Proje Numarası: Başlama Tarihi: Bitiş Tarihi: Rapor Tarihi:

Transkript

1 TÜRKİYE CUMHURİYETİ ANKARA ÜNİVERSİTESİ BİLİMSEL ARAŞTIRMA PROJESİ KESİN RAPORU Campylobacter ve Enterobakterilerde Quinolone ve Çoklu Antibiyotik Dirençliliğinin Genetik Analizi Prof.Dr. K.Serdar DİKER Proje Numarası: Başlama Tarihi: Bitiş Tarihi: Rapor Tarihi: Ankara Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Ankara

2 I. ÖZET Campylobacter ve Enterobakterilerde Quinolone ve Çoklu Antibiyotik Dirençliliğinin Genetik Analizi Bu çalışmada, tavuk, koyun, sığır ve köpeklerden izole edilen Campylobacter ve enterobakterilerin kinolon ve temel antibiyotik gruplarına dirençlilik özellikleri belirlendi, çoklu dirençlilik profilleri, exluks mekanizması, plazmid ve integron içerikleri incelendi, kinolon ve eritromisin dirençliliğine neden olan gen mutasyonları saptandı, tetrasiklin ve kanamisin ile ilişkili genler belirlenmiştir. İncelenen 248 Campylobacter suşunun %29.4 ünde çoklu antibiyotik dirençliliği ve %62.1 oranında kinolon dirençliliği bulundu. Kinolon dirençliliğinin çoğunlukla gyra mutasyonu, eritromisin dirençliliğinin 23S rdna mutasyonu, kanamisin dirençliliğinin apha-3 geni, tetrasiklin dirençliliğinin teto geni vasıtasıyla geliştiği belirlendi. Campylobacter suşlarının %33.5 inde sınıf 1 integronlar ve %39.1 inde plazmidler saptandı. Plazmid varlığı ile kanamisin ve tetrasiklin direnci, integron varlığı ile çoklu antibiyotik direnci arasında ilişki bulundu. İncelenen 259 enterobakteride %30.8 oranında kinolon dirençliliği bulundu. Escherichia suşlarında çoklu dirençlilik %36.3, sınıf 1 integron %33.6 ve sınıf 2 integron %6.2 oranında bulundu. 1

3 I. SUMMARY Genetic Analysis of Quinolone and Multiple Anmicrobial Resitance in Campylobacter and Enterobacteria In this study, resistance profiles to quinolones and several antimicrobials, multiple resistance patterns, efflux mechanisms, plasmid and integron contents, mutation causing resistance against quinolons and erythromycin, resistance-associated genes for kanamycin and tetracycline were investigated in Campylobacter and enterobacterial isolates from chickens, sheep, cattle and dogs. Multiple antimicrobial resistance and quinolone resistance were found in 29.4 and 62.1 per cent of 248 Campylobacter isolates, respectively. Following associations were noted for resistance mechanisms; gyra mutation in quinolone resistance, mutation in 23S rrna gene erythromycin resistance, apha-3 gene in kanamycin resistance, teto gene in tetracycline resistance.class 1 integrons and plasmids were detected in 33.5% and 39.1% of campylobacters, respectively. Relationships were determined between the presence of plasmids and kanamycin/tetracycline resistance, and between the integrons and multiple drug resistance. Quinolone resistance was found in 30.8 per cent of 259 enterobacterial strains. Multiple antimicrobial resistance, class 1 and class 2 integrons were found in 36.3, 33.6 and 6.2 per cent of Eschreichia isolates. 2

4 II. AMAÇ VE KAPSAM Gerek hayvan ve gerekse insanların Campylobacter, ve zoonotik özellikteki E.coli ve Salmonella infeksiyonlarına karşı etkili aşıların bulunmaması, bu etkenlerden ileri gelen infeksiyonlarda sağaltım yoluna gidilmesini zorunlu kılmaktadır. Bu infeksiyonların sağaltımında başta florokinolonlar olmak üzere aminoglikozidler, makrolidler ve bata laktamlar kullanılmaktadır. Son yıllarda bu antibiyotiklerin kullanımı inanılmaz boyutlara ulaşmıştır. Yoğun antibiyotik kullanımı, bakteri populasyonları üzerinde selektif baskı oluşturarak insan ve hayvanlarda dirençli bakteri oranının artmasına neden olmaktadır. Bugün için, bakteriyel infeksiyonlarda karşılaşılan en önemli sorun antimikrobiayl dirençliliktir. Direnç genlerinin kazanılmasında ve yayılmasında etkili mekanizmalardan birisi hareketli genetik elemanlarla taşınmadır. Bu genetik elemanlardan plazmidler, konjugatif transpozonlar ve konjugatif plazmidlerde taşınan transpozonlar, direnç genlerinin bakteriler arasındaki horizontal yayılımından sorumludurlar. Son yıllarda, hareketli elemanlarca taşınan direnç genlerinin kazanılmasını sağlayan ve çoklu antibiyotik dirençliliğinden sorumlu doğal gen expresyon elemanları olan integronlar ve gen kasetleri tanımlanmıştır. Gen kasetlerinin bir integrondan ayırılarak aynı veya farklı bir türden bakterinin integronuna, veya bakteriler arasında transfer olmak üzere bir transpozona girme yeteneğini bilmek önemlidir. Böyle bir genetik transfer, eğer yeni konak patojenik bir bakteriyse ve giren gen antibiyotik dirençliliği taşıyorsa özellikle önem taşımaktadır. Bakterilerin antimikrobiyal ajanlara karşı direnci tüm dünyada olduğu gibi Türkiye de de önemli bir sorundur. Antibiyotik dirençliliğinde saptanmış mekanizmalar geçerli olmasına rağmen, bölgeye veya ülkeye özel direnç tabloları da gelişebilmektedir. Ancak Türkiye de, en önemli enterik bakterilerin en çok kullanılan antimikrobiyal maddelere karşı direnç mekanizmaları ve bunların ülkeye özgü karekterleri üzerinde moleküler düzeyde ayrıntılı bir çalışma yapılmamıştır. Bu temelden yola çıkarak, projenin temel amacı Campylobacter ve enterobakteri türlerinin uygulamadaki antimikrobiyal maddelere karşı moleküler düzeydeki direnç mekanizmalarının, dirençlilik epidemiyolojilerinin belirlenmesi ve yeni antimikrobiyal stratejilerin geliştirilmesi için gerekli olan temel bilgilerin sağlanmasıdır. Projede farklı 4 hayvan türünden izole edilen Campylobacter ve enterobakterilerin temel antibiyotik gruplarına dirençlilik profilleri MIC düzeyinde belirlenmiştir. Ayrıca, 3

5 florokinolon ve eritromisin dirençliliğine neden olan gen mutasyonları saptanmış, tetrasiklin ve kanamisin ile ilişkili genler belirlenmiştir. Çoklu antibiyotik dirençliliği ile ilgili integronlar ve gen kasetleri genetik düzeyde belirlenmiş ve efluks mekanizmasının rolü incelenmiştir ve plazmid profilleri çıkartılmıştır. 4

