/11 1. KULLANIM AMACI

Transkript

1 PLATELIA Toxo IgG 1 plaka İNSAN SERUM VEYA PLAZMASINDA ENZİM İMMUNO TEST KULLANIMI İLE TOKSOPLAZMA GONDII ye DÖNÜŞEN IgG ANTİ BADİLERİN KANTİTATİF OLARAK BELİRLENMESİ /11 1. KULLANIM AMACI Platelia Toxo IgG, insan serum veya plazmasında Toksoplazma gondii ye dönüşen IgG anti badilerin immuno test ile kantitatif şekilde belirlenmesi içindir. 2. KLİNİK DEĞER T. gondii çeşitli memeli ve kuşlarda enfeksiyona sebep olan bir protozoandır. Toksoplazmoz, insan ve hayvanlarda sıklıkla görülür, genellikle sesizdir. Serolojik testler kullanılarak belirlenmiş olan bu enfeksiyonun popülasyon içinde yaygınlığı kaynak ülkeye ve yaşa göre farklılık gösterebilir. Hamilelik sırasında toksoplazmoz ciddi kongenital anormalliklere (özellikle bozuk beyin fonksiyonları) ve bazı durumlarda ölü doğumlara sebep olmuştur. Kadınlarda hamilelikten önce Toxo IgG antibadi kullanımı hamilelik sırasındaki olası toksoplazmozlara karşı fetal koruma sağlar. Ciddi toksoplazmoz enfeksiyonuna predispozisyon Kazanılmış Bağışıklık Eksikliği Sendromu (ADIS) veya bağışıklığı zayıf olan kişilerde sıklıkla görülür. Bu enfeksiyonların ana sebebi HIV enfeksiyonundan önce mevcut olan T. gondii kistlerinin tekrar aktifleşmesidir. T. gondii enfeksiyonunun spesifik teşhisi karmaşık olabilir ve parazit izolasyonu nadirdir. T. gondii antibadi serolojik onayı parazite maruz kalma göstergesidir ve bağışıklık durumu ile enfeksiyona açık olma durumunun belirlenmesi için geniş kabul görmüş bir yoldur. Çeşitli izotiplerin taranması ya T. gondii tarihlenmesine ve yeni bir enfeksiyon olması durumunda uygun terapinin uygulanmasına ya da profilaktik tavsiye önerisine izin verir: hamile kadınlarda hijyen beslenme ana hatları, bağışıklığı zayıf olan popülasyonda kemoprofilaksi. 3. PRENSİP Platelia Toxo IgG, insan serum veya plazmasında Toksoplazma gondii ye dönüşen IgG anti badilerin indirekt ELISA immuno enzimatik metot ile belirlenmesi içindir. Mikro plakayı kaplamak için T. gondii antijen kullanılmıştır. Konjuge olarak insan gamma zincirleri için (anti-igg) spesifik olan peroksidaz ile etiketlenmiş monokolonal anti badi kullanılmıştır. Test aşağıdaki adımları kullanır: Adım 1 Hasra örnekleri ve kalibratörler 1/21 oranında seyreltilir ve sonra mikro plaka çukurcuklarına dağıtılır. 37 C deki bir saatlik bu inkübasyon sırasında örnekte bulunan T. gondii ye dönüşebilen IgG anti badiler mikro plaka çukurcuklarında kaplı T. gondii antijenine yapışır. İnkübasyondan sonra, bağlanmamış spesifik olmayan anti badiler yıkama ile temizlenir. Adım 2 Mikro plaka çukurcuklarına konjuge (insan gamma zincirleri için spesifik peroksidaz etiketli monoklonal anti badi) eklenir. 37 C deki bir saatlik bu inkübasyon sırasında, etiketlenmiş anti badiler T. gondii antijen tarafından yakalanmış serum IgG ye bağlanır. Bağlanmayan konjuge inkübasyon sonunda yıkanarak temizlenir. Adım 3 Immun komplekslerin varlığı (T. gondii antijen, T. gondii ye dönüşebilen IgG anti badiler ve anti-igg konjuge) her çukurcuğa enzimlerle ilgili geliştirme çözeltisi eklenerek gösterilir. 1

2 Adım 4 Oda sıcaklığında ( C) inkübasyondan sonra, enzimlerle ilgili reaksiyon 1N sülfürik asit çözeltisi eklenerek durdurulur. 450/620 nm olarak ayarlanmış spektrometre ile elde edilen optik yoğunluk okuması örnekte bulunan T. gondii ye dönüşen IgM anti badilerin miktarına eşittir ve WHO Uluslararası Standart TOX-M ile kalibre edilmiş standart eğri kullanılarak IU/ml dönüştürülür. 