücresel proliferasyon evresi Bu evre inflamasyonu takiben yaklaşık yaralanmadan sonraki 3 5. günlerde yaradaki kan pıhtısı, nekrotik doku, yabancı cisimler ve enfeksiyon gibi bariyerler kalktıktan sonra başlar. Proliferatif dönem, fibroblastların hakim olmasıyla yaradaki granülasyon dokusunun oluşumu, epitelizasyon ve yara kontraksiyonu ile karakterizedir [44].
15 Granülasyon dokusunun oluşumu: Normal yara iyileşmesi sürecinde en belirgin gösterge, düzenli biçimde granülasyon dokusu gelişimidir. Granülasyon dokusu oluşumu tüm yaralarda meydana gelmekle birlikte, özellikle açık yara iyileşmesinde daha belirgindir ve yaralanmadan sonraki 3 6. günlerde başlar. Granülasyon dokusu; kollajen, fibronektin ve hyaluronik asidin hücre dışı matriks içine gömülmesi, yeni kapillar tomurcuklanma ile fibroblast ve inflamasyon hücrelerinin birleşiminden oluşur. Granülasyon deyimi, yara yüzeyindeki dokunun parlak kırmızı granüler görünümünden ileri gelmektedir. Her bir granül yeni bir kapillar tomurcuğu temsil eder. Granülasyon dokusu açık yaraların iyileşmesinde, sistemik bir enfeksiyona karşı bariyer görevi üstlenir Ayrıca granülasyon dokusu epitel hücrelerinin göç etmesi için bir zemin oluşturur [43-45, 80]. Đnflamatuar evre sürecinde şekillenen geçici matriks, kapsadığı büyüme faktörleri, sitokinler, hyaluronan ve fibronektin vasıtasıyla, granülasyon dokusu oluşumunu destekler. Bu oluşum epitel migrasyon ve yara kontraksiyonunun gecikmesine neden olmaktadır. Yapılan çalışmalarda taşkın granülasyon dokusu oluşumuna yüksek konsantrasyonda pro-fibrotik TGF-β1 ve düşük konsantrasyonda antifibrotik TGF-β3 büyüme faktörlerinin neden olduğu ileri sürülmektedir. Granülasyon dokusunun gelişimi, fibroplazia olarak tanımlanan, fibroblastların aktivasyonu ile yeni damar oluşum süreci olan anjiogenezis ile karakterizedir[48, 81]. Fibroplazia: Yetişkin memelilerde yara iyileşmesi, ekstrasellüler matriks komponentlerinin sentezi ve birikiminde anahtar rol oynayan fibroblastların proliferasyonunu kapsar. Fibroplazia, kollajen üreten fibroblastların yara kenarından köken alarak yaraya göç ederek prolifere olmaları, böylece kollajen üretilmesi ve kollajenin yara bölgesinde birikim süreci olarak tanımlanır ve yara bölgesinde granülasyon dokusunun oluşumu ile başlar [4]. Ekstrasellüler fragmentlerden ve inflamatuar hücrelerden salınan IL-1, TNF-α, PDGF, epidermal büyüme faktörü, EGF, FGF özellikle TGF-β1 ve TGF-β2 gibi birçok şemoatraktanlar, fibroblastların yara bölgesine göç etmesinde ve proliferasyonun da rol oynarlar. Fibroblastlar bağ dokuyu çevreleyen farklılaşmamış
16 mezenşimal hücrelerden ve perivasküler adventisyadan köken alarak, önceden şekillenen fibrin pıhtısı içindeki lifler ve yeni gelişen kapillarlar boyunca stoplazmik uzantılar oluşturarak yaranın içine doğru hareket ederler [44, 45]. Fibroblastlar yaralanmadan sonraki 3 4. günlerde görülürler ve 7. günde pik seviyeye ulaşarak 15 21. güne kadar yarada aktif olarak kalırlar. Fibroblastlar onarım sürecinin esas elementidir ve dokuların yeniden yapılanması sürecinde kullanılan yapısal proteinlerin büyük bir bölümünün üretilmesinden sorumludurlar. Fibroblastlar fibrin pıhtısını geçici matriks olarak kullanırlar. Geçici matriks hızla glikoprotein (fibronektin laminin), proteoglikan (hyaluronik asit) ve kollajen (başlangıçta tip III, daha sonra tip I) den oluşan gevşek bir yapıya sahip ekstraselüler matriks ile yer değiştirir Yara bölgesine ulaşan fibroblastlar, yara olgunlaşmasında önemli olan elastin, fibronektin ve glikozaminoglikan gibi geçici matriksin yerini alacak şekilsiz temel madde komponentleri ile kollajenaz gibi proteazların senteziyle, eş zamanlı olarak yaraya gerilim kuvveti kazandıran glikoprotein yapısında olan kollajen sentezini de yaparlar [4, 44, 46]. Kollajen oluşumu yara onarım sürecinin 4 5. günlerde tropokollajen moleküllerinin ekstrasellüler matrikse bırakılmasıyla şekillenmeye başlar. Başlangıçta şekillenen olgunlaşmamış kollajen fibrilleri, birbirleriyle çapraz bağlanarak olgun kollajeni oluştururlar. Kollajen içeriği artarken temel madde miktarı azalır. Yarada erken dönemde gerilim direncinin artması kollajen formasyonuna bağlı iken, sonraki direnç artışı skar dokusunun olgunlaşmasına bağlıdır. Ensizyon yaralarının oluşumundan 3 4 gün sonra yara içindeki pıhtının fibrin iplikleri yara yüzeyine dikey olarak yönelirler. Yaklaşık 6 gün sonra ise, ensizyonel yara arasındaki kapillarlar, fibroblastlar ve kollajen lifleri yara yüzeyine paralel bir yapı alarak yara dudaklarını birbirine bağlar [44, 45]. Yara merkezindeki asidik ortam ve düşük oksijen seviyesi, fibroblast proliferasyonunu stimüle eder. Anjiogenezis sürecinde şekillenen yeni damar oluşumu, yara merkezinde oksijen seviyesini artırarak fibroblast proliferasyonu azaltır. Fibroblastlar asidik ortam ve düşük oksijen seviyesinde maksimum matriks
