HBV YE BAĞLI KRONİK HEPATİT TEDAVİSİNDE ANTİVİRALLERE DİRENÇ - KLİNİK YAKLAŞIM Prof. Dr. Fatih Beşışık 1.HBV tedavisinde durum nedir? Güncel antiviral tedaviler ile HBV eradikasyonu mümkün değildir. Bunda, HBV replikasyonunu idame ettiren ccdna formunun konvansiyonel tedavilere dirençli olması önemli rol oynar. Bununla birlikte bu tedaviler ile, HBV DNA düzeylerini karaciğer hastalığı yapabilecek düzeylerin altına indirebilmek, dolayısı ile klinik remisyon sağlamak, progresyonu yavaşlatmak veya durdurmak olasıdır. Bu bağlamda antiviral tedaviye virolojik yanıt, HBV DNA titresinin < 10.000 kopya/ml olması olarak tanımlanır. Nukleo(t)sid analogları (NA) ile tedaviye inisyal yanıt, 12. haftada viral yükte bazale göre en az 1 log azalma ile karakterizedir (1,2). 2. Primer yanıtsızlık nedir? Tedaviye inisyal yanıtın olmamasıdır. Tedavinin 6.ayında HBV DNA > 1 log IU/ml azalmamış ise bu durum primer yanıtsızlık olarak isimlendirilir. Primer yanıtsızlıktan konağa, virüse veya ilaca ait faktörler sorumlu olabilir. Konağa ait enzimlerin genetik polimorfizminin sonucu olarak, NA, intrasellüler fosforilasyonlar aracılığı ile aktif metabolitlerine dönüştürülemeyebilir. Yine, bazı antivirallerin standart dozları primer yanıtı elde etmek için yeterli olmayabilir. Primer yanıtsızlık antiviral direnci gelişiminde rol oynayan önemli bir faktördür. Bu durumda daha potent, diğer bir NA a geçilmelidir (3,4). 3. Sekonder yanıtsızlık nedir? Tedaviye sekonder yanıtsızlık ise tedaviye yanıt vermiş hastalarda, tedavi sırasında, elde edilmiş en düşük viral yük düzeyine göre, viral titrede 1 log veya üzerinde artış olarak tanımlanır. Antiviral direnci ve tedaviye uyumsuzluk bu durumdan sorumlu olan en önemli 2 faktördür. Antiviral direnci, hızı değişken olmakla birlikte, zamana bağlı bir olaydır (3,5). 4. Antiviral direnci nedir? Replikasyon sırasında ortaya çıkan nukleotid değişikliği, antivirale duyarlılığı azaltan aminoasid değişikliği ile (non-sinonim mutasyon) sonlanır ise bu durumda artık genotipik antiviral direnci söz konusudur (3). 5. Genotipik antiviral direnci nedir? Nukleosid/nukleotid analoglarına direnç gelişiminden genellikle viral polimeraz genini (NA için hedef gen) ilgilendiren mutasyonlar (GENOTİPİK DİRENÇ) sorumludur (3,5). İlaç direncine yol açan primer mutasyonlar, antiviral ajana duyarlılığı azaltır. Bunu izleyen sekonder kompansatuvar mutasyonlar ise, primer mutasyon sonucu viral polimeraz aktivitesinde gelişen fonksiyonel defekti kompanse eder. Dolayısı ile genotipik direnç geliştiğinde, mutant suşların replikasyon yeteneğindeki sınırlılığa bağlı olarak HBV DNA düzeyleri, tedavi başlangıcına göre daha düşüktür. Kompansatuvar mutasyonlar geliştiğinde ise replikasyon sınırlılığı ortadan kalkar, HBV DNA düzeyleri progresif olarak artıp, inisyal düzeyleri geçer (viral rebound) (5,6). Genotipik direnç fenotipik analiz ile konfirme edilebilir. Fenotipik analizde virüsün 47
replikasyon yeteneği, başlangıçtaki HBV DNA (wild tip), eğer bu temin edilemiyor ise consensus HBV DNA, ile karşılaştırılır; %50 inhibisyon için gerekli olan antiviral konsantrasyonundaki (EC50 veya IC50) artış araştırılır (7). 6. Genotipik direnç nasıl isimlendirilir? Viral polimeraz geninin revers transkriptaz (rt) bölgesi tüm genotipler için ortaktır. Bu bölgedeki mutasyonlar; rt önekinin ardından, ilk aminoasid- rt bölgesinin başlangıcına göre kodon sayısı- mutasyonla yeni oluşan aminoasid; olarak isimlendirilir (3). 