4. ÜRÜN BİLGİSİ Temin edilmiş olan reaktif miktarları 96 test için yeterlidir. Tüm reaktifler özel olarak ın vitro teşhis içindir. Etiket Reaktifin doğası Sunum R1 Mikro plaka Mikro plaka: (Kullanıma hazır): İnaktive edilmiş T. gondii antijen ile kaplı 8 kırılabilir çukurcuklu 12 şerit 1 R2 Konsantre Yıkama Çözeltisi (20X) Konsantre Yıkama Çözeltisi (20X): TRIS-NaCl tampon (ph 7.4), %2 Tween 20 Koruyucu : 0,04% ProClin x 70 ml R3 Kalibratör 0 R4a Kalibratör 6 R4b Kalibratör 60 R4c Kalibratör 240 R6 R7 R9 Konjuge (51x) Seyreltici Kromojen TMB Kalibratör 0: T. gondii ye dönüşen IgG anti badiler için negatif ve HBs antijen, anti-hiv1, anti-hiv2 ve anti-hcv için negatif insan serumu Koruyucu : 0,098% ProClin 300 Kalibratör 6 IU/ml: T. gondii ye dönüşen IgG anti badiler için reaktif ve HBs antijen, anti-hiv1, anti-hiv2 ve anti-hcv için negatif insan serumu Koruyucu : 0,098% ProClin 300 Kalibratör 60 IU/ml: T. gondii ye dönüşen IgG anti badiler için reaktif ve HBs antijen, anti-hiv1, anti-hiv2 ve anti-hcv için negatif insan serumu Koruyucu : 0,098% ProClin 300 Kalibratör 240 IU/ml: T. gondii ye dönüşen IgG anti badiler için reaktif ve HBs antijen, anti-hiv1, anti-hiv2 ve anti-hcv için negatif insan serumu Koruyucu : 0,098% ProClin 300 Konjuge (51x): Kara turp peroksidaza bağlı murin monoklonal anti badi insan gamma zincirleri Koruyucu : 0,159% ProClin 300 Örnekler ve konjuge için seyreltici (Kullanıma hazır): Tris-NaCl (ph 7,7), gliserol, %0.1 Tween 20, fenol kırmızısı Koruyucu : 0,148 ProClin 300 Kromojen (Kullanıma hazır): tetrametilbenzidine (< %0.1), H2O2 (<1%) 1 x 0.75 ml 1 x 0.75 ml 1 x 0.75 ml 1 x 0.75 ml 1 x 0.7 ml 1 x 100 ml 1 x 28 ml R10 Durdurma Çözeltisi Durdurma Çözeltisi (Kullanıma hazır): 1N sülfürik asit çözeltisi 1 x 28 ml Saklama koşulları ve son kullanma tarihi için lütfen kutu üzerindeki ibarelere bakın. 5. UYARILAR VE ÖNLEMLER Sonuçların güvenilirliği aşağıdaki İyi laboratuar Uygulamalarının uygulanmasına bağlıdır: Son kullanma tarihi geçmiş reaktifleri kullanmayın. Bir çalışma içinde farklı lotlardan gelen reaktifleri karıştırmayın veya ilişkilendirmeyin. AÇIKLAMA: Yıkama Çözeltisi (R2, etiket tanımlama: 20x yeşil renkli), Kromojen (R9, etiket tanımlama: TMB turkuvaz renkli) ve Durdurma Çözeltisi (R10, etiket tanımlama: 1N kırmızı renkli) için,kit içindekilerin dışında lotlardan da kullanmak mümkündür, ancak bu kitlerin kesinlikle aynı olmaları gereklidir ve aynı test çalışmasında tamamen aynı lotlar kullanılmalıdır. AÇIKLAMA: Kit ile sağlanan dışında bir lottan Seyreltici (R7) kullanılmasına izin verilmez. Ayrıca Platelia Toxo IgM kitleri (Ref ) ile birlikte sağlanan Seyreltici (R7) kullanımına da izin verilmez. 2

3 AÇIKLAMA: Ek olarak, Yıkama Çözeltisi (R2, etiket tanımlama: 20x yeşil renkli) çeşitli Bio-Rad reaktif kitlerindeki diğer 2 yıkama çözeltisi ile karıştırılabilir (R2, etiket tanımlama: 10x mavi renkli veya 10x turuncu renkli) bir test çalışmasında sadece bir karışım kullanıldığı ve uygun şekilde sulandırıldığı takdirde. Kullanmadan önce, reaktiflerin oda sıcaklığına ( C) gelmesi için 30 dakika bekleyin. Reaktifleri kontaminasyona sebep olmadan dikkatle sulandırın veya seyreltin. Testleri reaktif buhar (asit, alkalin, aldehit buharları) veya konjugenin enzim aktivitesini değiştirebilecek tozların bulunduğu ortamlarda yapmayın. Deiyonize su ile güzelce yıkanmış ve durulanmış cam kaplar veya tercihen tek kullanımlık kaplar kullanın. Mikro plakanın yıkanması prosedürde kritik bir adımdır: tavsiye edilen yıkama döngülerine uyun ve tüm çukurcukların tamamen dolup sonra tamamen boşaldığından emin olun. Yanlış yıkamalar doğru olmayan sonuçlara yol açabilir. Mikro plakanın yıkama işleminin sonu ile reaktif dağıtımı arasında kurumasına izin vermeyin. Konjuge ve geliştirme çözeltisinin dağıtımı için asla aynı kabı kullanmayın. Enzimlerle ilgili reaksiyon metal veya metal iyonlarına karşı