17 proteinlerini üretirler. Yara ortamı anoksik koşullarda kollajenlerin çapraz bağlanmasını inhibe eder. Oksijen kollajenlerin çapraz bağlanması için zorunlu bir kofaktördür. Matriksin birikmesi ve fibroblastlarda protein sentezinin sona ermesinden sonra, fibroblastlar fenotipik karakterlerini değiştirerek miyofibroblast formuna dönüşürler. Miyofibroblastlar elektron mikroskobunda yapı olarak, hem düz kas hücrelerinin hem de fibroblastların özelliklerini gösterirler. Miyofibroblastlar özellikle onarım sürecinin 2. haftasında yara kontraksiyonuna katılırlar [48, 73]. Anjiogenezis: Anjiogenezis yara bölgesinde var olan endotel hücrelerden yeni kan damarları oluşumunu kapsar Anjiogenezis, yara iyileşmesinde fibroblastların proliferasyon süreci ile paralel olarak gelişir [38]. Yara onarımında mezenşimal hücrelerin migrasyonu, proliferasyonu ve sentez işlemini gerçekleştirebilmeleri için gerekli oksijen ve enerji, yeni oluşan kan damarları ile sağlanır. Endotel hücreleri anjiogenezisi oluşturmak üzere göç ederken salgıladıkları kollajenaz, plazminojen aktivatörü ve stromelizin gibi mediatörlerle venül bazal membranı parçalarlar. Bu parçalanmış bazal membran aralıklarından endotel hücreleri psödopodlar oluşturarak perivasküler alana çıkar ve proteolitik enzimler salgılayarak göçlerine devam ederler [7, 46]. Anjiogenezis, serum ve ekstrasellüler ortamdan kaynaklanan bir çok faktör tarafından aktive edilir. Yaralanma, dokuda yıkımlanmaya ve hipoksiye yol açarak makrofaj ve trombosit gibi aktive hücrelerden inflamasyon mediatörlerinin salgılanmasına neden olur. Özellikle bazik fibroblast büyüme faktörü (bfgf), onarım sürecinin ilk 3. günü aktive olarak, mikrokapillarların bazal membranlarını parçalayıp serbest endotel hücrelerin meydana gelmesini sağlayan proteazların sentezini stimüle ederek, endotel hücrelerinin migrasyonunu destekler. Yara kenarlarındaki keratinositlerden olmak üzere fibroblastlar, makrofajlar, trombositlerden ve diğer endotel hücrelerinden salgılanan vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF), ekstrasellüler matriks komponentlerinin bağlanmasına aracılık eden birçok yüzey reseptörlerini indükleyerek hücresel migrasyonu kolaylaştırır. Böylece anjiogenik uyarımlara cevap olarak yaralanmadan sonraki
18 ikinci günde kapillarların ucunda bulunan endotel hücreler yara içine doğru hareket eder ve ardı ardına dizilerek kapillar tomurcuklanmayı ve diğer yönlerden gelen tomurcuklarla birleşip kapillar dallanma oluşturarak kapillar ağı şekillendirirler. Yaradaki lenfatik drenaj iyileşmenin başlangıç sürecinde zayıf olduğu için, lenfatik kanal kan damarlarından yavaş veya eş zamanlı olarak gelişir [7, 45, 47]. Epitelizasyon: Epidermisin görevi iç ve dış ortam arasında bariyer oluşturmaktır. Dış ortamdan zararlı maddelerin girişini önlerken, iç ortamdan ise elektrolit ve sıvı kaybına engel olur. Epitelizasyon, yaralanmadan sonra derinin bariyer özelliğinin yeniden kazandırılması amacıyla epitel hücrelerinin ayrılmasını, göç etmesini, çoğalmasını, organize ve keratinize olmasını kapsayan bir süreçtir [8]. Bazal membranın zarar görmediği yüzeysel kısmi kalınlıktaki epidermal yaralarda epitelizasyon, yara periferinde kalan epitel kalıntıları kıl folikülü ve ter bezi gibi epidermal oluşumlardan meydana gelir. Tam kalınlıktaki açık yaralarda bazal membran hasar görmüştür ve epitelizasyon sadece yara kenarlarındaki sağlam epitel hücrelerinden köken alır Yaralanmadan sonraki ilk saatler içinde, epitel migrasyonla eş zamanlı olarak, bazal epidermal hücrelerin sitoplazmalarında aktin flamentlerin şekillenmesi, hücre içi tonoflamentlerin kısalması ve psödopod benzeri çıkıntıların şekillenmesi gibi belirgin fenotipik değişime uğrarlar. Bu değişim, epitel hücrelerin birbirleriyle ve bazal membranla olan bağlantılarını kaybetmelerine neden olur [7, 8, 48, 49]. Yaranın meydana gelmesinden sonraki ilk dakikalarda meydana gelen pıhtı epitelizasyon için geçici bir engel oluşturur. Keratinositler, tip V kollajen, nötral proteazlar, plazminojen aktivatörü, kollajenaz ve fibronektin üreterek epitelizasyon sürecine katkı sağlarlar. Fibronektin, epitelyum hücrelerinin yara tabanına doğru hareket etmelerinde kılavuzluk eder. Kollajenaz ve diğer proteazlar ise; (epitel hücreler yalnızca canlı yüzeyler üzerinde göç ettikleri için) pıhtı ile canlı yüzey arasındaki bağlantıyı ayırarak epitelyum hücrelerine göç edecek zemini oluştururlar Epitelizasyon, serbest yara kenarları tarafından başlatılıp, epitel hücrelerin ilerlemesi başka bir doğrultudan gelen hücrelerle karşılaşıncaya kadar devam eder, bu noktada