7. Genotipik direnç hangi metodlar ile araştırılır? a) PCR ürününün direk sekanslaması: Duyarlılığı en az olan metoddur. Mutant suşun tespit edilebilmesi için HBV havuzunun > %20 i oluşturması gereklidir (3). b) RFLP: Mutant suşlar viral populasyonun %5 ini oluşturduğunda pozitifleşir. Ancak reaksiyon için kullanılan endonukleazlar mutanta spesifiktir. Dolayısı ile spesifik endonukleaz kullanılmadığında reaksiyon negatif kalabilir (8). c) Revers hibridizasyon testi (LiPA DR): Mutant suşlar viral populasyonun %5 ini oluşturduğunda yakalayabilir. Her bir mutant için spesifik prob gereklidir. Ayrıca genotipik değişkenlikten ötürü, aynı mutasyonu farklı genotiplerde yakalamak için birden fazla prob gerekebilir (9). d) Mikrochip teknolojisi ile sekanslama: Pahalı ve her yerde olmayan yeni bir teknolojidir (10). e) MALDI-TOF MS: Mutasyonları taşıyan ufak DNA fragmanlarının mass spektropmetrik analizidir. Mutant suşlar viral populasyonun %1 ine eriştiğinde yakalayabilir. Her bir mutasyon için hazırlanmış yeni primer ve mass spektrometre gerektirir (11). f) Tek genomun sekanslanması: Güç ve yorucu bir iştir. Ayrıca saptanan mutasyonun populasyon içerisindeki sıklığı bilinmediğinden klinik karşılığını değerlendirmek güçtür (3). 8. Antiviral direncinde rol oynayan mekanizmalar nelerdir? Antiviral direnç gelişiminde rolü olan en az 6 farklı mekanizma söz konusudur (12): 1. Virüs replikasyonunun miktarı ve hızı: Replikatif dönemde her gün, >1011 HBV virüsü yapılabilir. HBV virüsü 3200 nükleotid içerir. Viral polimeraz her 104-105 nukleotidde bir hata yapar. Dolayısı ile konaktaki HBV populasyonu, muhtemelen her türlü nukleotid değişikliğini (mutasyonunu) içerebilen bir populasyon (quasispecies-türümsüler) olarak bulunabilir. Bununla birlikte genom okuma alanlarının (open reading frame) örtüşen (overlapping) bölgeler içermesi, virüsün yaşamını sürdürebilmesine izin verecek mutasyonların sayısını, sınırlı kılar. Türümsüler içerisinde baskın populasyonu, konağın bağışıklık yanıtının oluşturduğu baskı karşısında, hayatta kalabilme ve replikasyon kompetansı belirler. 2. Viral polimerazın hata hızı: HBV polimerazın, 1 yıl içerisinde her bir bölge için hatalı nukleotid yerleştirme olasılığı 1.4-3.2 x 10-5 tir. Bu olasılık diğer DNA virüslerine göre 10 misli daha fazla bir olasılıktır ve retrovirüslere benzer bir durumdur. Dolayısı ile türümsü havuzu içerisinde, daha başlangıçta, ilaç direnci ile ilgili 1 veya 2 mutasyon taşıyan varyantlar bulunabilir. 3. İlacın antiviral etkinliği: İlacın antiviral etkinliği düşük ise, anlamlı bir baskı oluşturamayacağı için dirençli suşların seleksiyonu olasılığı zayıftır. Bunun tam aksine replikasyon tamamen baskılanmış ise, mutagenez replikasyon bağımlı bir durum olduğundan, yine dirençli suşların seleksiyonu söz konusu olamayacaktır. Bununla birlikte antiviral ajanların antiviral etkinliği sınırlıdır. İdeal tedavi, virüsün yaşam siklüsünde değişik bölgelerin hedeflendiği, böylece dirençli suşların seleksiyonunun mümkün olmadığı rejimlerdir. 48
4. Karaciğerdeki replikasyon mesafesinin genişliği: Karaciğerde, yeni cccdna yerleştirilebilecek hepatosit miktarı replikasyon mesafesi olarak isimlendirilir. Mutant virüsün hepatositlere yerleşebilmesi için orijinal virüsün replikasyon mesafesini boşaltması gereklidir. Bu ise, cccdna nın hepatositlerden temizlenebilme hızı kadar, hepatosit yapım-yıkım hızı ve virüs suşlarının replikasyon yeteneği ile de ilgili bir olaydır. Normal karaciğerde yapım-yıkım hızı yavaştır; hepatositlerin yarılanma süresi ~ > 100 gündür. Nekroinflamatuvar aktivite arttığında ise bu süre < 10 gün olabilir. 