YMN40 POLİKATYONİK NANOPARTİKÜLLER KULLANILARAK PRİMER DÜZ KAS HÜRELERİNİN TRANSFEKSİYONU N. Türkoğlu, G. Güven, T. Kutsal, E. Bişkin Hacettepe Üniversitesi, Mühendislik Fakültesi, Kimya Mühendisliği Bölümü, 06800 Beytepe, Ankara, Türkiye e-posta: tkutsal@hacettepe.edu.tr ÖZET Bu çalışmada, (poli(st/peg-eem/dmapm) terpolimer katyonik nanopartiküller sentezlenmiş ve karakterize edilmiştir. Bu nanopartiküller ile GFP geni taşıyan plazmidin konjugat oluşturulması için en uygun koşullar saptanmıştır. Hücre kültür ortamlarında yapılan deneylerde, primer düz kas hücrelerine gen aktarımı incelenmiştir. Genetik modifikasyonun bu taşıyıcılar ile çok başarılı olarak sağlanabileceği gösterilmiştir. Anahtar Kelimeler: Restenoz, gen terapi, düz kas hücresi, nanopartikül 1. GİRİŞ Kalp-damar hastalıkları, yaklaşık 17 milyon/yıl gibi çok büyük bir sayıyla, dünyada en çok ölüme neden olan hastalıkların başında gelmektedir. Bu hastalıklar ülkemizde de en önemli halk sağlığı sorunlarından birisidir. Türkiye de yaklaşık 2 milyon koroner kalp hastası bulunmakta ve bu hastaların yılda 130 bini hayatını kaybetmektedir. Koroner arterlerin daralıp tıkanması, kalp krizi ve ölümle sonuçlanabilecek önemli bir patojenik durumdur ve giderilmesi için ilk akla gelen ve günümüzde yaygın olarak başvurulan stent uygulamasıdır. 1980 li yılların başında klinik uygulamaya giren metalik (çıplak) stent uygulamasında, özellikle karmaşık yapıdaki lezyonlu hastalarda %30-60 sıklıkla açılan damarın tekrar kapanması ( Stent-restenozu ) gözlenmektedir [1]. Bunun önlenmesi için ilaç-salan stentler ( drug-eluting stents ) 2003-2004 yıllarında klinik olarak uygulamaya girmiştir [2]. Çok uzun dönemli klinik bulgular olamamasına karşın tekrar kapanma sıklığının %20 lere kadar çekildiği rapor edilmiştir. Çıplak stente göre çok pahalı da olsa Türkiye de dahi ilaç-salan stent uygulaması özellikle ekonomik durumu uygun olan hastalarda ilk tercih haline gelmiştir. Gen terapisi günümüzde yaygın olarak çalışılan ve gelecekte birçok hastalığın kalıcı tedavisinde önemli rol oynayacağına inanılan, dolayısıyla büyük ilgi gören önemli bir tedavi yöntemidir [3]. Gen terapisinde, çıplak DNA veya uygun taşıyıcılar (vektörler) kullanılarak hedef hücreye gen aktarımı söz konusudur. Koroner stentler restenoz oranını %15-20`lere düşürmüştür. Restenozun tek haneli rakamlara düşürmek için üzerinde en çok durulan yaklaşımlardan birisi de gen aktarımının uygulanmasıdır [4]. Tarafımızdan başlatılan bu yöndeki çalışmalarda, temel amaç düz kas hücrelerinin proliferasyonun, ve böylece restonozu önleyen genetik bilginin bu hücrelere aktarılmasıdır. Bunun için nanopartikül formunda yeni bir polimerik taşıyıcı geliştirilmiştir. Nanopartikül formundaki bu taşıyıcı ile model bir geni (GFP geni) taşıyan
