TÜBERKÜLOZ TANI VE TAKİBİNDE MİKROBİYOLOJİ LABORATUARLARININ YERİ,SORUMLULUĞU, BİRLİKTE NELER YAPILABİLİR. Uzm Dr.Banu BAYRAKTAR

Transkript

1 TÜBERKÜLOZ TANI VE TAKİBİNDE MİKROBİYOLOJİ LABORATUARLARININ YERİ,SORUMLULUĞU, BİRLİKTE NELER YAPILABİLİR Uzm Dr.Banu BAYRAKTAR

2 Dünyada en sık ölüme neden olan infeksiyonlardan biri Dünya nüfusunun 1/3 ü infekte Her yıl dünya nüfusunun %1 i infekte 2 milyon ölüm/yıl

3 Dünyada Tüberküloz SAPTANAN Tüm vakalar Yayma (+) İnsidans 66/ TAHMİN EDİLEN Tüm vakalar Yayma (+) İnsidans 141/100000

4 Ülkemizde Tüberküloz 2004* Tüm vakalar İnsidans 28/ Yayma (+) TB 5870 *WHO Report 2004.Global Tuberculosis Control

5 Tuberculosis (as of 22 March 2006) -> Estimated TB -> Estimated TB incidence --> TB incidence, all forms (per population per year),

6 Türkiye de yıllara göre tüberküloz insidansı (n/ ) Türkiye WHO Report Global Tuberculosis Control 2004

7 TÜBERKÜLOZ LABORATUVARLARI TB yayılımını önlemede ve kontrol altına alabilmede Örnekte M.tuberculosis tespiti İzolasyon İdentifikasyon Anti-tüberküloz ilaç duyarlılığı testleri ile katkı sağlar.

8 Tüberküloz Laboratuar Seviyeleri CDC, Amerikan Toraks Derneği ve CAP tüberküloz laboratuarlarını iş yükü,tecrübe ve maliyet-yarar ilişkisine bağlı olarak basamaklandırmışlardır. Düzen Tüberküloz laboratuarı bu sınıflamay göre III. Seviyede hizmet veren bir laboratuardır. SEVİYE I II III ARB boyama Kültür M.tuberculosis kompleks identifikasyonu Bütün mikobakterilerin identifikasyonu İlaç duyarlılığı - + +

9 Tüberküloz laboratuarında yapılan testler ARB boyama Kültür İdentifikasyon tetsleri Moleküler yöntemlerle örnekte direkt Mycobacterium tuberculosis complex saptanması Antimikobakteriyal duyarlılık testleri

10 ARB boyama Mikobakteriler için başlıca iki boyama tekniği kullanılmaktadır. Karbolfuksin boyama -Ziehl-Neelsen -Kinyoun ( soğuk boyama) Florokrom boyama -auramine O, -auramine-rhodamine Florokrom boyama ile saptanan pozitifliklerin Z-N ile doğrulanması gerekmektedir.

11 ARB boyama Kültürle karşı şılaştırıldığında ARB boyamanın n duyarlılığı ığı %22-78 olduğu bildirilmiştir. Aynı gün sonuç alınmakta Pozitif saptanabilmesi için örnekte basil/ml bulunması gerekir.

12 ARB boyama Görülen ARB miktarı SONUÇ Karbolfuksin boya Florokrom boya 1000 X 250 X 450 X Negatif Şüpheli, tekrar 1-2/300 alan 1-2/30 alan 1-2/70 alan /100 alan 1-9/10 alan 2-18/50 alan /10 alan 1-9/1 alan 4-36/10 alan /1 alan 10-90/1 alan 4-36/1 alan 4+ >9/1 alan >90/1 alan >36/1 alan