5. Rezistan suşların replikasyon yeteneği: Bağışıklık sistemi ve ilaç baskısı altında virüsün çoğalabilme yeteneğidir. 6. Genetik bariyer: Primer antiviral direnci gelişebilmesi için gerekli mutasyon sayısıdır. L-nukleosidler (örneğin lamivudin) ve asiklik fosfanatlara (örneğin adefovir) direnç için tek bir mutasyon yeterli olabilir. Buna karşılık siklopentan grubunda yer alan entekavire direnç için en az 3 mutasyon gereklidir. 7. Diğer faktörler: İlaç metabolizması ile ilgili genetik faktörler, tedaviye uyum, saklı bölgelere antiviral erişebilirliği, cccdna formuna etkinlik olarak özetlenebilir. 9. Lamivudin ve diğer L-nukleosidlere genotipik direnç değişiklikleri nelerdir? Lamivudin için primer direnç mutasyonları rtm204v/i/s mutasyonları ve rta181t mutasyonudur. rta181t mutasyonu adefovir tedavisi sırasında da seçilebilir. rtm204v/i mutant suşlar diğer L-nukleosidlere de (emtrisitabin, telbivudin, klevudin ) dirençlidir. Dolayısı ile lamivudin direncine yol açan mutasyonlar diğer L-pirimidin analoglarına da (emtrisitabin, telbivudin, klevudin) direnç ile neticelenir. Bununla birlikte L-pirimidin analoglarından telbivudin pozitif zinciri hedef aldığından, negatif zinciri hedef alan lamivudine göre daha yavaş direnç geliştirir (13,14). Bu mutasyonları taşıyan virüslerin replikasyon kapasitesi sınırlıdır. Başlıca kompansatuvar mutasyonlar ise rtv173l, rtl180m, rtl80i olup replikasyon kapasitesini normale döndürürürler. 10. Asiklik fosfanatlara genotipik dirençten sorumlu değişiklikler nelerdir? Adefovir direnci: Primer direnç mutasyonları D bölgesindeki rtn236t ve B bölgesindeki rta181t/v mutasyonlarıdır. Nadiren rti233v mutasyonu primer direnç sebebi olabilir (15,16). rta181v mutant suşların lamivudine de duyarlılığı azalmış olabilir. Tenofovir direnci: Tenofovir direnci ile ilgili veriler henüz sınırlıdır. Muhtemelen, direnç gelişimi için birden fazla mutasyonun bir arada olması gereklidir (3,12). 11. Entekavir direnci: Entekavir direnci, lamivudin direncine yol açan mutasyonların yanı sıra T184, S202 ve/veya M250 değişikliklerini gerektirir. Naif hastalarda tedavi sırasında, önce, entekavire duyarlılığı daha az olan, lamivudin dirençli mutantlar seleksiyona uğrar. Bunlarda ortaya çıkan yeni mutasyonlar ise entakavir direnci ile sonlanır (17,18). HIV-HBV koinfekte hastalarda entekavir, lamivudin dirençli HIV mutant suşların seleksiyonuna yol açabileceğinden dikkatli kullanılmalıdır. 12. Direnç riski açısından hasta nasıl izlenmelidir? Genotipik direnci, genellikle fenotipik direnç; fenotipik direnci ise klinik hastalık (biyoşimik ve histolojik relaps) izler. Direnç gelişen hastalarda, alternatif tedaviye ne kadar erken geçilir ise, yeniden viral supresyon o kadar hızlı ve etkili olur. Dolayısı ile: 49
Fenotipik direnç açısından; lamivudin alan hastalarda 3-6 ayda bir, adefovir veya entakavir alan hastalarda 1.yıldan sonra 6 ayda bir kantitatif HBV DNA testi yapılmalıdır. Fenotipik direnç saptanan hastalarda, bir sonraki tedavi açısından da yol gösterici olması sebebi ile genotipik direnç testleri istenmelidir. Genotipik direnci aramak için Ülkemizde genellikle line-probe testleri kullanılmaktadır. Ancak bu yöntem ile sadece bilinen mutasyonlar aranabilir. Dolayısı ile direnç gelişimine yol açabilen yeni mutasyonlar tanımlandıkça, ilgili problar teste ilave edilmelidir. Ayrıca testin mutant suşlar viral populasyonun > %5 i olduğunda pozitifleştiği unutulmamalıdır (3,12). 