6 III. MATERYAL ve YÖNTEM Hayvan Materyali Çalışmada kullanılan materyaller Ankara ili ve çevresindeki tavukçuluk, sığırcılık ve koyunculuk işletmelerinde ve küçük hayvan barınaklarında yaşayan hayvanlardan alındı. Ayrıca, Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Mikrobiyoloji Anabilim Dalına ve Kliniklerine getirilen hayvan materyallerinden de yararlanıldı. Çalışma kapsamındaki hayvanlardan taze dışkı toplandı veya eküvyonlar vasıtasıyla rektal sürüntü örnekleri alındı. Toplanan materyaller en geç 3 saat içinde işlendi. Termofilik Campylobacter İzolasyonu Toplanan örneklerden Preston selektif besiyerine ve modifiye CCDA besiyerine ekimler yapıldı. Besiyerleri katalizörsüz jarlar içine konularak Gas-Generating Kit (Oxoid BR38) ile birlikte 37 0 C de saat bekletildi. İnkubasyon süresi sonunda üreme görülen besiyerlerindeki koloni morfolojileri incelenerek, Campylobacter benzeri koloniler ayrıldı. Şüpheli kolonilerden Gram yöntemi ile boyama, hareket muayenesi ve oksidaz testi yapıldı. Gram negatif, aktif hareketli ve oksidaz pozitif izolatlar Campylobacter sp. olarak ayrıldı. İzole edilen suşlar %15 (v/v) gliserin içeren Brucella buyyon içinde C de saklandı. Termofilik Campylobacter İdentifikasyonu Campylobacter sp. olarak ayrılan izolatların tür düzeyinde identifikasyonu için biyokimyasal, üreme ve tolerans özellikleri incelendi. Bu testler %0.15 agar içeren brucella buyyon, yarı-katı thiol medium ve Mueller Hinton agarda yapıldı ve istisnası bildirilmedikçe 37 0 C de gerçekleştirildi. Biyokimyasal testler Katalaz testi için; Mueller-Hinton agarda üretilen kolonilerden %3 H 2 O 2 ilavesi ile gaz oluşumu incelendi. Hippurat testi için; 0.4 ml hacimdeki %1 lik sodyum hippurat solusyonu içinde koloniler süspanse edildi ve 37 0 C de 2 saat bekletildi. Süre sonunda, aseton ve butanol karışımında hazırlanan %3.5 luk ninhidrin solusyonundan 0.2 ml eklenerek 10 dakika bekletildi ve koyu mor renk oluşumu izlendi. Selenit redüksiyon testi için; suşlar %0.1 sodyum selenit içeren yarı-katı Brucella buyyonda mikroaerobik koşullarda 3 gün üretildi ve 5

7 üreme çevresinde koyu turuncu renk oluşumu izlendi. H 2 S testi için; ekim yapılan %0.025 sistein hidrokloridli yarı-katı Brucella besiyeri üstüne kurşun asetatlı kağıt şerit yerleştirildi. Normal atmosferde 5 gün inkubasyon sırasında kağıt rengindeki kararma izlendi. Üreme testleri Yarı katı Thiol besiyerine ekilen suşların 25 0 C ve 42 0 C de üreme özellikleri incelendi. Tolerans testleri Glisin tolerans testi için; %1 glisin içeren yarı-katı Brucella buyyona ekim yapıldı ve 5 gün inkube edildi. Nalidiksik asit duyarlılık testi; suşlar 30 mcg/ml nalidiksik asit içeren %5 defibrine koyun kanlı Mueller-Hinton agara ekilerek mikroaerobik koşullarda 5 gün bekletildi. Süre sonunda suşların üreme durumları değerlendirildi. Campylobacter tür identifikasyonu Yukarıda bildirilen testler sonucunda; katalaz, hippurat, selenit, H2S pozitif; 25 0 C de üremeyen ve 42 0 C de üreyen; glisine toleranslı ve nalidiksik asite duyarlı bulunan izolatlar C.jejuni olarak ayrıldı. Katalaz, selenit, H 2 S pozitif, hippurat negatif; 25 0 C de üremeyen ve 42 0 C de üreyen; glisine toleranslı ve nalidiksik asite duyarlı bulunan izolatlar C.coli olarak ayrıldı. C.lari ayrımı için; katalaz, selenit, H 2 S pozitiflik, hippurat negatiflik; 25 0 C de ürememe ve 42 0 C de üreme; glisine tolerans ve nalidiksik asite direnç özellikleri arandı. Termofilik Campylobacter türlerinin fenotipik özelliklerine göre yapılan konvansiyonel identifikasyona ek olarak, moleküler identifikasyon da yapıldı. Bunun için Persson ve Olsen (2005) tarafından bidirilen yönteme göre PCR uygulandı. Antimikrobiyal Duyarlılık Testleri Campylobacter antimikrobiyal duyarlılık testleri Campylobacter suşlarının antimikrobiyal duyarlılıkları, Klinik ve Laboratuvar Standartları Enstitüsü (Clinical and Laboratory Standards Institute, 2006, M45A) prosedürüne uygun olarak, küçük modifikasyonla agar-dilusyon yöntemi ile incelendi. Özetle; suşlar %5 defibrine koyun kanlı Mueller-Hinton agarda mikroaerobik ortamda 24 saat üretildi. Üreyen koloniler besiyeri üzerinden toplanarak %0.075 NaCl içinde süspanse edildi ve bakteri yoğunluğu McFarland No.0.5 turbidite standartına ayarlandıktan sonra 1/10 oranında sulandırıldı. Antibiyotiklerin iki katlı sulandırmalarını içeren Mueller-Hinton agara, 6

8 hazırlanan bakteri süspansiyonundan replikatör vasıtasıyla 4 µl ekimler yapıldı. Kültürler mikroaerobik ortamda 24 saat inkube edildi. Besiyerinde üremenin görülmediği en düşük dilusyon MIC (minimal inhibitory concentration) olarak belirlendi. Çalışmada ampisilin, siprofloksasin, nalidiksik asit, eritromisin, gentamisin, kanamycin, tetrasiklin, streptomisin ve kloramfenikolün µg/ml, sulfametoksazolün µg/ml arasındaki iki katlı dilusyonları incelendi. Suşların duyarlı ve dirençli olarak değerlendirilmelerinde aşağıdaki eşik değerleri temel alındı (National Committee for Clinical Laboratory Standards, 2002 M31-A2; Clinical and Laboratory Standards Institute, 2006, M100-S16). Beta-laktam grubu: Ampisilin; dirençli > 16 µg/ml, duyarlı < 8 µg/ml. Aminoglikozid grubu: Streptomisin; dirençli > 64 µg /ml, duyarlı 32 µg/ml; Gentamisin;dirençli > 16 µg /ml, duyarlı 8 µg/ml. Kanamisin dirençli > 16 µg /ml, duyarlı 8 µg/ml Makrolid grubu: Eritromisin; dirençli > 8 µg/ml, duyarlı < 4 µg/ml. Kinolon grubu: Siprofloksasin; dirençli > 4 µg/ml, duyarlı < 2 µg/ml. Nalidiksik asit; dirençli > 32 µg/ml, duyarlı < 16 µg/ml. Tetrasiklin grubu: Tetrasiklin; dirençli > 16 µg/ml, duyarlı < 8 µg/ml. Kloramfenikol; dirençli > 32 µg/ ml, duyarlı < 16 µg/ml Sulfonamid grubu: Sulfametaksazol; dirençli > 512 µg/ml, duyarlı < 256 µg/ml. Campylobacter çoklu antibiyotik dirençliliğinin değerlendirilmesi Beta-laktam, aminoglikozid, makrolid, florokinolon, tetrasiklin, kloramfenikol veya sulfonamid gruplarından 3 veya daha fazlasına karşı direnç saptanan suşlar çoklu dirençli olarak kabul edildi. Bir gruptaki en az bir antibiyotiğe karşı direncin görülmesi, bakterinin o gruba dirençli olarak kabul edilmesi için yeterli oldu. İntegronların Saptanması Campylobacter izolatlarında integronların ve gen kasetlerinin saptanması için Sınıf 1 integraz geni inti1 ve Sınıf 2 integraz geni inti2 yi hedef alan PCR uygulamaları yapıldı. inti1 pozitif suşları saptamak için kullanılan HS 463a ve HS 464 primerleri ile inti2 pozitif suşları saptamak için kullanılan RB 201 ve RB 202 primerleri aşağıda gösterilmiştir (Barlow ve ark. 2004). 7

