Monolisa HBe Ag-Ab PLUS

Transkript

1 Monolisa HBe Ag-Ab PLUS 2 plaka HBe Ag - 96 HBe Ab HBe Antijenleri İle Anti-HBe Antikorlarini İmmünoenzimatik Yöntemle Algilama Kiti /01

2 İÇİNDEKİLER 1. TESTİN AMACI 2. KLİNİK ÖNEMİ 3. TEST PRENSİBİ 4. KİTİN İÇİNDEKİLER 5. GEREKLİ OLAN ANCAK ÜRÜNLE BİRLİKTE VERİLMEYEN DONANIM 6. ÖNLEMLER 7. HİJYEN VE GÜVENLİK TALİMATLARI 8. REAKTİFLERİN YENİDEN OLUŞTURULMASI 9. SAKLAMA - GEÇERLİLİK 10. NUMUNELER 11. ÇALIŞMA ŞARTLARI 12. HESAPLAMALAR VE SONUÇLARIN DEĞERLENDİRİLMESİ 13. REAKTİF İLAVELERİNİN SPEKTROFOTOMETRİ İLE KONTROL EDİLMESİ 14. PERFORMANSLAR 15. KAYNAKÇA 2 [TR]

3 1 - TESTİN AMACI Monolisa HBe Ag-Ab PLUS insan serumu veya plazmasında mevcut hepatit B virüsü e antijeninin (Ag HBe) ve/veya hepatit B virüsü e antijenine yönelik antikorların (Anti-HBe) immünoenzimatik teknikle kalitatif olarak belirlenmesini sağlar. 2 - KLİNİK ÖNEMİ HBe antijeninin varlığı genellikle aktif viral çoğalma şeklinde açığa çıkar ve deneğin bulaşıcı olduğu anlamına gelir. HBe antijeni B tipi bir viral hepatitte erken ortaya çıkar ve (bir aydan daha uzun süre) kalması hepatopatinin ağırlaşması riskini ifade eder. HBe antijenine karşı antikorların ortaya çıkması viral çoğalmada düşüş olduğu gösterir ve genellikle hastalığın ilerleyişi ile ilgili olumlu bir klinik tahmini temsil eder). 3 - TEST PRENSİBİ a) HBe antijeninin algılanması Ag HBe antijeninin algılanması iki zamanlı sandviç tipi immünoenzimatik bir tekniğe dayanır; bu teknik bir insan Anti-HBe antikoru ve farklı epitopları tanıyan murin kaynaklı (Acm1 ve Acm2) işaretlenmiş bir çift monoklonal Anti-HBe antikoru kullanır. Solid faz, insan Anti-HBe antikorları ile duyarlılaştırılmış 8 polistiren kaptan oluşan 12 şeritten oluşmaktadır. İki monoklonal antikor peroksidaz ile birleştirilmiştir. Dozaj aşağıdaki reaksiyonel aşamaları içerir: 1.Solid faza sabitlenen ilk insan Anti-HBe antikoru mevcut iken gerçekleştirilen numune ve kontrol inkübasyonu. 2.Yıkama, ardından peroksidaz ile işaretlenmiş monoklonal antikor çifti ile çözünmez kılınmış komplekslerin inkübasyona tabi tutulması. 3.Yıkama yoluyla, serbest kalan konjugatın elimine edilmesi, ardından substrat ilavesi ile solid faza bağlı enzimatik faaliyetin develope edilmesi. 4.Developmanın durdurulması; ardından, 450/620 nm'de optik yoğunlukların okunması ve sonuçların yorumlanması. b) Anti-HBe antikorlarının algılanması Anti-HBe antikorlarının algılanması için, kit Anti HBe için kullanılan solid fazın aynısını kullanır. Test, nötrleştirme reaktifi olarak kullanılan plazma kökenli sınırlı miktardaki HBe antijeni karşısında, çözünmez kılınmış antikor ile numunede mevcut antikor arasında gerçekleşen kompetisyon prensibine dayanmaktadır. Developman daha sonra, peroksidaz ile işaretlenmiş başka bir çift monoklonal antikor karışımı (Acm1 ve Acm2) yardımıyla gerçekleştirilir. Test aşağıdaki reaksiyonel aşamaları içerir: 1. Solid faza sabitlenen ilk insan Anti-HBe antikoru ve nötrleştirme antijeni mevcut iken gerçekleştirilen numune ve kontrol inkübasyonu. 2. Yıkama, ardından peroksidaz ile işaretlenmiş monoklonal antikor çifti ile çözünmez kılınmış komplekslerin inkübasyona tabi tutulması. 3. Yıkama yoluyla, serbest kalan konjugatın elimine edilmesi, ardından substrat ilavesi ile solid faza bağlı enzimatik faaliyetin develope edilmesi. 4. Developmanın durdurulması; ardından, 450/620 nm'de optik yoğunlukların okunması ve sonuçların yorumlanması. 3 [TR]