çok hassastır. Buna bağlı olarak, konjuge veya kromojen içeren çeşitli çözeltilerin herhangi bir metal ile temas etmesine izin vermeyin. Kromojen çözeltisi (R9) renksiz olmalıdır. Mavi renk görünmesi reaktifin kullanılamaz olduğunu ve değiştirilmesi gerektiğini gösterir. Her örnek için yeni pipet ucu kullanın. Pipetleri ve diğer ekipmanları hassaslık ve düzgün çalıştıklarından emin olmak için kontrol edin. SAĞLIK VE GÜVENLİK TALİMATLARI Reaktiflerin hazırlanmasında kullanılan insan kaynaklı materyaller test edilmiş ve hepatit B yüzey antijen (HBs Ag), hepatit C virüsü için antibadiler (anti-hcv) ve bağışıklık eksikliği sendromu virüsü (anti-hiv1 ve anti-hiv2) için reaktif olmadıkları bulunmuştur. Enfeksiyona sebep olan etken maddelerin yokluğunu mutlak şekilde garanti eden bir metot olmadığı için, insan kaynaklı reaktifler ve hasta örneklerini enfeksiyon hastalıkları için potansiyel kaynak olarak değerlendirin: İnsan kaynaklı reaktif malzemeler ve örnekler ile doğrudan temas eden yıkama çözeltileri dahil tüm malzemeler enfeksiyon hastalığı bulaştırma riskine sahip olarak kabul edilmelidir. Örnek ve reaktifler ile ilgilenirken tek kullanımlık eldivenler kullanın. Ağzınızla pipete çekmeyin. Örnek veya örnek içeren çözeltileri dökmekten kaçının. Döküntüler %10 seyreltilmiş çamaşır suyu ile temizlenmelidir. Asit içeren bir döküntü olması durumunda, bu önce sodyum bikarbonat ile nötralize edilmeli, sonra %10 seyreltilmiş çamaşır suyu ile temizlenmeli ve emici kağıt ile kurutulmalıdır. Temizlik için kullanılan maddeler kontamine atık konteynerine atılmalıdır. İnsan kaynaklı materyal içeren hasta örnekleri, reaktifler yanında kontemine olmuş malzeme ve ürünler sadece aşağıdaki şekilde dekonteminasyon sonrasında atılmalıdır: - ya nihai konsantrasyonu %5 olan sodyum hipoklorit içinde 30 dakika bekleterek, - ya da 121 C de minimum 2 saat otoklava koyarak. DİKKAT: Sodyum hipoklorit içeren çözeltileri otoklava koymayın Tehlikeli olarak kabul edilmeyenler dahil hiç bir reaktifin cilt ve mukoza ile temas etmesine izin vermeyin. Kimyasal ve biyolojik atıklarla İyi Laboratuar Uygulamalarına uygun şekilde ilgilenilmeli ve bertaraf edilmelidir. Bu test kitinde bulunan kimyasal komponentlerle ilgili tehlikeler ve bunlardan korunma yöntemleri konusunda öneriler için lütfen etiketler üzerinde bulunan ve ayrıca bu kullanım talimatlarının sonunda yer alan resimli grafiklere başvurun. Güvenlik Veri Sayfası adresinde bulunabilir. 3

4 6. ÖRNEKLER 1. Serum ve plazma (EDTA, heparin veya sitrat) tavsiye edilen örnek tipleridir. 2. Kan örnekleri ile ilgilenmek, işlemek ve depolamak için aşağıdaki tavsiyelere uyun: Tüm kan örneklerini damardan kan alma rutin önlemlerine uyarak alın. Serum için, örneklerin santrifüj öncesinde tamamen pıhtılaşmasını bekleyin. Tüplerin tıpalarını daima kapalı tutun. Santrifüj sonrasında serum veya plazmayı pıhtıdan veya kırmızı hücrelerden ayırın sıkıca kapatılmış saklama tüpüne koyun. Test 7 gün içinde yapılacaksa örnekler +2-8 C de saklanabilir. Test 7 gün içinde bitirilmeyecekse, örnekleri -20 C veya daha soğuk ortamda dondurun. 5 defadan fazla çözülmüş örnekleri kullanmayın. Önceden dondurulmuş örnekler test öncesinde çözüldükten sonra iyice karıştırılmalıdır (Vorteks) g/l albümin veya 100 mg/l konjuge olmayan bilirubin içeren örnekler, 36 g/l triolein (trigliserit) dengi içeren lipemik örnekler ve 10 g/l a kadar hemoglobin içeren örnekler sonuçları etkilemez. 4. Örnekleri ısıtmayın. 7. TEST PROSEDÜRÜ 7.1 Gerekli olan ama sağlanmamış malzemeler Vorteks karıştırıcı. 