19 kontak inhibisyon kurulur ve ilerleme durur. Ancak açık yaralarda ise, yeterli granülasyon dokusu şekillendikten sonra granülasyon dokusu yüzeyinde 4 5 günlük latent bir periyottan sonra göç etmeye başlarlar Yara kabuğu varsa, epitelizasyon bu kabuğun altında devam eder. Buraya göç eden epitel hücreleri yassı görünümlerini kaybeder ve daha çok sütunumsu bir şekil alırlar ve mitotik aktiviteleri normalin 17 katı artar Bu tek katlı epitel örtü, göç eden yeni epitel hücreleri ile birbirinin üstüne binecek şekilde ikinci ve üçüncü tabaka oluşur. Epitelin tabakalaşması ile yüzeysel epiteli yavaş yavaş keratinize olur ve sağlamlaşır. Fakat bu oluşum hiçbir zaman normal epitelyum yapısında değildir [5, 8, 36, 44]. Enfeksiyonun ve yara kabuğunun şekillenmediği yaralarda, nemli ortam ve yeterli oksijenasyonun sağlandığı koşullarda epitelyum hücrelerinin migrasyonu ve proliferasyonu maksimumdur. Aşırı granülasyon dokusu gelişimi, kronik yangı varlığı ve yara yatağındaki fibrin kalıntıları epitelizasyonun bozulmasına neden olur. Yeni şekillenen epitel deri eklentilerinden yoksun, ince ve kırılgan bir yapıdadır [80]. Yara kontraksiyonu: Defektin kapatılmasını kolaylaştırmak için yarayı çevreleyen tam kalınlıktaki yara dudaklarının merkeze doğru hareketi sonucu gelişen bir küçülmedir. Granülasyon dokusu deri kenarlarını içe doğru çeker ve böylece epitelizasyon ile kapatılacak alan azalır. Yaralanmadan hemen sonra derideki normal elastik gerilmenin açığa çıkmasına bağlı olarak yara kenarlarında hafif bir geri çekilme vardır ve bu durum yara alanının artışına neden olur. Bu yaklaşık 72 saat sürer. Ardından doku kontraksiyonu yaranın orijinal çapına döner ve yara kontraksiyonu ile yara büyüklüğü yavaş yavaş azalır. Kontraksiyon yaralanmadan sonra 5 ve 15. günler arasında maksimum düzeydedir ve günlük yaklaşık olarak 0,6-0,7 mm ilerler [46, 47]. Granülasyon dokusundaki fibroblastlar, yapısal ve fonksiyonel olarak farklılaşarak kontraktil yeteneğine sahip miyofibroblast olarak isimlendirilen düz kas hücrelerine benzer bir yapı kazanırlar. Bu hücreler sadece yara dokusunda bulunur, sağlam bağ dokuda ise bulunmazlar. Bu hücreler yara yatağında birbirlerine, kas tabakasına ve yara dudaklarındaki dermise bağlanırlar. Böylece bu miyofibroblastların
20 kontraksiyonu yara kenarlarını yara merkezine doğru çekerek, yara alanının küçülmesini sağlar [80]. 3-Maturasyon evresi Epitelizasyon tamamlandığında yaranın iyileştiği kabul edilir. Ancak daha pek çok olay devam etmektedir. Yara onarım sürecinin son evresi olan maturasyon, granülasyon dokusunun skar dokusuna dönüşmesini ve ekstrasellüler matriksin olgunlaşmasını kapsayan yara iyileşmesinin en uzun evresidir [43]. Maturasyon evresi, yara bölgesindeki fibroblastların sayısının azaldığı, kollajen üretiminin dengeye ulaştığı epitelizasyonun tamamlandığı yara renginin soluklaştığı, yara gerilim direncinin arttığı, nedbe dokusunun hacminin azaldığı ve sonuçta iyileşmiş skar dokusunun oluştuğu evredir. Bu evre sürecinde, fazla miktarda hücresel ve vasküler yapıya sahip granülasyon dokusu yavaş yavaş şekil ve yapı değiştirerek daha az hücre ve damara sahip skar dokusu ile yer değiştirir. Bu hücresel azalma, hücrelerin yara dışına göç etmeleri veya programlı hücre ölümü olarak adlandırılan apoptozis ile gerçekleşmektedir [46, 73]. Fibroblastlardan sentezlenen kollajen molekülleri, hidroksilasyondan sonra prokollajen olarak isimlendirilir. Prokollajenin yapısından amino ve karboksil terminal pepditler kaldırıldıktan sonra kollajen yapısı şekillenir. Bu ilk kollajen molekülü, yara direncini sağlayan fibriller birbirleri ile çapraz olarak bağlanırlar [46]. Kollajen yara boşluğuna yerleştiği zaman, fibronektin yavaş yavaş kaybolur. Nonsülfat glikozaminoglikanlar ve hyaluronik asit daha elastik yapıya sahip kondroitin-4-sülfat gibi proteoglikanlar ile yer değiştirir. Daha sonra skar dokusundaki su ve glikozaminoglikanların yavaş yavaş rezorbe olarak, kollajen fiberlerin ve diğer matriks komponentlerinin birbirlerine daha yakınlaşmasını sağlar. Liziloksidaz ise, yara direncinin artmasına neden olan kollajen fibrillerin çapraz bağlanmasına aracılık eder. Kollajen fibrillerin birbirine bağlanmasıyla şekillenen
21 kollajen demetleri gelişerek deri yüzeyine paralel bir şekilde yeniden düzenlenir. Granülasyon dokusundaki tip III kollajen yerini skar dokusunda tip I kollajene bırakır. Bu evrede kollajen sentezi ısrarlı biçimde devam ederse hipertrofik nedbe olarak adlandırılan kabarık ve sert bir doku oluşur [41, 44, 46]. Bu fazın en önemli özelliği, kollajen birikimi ve düzenlenmesidir. Kesintisiz kollajen sentezi en az yaralanmadan sonraki 4 5 haftaya kadar devam eder. Başlangıçta üretilen kollajen sağlam derideki kollajenden daha incedir. Zaman geçtikçe, başlangıçtaki kollajen iplikleri absorbe edilir ve gerilme hattı boyunca daha kalın ve düzenli kollajen birikir. Bu değişiklik ile birlikte yara gerilim kuvveti de artar. Kollajen fiberlerin kalınlığı ve düzeniyle yara gerilim kuvveti arasında pozitif bir korelasyon vardır. Skar dokusu 1. haftada yaranın en son kazanacağı direncin %3 üne sahiptir. Üçüncü haftada %30, 3. ay ve sonrasında %80 direnç kazanır [49]. Şekil 2.1. Yara iyileşmesinin fazları [82].