4 4 - KİTİN İÇİNDEKİLER Tüm reaktifler "in-vitro" teşhis amacıyla kullanılmaya yöneliktir Reaktifler 1 ila 12 bağımsız işlem şeklinde 2 x 96 ölçüm gerçekleştirmek için yeterli miktarda verilmiştir: yani 96 Ag HBe ölçümü ve 96 Ac HBe ölçümü ya da eşzamanlı olarak 2 x 48 Ag HBe ölçümü ve 2 x 48 Anti-HBe ölçümü. Etiketleme R1 Microplate R2 Concentrated washing solution (20X) R3 Negative control R4 HBe Ab positive control R5 HBe Ag positive control Reaktiflerin Niteliği Mikroplaka Etkisiz hale getirilmiş, Ag HBs açısından pozitif serumlardan elde edilen insan Anti-HBe antikorları ile duyarlı kılınmış 8 kaptan oluşan 12 şerit Konsantre yikama solüsyonu (20X) NaCl ph 7,4 Tris Tamponu Koruyucu: ProClin 300 (%0,04) Negatif Kontrol (Ag HBe/Anti-HBe testleri için ortak) Anti-HIV1 ve anti-hiv 2 antikorları, HBs antijeni ve anti-hcv antikorları açısından negatif insan serumu Koruyucu: < % 0,1 sodyum azid Anti-HBe testi pozitif kontrolü Anti-HBe antikorları içeren ve potansiyel olarak AgHBs açısından pozitif, anti-hiv1 antikorları ve anti-hiv2 ve anti-hcv antikorları açısından negatif, etkisiz hale getirilmiş insan serumu Koruyucu: < % 0,1 sodyum azid Ag HBe testi pozitif kontrolü Fibrinsiz insan plazması veya Ag HBe ve Ag HBs açısından pozitif, anti-hiv1, anti-hiv2 antikorları ve anti- HCV antikorları açısından negatif serum içeren, etkisiz hale getirilmiş sentetik sulandırıcı Koruyucu: < % 0,1 sodyum azid R6 Neutralizing HBe Ag Nötrleştirme antijeni Fibrinsiz insan plazması veya Ag HBe ve Ag HBs açısından pozitif, anti-hiv1, anti-hiv2 antikorları ve anti- HCV antikorları açısından negatif serum içeren, etkisiz hale getirilmiş sentetik sulandırıcı Koruyucu: < % 0,1 sodyum azid R7a Concentrated anti HBe conjugate R7b Concentrated Ag HBe conjugate R8 Substrate buffer R9 Chromogen: TMB solution (11X) R10 Stopping solution 5X konsantre, Anti-HBe test konjugati Peroksidaz ile bağlantılı 2 adet Anti-HBe monoklonal murin antikoru (Acm1 ve Acm2)* Koruyucu: ProClin 300 (%0,5) 5X konsantre, Ag HBe test konjugati Peroksidaz ile bağlantılı 2 adet Anti-HBe monoklonal murin antikoru (Acm1 ve Acm2)* Koruyucu: ProClin 300 (%0,5) Peroksidaz substrat tamponu % 0,015 H 2 O2 2 ve % 4 dimetilsülfoksit (DMSO) içeren sitrik asit ve sodyum asetat ph 4,0 solüsyonu Kromojen Tetrametil benzidin (TMB) içeren pembe renkli solüsyon Durdurma solüsyonu 1 N sülfürik asit solüsyonu Sulandirilmiş R2 için boş şişe Sunum plaka 235 ml 8 ml 1,5 ml 1,5 ml 8 ml 3 ml 3 ml 60 ml 5 ml 28 ml 25 ml 4 [TR]