13 KÜLTÜR Normal flora içeren klinik örnekler ile alınmaları ve transport işlemleri sırasında sterilizasyon kurallarına uyulmadığı düşünülen klinik örneklere; organik kalıntıları sindirmek (digestion), kontaminasyona neden olan bakteri ve mantarları elimine etmek amacıyla dekontaminasyon işlemi uygulanır. -NALC-NaOH yöntemi -NaOH yöntemi -Zephiran-trisodium phosphate yöntemi -Oxalic asit yöntemi -Cetylpyridinium chloride-sodium chloride yöntemi -Sülfirik asit yöntemi

14 KÜLTÜR canlı basil/ml saptayabildiğinden yaymalara göre daha duyarlıdır. Kültür için katı besiyerleri ve sıvı besiyerleri kullanılmaktadır. Sıvı besiyerlerinde basilin üreme süresi daha kısadır. Bakteri veya mantar kontaminasyonunun önüne geçilebilmesi amacıyla antimikrobiyallerin katıldığı selektif besiyerleri de mevcuttur.

15 KÜLTÜR Katı Besiyerleri: Yumurta temelli ve agar temelli besiyerleri mevcuttur. Nonselektif Besiyerleri -Löwenstein-Jensen (L-J) -Petragnani -American Thoracic Society -Middlebrook 7H10 -Middlebrook 7H11 Selektif Besiyerleri -L-JGruft(penisilin,nalidiksik asit) - Mycobactosel L-J (siklohekzimid, linkomisin, nalidiksik asit) - Mycobactosel Middlebrook 7H10 - Mitchison s selektif 7H11 (karbenisilin,polimiksin B,trimetoprim laktat, amfoterisin B)

16 KÜLTÜR Bifazik besiyerleri: Septi-Check (BD Biosciences) Sıvı besiyeri (Middlebrook 7H9) Üç tip katı besiyeri (L-J, Middlebrook 7H11, çukulatamsı agar) Kan dışındaki tüm klinik örnekler için uygun Duyarlılığı BACTEC 460 TB ye benzer ancak üremeyi saptama zamanı daha uzundur.

17 KÜLTÜR Sıvı besiyerleri: MGIT (BD, Biosciences) MB Redox (Heipha Diagnostica Biotest) * Düşük kapasite ile çalışan laboratuvarlarda tercih edilir.

18 KÜLTÜR Tam otomatize sistemler (Sıvı besiyerleri): BACTEC 460 (BD Biosciences) Bactec Mycobacterium Growth Indicator Tube (MGIT) 960 (BD Biosciences) Bactec 9000 MB (BD Biosciences) ESP II (Trek Diagnostics) MB/BacT ALERT 3D (BioMerieux)

19 KÜLTÜR BACTEC 460 TB Yarı otomatize, radyometrik BACTEC 12B besiyeri 14 Cişaretli palmitik asit içerir 14 Cişaretli palmitik asit kullanımı 14 CO 2 Üreme İndeksi (GI)

20 KÜLTÜR BACTEC 460 TB Duyarlılık % Özgüllük % PPD % 100 NPD % Ortalama sonuç alma süresi 4-15 gün NTM <7 gün J Clin Microbiol 1999 Jan; 37(1):

21 KÜLTÜR MGIT 960 Tam otomatize, radyometrik olmayan MGIT tüpünün dibindeki silikon içine floresan madde gömülüdür. Floresan madde sıvı besiyerindeki oksijen varlığına duyarlıdır. Üreyen mikobakterilerce oksijenin kullanılması sonucu floresans oluşumu

22 KÜLTÜR Tam otomatize sistemler : Sistemler arasında izolasyon oranı açısından önemli bir fark yok. Mikobakterileri üretme süreleri, radyometrik BACTEC 460 TB ile hemen hemen aynıdır. Kontaminasyon oranları açısından sistemler arasında önemli bir fark yok ancak, bu sistemlerde oran BACTEC 460 TB ve katı besiyerlerine göre daha yüksek CDC Sıvı + katı besiyeri kombinasyonu Mikobakterilerin izolasyon şansını arttırıyor.