450 nm ve 620 nm filtrelere sahip mikro plaka okuyucu (*). Termostatik olarak 37±1 C şeklinde ayarlanmış mikro plaka inkübatörü (*). Otomatik, yarı otomatik veya manuel mikro plaka yıkayıcı (*). Steril distile veya deiyonize su. Tek kullanımlık eldivenler. Emniyet gözlükleri. Emici kağıt. Otomatik veya yarı otomatik, ayarlanabilir veya önceden ayarlı, pipetler ya da çoklu pipetler, 10 μl ila1000 μl, ve 1 ml, 2 ml ve 10 ml ölçmek ve vermek için. 25 ml, 50 ml, 100 ml ve 1000 ml kapasiteli dereceli silindirler. Çamaşır suyu ve sodyum bikarbonat. Biyolojik olarak tehlikeli atıklar için konteyner. Tek kullanımlık tüpler. (*) Tavsiye edilen ekipman ile ilgili ayrıntılı bilgi için teknik departmanımızla görüşün. 7.2 Reaktifleri sulandırma R1: Torbayı açmadan önce oda sıcaklığında ( C) 30 dakika bekleyin. Taşıyıcı tepsiyi çıkartın, kullanılmamış şeritleri torbaya hemen geri koyun ve kurutucunun mevcut olduğundan emin olun. Torbayı sıkıca kapatın ve +2-8 C de saklayın. R2: Yıkama çözeltisi R2 yi distile su ile 1/20 oranında seyreltin: örneğin kullanıma hazır yıkama çözeltisi için 50 ml R2 ve 950 ml distile su. Manuel olarak yıkanacaksa 12 şeritlik bir plaka için 350 ml seyreltilmiş yıkama çözeltisi hazırlayın. R3, R4a, R4b, R4c: Seyreltici (R7) ile 1/21 oranında seyreltin (örnek: 300 μl R μl Kalibratör). R6+R7: Konjuge (R6) 51x konsantredir ve kullanımdan önce homojenleştirilmelidir. Seyreltici (R7) ile 1/51 oranında seyreltin. Bir plaka için, 0.5 ml Konjuge (R6) 25 ml Seyreltici (R7) ile seyreltilmelidir. Bir şerit için gerekli olan hacmi bulma amacıyla bu hacimleri ona bölün. 7.3 Açılmış ve/veya sulandırılmış reaktiflerin saklanması ve geçerliliği Kit +2-8 C de saklanmalıdır. Kit açılmadan önce +2-8 C de saklandığında, içindeki her bileşen kitin dış etiketinde belirtilen son kullanma tarihine kadar kullanılabilir. R1: Açıldıktan sonra, +2-8 C de aynı torba içinde ağzı sıkıca kapatılmış şekilde muhafaza edilen şeritler 8 haftaya kadar dengeli kalabilir (kurutucunun mevcut olduğundan emin olun). R2: Seyreltildikten sonra, Yıkama Çözeltisi C de 2 haftaya kadar muhafaza edilebilir. Konsantre Yıkama Çözeltisi açıldıktan sonra C de saklanabilir, kontaminasyon olmadığı takdirde etiketteki son kullanma tarihine kadar stabildir. 4

5 R3, R4a, R4b, R4c, R6, R7: Açıldıktan sonra, kontaminasyon olmadığı takdirde reaktifler +2-8 C de 8 haftaya kadar stabil kalabilir. R6+R7: Seyreltildikten sonra, konjuge çalışma çözeltisi oda sıcaklığında ( C) 8 saat +2-8 C de 2 hafta stabildir. R9: Açıldıktan sonra, kontaminasyon olmadığı takdirde reaktifler +2-8 C de 8 haftaya kadar stabil kalabilir. R10: Açıldıktan sonra, kontaminasyon olmadığı takdirde reaktifler +2-8 C de etiket son kullanma tarihine kadar stabil kalabilir. 7.4 Prosedür Test prosedürüne ve İyi Laboratuar Uygulamasına harfiyen uyun. Kullanmadan önce, reaktiflerin oda sıcaklığına ( C) gelmesini bekleyin. Kırılabilir çukurcukların kullanımı işlem sırasında özel dikkat gerektirmektedir. Her çalışmada test sonuçlarını doğrulamak için tüm kalibratörleri kullanın. 1. Kalibratör ve hasta örnekleri için dağıtım ve tanımlama planını dikkatle oluşturun. 2. Seyreltilmiş yıkama çözeltisini hazırlayın (R2) [Bakınız Bölüm 7.2]. 3. Taşıyıcı tepsiyi ve şeritleri (R1) koruyucu torbadan çıkartın [Bakınız Bölüm 7.2]. 4. Tek tek tanımlanmış olan tüplerde, Kalibratörler R3, R4a, R4b, R4c ve hasta örneklerini (S1, S2 ) Seyreltici (R7) ile 1/21 seyreltin: 300 μl Seyreltici (R7) ve 15 μl örnek [Bakınız Bölüm 7.2]. Vorteks ile seyreltilmiş örnekler. 5. Aşağıdaki diziye harfiyen uyarak her çukurcuğa 200 μl of seyreltilmiş kalibratör ve hasta örneği koyun: A R3 S5 S13 B R4a S6 C R4b S7 D R4c S8 E S1 S9 F S2 S10 G S3 S11 H S4 S12 6. Mikro plakayı yapışkan plaka izolatörü ile kapatın, sonra sıkıca yapıştığından emin olmak için plaka hafifçe bastırın. Mikro plakayı hemen termostat kontrollü su banyosunda veya kuru inkübatörde 1 saat ± 5 dakika 37 C ± 1 C ısıda inkübe edin. 7. İlk inkübasyon periyodunun bitmesinden önce, konjuge çalışma çözeltisini hazırlayın (R6+R7) [Bakınız Bölüm 7.2]. 