5 * acm1/acm2 oranları R7a ve R7b konjugatlarından her biri için farklıdır. Bu iki konjugatı birbirinin yerine kullanmayın. 5 - GEREKLİ OLAN ANCAK ÜRÜNLE BİRLİKTE VERİLMEYEN MALZEMELER Damıtık veya tamamen demineralize su. Çamaşır suyu veya sodyum bikarbonat. Emici kâğıt. Tek kullanımlık eldivenler. Tek kullanımlık (12 x 75 mm) polistiren borular. 50 µl, 100 µl, 200 µl ve 1 ml'lik hacimler dağıtabilen ayarlanabilir veya sabit, otomatik veya yarı otomatik pipetler 10 ml, 50 ml, 100 ml, ml dereceli deney tüpleri Vorteks tipi çalkalayıcı Kontamine atık konteyneri Mikroplakalar* için otomatik, yarı otomatik veya manüel yıkama sistemi 37 C ± 1 C* termostatlı benmari veya kuru inkübatör 450 nm ve 620 nm* filtrelerle donatılmış, mikroplaka okuma cihazı (*) Teknik servislerimiz tarafından onaylanan cihazlar konusunda tam bilgi edinmek için bize danışınız. 6 - ÖNLEMLER Elde edilecek sonuçların kalitesi aşağıdaki laboratuar uygulamalarına tam olarak uyulmasına bağlıdır: Aynı deney sırasında farklı partilere ait reaktifleri birbirine karıştırmayın. NOT: Aynı deney boyunca hep aynı partiyi kullanmak kaydıyla, kitte teslim edilenlerden farklı yıkama solüsyonu (etiketin üzerindeki yeşil 20X ibaresi ile tanıtılan, R2), substrat tamponu (mavi TMB buf. ibaresi ile tanıtılan, R8), kromojen (menekşe rengi TMB 11X. ibaresi ile tanıtılan, R9) ve durdurma solüsyonu (kırmızı 1N ibaresi ile tanıtılan, R10) partileri kullanmak mümkündür. Bu reaktifler şirketimizin diğer ürünleri ile birlikte kullanılabilir. Ayrıca, belli bir deneyde bir tek karışımın kullanılması kaydıyla, yıkama solüsyonu (etiketin üzerindeki yeşil 20X ibaresi ile tanıtılan, R2) düzgün bir şekilde yeniden oluşturulan farklı Bio-Rad reaktif kitlerine dahil edilmiş diğer iki yıkama solüsyonundan biri ile (etiketin üzerindeki mavi bir 10X veya turuncu bir 10X ibaresi ile tanıtılan, R2) karıştırılabilir. Ayrıntılı bilgi edinmek için teknik servislerimizle irtibat kurunuz. Test ismi ve test özel tanıtım numarası her mikroplaka çerçevesinin üzerinde belirtilmiştir. Bu özel tanıtım numarası her şeridin üzerinde de yer alır. Monolisa HBe Ag-Ab PLUS: Özel Tanıtım Numarası = 56. Bu tanıtım numarası her kullanımdan önce kontrol edilmelidir. Test numarası bulunmayan veya yukarıda bahsi geçen test numarasından farklı olan hiçbir şerit, kullanılmamalıdır. Son kullanma tarihi geçen reaktifleri kullanmayın. Kullanımdan önce, reaktiflerin ortam sıcaklığında (18-30 ) dengelenmesi için, 30 dakika ve sulandırılmış yıkama solüsyonu (R2) için bir saat bekleyin. Her türlü kontaminasyonu önleyerek, reaktifleri özenle tekrar oluşturun Konjugatların enzimatik faaliyetini bozabilecek reaktif buharlar (asitler, alkaliler, aldehitler) veya tozlar mevcut iken test yapmayın. Damıtık su ile mükemmel bir şekilde yıkanmış cam aletler veya tercihen tek kullanımlık donanım kullanın. Yıkama işleminin sonu ile reaktiflerin dağıtımı arasında geçen sürede mikroplakanın kurumasına izin vermeyin. Her serum için yeni bir dağıtım konisi kullanın. 5 [TR]