22 2.2.6.Yara iyileşmesini etkileyen faktörler Lokal faktörler 1. Đskemi 2. Gerilim 3. Ölü boşluklar 4. Yabancı cisimler ve kontaminasyon 5. Çevre sıcaklığı 6. Hematom 7. Lokal travma 8. Sütürler 9. Doku tipi 10. Kronik doku faktörleri 11. Radyasyon [57, 66, 82] Genel (Sistemik) faktörler Sistemik faktörlerin immün fonksiyonlar ve kollajen sentezi üzerinde endojen etkileri bulunur. Ayrıca lokal faktörler üzerinde de etkileri bulunur ve yara iyileşmesini geciktirir. 1.Büyüme faktörleri 2.Tıbbi durumlar 3.Anemi/ Kan kaybı 4.Beslenme 5.Yaş 6.Anestezi şekli [57, 66, 83] 2.3. Büyüme Faktörleri Büyüme faktörleri, molekül ağırlıkları 4 000-60 000 Da arasında değişen, çok az miktarları bile hücresel aktiviteleri etkileyebilen proteinlerdir [84]. Stanley Cohen,
23 1974 yılında büyüme faktörü terimini, çözülebilir olan, T lenfositleri ve makrofajlar tarafından üretilen bir madde için kullanılmıştır [85]. Büyüme faktörleri biyolojik olarak aktif doğal polipeptid hormonlardır. Hücrelerin proliferasyonu, kemotaksisi, farklılaşması ve matriks sentezi gibi doku tamirindeki anahtar hücresel olayları, özgün reseptörlerine bağlanarak düzenlerler [86]. Büyüme faktörleri hücresel fonksiyonlarını endokrin, parakrin ve otokrin mekanizmalarla sağlarlar. Bu maddelerin kana salınımı uzak hedeflere ulaşmasını ve buradaki hücreleri etkilemesini sağlar ki bu da endokrin yoldur. Parakrin yolda ise hücre orijinli büyüme faktörleri diğer hücreleri etkileyebilmek için kısa mesafelere difüze edebilir ve komşu hücreleri etkileyebilir. Büyüme faktörleri otokrin yol ile üretildikleri hücrede faaliyet gösterebilir. Bu farklı yollar, doku onarımı sırasında aktif olabilirler [87-89]. Otokrin yol Parakrin yol Endokrin yol Şekil 2.2. Büyüme faktörlerinin hücresel fonksiyon yolları [90] Geniş araştırmalarda dokuya özgü büyüme faktörü üretimi gösterilememiştir, çoğunlukla aynı faktör çeşitli hücre ve dokularca sentezlenir. Lokal olarak üretilen dokuların sentez ve etkileri, sistemik hormonlarca reseptör içeren dokularda modifiye edilir. Sistemik hormonlar spesifik dokularda lokal faktörleri düzenleyerek hedef dokuya özgüllük kazandırırlar. Bu dört seviyede düzenlenir [91];
24 1. Sentez 2. Aktivasyon 3. Reseptörlere bağlanma 4. Bağlayıcı proteinler Büyüme faktörlerinin herhangi bir hücreyi etkileyebilmesi, o hücrenin, o faktörler için o reseptörlere sahip olup olmamasına bağlıdır. Reseptörlere bağlanma sonucu hücre içinde özgün bir cevaba neden olan bir seri sinyal ortaya çıkar. Etki çoğunlukla tirozin kinaz uyarılarak sağlanır. Her hücrenin farklı büyüme faktörleri için farkli sayıda reseptörleri bulunur [87, 92]. Sitokin ve koloni uyarıcı faktörlerin reseptörleri diğer faktörlerden farklıdır. Çünkü diğerleri stoplazmik uzantılarında tirozin kinaz aktivitesi gösteren stoplazmik bir parça içermezler ya da stoplazmikm uzantıları yoktur veya çok kısadır. Bununla birlikte stoplazmada tirozin kinaz aktivitesi başlatırlar [10]. Büyüme faktörleri reseptörleri tirozin kinaz aktivitesine sahiptir ve hücreler arası proteinlerin fosforilasyonu uyarılarına tepki verir Büyüme faktörleri normal ve neoplastik hücreler tarafından in-vitro ya da in-vivo üretilirler. Bunlar in-vitro kültürlerdeki hücrelerin yaşaması ve büyümesi için gerekli olan ortamın temel bileşenleridir ve hücreleri ölüme karşı koruma özelliğindedir. Büyüme faktörleri hücre yaşamasında in-vivo görev alır. Organ ve doku gelişimi mekanizmaları rolünde çok önemli görevleri vardır. Büyüme arttırıcı ve farklılaşmayı indükte edici aktivitelerine ek olarak, hedef hücreler üzerinde çok çeşitli etkiler gösterebilirler. Büyüme faktörleri, yangı (inflamasyon), bağışıklık tepkileri ve doku onarımı gibi fizyolojik işlemlerde de önemli rol oynarlar. Yara iyileşmesi degratatif ve rejeneratif işlemlerin yakın kontrolünü gerektirir. Yara iyileşmesi, biyokimyasal yollar ve epidermal büyüme faktörü arasındaki birçok karmaşık etkiyi ve sayısız hücre tipini içerir. Büyüme faktörlerinin, yara iyileşmesindeki etkileri, hücrelerin yara bölgesine nüfuzunu arttırmayı, epitelyal hücrelerin ve fibroblastların prliferasyonunu, matrikslerin oluşmasını ve etkilenen bölgenin yeniden şekillenmesini içerir. Büyüme
25 faktörleri, hedef hücrenin proliferasyonunun uyarılmasını indükte edici özelliğiyle tanınır [93]. Peptit hormonlarıyla büyüme faktörleri arasında kesin bir fark olmayabilir, ancak birçok büyüme faktörleri ve büyüme faktörlerinin proteolitik ürünleri kanda dolaşabilir ve salgılandıkları yerlerden uzak bölgelerde faaliyet gösterebilir ya da özel düzenleyici fonksiyonlar yüklenebilirler. Büyüme faktörleri ya da büyüme faktörü benzer aktivitelere sahip maddeler, sadece omurgalılarda olmayıp, omurgasızlarda da ve hatta sitokin olarak adlandırılan biyolojik olarak aktif ajanlar tarafından temsil edildikleri bitkilerde de bulunabilirler [93]. Büyüme faktörlerinin biyolojik özellikleri in-vitro ya da in-vivo incelenebilir. Büyüme faktörlerinin izolasyonu, hücrelerin belirli bir proteinsiz aracıda kültürlenmesiyle sağlanır [93]. Büyüme faktörlerinin klinikte birçok sebepten karıştırılabilmesi dolayısıyla büyüme faktörlerini tanımlamak için nomenklatür isimlendirme kullanılmıştır. Her şeyden önce büyüme faktörlerinin isimleri, hücre indeki spesifik etkilerinden ziyade, görüldükleri durumlar baz alınarak seçilmiştir. Böylece FGF ler çok potansiyelli anjiogenetik faktörlerdir. TGF-β lar da hücre dönüşümü yapamaz ve aslında kanseri önlemede önemlidir. Büyüme faktörü terimi genel anlamda, hücre proliferasyonunu, mitolojik aktiviteyi ve hücre dışı matriks oluşumunu fazlalaştıran maddeleri göstermek için kullanılır. Büyüme faktörlerinin yer aldığı kategoriler, hangi durumda keşfedildiklerine bağlıdır. Örneğin bir biyokimyacı, bir immünolojist ve bir hematolojist tarafından büyüme faktörü, sırasıyla interlökin, koloni stimüle edici faktör olarak adlandırılabilir [88]. 2.3.1. Büyüme faktörlerinin reseptörleri Büyüme faktörlerinin herhangi bir hücreyi etkileyebilmesi, o hücrenin o faktör için reseptöre sahip olup olmamasına bağlıdır. Reseptöre bağlanma sonucunda hücre içinde özgün bir cevaba sebep olan bir seri sinyal ortaya çıkar. Her hücrenin farklı büyüme faktörleri için farklı sayıda reseptörleri bulunur [87, 94].