plazmidin aktarımda kullanılabilirliği araştırılmıştır. Yapılan çalışmaların sonuçları burada özet olarak sunulmuştur. 2. DENEYSEL YÖNTEMLER 2.1. Polikatyonik Nanopartiküllerin Üretimi Polimerizasyonlar su içinde yağ (o/w) sisteminde yüzey aktif madde içermeyen emülsiyon polimerizasyonu yöntemiyle gerçekleştirilmiştir. Çalışmada kullanılan ana monomer stiren (St) Sigma (ABD) firmasından temin edilmiştir ve kullanılmadan önce distile edilmiştir. Katyonik komonomer N-[3-(dimetil amino) propil] metakrilamid (DMAPM) ve stabilizör poli(etilenglikol) etil eter metakrilat (PEG-EEM)(n=3) Sigma (ABD) firmasından, katyonik başlatıcı 2,2 -azobis (2-metil propion amidin) dihidroklorür (V-50) Aldrich (ABD) firmasından satın alındığı gibi kullanılmıştır. Dağıtma ortamı ise distile sudur. 1.25 ml Stiren, 0.1 ml DMAPM, 0.1 ml PEG-EEM ve 0.03 g V-50 100 ml hacminde sızdırmaz cam reaktör içinde yer alan 120 ml distile suya eklenmiştir. Ortam ph sı 0.1 N lik standart hidroklorik asit çözeltisi yardımıyla 2.5-3 e ayarlanmıştır. Polimerizasyon öncesi reaktörden su fazındaki çözünmüş oksijeni uzaklaştırmak amacıyla 5 dk süreyle saf azot gazı geçirilmiştir. Polimerizasyonlar 50 ve 60 de, sıcaklık kontrollü çalkalamalı su banyosunda (Köttermann Laborteknik, Almanya) 70 vuru/dak hızda çalkalanan reaktörlerde gerçekleştirilmiştir Polimerizasyon süresi yaklaşık 24 saattir. Polimerizasyon sonrası elde edilen lateksler ortamda bulunan reaksiyona girmemiş monomerlerin uzaklaştırılması amacıyla sırasıyla metanol ve su ile yıkanmıştır. 2.2. Nanopartikül-Plazmid DNA Konjugatlarının Hazırlanması Hücreye aktarmada ve gen ekspresyonunun (protein sentezinin) gösterilmesinde model gen olarak kullanılan yeşil floresan protein (GFP) sentez genini taşıyan PEGFP-N3 plazmidi (olontech, ABD) kullanılmıştır. Bu plazmid önce E.oli de üretilmiş ve Qiagen Inc. (Almanya) saflaştırma kiti ile saflaştırılmıştır. Daha sonra GFP genlerini kodlayan plazmid kullanılarak plazmid/nanopartikül konjugatları hazırlanmıştır. Bunun için en uygun olduğu saptanan koşullar şöyledir: polimer/plazmid DNA oranı: 180 μg polimer/2 μg plazmid; ortam ph sı:7.4; sıcaklık: 25 ve etkileştirme süresi ise 15 dak. 2.3. Düz Kas Hücrelerinin Elde Edilmesi ve MMT Testi Düz kas hücreleri (DKH) dana fetus aort damarından izole edilmiştir. Hücreler uygun kültür koşullarında inkübe edildikten sonra morfolojik değişiklikler ve hücre sayıları ışık mikroskobu ile takip edilmiştir. Primer düz kas hücreleri 