23 2006 Yılı Düzen Laboratuvarı BACTEC Kültür ve ARB Verileri ARB POZİTİF NEGATİF TOPLAM BACTEC POZİTİF NEGATİF TOPLAM

24

25

26 İdentifikasyon Yöntemleri Konvansiyonel biokimyasal yöntemler NAP (p-nitro-a- acetylamine-b- hydroxyprophonone) (BACTEC) Moleküler yöntemler AcuProbe DNA hibridizasyon PCR-RFLP INNO-LiPA DNA sekanslama

27 İdentifikasyon yöntemleri Konvansiyonel biokimyasal yöntemler Üreme hızı, üreme ısısı Pigment üretimi Koloni ve mikrokoloni görünümü, kord faktör oluşumu Niasin testi Nitrat redüksiyonu testi Katalaz testi PNB (para-nitro benzoik asit) içeren besiyerinde üreme TCH (Thiophene-2- carboxylic acid hydrazide) ile üremenin inhibe edilmesi Pirazinamidaz testi Tween 80 hidrolizi testi Arilsülfataz testi Tellurit redüksiyonu Üreaz testi

28 İdentifikasyon yöntemleri Kord oluşumu Duyarlılık >%90

29 İdentifikasyon yöntemleri Niasin birikimi; Niasin NAD a dönüşemeyip besiyerinde birikir M. tuberculosis M. simiae niasin (+) M. chelonae M. bovis in bazı suşları LJ de, 3 haftalık kültürler ile çalışılmalıdır Kullanılan ayıraçlar toksiktir

30 İdentifikasyon yöntemleri Nitrat redüksiyonu Nitroredüktaz enzimi ile nitratların nitritlere indirgenmesi M. tuberculosis M. kansasii nitroredüktaz üretir M. szulgai Asitli ortama amin eklendiğinde kırmızı diazonium boyası oluşur

31 İdentifikasyon yöntemleri Katalaz aktivitesi INH dirençli M. tuberculosis M. bovis dışında bütün mikobakteriler katalaz (+). Semikantitatif katalaz testi Isıya stabil katalaz testi M. tuberculosis kompleks; Katalaz aktivitesi düşük ve ısıya stabil değil

32 İdentifikasyon yöntemleri TCH varlığında üreyebilme Niasin (+) M. bovis i M. tuberculosis den ayırır. M. bovis TCH a duyarlıdır Kontrole göre >%1 üreme varsa; TCH dirençli Besiyeri karanlıkta saklanmalıdır

33 İdentifikasyon yöntemleri M.tbc M.africanum M.bovis Üreme sıcaklığı 37 C 37C 37C Pigmentasyonu Nonkromojen(100) N N(100) Niasin + (95) V -(4) TCH üreme + V - Nitrat indirgenmesi + V -(9) Semikantitatif katalaz < 45 mm (89) < 45 mm < 45 mm (69) 68 C katalaz Tween hidrolizi ± (68) - -(21) Tellurit indirgenmesi ± (36) - %5 NaCl tolerans - - -(0) Arilsülfataz (3gün) - - -(0) Üreaz ± (64) + ± (50) Pirazinamidaz(4gün) + - -

34 İdentifikasyon yöntemleri NAP ile inhibisyon-bactec Duyarlılık>%95 M. kansasii, M. gastri, M. terrae kısmen inhibe olabilir 4 günden önce değerlendirilmemeli Biyokimyasal testler veya moleküler yöntemlerle desteklenmeli

35 İdentifikasyon yöntemleri

36 İdentifikasyon yöntemleri PCR-RFLP Hsp 65 geni PCR ile çoğaltıldıktan sonra, BstE II ve Hae III enzimleriyle kesilip poliakrilamid jelde yürütüldüğü bir yöntem En az 32 Mikobakteri türünü birbirinden ayırabiliyor. M.tbc complex içinde tür ayrımı yapamıyor.