26 Büyüme faktörlerinin, sitokinlerin ve peptit ya da protein hormonların hücresel ve çekirdek fonksiyonlarının düzenlenmesi, hücre yüzeyi reseptörlerinin aktivasyonuyla başlar. Tüm reseptörler iki ana bileşene sahiptir; 1. Ligand spesifikasyonu sağlayan, ligand bağlayıcı bir alan 2. Ligand bağlanmasından sonra biyolojik cevabın oluşmasını başlatan bir alan Aktive edilmiş reseptör, daha sonra sinyal iletimi işlemini bitirmek için diğer hücre bileşenleriyle etkileşime girer. Birçok büyüme faktörü G proteinleri aracılığıyla zar sınırı fosfolipaz C ye bağlan (PLC) reseptörlere bağlanır. Büyüme faktörlerinin ve sitokinlerin reseptörleri, ligant-reseptör etkileşimi sonucu aktive edilen protein tirozin kinazlardır. Bu protein kinazların herhangi birinin aktivasyonu hücre içindeki diğer proteinlerin fosforilasyonunu katalize eder [95]. Büyüme faktörleri bilimindeki son on yılda gerçekleşen ilerlemeler, reseptörlerin bağlanması sonucu oluşan kompleks haer yollarını açıklamada ve kendi özel hücresel reseptörlerini açıklamada yol kat etmiştir. Tirozin kinaz reseptörler zardan yayılan moleküllerdir ve sitoplazmik etki alanlarında kinaz aktiviteye sahiplerdir. Kinaz aktivitesi, fosfat grubu ekleme yani fosforilasyon becerisidir. Kinaz aktivitesi, büyüme faktörünün bağlanmasıyla aktive edilir. Yaklaşık 60 tane tirozin kinaz tanımlanmış ve bunlar 14 gruba ayrılmıştır. Aktivasyon sonrası reseptör, fosfat gruplarını belli alt hedeflere ekleyebilir ya da kendi fosfotirozin artıkları olması durumunda, diğer molekülleri haberleşme komplekslerine dönüştürebilir [88]. 2.3.2. Büyüme faktörleri ve yara iyileşmesi Büyüme faktörleri, kemotaksis ve hücresel proliferasyonu uyararak, aynı ve farklı tipteki hücreler arası haberleşmeyi sağlayarak, hücre dışı matriks oluşumu ve anjiogenezi kontrol ederek, yara büzülme işlemini düzenleyerek ve doku bütünlüğünü yeniden kurarak, yara onarımı işleminde temel bir rol alır. Büyüme faktörlerinin yara iyileşmesindeki rolü, deri yaralarında ve gerçek granülasyon
27 dokusunda detaylı biçimde incelenmiştir. Çok sayıdaki büyüme faktörünün bu işlemde yer aldığı gösterilmiştir [93]. Kan damarları açılır açılmaz, çok miktarda trombosit yara içine girer ve PDGF ve TGF-β yı da içeren birçok büyüme faktörü serbest kalır. Bunlar ve diğer büyüme faktörleri, makrofaj, fibroblast, endotelyal hücreler gibi onarım işleminde kritik rol alan birçok hücre tipleri içn kemotaksi özelliğine sahiptir. Yara tamirinin diğer basamakları sırasında büyüme faktörlerinin, yara iyileşmesinde önemli yeri vardır. Büyüme faktörlerinin yara kapanması ve dokunun yeniden oluşumu ile bitmemesi ayrıca doku bütünlüğü ve hücreler arası iletişimde de anahtar rol oynaması mümkündür [88]. Çizelge 2.2. Yara iyileşmesinde büyüme faktörleri [61] Büyüme Faktörleri Kaynak Yara iyileşmesindeki fonksiyonları PDGF Trombositler, makrofajlar, endotel hücreleri, zedelenmiş hücreler TGF-β Makrofajlar, trombositler, nötrofiller, lenfositler, epitel ve endotel hücreleri, zedelenmiş hücreler Kemotaksi, fibroblast proliferasyonu, kollajenaz üretimi Fibroblast proliferasyonu, kemotaksi, kollajen metabolizması EGF TGF-α Plazma, trombositler, makrofajlar, epitel hücreleri Aktive makrofajlar, trombositler, epitel hücreleri, zedelenmiş hücreler Epitel hücre proliferasyonu, granulasyon doku formasyonu Epitel hücre proliferasyonu, granulasyon doku formasyonu KGF Fibroblastlar Epitel hücre proliferasyonu IL-1 Makrofajlar Fibroblast proliferasyonu FGF Pitüiter, makrofajlar, fibroblastlar, endotel hücreleri Fibroblast proliferasyonu, matriks depolanması, yara kontraksiyonu, anjiogenez TNF-α Makrofajlar, T lenfositler Fibroblast proliferasyonu IGF-1 Plazma, karaciğer, fibroblastlar Kollajen ve proteoglikanların sentezi, Fibroblast proliferasyonu IFNs Lenfositler, fibroblastlar Fibroblast proliferasyonu ve kollajen sentezinin inhibisyonu
28 2.3.3. Epidermal büyüme faktörü (EGF) EGF, ilk kez 1962 yılında Dr. Stanley Cohen tarafından erkek fare çene altı tükürük bezinden izole edilmiştir [14, 96]. Cohen, erkek fare çene altı tükürük bezinde sinir büyüme faktörü (NGF) izole etmeye çalışırken, bu bezlerden elde ettiği ekstrenin yeni doğan farelere enjekte edildiğinde erken gözkapağı açılışına ve erken diş sürmesine neden olduğunu gözleyerek etken maddeyi izole etmiş ve epidermis gelişimini hızlandırıcı etkisi nedeni ile bu maddeye Epidermal Büyüme Faktörü (EGF) adını vermiştir [14, 97] EGF aminoasit dizisinde lizin, fenilalanin ve alanin bulundurmayan 53 aminoasitten oluşmuş 6000 Da moleküler ağırlığında tek zincirli bir polipeptittir [98-101]. Molekülün bir ucu NH 2 grubu, diğer ucu ise COOH grubu ile sonlanmaktadır. Polipeptit, 6 sistein köküne sahiptir ve 3 tane disülfit bağı içerir. U disülfit bağları molekülün biyolojik aktivitesi için çok gereklidir. EGF nin öncül (prekürsör) molekülü ise 1217 aminoasit içerir. Bu sayılar olgun EGF den 24 kat daha büyüktür ve prepro EGF olarak adlandırılır [102]. Şekil 2. 3. EGF nin yapısı [103] (gri hat: disülfit bağları)