96-gözlü kültür kabına, her kuyuda 30x10 3 olacak şekilde ekilmiş, %10 fetal kalf serum, %1 penisilin-streptomisin antibiyotik içeren DMEMF12 kültür ortamında çoğaltılmıştır ve 24 saat (37 o 5% O 2 ) inkübasyona bırakılmıştır. Daha sonra kuyulara taze besi ortamı konularak, sitotoksitesi belirlenecek polimer kuyulara ilave edilmiştir. Bu çalışmada polimer miktarı her kuyuda 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 ve15 μl olacak şekilde seçilmiştir. Ertesi gün tekrar taze besi ortamı ilave edilerek ve kuyulara 13μL MTT (0,5mg/mL) çözeltisi eklenerek, 4 saat karanlıkta
inkübe edildikten sonra oluşan formazan kristalleri (0,08N Hl içerir) izopropanol çözeltisi ile çözülerek 510nm de okunmuştur 3. DENEYSEL BULGULAR VE TARTIŞMA 3.1. Nanopartiküllerin Karakterizasyonu Yapılan çalışmanın ilk kısmında fonksiyonel grup içermeyen katyonik nanopartiküller yüzey aktif madde içermeyen emülsiyon polimerizasyonu yöntemiyle üretilmiştir. Polimerizasyonlar St, DMAPM ve PEG-EEM (n=3) monomerlerinde bulunan vinil grupları üzerinden zincir polimerizasyonu şeklinde yürümüş ve Şekil 1 de görülen kimyasal yapıda terpolimer nanopartiküller üretilmiştir. H 3 H 3 H 2 H H 2 H 2 x O y O z O NH (H 2 H 2 O) n 2 H 5 (H 2) 3 N H 3 H 3 Şekil 1. Poli(St/PEG-EEM/DMAPM) terpolimerinin molekül yapısı. Partikül boy/boy dağılımı ve yüzey yükleri Zeta Sizer ile analiz edilmiştir. 78 nm boyutlu (PI: 1.142) nanopartiküller 59.1 mv yüzey yüküne sahip iken, 200 nm boyutlu (PI: 1.066) nanopartiküllerin 54 mv yüke sahip olduğu bulunmuştur. Nanopartikül boyutu azaldıkça, Zeta Potansiyelin arttığı gözlenmiştir. Sentezlenen poli(st/peg- EEM/DMAPM) terpolimerinin yapısal analiz incelemesi FTIR ve 1 H-NMR ile yapılmıştır. FTIR spektrumda karakteristik pikler sırasıyla, St e ait aromatik benzen halkası (= gerilmesi) 1600 cm -1 de, DMAPM ye ait =O ya bağlı N-H düzlem içi eğilmesi 1650 cm -1 de ve PEG-EEM e ait =O piki 1730 cm -1 da görülmektedir (Şekil 2). 1 H-NMR spektrumunda gözlenen piklerin terpolimer yapısında hangi gruba karşılık geldiği spektrum üzerinde gösterilmiştir (Şekil 3). Spektrumda görülen kimyasal kaymalar sırasıyla (27 de Hl 3 içinde-d1), δ ppm: stiren birimine ait (1) 1H, H (ana zincir) 2.40-2.39, (2) 2H, H 2 (ana zincir) 1.72, (3-7) 5H, H (benzen halkası) (geniş pikler) 6.97-7.02; PEG-EEM birimine ait (8) 2H, H 2 (ana zincir) 2.08-2.05, (9) 3H, H 3 1.19, (10,11) 2H, H 2 3.76-3.28, (12) 2H, H 2 3.43, (13) 3H, H 3 0.85-0.74; DMAPM birimine ait (14) 2H, H 2 (ana zincir)1.98, (15) 3H, H 3 1.14, (16) 1H, NH (geniş pik) 4.19-3.90, (17-19) 2H, H 2 (geniş pik) 3.17-3.02, (20-21) 3H, H 3 1.35 piklerdir.