8. İlk inkübasyon periyodunun sonunda, yapışkan plaka izolatörünü çıkartın. Çukurcukların içindekileri biyolojik olarak tehlikeli atık konteyneri (sodyum hipoklorit içerir)içine aspire edin. Mikro plakaları 4 kez 350 μl Yıkama Çözeltisi (R2) ile yıkayın. Mikro plakayı ters çevirerek emici kağıda hafifçe vurarak kalan sıvıdan kurtulun μl konjuge çalışma çözeltisini (R6+R7) tüm çukurcuklara hemen dağıtın. Çözelti kullanımdan önce hafifçe çalkalanmalıdır. 10. Mikro plakayı yapışkan plaka izolatörü ile kapatın, sonra sıkıca yapıştığından emin olmak için plaka hafifçe bastırın. Mikro plakayı hemen termostat kontrollü su banyosunda veya kuru inkübatörde 1 saat ± 5 dakika 37 C ± 1 C ısıda inkübe edin. 11. İkinci inkübasyon periyodunun sonunda, yapışkan plaka izolatörünü çıkartın. Çukurcukların içindekileri biyolojik olarak tehlikeli atık konteyneri (sodyum hipoklorit içerir)içine aspire edin. Mikro plakaları 4 kez 350 μl Yıkama Çözeltisi (R2) ile yıkayın. Mikro plakayı ters çevirerek emici kağıda hafifçe vurarak kalan sıvıdan kurtulun. 12. Her çukurcuğa hızlı şekilde ve ışıktan koruyarak 200 μl Kromojen çözeltisi (R9) ekleyin. Reaksiyona karanlık ortamda ve oda sıcaklığında ( C) 30 ± 5 dakika izin verin. Bu inkübasyon sırasında yapışkan izolatör kullanmayın. 13. Her çukurcuğa 100 μl Durdurma Çözeltisi (R10) ekleyerek enzimlerle ilişkili reaksiyonu durdurun. Çözeltinin gelişmesi için kullanılan ile aynı dizi ve dağıtım oranını kullanın. 5

6 14. Plakanın altını dikkatle silin. Optik yoğunluğu reaksiyonu durdurduktan sonraki 30 dakika içinde 450/620 nm da plaka okuyucu kullanarak okuyun. Şeritler okuma öncesinde daima ışıktan uzak tutulmalıdır. 15. Sonuçları rapor etmeden önce okum aile plaka ve örneklerin dağılımı arasındaki uyumu kontrol edin. 8. SONUÇLARIN YORUMLANMASI 8.1 Standart eğrisini oluşturma Test örneğinde T. gondii ye dönüşebilecek IgG anti badilerin varlığı ve miktarı test örneklerinin optik yoğunluklarının (OD) standart aralık ile karşılaştırılmasıyla bulunur. Platelia Toxo IgG testi standart olarak WHO Uluslararası Standardı TOX-M kullanır. Bununla birlikte, farklı serolojik teknikler ile test edildiğinde aynı serum için belirli titrasyon farklılıkları gözlemlenebilir. Bu farklılığın sebebi çeşitli tekniklerde kullanılan T. gondii nin değişken miktarlarda çözülebilir membran antijen içermesidir. Standart eğrisini [OD = fonksiyon (IU/ml)] kalibratörlerin OD okumalarını R3, R4a, R4b, R4c dikey eksen (Y) üzerinde işaretledikten sonra, bunlara karşılık gelen konsantrasyonları IU/ml yatay eksende (X) işaretleyin. Test edilen her örnek için, anti-t. gondii IgG anti badi titrasyonunu çizilmiş olan standart eğrisinden ölçülen OD ye karşılık gelen konsantrasyonu belirleyerek hesaplayın. Not: Eğer 1/21 seyreltilmiş test örneği için OD okuması > OD R4c ise, bu test örneği seyreltici ile R7 ile 1/210 seyreltilmeli ve test tekrar çalışılmalıdır. İlgili IU/ml değerleri bundan sonra 10 faktörü ile çarpılmalıdır. 8.2 Kalite Kontrol Her çalışma ve her mikro plaka için kalibratör ve kontrolleri dahil edin ve elde edilen sonuçları analiz edin. Testin validasyonu için, aşağıdaki kriter sağlanmalıdır: Optik yoğunluk değerleri: OD R4a OD R4b Optik yoğunluk oranları: OD R4a / OD R OD R4b / OD R4a 2.20 OD R4c / OD R4b 1.15 Eğer kalite kontrol kriterleri karşılanmazsa, test çalışması tekrarlanmalıdır. 