29 EGF, çene altı tükürük bezinin homojenatında moleküler ağırlığı 29000 Da olan bir arjinin esteraz proteinine bağlı olarak bulunur. Đki molekül arjinin esteraz ile iki molekül EGF birlikte yüksek molekül ağırlık High Moleculer Weight (HMW) kompleksini oluşturur. Radioimmunoassay ile yapılan ölçümlerde erkek fare çenealtı tükürük bezinde 1000 ng, dişi fare çenealtı tükürük bezinde 70 ng EGF bulunduğu tespit edilmiştir [102]. EGF erkek farede toplam bez proteinin %5 i kadardır. EGF, fare çenealtı tükürük bezinde sentezlenerek tübüler kanal hücrelerinde depo edilmektedir. Ancak farelerde çenealtı tükürük bezinin çıkarılması sonrasında plazma EGF düzeyinde herhangi bir değişikliğin olmaması EGF nin organizmada başka bir yerde de sentezlendiğini düşündürmektedir. Đnce bağırsaktaki Brunner bezleri önemli miktarda EGF sentezler ve salgılarlar [102]. EGF en yüksek miktarda çenealtı tükürük bezinde bulunur [103]. Daha sonra duedenum, Brunner bezleri, tiroit, pankreas, adrenal bez, ovaryum, parotis bezi, karaciğer, özofagus, mide, incebağırsak, kolon, kalp, böbrek, prostat, iskelet kası, düz kas, akciğerler, timus bezi bunlar arasında sayılabilir [104]. Bunların yanı sıra EGF, idrarda, gastrik sıvıda, tükürükte, safrada, prostatik ve seminal sıvıda, terde, gözyaşında, amniyotik sıvıda ve anne sütünde plazma ve serumda bulunur [105]. EGF, pek çok mezodermal ve ektodermal kökenli hücreler için mitojenik özelliktedir [28, 103, 106]. EGF endojen olarak insan çenealtı tükürük beznden salgılanmaktadır [107]. Gregory ve arkadaşları insan idrarının köpeklerde mide asit salgısını inhibe ettiğini göstermişler ve izole ettikleri etken maddenin adını Urogastrone koymuşlardır. Đzole edilen bu maddenin fare EGF sine benzerlik göstermesi üzerine Urogastrone a (URO) insan EGF si denilmiştir. EGF URO, insanda tükürük bezleri ve Brunner bezlerinde tespit edilmiştir [108]. EGF, etkin olduğu hücrelerde de iyon alınımını, glikolizi, DNA ve RNA sentezini arttırıcı özelliğe sahiptir [109, 110]. EGF farklılaşma ve büyümeyi etkileyerek
30 organizmanın gelişiminde rol oynar [102]. Çeşitli epitelyum hücre kültürlerinde EGF büyümeyi, çoğalmayı ve farklılaşmayı arttırmaktadır [98]. EGF gibi peptit büyüme faktörleri keratinositlerin ve fibroblastların mitogenezini, keratinositlerin göçünü ve doku ve granülasyon gelişimini uyarırlar [111]. EGF nin bol miktarda bulunduğu çenealtı tükürük bezi ekstrelerinin yara iyileşmesi üzerinde hızlandırıcı etkisi olduğu birçok çalışmada deneysel olarak gösterilmiştir. Erbaş ve arkadaşları, EGF nin yara iyileşmesindeki hızlandırıcı etkilerini gösterdikleri çalışmalarında, EGF nin serum çinko düzeyini arttırdığını bildirmişlerdir [112]. Son zamanlarda gerek tıp alanında, gerekse ağız cerrahisinde yapılan çalışmalarda, EGF nin yara iyileşmesi üzerinde olumlu etkilerinin olduğu gösterilmiştir [113]. EGF, neotanal kemiricilerde diş patlamasına ve göz kapaklarının erken açılmasına neden olur, fetal sıçanlarda, koyunlarda ve tavşanlarda akciğerin olgunlaşmasını başlatır, organ kültürlerinde damak gelişimine yardımcı olur, gastrointestinal, karaciğer ve pankreatik olgunlaşmayı stimüle eder, tiroit ve adrenal bezin gelişimine yardımcı olur, meme bezi gelişimi ve yara iyileşmesini stimüle eder, gastrik asit sekresyonunu inhibe eder, büyüme hormonu (GH), prolaktin (PRL) ve adrenokortikotropik hormon (ACTH) u içeren hipofiz hormon sekresyonunu uyarır, plasenta dokusunda plasental laktogen ve koriyonik gonadotropin (CG) sekresyonunu stimüle eder [102, 114]. EGF, diğer tüm büyüme faktörleri gibi yüksek eğilimli ve düşük kapasiteli reseptörleri ilgili hücre yüzeyine bağlar. EGF reseptörünün içindeki aktivite, EGF bağlanmasına karşı gerçekleşen tirozin kinaz aktivitesidir. EGF reseptörünün kinaz etki alanı, EGF reseptörünün kendisini fosforile eder. Buna da otofosforilasyon denir. Bu işlem sinyal iletimi basamağındaki diğer proteinler için de geçerlidir [115]. EGF reseptörü ile birleşip agregasyon ve fosforilasyon olayı meydana geldikten sonra EGF ve reseptör birlikte sitoplazmaya geçerler. Orada lizozomlar ile birleşerek reseptozomları oluştururlar ve parçalanırlar [21]. EGF özellikle keratinosit ve