9 HS 463a HS 464 RB 201 RB CTGGATTTCGATCACGGCACG-3 5 -ACATGCGTGTAAATCATCGTCG-3 5 -GCAAACGCAAGCATTCATTA-3 5 -ACGGATATGCGACAAAAAGG-3 PCR, 2 µl of örnek DNA, 1.0 µm her bir primer, 200 µm DNTP ler, 10 mm Tris-HCl, 1.5 mm MgCl 2, 50 mm KCl ve 1 U Taq polimeraz içeren 25 µl reaksiyon karışımında gerçekleştirildi. PCR 94 C 30 saniye, 65 C (inti1) veya 62 C (inti2) 30 saniye, ve 72 C 45 saniye 30 siklusluk koşullarda uygulandı. PCR ürünleri agaroz jel elektroforezden sonra ethidium bromide boyama ile görüntülendi. Sınıf 1 integronların içindeki gen kasetlerinin boyutunu saptamak için, gen kasetlerine spesifik primer seçildi (Barlow ve ark. 2004). Sınıf 1 gen kaseti için kullanılan RB317 ve RB320 primer çiftinin dizini aşağıda gösterilmiştir. PCR 94 C 30 saniye, 59 C 30 saniye ve 72 C 3 dakika, 30 siklusluk koşullarda uygulandı. RB 317 RB GAACCTTGACCGAACGCAG-3 5 -AGCTTAGTAAAGCCCTCGCTAG-3 Sınıf 1 integronların ve bununla ilişkili sul geninin varlığını ortaya koymak için ayrıca Levesque ve ark. (1995) tarafından bildirilen primerler ile PCR uygulandı. Plazmid İzolasyonu İncelenen Campylobacter suşlarından plazmid kitleri ile izolasyon yapıldı (Qiagen). Plazmid izolasyonunda üretici firma tarafından önerilen protokol uygulandı. Plazmid büyüklükleri agaroz jel elektroforez ile, miktarları bir spektrofotometre (Nanodrop) ile saptandı. Efluks Pompalarının Saptanması cmeabc gen kümesinin saptanması Çoklu antibiyotik dirençli Campylobacter suşlarında ve kontrol için çoğul dirençli olmayan suşlarda efluks pompası ile ilişkili cmea, cmeb ve cmec genlerinin varlığını saptamak için PCR kullanıldı. Bunun için cmea geni 1, cmeb ve cmec genleri 2 şer farklı PCR protoklü ile araştırıldı. 8

10 cmeabc genlerinin saptanması cmeabc operononda yer alan cmea, cmeb ve cmec genleri aşağıdaki PCR protokolü ile belirlendi. Bakteri DNA sı kaynatma yöntemi ile elde edildi. Amplifikasyon için aşağıda dizinleri verilen primer çiftleri ve protokol kullanıldı (Olah ve ark. 2006). cmea F cmea R cmeb F cmeb R cmec F cmec R 5 - TAGCGGCGTAATAGTAAATAAAC ATAAAGAAATCTGCGTAAATAGGA AGGCGGTTTTGAAATGTATGTT TGTGCCGCTGGGAAAAG CAAGTTGGCGCTGTAGGTGAA CCCCAATGAAAAATAGGCAGAGTA-3 Her bir PCR karışımı, toplam 50 µl reaksiyon hacmi içinde 1x PCR buffer, 0.2 şer mm dntp ler, 1 mm MgCl 2, 1.25 ünite Taq DNA polimeraz, 50 şer pmol F ve R primerler ve 5 µl DNA template karışımından oluştu. PCR, 94 0 C de 7 dakika ön denatürasyon, 31 siklusluk 94 C de 1 dakika denaturasyon, cmea için C, cmeb için C, cmec için C de 1.5 dakika primer bağlanması, 72 C de 2.5 dakika uzama ve 72 C de 5 dakika son uzama basmaklarında gerçekleştirildi. Agaroz jel elektroforezde cmea 435 bp, cmeb 444 bp ve cmec 431 bp amlikonlar oluşturdular. cmeb geninin saptanması Bunun için; bakteri DNA sı kaynatma yöntemi ile elde edildi ve PCR için hazırlandı. Amplifikasyon için Cj0366c (cmeb) geni hedeflendi ve aşağıdaki dizini verilen 0366cF/0366cR primer çifti seçildi (Beilei ve ark. 2005). 0366cF 5 -GCAATGATGCAGTTCCAATT cR 5 -GCCTGTGATACTTAATCCAG -3 Her bir PCR karışımı, toplam 50 µl reaksiyon hacmi içinde 1x PCR buffer, 0.2 şer mm deoksinukleosid trifosfatlar, 2.5 mm MgCl 2, 1 ünite Taq DNA polimeraz, 1 er µm F ve R primerler ve 5 µl DNA template karışımından oluştu. PCR, 30 siklusluk 94 C de 1 dakika denaturasyon, 50 C de 1 dakika primer bağlanması, 72 C de 1 dakika uzama ve 72 C de 7 dakika son uzama basmaklarında gerçekleştirildi. Agaroz jel elektroforezde 1166 baz çiftlik amlikon bantı görülmesi gen varlığına işaret etti. 9

11 cmec geninin saptanması cmeabc operononda yer alan cmec genli aşağıdaki PCR protokolü ile belirlendi (Fakhr ve Logue, 2007). Bakteri DNA sı kaynatma yöntemi ile elde edildi. cmec geni integral fragmanını amplifiye etmek için aşağıda belirtilen primer çifti kullanıldı. Taq PCR master mix kiti ile uygulanan işlemde (QIAGEN) DNA templeyti olarak 3µl bakteri ekstraktı kullanıldı. PCR, 94 0 C de 5 dakika ön denatürasyon, 30 siklusluk 95 0 C de 1 dakika denaturasyon, 48 0 C de 1 dakika primer bağlanması, 72 C de 1 dakika uzama ve 72 C de 10 dakika son uzama basmaklarında gerçekleştirildi. Agaroz jel elektroforezde yaklaşık 500 bp amplikon gözlendi. cmec ileri cmec geri 5 -AGATGAAGCTTTTGTAAATT-3 5 -TATAAGCAATTTTATCATTT-3 Akümülasyon deneyi Efluks pompalarının varlığını fonksiyonel olarak göstermek için ethidium bromid akümülasyon deneyi uygulandı (Lin ve ark.2002). Ethidium bromid akümülasyonunu kantitatif olarak ölçmek için bakteri Mueller-Hinton agarda geç logaritmik faza kadar üretildi, santrifüj ile çöktürüldü, 15 mm PBS (ph 7.2) ile bir kez yıkandı ve PBS (ph 7.2) içinde 600A dalga bounda 0.2 optik dansiteye ayarlandı. Bakteriler 37 0 C de 10 dakika inkube edildikten sonra süspansiyona 2 µg/ml olacak şekilde ethidium bromid katıldı. Hücre süspansiyonunun florosansı spectroflorometre ile 530 nm ekzitasyon ve 600 nm emisyon dalga boylarında ölçüldü, ve hücre tarafından alınan ethidium bromid miktarının indikatörü olarak kullanıldı. Ethidium bromid ilavesinden 7 dakika sonra hücre süspansiyonuna son konsantrasyonu 200 µm olacak şekilde efluks pompa inhibitörü carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone (CCCP) katıldı. Aynı dalga boylarında ölçümler yapılarak relatif değerler belirlendi. (Campylobacter hücrelerinin doğal florosansını gözardı etmek için ethidium bromid ilavesinden önce ölçüm sıfır noktasına ayarlandı). Florokinolon Direnç Mekanizmasının Saptanması MAMA-PCR Campylobacter izolatlarında florokinolon dirençliliği ile ilişkili gyra geni QRDR (quinolone resistance determining region) mutasyonlarının tesbiti için MAMA (mismatch amplification mutation assay) PCR kullanıldı (Zirnstein ve ark. 1999). C.jejuni için reaksiyon 10