Şekil 2. Poli(St/PEG-EEM/DMAPM) terpolimerinin FTIR spektrumu. Şekil 3. Poli(St/PEG-EEM/DMAPM) terpolimerinin 1 H-NMR spektrumu. 3.2. Nanopartikül-Plazmid DNA Konjugatları GFP sentezleyen geni taşıyan plazmid, model olarak kullanılmıştır. Bu gen hücre içinde eksprese olduğunda, hücrede floresan ışıkta yeşil renk ortaya çıkmaktadır. Çıplak plazmidin boyu ve yüzey yükü Zeta Sizer ile ölçüldüğünde sırasıyla 740 nm ve -21 mv olarak bulunmuştur. Daha sonra plazmid ve nanopartiküller etkileştirilerek konjugatlar hazırlanmıştır. Nanopartikül-plazmid DNA konjugatlarının, Zeta-Sizer ile ölçülen ortalama boyları sırasıyla 104 nm ve 331 nm dir. Zeta Potansiyel yükleri ise sırasıyla 45.3 mv ve 47.2 mv olarak belirlenmiştir. Görüldüğü gibi her iki boy polikatyonik nanopartikülünde plazmid DNA ile etkileşince boyları artmıştır. Terpolimerlerin plazmid DNA yı sıkıştırabilme özelliğine sahip olduğu gözlenmiştir. Negatif yüklü plazmid DNA ile etkileşim sonucu yüklerde, beklendiği gibi azalma olmuştur, ancak yine de yükler yüksek ve pozitif kalmıştır. Nanopartiküllerin sitotoksitesi MTT yöntemi ile saptanmıştır.yapılan çalışmada %76
üzerinde canlılık saptanmıştır. Çalışmanın diğer bölümünde sentezlenen kopolimerin yalnız başına hücre içine girebilme kabiliyeti araştırılmıştır. Buna göre, hücre içine floresan boya-işaretli polimer giriş verimi 78 and 200 nm boyutundaki partiküller için sırasıyla % 85 ve % 70 olarak belirlenmiştir. Gen ekspresyonu izlemek için ise önceki bölümlerde tanımlanan Kopolimer-Plazmid DNA konjugatları kullanılmıştır. DKH lerin içine giren polimerin, açılıp plazmid DNA yı serbest bırakması için hücreler 10 dak 25 de inkübe edilmiştir ve 3 gün süre ile hücreler takip edilmiştir. Burada kullanılan kopolimer floresan işaretli değildir. Dolayısıyla floresan mikroskobu ile yeşile boyandığı gözlenen hücreler GFP nin eksprese olduğu hücrelerdir. Burada optik ve floresan mikroskoplar (Şekil 5 ve 6) ile çekilen transfeksiyon sonunda elde edilen görüntülerden boyanan hücrelerin sayısı toplam hücre sayısına bölünüp ve 100 ile çarpılarak gen ekspresyon yüzdesi bulunmuştur. Burada elde edilen gen ekspresyon verimleri ise küçük boyuttaki partikül için % 68, diğeri için yaklaşık % 60 olarak bulunmuştur. (a) (b) Şekil 5. 200 nm boyutlu nanopartiküller ile DKH ların gen ekspresyonu: (a) Işık mikrokop ve (b) floresan mikroskop görüntüleri. 4. SONUÇ (a) (b) Şekil 6. 78 nm boyutlu nanopartiküller ile DKH ların gen ekspresyonu: (a) Işık mikrokop ve (b) floresan mikroskop görüntüleri. Bu çalışma kapsamında üretilen katyonik nanopartiküller ile düz kas hücrelerinin hücre kültür ortamlarında çok başarılı bir şeklide transfekte edilebileceği gösterilmiştir. 5. TEŞEKKÜR Bu çalışma TÜBİTAK tarafından (Proje No: 104S334) ile desteklenmiştir.
6. KAYNAKLAR [1] MGaras, S.M., Huber P., Neal A.S., Overview of therapies for prevention of restenosis after coronary interventions, Pharmacology & Therapeutics, 92:165, 2001. [2] Salam, M.A., Suwaidi, A.J., Holmes, D.R., Drug-Eluting oronary Stents, urr Probl ardiol, 8: 119, 2006. [3] Niidome T., Huang L. Gene Therapy Progress & Prospects: non-viral Vectors. Gene Therapy, 9:1647, 2002. [4] Quark, R., Holvoet, P., Restenosis and gene therapy, Exp. Opin. Biol. Ther., 1:79, 2001.