8.3 Sonuçların yorumlanması Anti-T. gondii anti badi titrasyonu (uluslararası Birim/ml) Sonuç Yorum Titratör < 6 IU/ml Negatif Negatif veya belirsiz sonuç gerekli bağışıklığın eksikliğini gösterir, ama yakın zamandaki enfeksiyonu dışlamaz. Eğer hastanın son zamanlarda 6 IU/ml Titratör < 9 IU/ml Belirsiz enfeksiyon geçirdiğinden şüpheleniliyorsa, ikinci örnek yaklaşık iki hafta içinde tekrarlanmalıdır. Titratör 9 IU/ml Pozitif Pozitif sonuç genellikle geçmiş enfeksiyonu gösterir. Bununla birlikte anti-t. gondii IgM anti badiler mevcutsa yakın zamandaki enfeksiyon göz ardı edilemez. 200 IU/ml üzeri konsantrasyonlarda daha yüksek titratör sapmaları gözlenebilir. 6

7 8.4 Sorun Giderme Rehberi Doğrulanmamış veya tekrarlanamayan reaksiyonlar genellikle şunlardan kaynaklanır: Yetersiz mikro plaka yıkaması. Negatif örneklerin yüksek antibadi titresi içeren serum veya plazma ile kontaminasyonu. Geliştirme çözeltisinin kimyasal oksitleyici etken maddeler ile (çamaşır suyu, metal iyonları) kontaminasyonu. Durdurma Çözeltisinin kontaminasyonu. 9. PERFORMANSLAR Platelia Toxo IgG performansı 2 merkezde hamile kadınlardan ve kan donörlerinden alınan toplam 1310 örnek üzerinde değerlendirilmiştir. Bir merkezde manuel testte Platelia Toxo IgG TMB (72741) kullanılarak karşılaştırma çalışması yapılmıştır. İkinci merkezde, Platelia Toxo IgG performansı Platelia Toxo IgG TMB (72741) ile otomatik EIA mikro plaka analizöründe karşılaştırılmıştır. Ek olarak, Platelia Toxo IgG performansı 47 kordon kanı örneğinde değerlendirilmiştir. 9.1 Yaygınlık Anti-Toxoplasma gondii IgG anti badilerin Platelia Toxo IgG kullanılarak yaygınlığının tespiti için çoğunluk Paris (Fransa) içinden veya çevresinden olan hamilelikleri süresince izlenmiş hamile kadınlardan alınmış 538 örnek ile belirlenmiştir. 128 örnek anti-toksoplazma IgG anti badiler için pozitif olarak tespit edilmiştir. Platelia Toxo IgG testi ile ölçülen yaygınlık %23.8 (128/538) olarak çıkmıştır. 9.2 Karşılaştırma çalışması (Merkez 1) Platelia Toxo IgG performansı aşağıdaki şekilde gruplanmış 745 kan örneği kullanılarak değerlendirilmiştir: Kan donörlerinden 606 serum Hamile kadınlardan 139 serum Sonuçlar referans olarak Platelia Toxo IgG TMB (72741) kullanılarak elde edilmiş olanlarla karşılaştırıldı. Platelia Toxo IgG TMB (72741) Negatif Şüpheli* Pozitif Toplam Negatif Platelia Toxo IgG (72840) Şüpheli* Pozitif Toplam Global anlaşma: 743/743 %100.0 [IC %95 = % %100.0] Nispi spesifiklik: 365/365 %100.0 [IC %95 = % %100.0] Nispi hassasiyet: 378/378 %100.0 [IC %95 = % %100.0] *Şüpheli örnekler hassasiyet, spesifiklik ve anlaşma hesaplamalarında kullanılmamıştır. [IC%95] = %95 güvenilirlik aralığı 9.3 Performanslar (Merkez 2) Çalışma çoğunluğu hamile kadınlardan oluşan 538 örnek üzerinde hamilelikleri süresince yapılmış ve laboratuar rutini içinde test edilmiştir. Bu örnekler Platelia Toxo IgG ve Platelia Toxo IgG TMB (72741) testleri ile paralel şekilde test edilmiştir. Bunun da ötesinde, laboratuar veritabanında bilinmeyen hastalardan gelen ve 100 UI/ml altında titratöre sahip tüm örnekler iki metot ile kontrol edilmiştir: Hassas Aglünitasyon (Laboratuar antijeni: T. gondii, RH tür) serum için titrasyon > 10 IU/ml. İndirekt immuno floresan (Laboratuar antijeni: T. gondii, RH tür) titrasyon 3 ve 10 IU/ml arası serum için. 7