12 100 µl volumde 1x PCR master mixi içinde, 2 µl ekstrakte DNA örneği (yaklaşık 100 ng) ve 1 er µl (20 pmol lük) aşağıda gösterilen ileri (CampyMAMAgyrA1)ve geri (CampyMAMAgyrA5) primerlerin ilavesi ile gerçekleştirildi. İleri primer: CampyMAMAgyrA1 5 -TTT TTA GCA AAG ATT CTG AT- 3 Geri primer: CampyMAMAgyrA5 5 -CAA AGA TCA TAA ACT GCA A-3 Ek olarak gyra geninin varlığı aynı ileri primer (CampyMAMAgyrA1) ve farklı bir geri primer (GZgyrA4) kullanılarak PCR ile belirlendi. 2.Geri primer: GZgyrA4 5 -CAG TAT AAC GCA TCG CAG CG-3 Her iki PCR için reaksiyon koşulları; 94 C de 3 dakika denatürasyonu takiben 94 C de 30 saniye, 50 C de 30 saniye ve 72 C de 20 saniyelik 30 siklustan oluştu. C.coli de gyra mutasyonlarının tesbiti için, aşağıda belirtilen ileri (GZgyrACcoli3F) ve geri (CampyMAMAgyrA8) primerlerin ilavesi ile aynı reaksiyon karışımı hazırlandı (Zirnstein ve ark. 2000). İleri primer: GZgyrACcoli3F 5 -TAT GAG CGT TAT TAT CGG TC-3 Geri primer: CampyMAMAgyrA8 5 -TAA GGC ATC GTA AAC AGC CA-3 Ek olarak gyra geninin varlığı aynı ileri primer (GZgyrACcoli3F) ve farklı bir geri primer (CampyMAMAgyrA8) kullanılarak PCR ile belirlendi. 2.Geri primer: GZgyrACcoli4R 5 -GTC CAT CTA CAA GCT CGT TA-3 Heriki PCR protokolü yukarıda C.jejni için belirtilen ile aynı şekilde uygulandı. Amplifikasyondan sonra 5µl PCR ürünü %2 lik agaroz jele yüklendi ve 150 V da 1 saat elektroforezden sonra, ethidium brimid ile boyandı. C.jejuni gyra geni 368 baz çiftlik ve C.jejuni gyra mutasyonu 265 baz çiftlik bantlar ile belirlendi. C.coli gyra geni 505 baz çiftlik ve C.coli gyra mutasyonu 192 baz çiftlik bantlar ile belirlendi. Bu bulgular tek bazlık değişimden (ACA ATA) kaynaklanan Thr-86-İle mutasyonunu işaret etmektedir. DNA dizin analizi MAMA-PCR ile saptanan mutasyonların onaylanması için, mutasyon saptanan 5 ve saptanmayan 2 Campylobacter suşunun sekans analizleri yaptırıldı (İyontek, Refgen). Bu amaçla, C.jejuni için CampyMAMAgyrA1 ve GZgyrA4, C.coli için GZgyrACcoli3F ve 11

13 GZgyrACcoli4R primer çifti ile amplifiye edilen gyra geni QRDR sine ait PCR ürünleri kullanıldı. Plazmid ile ilişkili florokinolon dirençliliğinin araştırılması Campylobacter suşlarında plazmid ile taşınan kinolon direnç geni qnr PCR ile araştırıldı (Jacoby ve ark. 2003). Aşağıda belirtilen primer çifti kullanılarak PCR koşulları; 94 C 1 dak, 57 C 30 saniye ve 72 C 1 dakikalık 30 siklusla sağlandı. Elektroforez sonrasında genin varlığı 543 baz çiftlik bantın görülmesi ile anlaşıldı. Ayrıca qnr geninin varlığı, suşun plazmid içeriği ile karşılaştırılarak da değerlendirildi. QP1 5 - GATAAAGTTTTTCAGCAAGAGG - 3 QP2 5 - ATCCAGATCGGCAAAGGTTA - 3 Ciprofloksasin akümülasyon deneyi Siprofloksasin dirençliliğinde efluks pompalarının rolünü belilemek için akümülasyon deneyi yapıldı (Lin ve ark.2002). Bunun için suşlar Mueller-Hinton agarda geç logaritmik faza kadar üretildi, santrifüj ile çöktürüldü, 15 mm PBS (ph 7.2) ile bir kez yıkandı ve PBS (ph 7.2) içinde CFU/ml yoğunluğa ayarlandı. Bakteriler 37 0 C de 10 dakika inkube edildikten sonra süspansiyona 10 µg/ml olacak şekilde siprofloksasin katıldı ve periyodik aralıklarla süspansiyondan 0.5 ml örnekler alındı. Siprofloksasin ilavesinden 7 dakika sonra süspansiyonun yarısına, son konsantrasyonu 200 µm olacak şekilde CCCP katıldı ve süspansiyonun diğer yarısı kontrol olarak bırakıldı. Florosans ölçümleri her iki fraksiyonda 20. dakikaya kadar sürdürüldü. Değişik zamanlarda toplanan herbir örnek 2.5 ml soğuk PBS içine alındı ve 4 0 C de 6000 g de 5 dakika santrifüj edildi. Pelet 2 ml soğuk PBS ile bir kez yıkandı, 2 ml 0.1 M glisin hidroklorid (ph 3.0) içinde süspanse edildikten sonra 25 0 C de 15 saat çalkalandı. Örnekler 6000 G de 15 dakika santrifüj edildi. Süpernatantın florosansı spectroflorometre ile 297 nm ekzitasyon ve 447 nm emisyon dalga boylarında ile ölçüldü. Süpernatanttaki siprofloksasin konsantrasyonu 0.1 M glisin hidroklorid (ph 3.0) içindeki siprofloksasin standart eğrisi ile karşılaştırılarak hesaplandı. Sonuç bakterinin 1 mg yaş ağırlığında nanogram cinsinden siprofloksasin miktarı olarak verildi. Kanamisin Direnç Geninin Saptanması Kanamisin dirençli izolatlarda apha-3 geni Gibreel ve ark. (2004) tarafından bildirilen PCR amplifikasyonu ile saptandı. Amplifikasyon için aşağıda açık dizini belirtilen apha-3 F 12

14 ve apha-3 Rprimerleri kullanıldı (Trieo-Cuot ve ark. 1985). PCR miksine template olarak 100 ng plazmid DNA sı veya total DNA katıldı ve reaksiyon 50 µl toplam hacımda gerçekleştirildi. Herbiri 95 0 C de 30 saniye denatürasyon, 55 0 C de 1dakika anneling ve72 0 C de 1dakika uzama aşamalarından oluşan 30 siklus gerçekleştirildi. Yaklaşık 600 bp lik bir amplikon, pozitif sonuç olarak değerlendirildi. Her reaksiyonda pozitif ve negatif kontroller kullanıldı. apha-3 F 5 - GGGACCACCTATGATGTGGAACG -3 apha-3 R 5 - CAGGCTTGATCCCCAGTAAGTC -3 Tetrasiklin Direnç Geninin Saptanması İncelenen izolatlarda teto geni Gibreel ve ark.(2004) tarafından bildirilen PCR amplifikasyonu ile saptandı. Template olarak plazmid DNA sı, total DNA ve kaynatılmış tüm hücre kullanıldı. Plazmid DNA sı yukarıda açıklandığı gibi Qiagen mini ve midi plazmid izolasyon kitleri, total DNA Qiagen DNA izolasyon kiti ile elde edildi. Kaynatılmış tüm hücreler bir öze dolusu koloninin 100 µl tris-edta buffer içinde kaynatılmasından sonra, santrifüjlenmesi ve üst sıvının toplanması ile elde edildi. TetO gen amplifikasyonunda aşağıda açık dizini verilen DMT1 ve DMT2 primerleri seçildi. Reaksiyon miksi 0.5 er µm primer, 200 µm dntp ler, 1x reaksiyon tamponu (50 µm KCl, 10 mm Tris-HCl [ph 8.3], 1.5 mm MgCl 2 ), %0.01 jelatin, 1 U Taq polimeraz ve yukarıda belirtilen template DNA lardan oluştu. PCR 1 dak 95 0 C de ön denatürasyonu takiben 30 siklusta (95 0 C 1 dak, 50 0 C 1 dak, 72 0 C bir dak) gerçekleştirildi. Elektroforez sonunda 559 bp amplikon teto genini gösterdi. DMT1 5 - GGCGTTTTGTTTATGTGCG 3 DMT2 5 - ATGGACAACCCGACAGAAGC 3 Yüksek düzeyde tet dirençli suşlardan elde edilen plazmidlerde tetm geni aşağıdaki CAT5 ve CAT6 primerleri ile arandı. CAT5 5 - TATATGAATTCAATGAAAATTATTAATATTGGAG -3 CAT6 5 - TATATGGATCCACTAAGTTATTTTATTGAAC -3 Eritromisin Direnci ile İlişkili Mutasyonların Analizi Campylobacter suşlarında 23S rrna geninde eritromisin direnci ile ilgili mutasyonların saptanması için (Alonso ve ark.2005) tarafından bildirilen MAMA-PCR yöntemi kullanıldı. A2075G mutasyonunu saptamak için 23SrRNA-F ileri primeri ERY