31 fibroblast gibi hem mezodermal hem de ektodermal orijinli hücreler üzerinde proliferatif etkiye sahiptir. EGF granülasyon dokusu, kollajen ve glikozaminoglikan düzeyini arttırır, sonuçta epitelizasyon hızlanır ve yara gerilim kuvveti artar [115]. EGF nin içinde bol miktarda bulunduğu çenealtı tükürük bezi ekstreleri yara iyileşmesini hızlandırıcı etki göstermektedir [112]. Şekil 2.4. EGF sinyalizasyon yolu [116] 2.3.4. EGF etkileşimleri EGF pek çok mezodermal ve ektodermal kökenli hücre için mitojenik özelliktedir. Hücrelerde iyon alınımı, glikolizis, RNA ve protein sentezi, DNA sentezi artışına sebep olur [117]. EGF' nin içinde bol miktarda bulunduğu submandibular bez ekstreleri yara iyileşmesini hızlandırıcı etki göstermekte [112], serum çinko düzeyini arttırmaktadır [118]. Đnsanda tükrük ve serum EGF konsantrasyonları tiroid hormonuna bağlı değildir. Đnsan serum EGF' si hipertiroidizmde değişmezken, farede azalma göstermektedir. Đnsanda idrar ile atılan EGF tiroid hormonuna bağlıdır. Hipertiroidide artar, hipotiroidide azalır [119]. Epidermisin proliferasyonunu ve keratinizasyonunu arttırıcı etkidedir. Bu etki tiroid hormonu etkisi ile artar. EGF' nin sentez yeri henüz bilinmemektedir. Tiroid hormonunun EGF sentezini deride lokal olarak arttırdığı
32 sanılmaktadır [120]. Prematüre doğumlarda anne sütündeki EGF miktarı normal doğumdakine oranla yüksek bulunmuştur. Yeni doğanlarda ağızdan alındığında değişikliğe uğramadan kana geçmektedir [121]. 2.3.5. EGF ve yara iyileşmesi EGF, normal büyüme etkisi, neoplastik büyümedeki rolü ve yara iyileşme sindeki etkisi olmak üzere üç başlıkta değerlendirilebilir [122]. EGF' nin yara iyileşmesindeki etkisi, inflamatuar safha (0-3gün), fibroblastik safha (3-12 gün) ve remodelling safhası olmak üzere birinin içinde öbürünün geliştiği üç süreçten geçmektedir [123, 124]. Mitojenik bir polipeptid olan EGF, yara iyileşmesine inflamasyon fazının bitiminde etki etmeye başlamakta ve fibroblastik oluşumunu indüklediği ve bunun yanı sıra granülasyon dokusunun oluşumu ve epitelizasyonu uyardığı bilinmektedir [96, 112, 125]. Yapılan hayvan çalışmalarında sistemik ya da topikal olarak uygulanan EGF nin yara iyileşmesine olumlu katkılarının olduğu gösterilmiştir [114, 126]. Ağız cerrahisinde, ağız içinde oluşan yaralanmalarda iyileşme sürecinin hızlı olarak gerçekleştirilmesinin oldukça önemli olduğu bilinmektedir. Oluşan yaralarda, cerrahi işlemlerden sonra ve oral mukoza ülserinin tedavilerinde EGF nin olumlu etkisinin olduğu bildirilmiştir. Farklı formlarda EGF yara iyileşmesini hızlandırmaktadır [127]. Arıcıoğlu ve arkadaşlarının EGF ve lazerin farelerde bistüri ile oluşturulan insizyon (kesi) yaralarını iyileştirilmesinde lipit peroksidasyon üzerine etkilerinin incelenmesi adlı çalışmaların sonucunda, yara iyileşmesinde 1. ve 3. günlerde anlamlı bir fark olduğunu bildirmişlerdir [128].
33 Diş etlerinde ülserler oluşturulmuş tavşanlardan izole edilen dokuların in-vitro kültürlerinde EGF ve bfgf nin fibroblastların proliferasyonunu; sadece EGF nin de keratinositlerin proliferasyonunu geliştirdiği bildirilmiştir. Tükürük bezleri çıkarılmış, diş etlerinde ülser oluşturulmuş tavşanlarda EGF ve bfgf nin sistemik enjeksiyonu ve bfgf nin topikal uygulaması yara iyileşmesini hızlandırmıştır [127]. EGF nin domuz yara modelinde ve tavşan korneasında epitelizasyonu hızlandırdığı gösterilmiştir. Ayrıca, hayvan modellerinde yara gerilim kuvvetini de arttırdığı bildirilmiştir [9]. 2.4. Kollajen Memeli hücrelerinin çoğu dokulara yerleşmiş olup çoğunlukla bağ dokusu adı verilen karmaşık bir hücre dışı yatakla çevrelenmiştir [33]. Bağ doku, hücrelerin aralarını doldurmak suretiyle dokuların şekillenmelerini sağlar. Diğer önemli bir görevi ise organizmadaki doku kayıplarının önlenmesidir. Doku kayıplarının önlenmesinde bağ dokusu hücreleri çoğalıp yeni hücrelerarası madde yaparak, hem bağ dokunun hem de rejenere olamayan dokuların kayıplarını kapatır [34]. Bağ dokusunu oluşturan ekstrasellüler makromoleküler ara madde kollajen, retikülin, elastin ve proteoglikanlardan meydana gelir [2]. Günümüzde bilinen 24 farklı kollajen molekülü vardır. Omurgalı grupların vücudunda en az 20 farklı kollajen tipi bulunur [129]. Kollajen molekülleri keşfedilme sıralarına göre Roma Rakamları ile (I, II, III, IV, V vb.) adlandırılır. Tüm bu moleküller birbirinden farklı ve dokuya özel moleküler yapılarda bulunarak, değişik organizasyonları ve işlevleri yerine getirmek için özelleşmiştir. Fibriller protein ve α-heliks yapısında olan kollajen molekülleri tip I, II, III, V ve XI dir. Bu yapı kollajen fibrillere yüksek gerilme özelliği ve direnç sağlamaktadır. Kollajen vücuttaki çoğu organın stabilizasyonunu sağlamakta ve kornea, dermis, kemik gibi dokuların ana bileşenini oluşturmaktadır. Kollajen fibriller her bir canlı türünün değişik dokularında göstereceği işleve bağlı olarak farklı düzenlenmeye sahiptir. Tendonda yer alan kollajen fibriller paralel sıralar halinde uzanarak tendona büyük