37 Moleküler yöntemler Tüberküloz tanısında kullanılan moleküler testler, hızlı ve özgüllükleri yüksek olmakla birlikte duyarlılıkları kültürden düşüktür. Kültürde üreyen mikroorganizmaların sulandırılması ile yapılan çalışmalarda saptama sınırı CFU arasında değişirken, gerçek klinik örneklerde duyarlılıklar çok daha düşük bulunmaktadır.

38 Moleküler yöntemler Klinik örneklerde tüberkülozun saptanmasında geleneksel in-house PCR yönteminin geçerliliği ve tekrarlanabilirliğinin belirlenmesi amacıyla yapılan bir çalışmada, basil miktarı standardize edilmiş örnekler aynı hedef bölgenin çoğaltıldığı yedi laboratuarda test edilmiştir. Bu çalışmada, duyarlılık ve özgüllüklerin %2-90, yalancı pozitifliklerin ise %3-77 oranında değiştiği saptanmıştır. Günümüzde klinik örnekte M.tuberculosis saptanmasında standardize moleküler testler tercih edilmektedir.

39 Moleküler yöntemler Amplicor MTB test (Roche Diagnostics) AMTD (Gen-Probe) testi SDA (BD ProbeTec ET) LCx MTB (Abbott) Real-time PCR Inno-LiPA Rif.TB (Innogenetics)

40 Moleküler yöntemler Amplicor MTB test (Roche Diagnostics) İlk ticari kit Yayma pozitif solunum yolu örneklerinde kullanılmak üzere FDA onaylı 16S rrna Cobas Amplicor MTB, bu testin otomotize versiyonudur. Test süresi yaklaşık saat

41 Moleküler yöntemler AMTD (Gen-Probe) FDA onaylı ilk amplifikasyon testidir. RNA temelli ve izotermal bir çoğaltma yöntemidir. TMA (transcription mediated amplification) Test süresi yaklaşık 3.5 saat

42 Düzen Laboratuarı AMTD Sonuçları AMTD POZİTİF NEGATİF TOPLAM BACTEC POZİTİF NEGATİF TOPLAM ARB(+), AMTD(+) hasta sayısı:4 ARB(-), AMTD(-) hasta sayıs:41

43 Moleküler yöntemler SDA (Strand Displacement Amplification) (BD ProbeTec ET) DNA polimeraz ve restriksiyon enzimlerinin birlikte yer aldığı izotermal bir yöntemdir. M.tuberculosis komplekse özgül IS6110 ve tüm mikobakterilerde bulunan 16S rrna hedef dizileri birlikte çoğaltıldığından M.tuberculosis tür tayini yapabilmektedir. Toplam test süresi yaklaşık 3 saat

44 Moleküler yöntemler LCx MTB (Abbott) Prob molekülünün çoğaltıldığı ligaz zincir reaksiyonu (LCR) yöntemi kullanılmaktadır. Çoğaltma termal cycler da yapılmaktadır. Test süresi yaklaşık 5 saat

45 Moleküler yöntemler Real-time PCR Çoğaltma ile birlikte ve eş zamanlı olarak gerçekleşen saptama, DNA ya bağlanan boyalar veya floresan veren boyalar ve işaretli problar ile sağlanmaktadır. Yöntemin avantajları, PCR sonrası ürün saptama basamaklarının olmaması, kısa sürede sonuçlanması, kantitasyon yapılabilmesi ve kontaminasyon riskinin çok düşük olmasıdır.

46 Moleküler yöntemler Inno-LiPA Rif.TB (Innogenetics) Hibridizasyon yöntemidir. Klinik örneklerde M.tuberculosis kompleks ve rifampisin direnci birlikte saptanabilmektedir.