15 R geri mutasyon primeri ile, A2074C mutasyonunu saptamak için 23SrRNA-F ileri primeri ERY2074-R geri mutasyon primeri ile ile birlikte kullanıldı. Hedeflenen gen bölgesinin kontrolü için ayrıca 23SRNA-F primeri 23SRNA-R ile de reaksiyona sokuldu. 23SRNA-F 5 -TTAGCTAATGTTGCCCGTACCG -3 23SRNA-R 5 -AGCCAACCTTTGTAAGCCTCCG -3 ERY2075-R 5 -TAGTAAAGGTCCACGGGGTCGC -3 ERY2074-R 5 -AGTAAAGGTCCACGGGGTCTGG -3 PCR, 25 µl reaksiyon karışımı içinde;1xpcr tamponu (10 mm Tris HCl, 1.5 mm MgCl 2, 50 mm KCl, ph 8.3), 1.5 mm MgCl 2 ; 80 ng genomik DNA, 0.2 er µm primerler, 0.2 mm DNTP miski ve 1 U Taq polimeraz ile reaksiyon gerçekleştirildi. Reaksiyon aşamaları, 94 0 C de 5 dakika ön denaturasyon, 94 0 C de 30 saniye, 59 0 C de 30 saniye ve 72 0 C de 45 saniyelik 30 siklus, ve 72 0 C de 5 dakikalık son uzama şeklinde uygulandı. PCR ürünleri agaroz jel elektroforez sonrasında ethidium bromid boyama ile izlendi. ERY2075-R ve ERY2074-R mutasyon primerlerinin her biri ile uygulanan PCR sonucunda 485 bp uzunluğunda amplikonlar arandı. Hedef bölgenin kontrolü için 23SRNA primerleri ile uygulanan reaksiyonda 697 bp uzunluğunda amplikon beklendi. Enterobakterilerin İzolasyonu ve İdentifikasyonu Toplanan hayvan dışkılarından McConkey agar ve EMB agar besiyerlerine ekimler yapıldı. Salmonella bulunma olası görülen örnekler ayrıca, Brilliant Green Agara ekildi. Besiyerleri aerobik ortamda 37 0 C de saat bekletildi. İnkubasyon süresi sonunda üreme görülen indikatörlü besiyerlerindeki koloni özellikleri incelendi ve en baskın koloni tipi seçilerek kanlı agara pasajları yapıldı. Bu kolonilerden Gram yöntemi ile boyama, hareket muayenesi, oksidaz, katalaz, glukoz O/F ve nitrat testleri yapıldı. Tüm izolatlara üçlü tüp yöntemi uygulandı. Ayrıca, izolatların Genus düzeyinde identifikasyonu için Farmer (2005) tarafından bildirilen screening testleri uygulandı. İzole edilen suşlar Brain-Heart İnfusion buyyon içinde C de saklandı. Antimikrobiyal Duyarlılık Testleri Enterobakteri antimikrobiyal duyarlılık testleri Enterobakteri suşlarının antimikrobiyal duyarlılıkları, Klinik ve Laboratuvar Standartları Enstitüsü (Clinical and Laboratory Standards Institute, 2006, M31-A2 ) prosedürüne uygun olarak, küçük modifikasyonla agar-dilusyon yöntemi ile incelendi. Özetle; 14

16 incelenen suşa ait birkaç koloni Mueller-Hinton buyyona ekilerek aerobik ortamda 2-6 saat üretildi. Süre sonunda bakteri yoğunluğu steril tuzlu su ile McFarland bulanıklık standartı 0.5 e ayarlandı (yaklaşık 1.5 x 10 8 cfu/ml). Bakteri süspansiyonu steril tuzlu su ile 1/10 oranında dilue edildi (yaklaşık 10 7 cfu/ml). Antibiyotiklerin iki katlı sulandırmalarını içeren Mueller-Hinton agara, hazırlanan bakteri süspansiyonundan replikatör vasıtasıyla 2 µl miktarında ekimler yapıldı. İnokulumun kuruması için oda ısısında 10 dakika bekletildi. Kültürler aerobik ortamda saat inkube edildi. Besiyerinde üremenin görülmediği en düşük dilusyon MIC (minimal inhibitory concentration) olarak belirlendi. Tüm testlerde Escherichia coli ATCC ve Klebsiella pneumoniae ATCC suşları kontrol olarak kullanıldı. Çalışmada ampisilin, siprofloksasin, enrofloksasin, nalidiksik asit, eritromisin, gentamisin, tetrasiklin, streptomisin ve kloramfenikolün µg/ml, sulfametoksazolün µg/ml arasındaki iki katlı dilusyonları incelendi. Suşların duyarlı ve dirençli olarak değerlendirilmelerinde aşağıdaki eşik değerleri temel alındı (Clinical and Laboratory Standards Institute, 2006, M100-S16). Beta-laktam grubu: Ampisilin; dirençli > 32 µg/ml, duyarlı < 8 µg/ml, intermedier 16 µg/ml. Aminoglikozid grubu: Streptomisin; dirençli > 64 µg /ml, duyarlı 32 µg/ml. Gentamisin; dirençli > 16 µg /ml, duyarlı 4 µg/ml, intermedier 8 µg/ml. Kanamisin; dirençli > 64 µg/ml, duyarlı 8 µg/ml. Makrolid grubu: Eritromisin; dirençli > 8 µg/ml, duyarlı < 0.5 µg/ml, intermedier 1-2 µg/ml Florokinolon grubu: Siprofloksasin; dirençli > 4 µg/ml, duyarlı < 1 µg/ml, intermedier 2 µg/ml. Nalidiksik asit; dirençli > 32 µg/ml, duyarlı < 8 µg/ml, intermedier 16 µg/ml. Tetrasiklin grubu: Tetrasiklin dirençli > 16 µg/ml, duyarlı < 4 µg/ml, intermedier 8 µg/ml. Kloramfenikol; dirençli > 32 µg/ ml, duyarlı < 8 µg/ml, intermedier 16 µg/ml Sulfonamid grubu: Sulfametoksazol; dirençli > 512 µg/ml, duyarlı < 256 µg/ml. Enterobakterilerde çoklu antibiyotik dirençliliğinin değerlendirilmesi Beta-laktam, aminoglikozid, makrolid, florokinolon, tetrasiklin, kloramfenikol veya sulfonamid gruplarından 3 veya daha fazlasına karşı direnç saptanan suşlar çoklu dirençli 15

17 olarak kabul edildi. Bir gruptaki en az bir antibiyotiğe karşı direncin görülmesi, bakterinin o gruba dirençli olarak kabul edilmesi için yeterli oldu. İntegronların Saptanması Enterobakteri izolatlarında integronların ve gen kasetlerinin saptanması için Sınıf 1 integraz geni inti1 ve Sınıf 2 integraz geni inti2 yi hedef alan PCR uygulamaları yapıldı. inti1 pozitif suşları saptamak için kullanılan HS 463a ve HS 464 primerleri ile inti2 pozitif suşları saptamak için kullanılan RB 201 ve RB 202 primerleri aşağıda gösterilmiştir (Barlow ve ark. 2004). HS 463a HS 464 RB 201 RB CTGGATTTCGATCACGGCACG-3 5 -ACATGCGTGTAAATCATCGTCG-3 5 -GCAAACGCAAGCATTCATTA-3 5 -ACGGATATGCGACAAAAAGG-3 PCR, 2 µl of örnek DNA, 1.0 µm her bir primer, 200 µm DNTP ler, 10 mm Tris-HCl, 1.5 mm MgCl 2, 50 mm KCl ve 1 U Taq polimeraz içeren 25 µl reaksiyon karışımında gerçekleştirildi. PCR 94 C 30 saniye, 65 C (inti1) veya 62 C (inti2) 30 saniye, ve 72 C 45 saniye 30 siklusluk koşullarda uygulandı. PCR ürünleri agaroz jel elektroforezden sonra ethidium bromide boyama ile görüntülendi. Sınıf 1 integronların içindeki gen kasetlerinin boyutunu saptamak için, gen kasetlerine spesifik primer seçildi (Barlow ve ark. 2004). Sınıf 1 gen kaseti için kullanılan RB317 ve RB320 primer çiftinin dizini aşağıda gösterilmiştir. RB 317 RB GAACCTTGACCGAACGCAG-3 5 -AGCTTAGTAAAGCCCTCGCTAG-3 PCR 94 C 30 saniye, 59 C 30 saniye ve 72 C 3 dakika, 30 siklusluk koşullarda uygulandı. Plazmid İzolasyonu İncelenen Enterobakteri suşlarından Mini ve Midi plazmid kitleri ile izolasyon yapıldı (Qiagen). Plazmid izolasyonunda üretici firma tarafından önerilen protokol uygulandı. Plazmid büyüklükleri agaroz jel elektroforez ile, miktarları bir spektrofotometre (Nanodrop) ile saptandı. 16