8 Sonuçlar referans olarak Platelia Toxo IgG TMB (72741) kullanılarak elde edilmiş olanlarla karşılaştırıldı. Platelia Toxo IgG TMB (72741) Negatif Şüpheli* Pozitif Toplam Platelia Toxo IgG (72840) Negatif Şüpheli* Pozitif Toplam Global anlaşma: 517/524 %98.7 [IC %95 = % %99.5] Nispi spesifiklik: 406/413 %98.3 [IC %95 = % %99.3] Nispi hassasiyet: 111/111 %100.0 [IC %95 = % %100.0] *Şüpheli örnekler hassasiyet, spesifiklik ve anlaşma hesaplamalarında kullanılmamıştır. [IC%95] = %95 güvenilirlik aralığı Platelia Toxo IgG testi ile 7 farklı pozitif örneğin tamamı laboratuarda kullanılan tamamlayıcı metotlarla pozitif olarak doğrulanmıştır (Hassas Aglünitasyon, İndirekt immuno floresan) Ek olarak, 3 örnek dahil 9 serokonversiyon paneli Platelia Toxo IgG (72840) ve Platelia Toxo IgG TMB (72741) testleri ile test edilmiştir. Her panel için ilk örnek hem anti-toxoplasma gondii IgG hem de IgM anti badiler için negatiftir. 9 serokonversiyon panelinin 8 inde her iki testte benzer sonuç vermiştir. Bir panelde 2. serokonversiyon serumu Platelia Toxo IgG testi ile pozitif bulunmuş ancak Platelia Toxo IgG TMB testi ile şüpheli bulunmuştur. 9.4 Kordon kan örneklerindeki performans 47 kordon kan örneği Bölüm 7.4 içinde açıklanan protokol kullanılarak test edilmiştir (örnek seyreltme 1:21): Onaylanmış kongenital toksoplazmozdan 22 örnek Anneliğe ait toksoplazmoz geçmiş enfeksiyondan 18 örnek Enfeksiyonsuz 7 örnek Kongenital ve geçmiş enfeksiyonların Platelia Toxo IgG (72840) ile yapılan testlerinin tümü pozitif, geçmiş enfeksiyon örneklerinin Platelia Toxo IgM testi (72841) ile yapılan sonuçlarının hepsi negatiftir. Enfekte olmayan 7 örnek negatif olarak doğrulanmıştır. Kongenital toksoplazmoz (n=22) Anneliğe ait geçmiş enfeksiyon (n=18) Platelia Toxo IgG (72840) Platelia Toxo IgM (72841) Pozitif Şüpheli Negatif Pozitif Şüpheli Negatif Negatif (n=7)

9 9.5 Çapraz Reaktivite CMV, Rubella, EBV, HSV, VZV, kabakulak, kızamık ve HIV için pozitif 159 örnek ve romatoid faktör için pozitif 38 örnekten oluşan 197 örneklik panel, otomatik anti badiler heterofil anti badiler Platelia Toxo IgG (72840) ve Platelia Toxo IgG TMB (72741) ile test edilmiştir. Platelia Toxo IgG testi ile 141 örnek negatif bulunmuş, 55 örnek pozitif bulunmuş ve 1 örnek şüpheli bulunmuştur. Tüm pozitif örnekler Platelia Toxo IgG TMB testi ile de pozitif bulunmuştur. 9.6 Hassasiyet Çalışma içinde hassasiyet (tekrarlanabilirlik): İntra-test tekrarlanabilirliğini değerlendirmek için, bir negatif ve üç pozitif örnek aynı çalışma sırasında 32 kez test edildi. Her örnek için konsantrasyon (IU/ml) belirlendi. Her örnek için konsantrasyonların (IU/ml) ortalaması, Standart Sapma (SD) ve Sapma Katsayısı (%CV) aşağıdaki tabloda listelenmiştir: Çalışma içinde hassasiyet (tekrarlanabilirlik) N=32 Negatif Örnek Düşük Pozitif Örnek Pozitif örnek Yüksek Pozitif Örnek Konsantrasyon (IU/ml) Ortalama SD % CV 7.2% 14.4% 6.9% 13.8% Çalışma arasında hassasiyet (tekrarlanabilirlik): İnter-test tekrarlanabilirliğini değerlendirmek amacıyla, dört örnek (bir negatif ve üç pozitif) 20 günlük sürede iki çalışmada tekrar test edilmiştir. Her örnek için konsantrasyon (IU/ml) belirlendi. Her örnek için konsantrasyonların (IU/ml) ortalaması, Standart Sapma (SD) ve Sapma Katsayısı (%CV) aşağıdaki tabloda listelenmiştir: Çalışma arasında hassasiyet (tekrarlanabilirlik) N=32 Düşük Pozitif Yüksek Pozitif Negatif Örnek Pozitif örnek Örnek Örnek Konsantrasyon (IU/ml) Ortalama SD % CV 32.6% 15.5% 10.1% 12.6% 9.7 Hassasiyet ve lineerlik Kalibrasyon hassasiyetini değerlendirmek için WHO Uluslararası Standart TOX-M çeşitli seyreltilerde test edilmiştir. Elde edilen sonuçlar Platelia TOXO IgG testinin WHO Uluslararası Standardı TOX-M için 30 IU/ml değerlerine kadar hassas şekilde kalibre edildiğini göstermiştir. 30 IU/ml üzerinde elde edilen sonuçlar yaklaşık %25 ila 50 eksik tahmin edilmiştir. 5 pozitif örneğin seri seyreltilmesi kullanılarak Platelia Toxo IgG test aralığı 7 ve 200 UI/ml arasında oluşturulmuştur. 10. PROSEDÜRÜN KISITLAMALARI T. gondii enfeksiyonu teşhisi sadece klinik ve biyolojik verilerin kombinasyonuna dayalı olarak yapılabilir. Anti-T. gondii IgG anti badilerin titrasyonunun tek bir test sonucu son zamanlarda meydana gelmiş Toksoplazma gondii enfeksiyonu için yeterli kanıt sağlamaz. 9