13. Dirençli HBV infeksiyonunun tedavisi nasıl yapılır? a. Lamivudin, telbuvidin ve diğer L-nukleosidlere direnç: Direnç gelişim hızını da azaltmayı hedefleyerek, adefovir veya tenofovir ilave edilmelidir (19,20). Entekavir başlangıçta etkili olabilmekle birlikte, direnç gelişme riskinin yüksek olması sebebi ile ilk seçenek değildir. Eğer entekavir başlanacak ise yüksek doz (1 mg/gün) ve lamivudinsiz başlanmalıdır (21). b. Adefovir dirençli hastalar lamivudin naif ise ilk tercih entekavirdir; aksi takdirde tenofovir tercih edilebilir (22). c. Entekavir dirençli suşlara adefovir ve tenofovir etkilidir (14,17). 14. Sonuç olarak: HBV revers transkriptazı (polimeraz), yaptığı hatayı düzeltemediğinden, replikasyon süresine ve hızına paralel olarak pek çok mutant suş HBV populasyonu içerisinde yer alır (yüksek viremi, uzun süreli infeksiyon). Replikasyonun devam etmesi yeni mutantların oluşumunu ve bunların intrahepatik cccdna da arşivlenmesini kolaylaştırır. Dolayısı ile tedavide viral replikasyonun hızla tamamen baskılanması en önemli hedef olmalıdır. Bu ise antiviralin gücü kadar, viral replikasyonun hızı, yani bazal viremi ile de ilgili bir olaydır. HBV e bağlı kronik hepatit tedavisinde kullanılan güncel antiviraller viral polimerazı hedeflemektedir. Aynı hedefe yönelik antivirallerin kombinasyonu ise vireminin kontrolunda aditif etki sağlamamaktadır. Dolayısı ile kombinasyon içersinde yer alabilecek, virüs replikasyonunda diğer basamakları hedefleyen yeni antivirallere hızla ihtiyaç vardır. Muhtemelen, intrahepatik cccdna da arşivlenmiş olarak hemen tüm mutantlar bulunmaktadır. Lamivudinde olduğu gibi tek bir mutasyon, direnç gelişimi için yeterli olduğunda, arşiv içerisinde yer alan mutant populasyon baskın hale geçebilmektedir. Direnç gelişimi çok sayıda mutasyonu gerektirdiğinde ise (ilaca intrensek genetik bariyer veya çapraz direnç riski taşımayan ilaçaların kombinasyonu) fenotipik rezistansın ortaya çıkması güçleşmektedir. Mutant suşların, cccdna olarak arşivlenebilmesi için, bunları arşivleyecek hepatositlere gereksinim vardır. Hızlı hepatosit yapım ve yıkımı (aktif hastalık, yüksek ALT) replikasyon sahasını genişleterek bu hedefi karşılar. Direnç gelişmesi açısından riskli bu grupların yanı sıra, direnç geliştiğinde ortaya çıkabilecek alevlenmeyi tolere edemeyecek sınırlı rezervli hastalarda (siroz, karaciğer transplantasyonu) tedavi, profesyonel yaklaşım, yakın takip ve gelişmelere paralel olarak yeni stratejilerin belirlenmesini gerektirir. KAYNAKLAR 1. Hoofnagle JH, Doo E, Liang TJ, Fleischer R, Lok ASF. Management of Hepatitis B: Summary of a Clinical Research Workshop. Hepatology 2007; 45: 1056-1075. 2. Dienstag JL. Drug therapy: Hepatitis B Virus Infection N Engl J Med 2008; 359:1486-1500. 3. Lok AS, Zoulim F, Locarnini S, et al. Antiviral drug-resistant HBV: standardization of nomenclature and assays and recommendations for management. Hepatology 2007;46:254-265. 4. Eriksson S, Wang L. The role of cellular deoxynucleoside kinases in the activation of nucleoside analogs used in 50
chemotherapy. Recent Advances in Nucelosides: Chemistry and Chemotherapy, Chu C.K. ed. Amsterdam: Elsevier, 2002: 455-475. 5. Locarnini S, Hatzakis A, Heathcote J, Keeffe EB, Liang TJ, Mutimer D, Pawlotsky JM, et al. Management of antiviral resistance in patients with chronic hepatitis B. Antivir Ther 2004; 9: 679-693. 6. Ono SK, Kato N, Shiratori Y, Kato J, Goto T, Schinazi RF, et al. The polymerase L528M mutation cooperates with nucleotide binding-site mutations, increasing hepatitis B virus replication and drug resistance. J Clin Invest 2001; 107: 449-455. 