18 Efluks Mekanizmasının Saptanması Çoklu antibiyotik dirençli enterobakteri suşlarında ve kontrol için çoğul dirençli olmayan suşlarda efluks pompası in vitro akumulasyon deneyi ile saptandı (Lin ve ark.2002). Efluks pompalarının varlığını fonksiyonel olarak göstermek için ethidium bromid akümülasyon deneyi uygulandı. Ethidium bromid akümülasyonunu kantitatif olarak ölçmek için bakteri Mueller-Hinton agarda geç logaritmik faza kadar üretildi, santrifüj ile çöktürüldü, 15 mm PBS (ph 7.2) ile bir kez yıkandı ve PBS (ph 7.2) içinde 600A dalga bounda 0.2 optik dansiteye ayarlandı. Bakteriler 37 0 C de 10 dakika inkube edildikten sonra süspansiyona 2 µg/ml olacak şekilde ethidium bromid katıldı. Hücre süspansiyonunun florosansı spectroflorometre ile 530 nm ekzitasyon ve 600 nm emisyon dalga boylarında ölçüldü, ve hücre tarafından alınan ethidium bromid miktarının indikatörü olarak kullanıldı. Ethidium bromid ilavesinden 7 dakika sonra hücre süspansiyonuna son konsantrasyonu 200 µm olacak şekilde efluks pompa inhibitörü carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone (CCCP) katıldı. Aynı dalga boylarında ölçümler yapılarak relatif değerler belirlendi. (Enterobakteri hücrelerinin doğal florosansını gözardı etmek için ethidium bromid ilavesinden önce ölçüm sıfır noktasına ayarlandı). Florokinolon Direnç Mekanizmasının Saptanması MAMA-PCR Escherichia izolatlarında florokinolon dirençliliği ile ilişkili gyra geni QRDR (quinolone resistance determining region) ve parc mutasyonlarının tesbiti için MAMA (mismatch amplification mutation assay) PCR kullanıldı (Qiang ve ark. 2002). Her iki gen için uygulanan PCR da bir ileri primer (WPgyrA ve WPparC) ve bir MAMA geri primer (gyra genindeki ser-83 değişimi için MAMAgyrA83, asp-87 değişimi için MAMAgyrA87 primeri; parc genindeki Ser-80 değişimi için MAMAparC80 primeri, Glu-84 değişimi için MAMAparC84 primeri kullanıldı. Ayrıca internal kontrol olarak gyra için ControlgyrA geri primeri, parc PCR için ControlparC geri primeri PCR içinde yer aldı. WPgyrA 5 - GACCTTGCGAGAGAAATTACAC 3 MAMAgyrA TCGTGTCATAGACCGGGC 3 MAMAgyrA GCGCCATGCGGACGATCGTTTC 3 ControlgyrA 5 - GATGTTGGTTGCCATACCTACG 3 17

19 WPparC 5 - CGGAAAACGCCTACTTAAACTA 3 MAMAparC ATCGCTTCATAACAGGCCGGGC 3 MAMAparC CCATCAGGACCATCTCCGC 3 ControlparC 5 - GTGCCGTTAAGCAAAATGT 3 Herbir PCR 50 µl toplam hacim içinde 1 µl örnek DNA, 0.35 µl ileri primer, 0.20 µl MAMA primer, 0.10 µl kontrol primer, 5 µl 10x Taq buffer, 200 er µm DNTP ler, 1.5 U Taq DNA polimeraz ile gerçekleştirildi. Reaksiyon, 94 0 C de 5 dakika ön denatürasyon, 94 0 C de 40 saniye, 54 0 C de 40 saniye, 72 0 C de 40 saniyelik 35 siklus, ve 72 0 C de 5 dakikalık son aşamadan oluştur. Jel elektroforez ve ethidium bromid boyamadan sonra oluşan bantlar değerlendirildi. gyra geni için, sadece 540 bp bant izlenmesi C248T, G259A, A260G mutasyonlarını işaret ederken, 540/249 veya 540/274 bp lik iki bantın izlenmesi bu mutasyonların oluşmadığını gösterdi. parc geni için, sadece 446 bp bant izlenmesi A238C, G239T, G250A, A251G mutasyonlarını işaret ederken, 446/217 veya 446/238 bp lik iki bantın izlenmesi bu mutasyonların oluşmadığını gösterdi. Plazmid ile ilişkili florokinolon dirençliliğinin araştırılması Enterobakteri suşlarında plazmid ile taşınan kinolon direnç geni qnr PCR ile araştırıldı (Jacoby ve ark. 2003). Aşağıda belirtilen primer çifti kullanılarak PCR koşulları; 94 C 1 dak, 57 C 30 saniye ve 72 C 1 dakikalık 30 siklusla sağlandı. Elektroforez sonrasında genin varlığı 543 baz çiftlik bantın görülmesi ile anlaşıldı. Ayrıca qnr geninin varlığı, suşun plazmid içeriği ile karşılaştırılarak da değerlendirildi. Ciprofloksasin akümülasyon deneyi Siprofloksasin dirençliliğinde efluks pompalarının rolünü belilemek için akümülasyon deneyi yapıldı (Lin ve ark 2002). Bunun için suşlar Mueller-Hinton agarda geç logaritmik faza kadar üretildi, santrifüj ile çöktürüldü, 15 mm PBS (ph 7.2) ile bir kez yıkandı ve PBS (ph 7.2) içinde CFU/ml yoğunluğa ayarlandı. Bakteriler 37 0 C de 10 dakika inkube edildikten sonra süspansiyona 10 µg/ml olacak şekilde siprofloksasin katıldı ve periyodik aralıklarla süspansiyondan 0.5 ml örnekler alındı. Siprofloksasin ilavesinden 7 dakika sonra süspansiyonun yarısına, son konsantrasyonu 200 µm olacak şekilde CCCP katıldı ve süspansiyonun diğer yarısı kontrol olarak bırakıldı. Florosans ölçümleri her iki fraksiyonda 20. dakikaya kadar sürdürüldü. Değişik zamanlarda toplanan herbir örnek 2.5 ml soğuk PBS içine alındı ve 4 0 C de 6000 g de 5 dakika santrifüj edildi. Pelet 2 ml soğuk PBS ile bir kez 18

20 yıkandı, 2 ml 0.1 M glisin hidroklorid (ph 3.0) içinde süspanse edildikten sonra 25 0 C de 15 saat çalkalandı. Örnekler 6000 G de 15 dakika santrifüj edildi. Süpernatantın florosansı spectroflorometre ile 297 nm ekzitasyon ve 447 nm emisyon dalga boylarında ile ölçüldü. Süpernatanttaki siprofloksasin konsantrasyonu 0.1 M glisin hidroklorid (ph 3.0) içindeki siprofloksasin standart eğrisi ile karşılaştırılarak hesaplandı. Sonuç bakterinin 1 mg yaş ağırlığında nanogram cinsinden siprofloksasin miktarı olarak verildi. 19