10 Son zamanlarda meydana gelen enfeksiyon sadece klinik ve biyolojik veriler dahil eksiksiz hasta bilgilerinin tümü ile teşhis edilebilir (3 hafta aralıkla hastadan alınan 2 serumun incelenmesinde anti-t. gondii IgG anti badilerin ciddi şekilde artışı, ciddi seviyelerde anti-t. gondii IgM varlığı, düşük anti-t. gondii IgG isteği demonstrasyonu). Anti-T. gondii IgM antibadilerin varlığı yeni bir enfeksiyon için tek başına yeterli kanıt oluşturmaz çünkü IgM enfeksiyondan bir kaç ay hatta yıllar sonra bile görülebilir. IgM bulunduğunda, anti-t. gondii anti badilerin üç hafta sonra alınacak ikinci serum örneğinde tekrar çalışılmasının yanında anti-t. gondii IgG anti badilerin kantitatif belirlenmesi yapılmalıdır. Eğer örnek enfeksiyon başlangıcından hemen önce çok erken test edildiyse, anti-t. gondii IgM antibadiler var olmayabilir. Şüphe oluştuğu takdirde, ikinci örnek 3 hafta sonra alınarak IgM testi tekrar gerçekleştirilmelidir. 11. ÜRETİCİNİN KALİTE KONTROLÜ Üretilmiş olan tüm reaktifler, ham maddenin gelişinden nihai ürünün piyasaya sunuluşuna kadar Kalite Sistemimize uygun şekilde hazırlanmıştır. Her lot kalite kontrol değerlendirmelerine sokulmuş ve sadece önceden belirlenmiş kabul kriterlerine uygunluğu tespit edildikten sonra piyasaya verilmiştir. Her lotun üretim ve kontrolüne ilişkin kayıtlar Bio-Rad tarafından tutulmaktadır. 12. REFERANSLAR 1. ANDERSON S.E. and REMINGTON J.S. : The diagnosis of toxoplasmosis. Southern Med. J. 1975; 68, DECOSTER A., DARCY F., CARON A., VINATIER D., HOUZE DE L AULNOIS D., VITTU G., NIEL G., HEYER F., LECOLIER B., DELCROIX M., MONNIER J.C., DUHAMEL M. and CAPRON A. : Anti-P30 IgA antibodies as prenatal markers of congenital Toxoplasma infection. 1992; 87, JENUM P.A., STRAY-PEDERSEN B., MELBY K.K., KAPPERUD G., WHITELAW A., ESKILD A. and ENG J. : Incidence of Toxoplasma gondii infection in pregnant women in Norway and pregnancy outcome forinfected women. J. Clin.Microbiol. 1998; 36, JENUM P.A. and STRAY-PEDERSEN B. : Development of specific immunoglobulins G, M, and A following Toxo-plasma gondii infection in pregnant women in Norway and pregnancy outcome for infected women. J. Clin. Microbiol. 1998; 36, JENUM P.A., STRAY-PEDERSEN B. and GUNDERSEN A.G. : Improved Diagnosis of primary Toxoplasma gondii infection in early pregnancy by determination of anti-toxoplasma immunoglobulin G avidity. J. Clin. Microbiol ; 35, LECOLIER B. and PUCHEU : Usefulness of IgG avidity analysis for the diagnosis of toxoplasmosis. Path. Biol. 1993; 42, REMINGTON J.S. and DESMONTS G. : Toxoplasmosis in infectious disease of the fetus and newborn infant. JS Remington and JO Klein, eds. WB Saunders Co., Philadelphia 1976; SULHANIAN A., NUGUES C., GARIN J.F., PELLOUX H., LONGUET P., SLIZEWICZ B. and DEROUIN F. : Serodiagnosis of toxoplasmosis in patients with acquired or reactivating toxoplasmosis and analysis of the specific IgA antibody response by ELISA, agglutination and immunoblotting. Immunol. Infect. Dis. 1993; 3, WILSON M., REMINGTON J.S., CLAVET C., VARNEY G., PRESS C., WARE D. and the FDA TOXOPLASMOSIS AD HOC WORKING group : Evaluation of six commercial kits for detection of human immunoglobulin M. Antibodies to Toxoplasma gondii. J. Clin. Microbiol. 1997; 35, WONG S.Y. and REMINGTON J.S. : Biology of Toxoplasma gondii. AIDS 1993; 7,

11 11

12 12

13 Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincare Marnes-la-Coquette - France Tel. : +33 (0) /11 Fax : +33 (0)