7. Zoulim F. In vitro models for studying hepatitis B virus drug resistance. Semin Liver Dis 2006; 26: 171-180. 8. Allen MI, Gauthier J, DesLauriers M, Bourne EJ, Carrick KM, Baldanti F, et al. Two sensitive PCR-based methods for detection of hepatitis B virus variants associated with reduced susceptibility to lamivudine. J Clin Microbiol 1999; 37: 3338-3347. 9. Lok AS, Zoulim F, Locarnini S, Mangia A, Niro G, Decraemer H, et al. Monitoring drug resistance in chronic hepatitis B virus (HBV)-infected patients during lamivudine therapy: evaluation of performance of INNO-LiPA HBV DR assay. J Clin Microbiol 2002; 40: 3729-3734. 10. Tran N, Berne R, Chann R, Gauthier M, Martin D, Armand MA, et al. European multicenter evaluation of high-density DNA probe arrays for detection of hepatitis B virus resistance mutations and identification of genotypes. J Clin Microbiol 2006; 44: 2792-2800. 11. Kim HS, Han KH, Ahn SH, Kim EO, Chang HY, Moon MS, et al. Evaluation of methods for monitoring drug resistance in chronic hepatitis B patients during lamivudine therapy based on mass spectrometry and reverse hybridization. Antivir Ther 2005; 10: 441-449. 12. Locarnini S. The haunting spectre of vi,ral resistance in HBV. In: The changing face of hepatology, postgraduate course book 2008, pp:101-110 13. Allen MI, Deslauriers M, Andrews CW, Tipples GA, Walters KA, Tyrrell DL, et al. Identification and characterisation of mutations in hepatitis B virus resistant to lamivudine. Lamivudine Clinical Investigation Group. Hepatology 1998; 27: 1670-1677. 14. Brunelle MN, Jacquard AC, Pichoud C, Durantel D, Carrouee-Durantel S, Villeneuve JP, et al. Susceptibility to antivirals of a human HBV strain with mutations conferring resistance to both lamivudine and adefovir. Hepatology 2005; 41: 1391-1398. 15. Villeneuve JP, Durantel D, Durantel S, Westland C, Xiong S, Brosgart CL, et al. Selection of a hepatitis B virus strain resistant to adefovir in a liver transplantation patient. J Hepatol 2003; 39: 1085-1089. 16. Angus P, Vaughan R, Xiong S, Yang H, Delaney W, Gibbs C, et al. Resistance to adefovir dipivoxil therapy associated with the selection of a novel mutation in the HBV polymerase. Gastroenterology 2003; 125: 292-297 17. Tenney DJ, Levine SM, Rose RE, Walsh AW, Weinheimer SP, Discotto L, et al. Clinical emergence of entecavir-resistant hepatitis B virus requires additional substitutions in virus already resistant to Lamivudine. Antimicrob Agents Chemother 2004; 48: 3498-3507 18. Colonno RJ, Rose R, Baldick CJ, Levine S, Pokornowski K, Yu CF, et al. Entecavir resistance is rare in nucleoside naïve patients with hepatitis B. Hepatology 2006; 44: 1656-1665. 19. van Bommel F, Wunsche T, Mauss S, Reinke P, Bergk A, Schurmann D, et al. Comparison of adefovir and tenofovir in the treatment of lamivudine-resistant hepatitis B virus infection. Hepatology 2004; 40: 1421-1425. 20. Peters MG, Hann H, Martin P, Heathcote EJ, Buggisch P, Rubin R, et al. Adefovir dipivoxil alone or in combination with lamivudine in patients with lamivudine-resistant chronic hepatitis B. Gastroenterology 2004; 126: 91-101 21. Chang T, Chish R, Hadziyannis S, Cianciara J, Rizzetto M, Schiff E, et al. A dose-ranging study of the efficacy and tolerability of entecavir in Lamivudine-refractory chronic hepatitis B patients. Gastroenterology 2005; 129: 1198-1209. 22. Fung SK, Chae HB, Fontana RJ, Conjeevaram H, Marrero J, Oberhelman K, et al. Virologic response and resistance to adefovir in patients with chronic hepatitis B. J Hepatol 2006; 44: 283-290. 51