21 IV. ANALİZ VE BULGULAR Campylobacter Suşları Ankara ili ve çevresindeki tavukçuluk, sığırcılık ve koyunculuk işletmelerinde ve küçük hayvan barınaklarında yaşayan hayvanlardan; ayrıca, Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Mikrobiyoloji Anabilim Dalına ve Kliniklerine getirilen hayvanlardan toplanan dışkı ve rektal kazıntı örneklerinden toplam 248 termofilik Campylobacter suşu izole edildi. Bu izolatların 115 i tavuklardan, 55 i koyunlardan, 32 si sığırlardan ve 46 sı köpeklerden sağlandı. İzole edilen termofilik Campylobacter suşlarının fenotipik özelliklerine göre identifikasyonu sonucunda 190 ının C.jejuni, 58 inin C.coli olduğu belirlendi. Bu bulguların onaylanması amacıyla bakteri kültürlerine uygulanan PCR sonucunda C.jejuni için 344 bp, C.coli için 500 bp bantların görülmesi ile identifikasyon kesinlik kazandı. Calışmada kullanılan termofilik Campylobacter türlerinin hayvan kökenlerine göre dağılımı Tablo 1 de gösterilmiştir. Tablo 1. Calışmada kullanılan termofilik Campylobacter türlerinin hayvan kökenlerine göre dağılımı C.jejuni C.coli Toplam Tavuk Koyun Sığır Köpek Toplam Campylobacter Suşlarının Antibiyotik Duyarlılıkları Ampisilin, siprofloksasin, nalidiksik asit, eritromisin, gentamisin, kanamycin, tetrasiklin, streptomisin ve kloramfenikolün µg/ml, sulfametoksazolün µg/ml arasındaki iki katlı konsantrasyonlarının izole edilen Campylobacter suşları için MIC değerleri agar dilusyon yöntemi ile incelendi. Gereç ve Yöntem bölümünde verilen eşik değerleri temel alınarak duyarlı ve dirençli suş sayıları belirlendi. Çalışmada kullanılan antibiyotiklere dirençli C.jejuni ve C.coli suşlarının sayıları Tablo 2 de, hayvan türüne göre dirençlilik oranları Tablo 3 de ve Grafik 1-6 da gösterilmiştir. 20

22 Tablo 2. C.jejuni ve C.coli nin antibiyotik dirençlilik özellikleri. Tür Hayvan Dirençli Suş Sayısı(%) amp str gen kan eri cip nal klo tet sul Tavuk (82) C. jejuni Sığır (25) Koyun (42) Köpek (41) TOPLAM (190) 52 (27.4) 102 (53.7) 13 (6.8) 69 (36.3) 24 (12.6) 97 (51.1) 111 (58.4) 8 (4.2) 55 (28.9) 64 (33.7) Tavuk (33) C. coli Sığır (7) Koyun (13) Köpek (5) _ TOPLAM (58) 19 (32.7) 30 (51.7) 4 (6.9) 23 (39.7) 20 (34.9) 41 (70.7) 43 (74.1) 2 (3.4) 24 (41.4) 19 (32.8) amp, ampisilin; str, streptomisin; gen, gentamisin; kan, kanamisin; eri, eritromisin; sip, siprofloksasin; nal, nalidiksik asit; tet, tetrasiklin; sul, sulfametaksazol 21

23 Tablo 3.Hayvan türlerinde belirlenen Campylobacter antibiyotik direnç oranları Hayvan Tavuk (115) Dirençli Suş Sayısı(%) amp str gen kan eri cip nal klo tet sul _ (33.9) (40.0) (3.5) (33) (17.4) (81.7) (87.8) (46.1) (30.4) Koyun (55) 10 (18.2) 41 (74.5) 2 (3.6) 23 (41.8) 9 (16.4) 13 (23.6) 18 (32.7) 7 (12.7) 11 (20.0) 21 (38.2) Sığır (32) 9 (28.1) 23 (71.9) 4 (12.5) 14 (43.7) 9 (28.1) 17 (53.1) 20 (62.5) 3 (9.4) 7 (21.9) 12 (37.5) Köpek (46) 13 (28.3) 22 (47.8) 7 (15.2) 17 (36.9) 6 (13) 14 (30.4) 15 (32.6) _ 8 (17.4) 15 (32.6) Toplam (248) 71 (28.6) 132 (53.2) 17 (6.9) 92 (37.1) 44 (17.7) 138 (55.6) 154 (62.1) 10 (40.0) 79 (31.8) 83 (33.5) amp, ampisilin; str, streptomisin; gen, gentamisin; kan, kanamisin; eri, eritromisin; sip, siprofloksasin; nal, nalidiksik asit; tet, tetrasiklin; sul, sulfametaksazol Genelde, termofilik Campylobacter in ampisilin, streptomisin, gentamisin, kanamisin, eritromisin, siprofloksasin, nalidiksik asit, kloramfenikol, tetrasiklin ve sulfametaksazole karşı %28.6, %53.2, %6.9, %37.1, %17.7, %55.6, %62.1, %40, %31.8 ve %33.5 oranında dirençli oldukları saptandı. Termofilik Campylobacter türlerinin antibiyotiklere dirençliliği karşılaştırıldığında, C.jejuni ve C.coli suşlarının dirençliliği sırasıyla; ampisilin için %27.4 ve %32.7, streptomisin için %53.7 ve %51.7, gentamisin için %6.8 ve %6.9, kanamasin için %36.3 ve %39.7, eritromisin için %12.6 ve %34.9, siprofloksasin için %51.1 ve %70.7, nalidiksik asit için %58.4 ve %74.1, kloramfenikol için %4.2 ve %3.4, tetrasiklin için %28.9 ve %41.4, sulfametaksazol için %33.7 ve %32.8 olarak bulundu (Tablo 2). Buna göre, C.coli suşlarının eritromisin, siprofloksasin, nalidiksik asit ve tetrasikline, C.jejuni suşlarına göre daha dirençli oldukları belirlendi. Makrolid grubu antibiyotiklerden eritromisine karşı en yüksek düzeyde dirençlilik (%28.1) sığır suşlarında bulundu (tüm türler ortalaması %17.7). Kinolon grubu antimikrobiyallerden siprofloksasin dirençliliği tavuk ve koyun suşlarının sırasıyla %81.7 ve %23.6 sında; nalidiksik asit dirençliliği saırasıyla %87.8 ve %32.7 sinde belirlendi. Tavuk ve köpek suşları arasında kloramfenikole karşı direnç görülmezken, koyun ve sığır suşlarında %12.7 ve %9.4 dirençlilik görüldü. Tavuk suşlarında tetrasikline karşı %46.1, köpek suşlarında %17.4 oranında direnç gözlendi (tüm türler ortalaması %31.8). 22

24 ,9 28,1 28, , Tavuk Koyun Sığır Köpek Grafik 1. Hayvanlarda ampisilin dirençli Campylobacter suşlarının oranları ,5 71, ,8 43,7 47,8 36,9 STR GEN 30 KAN ,5 15,2 3,5 3,6 Tavuk Koyun Sığır Köpek Grafik 2. Hayvanlarda streptomisin (str), gentamisin (gen) ve kanamisin (kan) dirençli Campylobacter suşlarının oranları. 23

25 ,1 21, ,4 Tavuk Koyun Sığır Köpek tet Grafik 3. Hayvanlarda tetrasiklin dirençli Campylobacter suşlarının oranları ,8 81,7 62,5 53,1 37,2 30,4 32,6 23,6 Tavuk Koyun Sığır Köpek cip nal Grafik 4. Hayvanlarda siprofloksasin ve nalidiksik asit dirençli Campylobacter suşlarının oranları. 24

26 30 28, ,4 16,4 13 eri 0 Tavuk Koyun Sığır Köpek Grafik 5. Hayvanlarda eritromisin dirençli Campylobacter suşlarının oranları ,7 9,4 6 klo Tavuk Koyun Sığır Köpek 0 Grafik 6. Hayvanlarda kloramfenikol dirençli Campylobacter suşlarının oranları. Denenen tüm antibiyotiklere karşı, farklı hayvan türlerinin dirençlilik oranlarının ortalamaları alındığında, genelde tavuk kökenli termofilik Campylobacter suşlarının en dirençli suşlar olduğu (%37.4), bunu sığır (%36.9) ve köpek (%33.1) suşlarının takip ettiği, en düşük düzeyde dirençliliğin ise koyun (%28.2) suşlarında görüldüğü anlaşıldı. 25

27 MIC Dağılımı, MIC50 ve MIC90 Değerleri Tablo 4. Antibiyotiklerin C.jejuni ve C.coli suşları için MIC değerlerinin kümülatif dağılımı. Antibiyotikler Ampisilin Streptomisin Gentamisin Kanamisin Eritromisin Siprofloksasin Nalidiksik Asit Kloramfenikol Tetrasiklin MIC mcg/ml Suş < > 1024> C. jejuni C. coli C. jejuni C. coli C. jejuni C. coli C. jejuni C. coli C. jejuni C. coli C. jejuni C. coli C. jejuni C. coli C. jejuni C. coli C. jejuni C. coli C. jejuni Sülfametoksazol C. coli