34 bir dayanıklılık sağlamakta, aynı zamanda esneme yeteneğini azaltmaktadır. Deride yer alan kollajen proteinleri tamamen dağınık düzenleniş göstererek ağsı bir yapı oluşturur. Fibriller arasında meydana gelen kovalent bağlar da bu yapıyı kuvvetlendirmektedir. Gözün korneasındaki organik materyal hemen hemen saf kollajenden ibarettir. Şekil 2.5. Kollajen fibrilin ince yapısı [130] Kollajen, fibroblastların ribozomlarında üretildikten sonra endoplazmik retikuluma geçerek heliks yapısını alır. Heliks formasyonu hidroksiprolin ve hidroksilizinden arta kalan prolin ve lizinin hidroksilasyonu sonucu oluşur. Hidroksilasyon için oksijen ve askorbik asite ihtiyaç vardır. Heliks yapısını alan bu oluşuma prokollajen adı verilir. Fibroblastlardan hücre dışına verilen prokollajen, prokollajen peptidaz enzimi tarafından, tropokollajen adı verilen yapıya dönüştürülür [38, 39]. Kollajen fibrillerin temel bileşenini hücre içerisinde sentezlenen tropokollajen molekülleri oluşturur. Tropokollajen, molekül ağırlığı yaklaşık 300 000 dalton olan bir protein molekülüdür. Aynı boyda ve yaklaşık 1000 amino asitten oluşan 3 polipeptid zincirden meydana gelmiştir. Birbirinin eşi olan ve α-1 olarak adlandırılan
35 2 zincir ile, α-2 ile gösterilen üçüncü bir zincirin bir araya gelerek ortak sarmal yapı oluşturmasıyla kollajen fibril meydana gelmiştir. Kollajen proteinin yapısında %35 oranında glisin, %11 oranında alanin bulunmaktadır. Kollajen diğer proteinlerden farklı olarak %12 oranında prolin ve %9 oranında hidroksiprolin içermektedir. Bu amino asitlere diğer proteinlerde nadir olarak rastlanmaktadır. Kollajen yapısı içerisinde glisinprolin- hidroksiprolin amino asitleri devamlı olarak tekrar etmektedir. Tropokollajen molekülleri in vivo koşullarda hemen biraraya gelerek sol-el heliksi oluşturmaktadır. In vitro koşullarda α-1 ve α-2 zincirlerinin üçlü sarmal oluşturması oldukça uzun zaman almaktadır. Bu sebeple bu yapının yüzdesi ortamda bulunan total tropokollajene oranla daha düşüktür [35]. Kollajen fibrillerin, dokulara dayanıklılık sağlayan uzun, kristal ve filamentöz yapıları vardır. Fibriller aralarında yer alan bağ doku hücreleri ile paketlenerek dokulara destek sağlar. Kollajen moleküllerini oluşturan zircirlerde bir NH2 (α), bir de COOH- (β) ucu bulunur. Olgun kollajen fibrillerinin oluşumu α ve β uçlarını içeren prokollajen moleküllerinin birbirine eklenmesi ile meydana gelir. Uç uca eklenen prokollajen moleküllerinin asimetrik uçları vardır [131]. α uçları uzun ve ince, β uçları ise daha kısa ve kalındır. Bu fibril uçları ilk olarak tendon dokusunda, daha sonra kornea ve dermiste tanımlanmıştır [132, 133, 134]. Tendon dokusu ile yapılan elektron mikroskobu çalışmalarında fibril 22 paketleri içerisinde serbest α ve β uçlarının görüldüğü rapor edilmiştir [135]. Bu uçların görülmesi fibrillerin doku bütününde kesintisiz uzanmadığını ve dallanmalar yaptığını göstermektedir. In situ fibriller, fibril yapısını oluşturan kollajenler ve diğer matriks bileşenlerinin kombinasyonu ile meydana gelen heteropolimerik yapılardır.
36 (a) Şekil 2.6. Tavuk embriyosu korneasında tip I ve tip V kollajen moleküllerinin transmisyon elektron mikroskobu görüntüsü [136] a) Tip I Kollajen b) Tip V Kollajen Tip I kollajen, diğer fibriller tipte kollajen moleküllerine göre daha kalın yapılıdır. Tip V kollajen kısmen esnek çubuklar şeklinde düzenleniş gösterir. Mikroskobik yapısını oluşturan bu çubuksu görünüm içerisinde helikal ve uçlarda bulunan terminal globüler bölgeler vardır. Elektron migrograflarından edinilen bilgilere göre, tip I kollajen 67nm de bir çizgilenme gösteren fibril yapısındayken, tip V kollajen kesintisi olmayan daha ince fibriller halinde görülür. Tip I molekülleri (çap:156±46nm) tip V moleküllerinden (çap:25±8nm) daha kalındır. Şekil 2.8 de tavuk embriyosu korneasındaki tip I ve tip V kollajen fibrillerin elektron mikroskobu görüntüleri görülmektedir [129]. (b)
37 Şekil 2.7. Tip I ve tip V kollajen moleküllerinin oluşturduğu heterotipik fibril yapısı. (Kırmızı: tip V, Gri: tip I kollajen) a) ve b) Boyuna görüntü c) Enine kesit [137] Şekil 2.8. Tip IX ve tip II kollajen moleküllerinin oluşturduğu heterotipik fibril yapısı a) Şematik çizim b) Elektron mikroskop görüntüsü [138] Farklı dokularda farklı miktarda dayanıklılık sağlayan özellik, değişik tipte kollajen fibrillerinin heterotipik fibriller olarak karışık şekilde paketlenmesidir. Bu paketlenme kollajen fibril oluşumunu düzenleyici mekanizmadır. Kompleks kollajen moleküllerinin değişik şekillerde paketlenmesi morfogenez, gelişim, rejenerasyon ve