47 Moleküler Tanı Sistemlerinin Performansı (Solunum Örnekleri) TİCARİ SİSTEMLER DUYARLILIK % ÖZGÜLLÜK % PPD % NPD % MTD COBAS AMPLICOR LCx SDA (BD Probe Tec ET)

48 Moleküler yöntemler Moleküler testlerin klinik örnekte tüberküloz varlığının saptanmasında, ARB mikroskopisi ve kültür ile birlikte uygulanması önerilmektedir. Amplikor ve AMTD testleri, M.tuberculosis ile tüberküloz dışı mikobakteri ayrımının yapılabildiği merkezlerde, son bir yıl içinde tedavi almayan hastaların solunum yolu örneklerinde kültür ile birlikte yapılması koşulu ile FDA onayı almıştır. CDC Morb Mortal Wkly Rep:2000;49:593-4

49 Moleküler yöntemler Laboratuvar tanıda moleküler ticari sistemler; TB şüpheli hastaların,özellikle yayma (+) solunum örneklerinde Hastalığın eradikasyonu için mücadelede, Tedavinin takibi ve yönlendirilmesinde, etkili görünmektedir. Mevcut ticari ürünler asla tarama amaçlı kullanılmamalı, Referans laboratuvarlarda kurulmasına önem verilmeli, Konvansiyonel yöntemlerin altın standart olduğu unutulmamalı

50 Duyarlılık Testleri CDC Her hasta için kültürde izole edilen ilk M.tuberculosis izolatına duyarlılık testi Üç aylık tedaviden sonra, kültür pozitifliği devam eden veya klinik yanıtsızlığı olan her hastada testin tekrarı

51 Duyarlılık Testleri CLSI a göre Primer İlaçlar İzoniazid Rifampisin Etambutol Pirazinamid Ülkemizde Primer İlaçlar İzoniazid Rifampisin Etambutol Streptomisin Sekonder ilaçlar Streptomisin Kapreomisin Etionamid Kanamisin Ofloksasin Rifabutin

52 Duyarlılık Testleri Agar Proporsiyon Yöntemi: Referans yöntemdir. 10-2, 10-4 dilüsyonlu inokulumlar kullanılır

53 Duyarlılık Testleri İlaçlı b.y.. ded üreyen koloni sayısı İlaçsız b.y.. de üreyen koloni sayısı %1 (KP) R

54 Duyarlılık Testleri Proposiyon yöntemi Direkt test Dekontamine ve konsantre edilmiş ARB pozitif örnek kullanılır. İndirekt test Primer kültürde üremiş saf bakteri kolonileri kullanılır.

55 Duyarlılık Testleri CDC; örnek kabul edildikten sonra 30 gün içinde primer ilaçlara karşı duyarlılık sonuçları bildirilmelidir. Bu amaçla CLSI; FDA in de onayladığı bazı hızlı, sıvı besiyerinde kültüre dayalı ticari sistemlerin kullanılabileceğini kabul etmiştir. BACTEC 460 TB, MGIT 960, ESP II

56 Duyarlılık Testleri Duyarlılık Test Sonuçları Geciktirilmeden bildirilmelidir. Her bir ilacın adı ve sonucun yorumu mutlaka belirtilmelidir. CLSI alt komitesi; kullanılan yöntem ve besiyeri; kullanılan konsantrasyonlar ve referans yönteme eşdeğer karşılıkları, direnç oranının belirtilmesini önermektedir.

57 Düzen laboratuarı, yıllarına ait majör ilaç direnç yüzde verileri Major Duyarlılık Testi Sonuçları % YILLAR Hepsi duyarlı 5 ilaca R 1 ilaca R 2 ilaca R 3 ilaca R 4 ilaca R

58 Birlikte neler yapabiliriz? Tüberküloz şüpheli bir vakada EZN ve kültür çalışmasını mutlaka birlikte yapılmasını sağlamalıyız. (idealinde 3 örnekte) Her hastadan izole edilen ilk M.tuberculosis suşunun mutlak majör ilaçlara direncine bakmalıyız. Tedavinin üçüncü ayında hala kültür pozitifliği süren hastalarda direnç gelişiminden şüphelenmeli, duyarlılık tetsini tekrarlamalı ve minör ilaç dirençlerine bakmalıyız. Hızlı tanı için moleküler testleri kullanmalı, ancak yanında altın standart kültür tetslerini mutlaka istemeliyiz.

59