28 Tablo 5. Antibiyotiklerin C.jejuni ve C.coli suşları için MIC aralıkları, MIC50 ve MIC90 değerleri Antibiyotikler Tür MIC Aralığı (mcg/ml) MIC 50 (mcg/ml) MIC 90 (mcg/ml) Tetrasiklin Kloramfenikol Streptomisin Gentamisin Eritromisin Ampisilin Siprofloksasin Nalidiksik Asit Kanamisin Sülfametoksazol C. jejuni < > 2 64 C. coli < > 8 64 C. jejuni < C. coli < C. jejuni C. coli 2-512> C. jejuni < C. coli < > C. jejuni < C. coli < > C. jejuni < C. coli < > C. jejuni < > 4 64 C. coli < > C. jejuni 1-512> C. coli 1-512> > C. jejuni < > 8 64 C. coli < > C. jejuni > > C. coli > > Antibiyotiklerin C.jejuni ve C.coli suşları için MIC değerlerinin kümülatif dağılımı Tablo 4 de, C.jejuni ve C.coli suşları için MIC aralıkları, MIC50 ve MIC90 değerleri Tablo 5 de gösterilmiştir. 27

29 Campylobacter Çoklu Antibiyotik Dirençliliği Beta-laktam, aminoglikozid, makrolid, florokinolon, tetrasiklin, kloramfenikol veya sulfonamid gruplarından 3 tanesine veya daha fazlasına karşı direnç saptanan suşlar çoklu dirençli olarak kabul edildi. Bir gruptaki en az bir antibiyotiğe karşı direncin görülmesi, bakterinin o gruba dirençli olarak kabul edilmesi için yeterli oldu. Örneğin ampisilin, streptomisin ve siprofloksasine karşı dirençli bulunan bir suş çoklu antibiyotik dirençli olarak değerlendirildi (burada streptomisin amino glikozid grubunu, siprofloksasin ise kinolon grubunu temsil etmektedir). Buna karşın bir suş streptomisin, gentamisin, kanamisin, siprofloksasin ve nalidiksik asite dirençli bulunsa bile çoklu antibiyotik dirençli olarak kabul edilmedi (buradaki 5 antibiyotik toplam iki grubu temsil etmektedir). İncelenen 248 termofilik Campylobacter suşunun 73 ünde (%29.4), çoklu antibiyotik dirençliliği ile ifade edilen, farklı gruplardan 3 veya daha fazla antibiyotiğe dirençlilik bulundu (Tablo 6). Çoklu antibiyotik dirençliliği C.jejuni suşlarının 51 inde (%26.8) izlenirken, bu sayı C.coli suşlarında 22 (%37.9) oldu. Değişik hayvan türlerinden izole edilen suşların çoklu antibiyotik dirençlilik oranları arasında da farklılıklar bulundu. Tavuklara ait 49 (%42.6) suş, koyunlara ait 6 (%10.9) suş, sığırlara ait 7 (%21.9) suş ve köpeklere ait 11 (%23.9) suş çoklu antibiyotik dirençli kategorisine girdi. Tablo 6. Campylobacter türlerinde ve farklı hayvan türlerinde izlenen çoklu antibiyotik dirençliliği. Tavuk (115) Koyun (55) Sığır (32) Köpek (46) TOPLAM C.jejuni (190) C.coli (58) TOPLAM Çoklu antibiyotik dirençlilik profilleri değerlendirildiğinde üç antibiyotiğe dirençli 40 izolat, dört antibiyotiğe dirençli 19 izolat, beş antibiyotiğe dirençli 11 izolat ve 6 antibiyotiğe dirençli 6 suş belirlendi. Çoklu dirençli izolatlarda kinolon + aminoglokozid + beta laktam, kinolon + aminoglikozid + sulfanomid, kinolon + beta laktam + sulfonamid kmobinasyonlarına dirençlilik en sık rastlanan profiller oldu. 28

30 Campylobacter Suşlarında İntegron Sıklığı Integraz geninin PCR amplifikasyonu ile ortaya konan tip 1 integron varlığı incelenen 248 Campylobacter suşunun 83 ünde (%33.5) bulundu (Tablo 7). İncelenen izolatların hiçbirinde tip 2 integrona rastlanmadı. Sınıf 1 integron varlığı 190 C.jejuni suşunun 39 unda (%20.5), 58 C.coli suşunun 20 sinde (%34.5) saptandı. Hayvan türleri içinde, integron taşıyan suşların çoğunluğu (%51.3) tavuklardan izole edildi. Koyun, sığır ve köpek suşlarında integron taşıyıcılık oranları sırasıyla %10.9, %12.5 ve %30.4 olarak bulundu. Sınıf 1 integron varlığı saptanan 83 suşun 81 inde (%97.5) sul geninin varlığı da saptandı. İntegron pozitif suşların tümünün çoklu antibiyotik direnç özelliğine sahip olduğu belirlendi. Saptanan integronlar gen kasetleri yönünden değerlendirildiğinde, 800 bp üzeri amplikon veren 80 integron saptandı. Bu grup içindeki amplikonların uzunluğu 800 bp ile 2.1 kb arasında değişti. Bu bantlara göre 14 farklı kaset profili belirlendi. Tablo 7. Sınıf 1 integraz geni taşıyan Campylobacter suşlarının C.jejuni, Coli ve farklı hayvan türlerindeki dağılımı. Tavuk (115) Koyun (55) Sığır (32) Köpek (46) TOPLAM C.jejuni (190) C.coli (58) TOPLAM Campylobacter Suşlarında Plazmid Sıklığı İncelenen 248 Campylobacter suşunun 97 sinde (%39.1) plazmid varlığı saptandı (Tablo 8). Bulunan plazmidlerin boyutları 3-80 kb arasında değişti. Plazmid saptanan suşların 24 ünde birden fazla plazmid bulundu. Plazmid varlığı 190 C.jejuni suşunun 48 inde (%25.3), 58 C.coli suşunun 23 ünde (%39.7) saptandı. Hayvan türleri içinde, plazmid taşıyan suşların çoğunluğu (%61.7) tavuklardan izole edildi. Koyun, sığır ve köpek suşlarında plazmid taşıyıcılık oranları sırasıyla %18.2, %21.9 ve %19.6 olarak bulundu. 29

31 Tablo 8. Plazmid taşıyan Campylobacter suşlarının C.jejuni, Coli ve farklı hayvan türlerindeki dağılımı. Tavuk (115) Koyun (55) Sığır (32) Köpek (46) TOPLAM C.jejuni (190) C.coli (58) TOPLAM Campylobacter Suşlarında Efluks Pompalarının Genetik Analizi Effluks pompaları ile ilgili cmeabc operonu incelenen suşların 153 ünde (%61.7) saptandı. Bu operona C.jejuni suşlarının 146 sında (%76.8), C.coli suşlarının 7 sinde (%12.1) rastlandı. Bulunan dağılımın dengesiz olması nedeniyle cmeb ve cmec genleri farklı primer ve PCR protokolleri ile tekrar incelendi. Bu protokoller ile yapılan inceleme sonucunda incelenen tüm Campylobacter izolatlarının cmeabc genlerine sahip olduğu anlaşıldı. Campylobacterlerde Ethidium Bromid Akümülasyonu İncelenen suşlarda cmeabc geni ile ilişkili efluks pompalarının ifade edilip edilmediğini belirlemek için in vitro ethidium bromid akümülasyon deneyleri yapıldı. Deneyler sonucunda, bir efluks pompa inhibitörü olan CCCP nin hücre içi ethidium bromid akümülasyonuna neden olduğu belirlendi ve incelenen suşlarda eflluks pompalarının aktif olarak çalıştığı anlaşıldı. Campylobacter Suşlarında Kinolon Direnç Mekanizmaları Mutasyon analizi Campylobacter izolatlarında florokinolon dirençliliği ile ilişkili gyra geninin QRDR (quinolone resistance determining region) bölgesindeki mutasyonları tesbit etmek için MAMA (mismatch amplification mutation assay) PCR kullanıldı. Mutasyonların saptanmasından önce gyra geninin varlığını göstermek için bu geni hedef alan PCR uygulandı. Bu PCR sonusunda, incelenen tüm suşlarda gyra geninin bulunduğu onaylandı. MAMA-PCR sonucunda Campylobacter suşlarının 27 sinde (%10.9) Thr-86-İle mutasyonu saptandı. Mutasyon saptanan bu 28 suşun tümü antimikrobiyal duyarlılık 30