6 Kapların yıkanması, yapılan işlemler açısından önemli bir aşama teşkil eder: tavsiye edilen yıkama döngüleri sayısına uyun ve tüm kapların tamamen doldurulup, ardından tamamen boşaltılmasına özen gösterin. Kötü bir yıkama işlemi yanlış sonuçlar elde edilmesine yol açar. Konjugatı ve developman solüsyonunu dağıtmak için asla aynı kabı kullanmayın. Pipetlerin doğruluğunu ve hassasiyetini ve kullanılan cihazların düzgün çalıştığını konrol edin. İşlem protokolünü değiştirmeyin. Enzimatik developman solüsyonunu dağıtmadan önce kontrol edin. Bu solüsyon pembe renkte olmalıdır. Solüsyonun rengi mavimsi ise, developman solüsyonu bozulmuştur ve testte kullanılamaz. 7 - HİJYEN VE GÜVENLİK TALİMATLARI Çantadaki tüm reaktifler "in vitro" teşhis amacıyla kullanılmaya yöneliktir. Reaktifler ve numuneleri kullanırken tek kullanımlık eldivenler giyin ve söz konusu maddeleri kullandıktan sonra ellerinizi özenle yıkayın. "Ağzınızla pipetlemeyin". R3 reaktifinin (negatif kontrol) hazırlanmasında kullanılan insan kaynaklı malzeme, Hepatit B virüsü yüzey antijeni (Ag HBs), HIV virüslerine yönelik (HIV-1 ve HIV-2) antikorlar ve Hepatit C (anti-hcv) virüsüne yönelik antikorlar açısından kontrol edilmiş ve reaktif olmadığı belirlenmiştir. R1 reaktifinin (duyarlı kılınmış plaka) hazırlanmasında kullanılan insan kaynaklı malzeme HIV virüslerine yönelik antikorlar (anti HIV-1 ve anti-hiv-2) ve hepatit C virüsüne (HCV) yönelik antikorlar açısından kontrol edilmiş ve reaktif olmadığı belirlenmiştir. Bu malzeme hepatit B virüsü yüzey antijeni (Ag HBs) açısından reaktiftir. Muhtemelen fotokimyasal olarak etkisiz hale getirilmiştir. R4 (Anti HBe testi pozitif kontrolü), R5 (Ag HBe testi pozitif kontrolü) et R6 (nötrleştirme antijeni) reaktiflerinin hazırlanmasında kullanılan insan kaynaklı malzeme, HIV virüslerine yönelik antikorlar (anti-hiv-1 et anti HIV-2) ve anti-hcv antikorları açısından kontrol edilmiş ve reaktif olmadığı belirlenmiştir. R5 ve R6 reaktifleri hepatit B virüsü yüzey antijeni (Ag HBs) açısından pozitiftir; R4 reaktifi hepatit B virüsü yüzey antijeni (Ag HBs) açısından potansiyel olarak pozitiftir. Bu reaktifler fotokimyasal olarak etkisiz hale getirilmiştir. Hiçbir yöntem HIV, HBV, HCV virüslerinin veya diğer bulaşıcı ajanların bir ortamda bulunmadığını kesin bir şekilde garanti edemediği için, insan kaynaklı reaktifleri ve hasta numunelerini potansiyel olarak bulaşıcı malzeme addedin ve olağan önlemler ile kullanın. Numuneler ve insan kaynaklı reaktifler ile doğrudan temas eden malzemeyi ve ayrıca yıkama solüsyonlarını kontamine ürünler addedin. Numunelerin veya bunları içeren solüsyonların sıçramasına engel olun. Kirlenen yüzeyler % 10 sulandırılmış çamaşır suyu ile temizlenecektir. Bulaşan sıvı bir asit ise, kirlenen yüzeyler önceden sodyum bikarbonat ile nötrleştirilecek, ardından çamaşır suyu ile temizlenecek ve emici kâğıt ile kurutulacaktır. Temizleme işleminde kullanılan malzeme kontamine atıklar için öngörülmüş özel bir konteynere atılmalıdır. İnsan kaynaklı numuneler ve reaktifler ve kontamine malzeme ve ürünler, bulaşıcı özellikleri giderildikten sonra atılacaktır: - Bu işlem, ya % 5 sodyum hipoklorit son konsantrasyonlu çamaşır suyuna (10 hacim kontamine sıvı veya su için, 1 hacim çamaşır suyu) 30 dakika boyunca batırılarak, - Ya da minimum 2 saat boyunca 121 C'de otoklavlama vasıtasıyla gerçekleştirilir. Otoklavlama, HIV ve HBV virüslerini etkisiz hale getirmek için en iyi yöntemdir. DİKKAT: SODYUM HİPOKLORİT İÇEREN SOLÜSYONLARI OTOKLAVIN İÇİNE SOKMAYIN. 6 [TR]

7 Solüsyonları veya yıkama atık sıvılarını veya biyolojik numuneler içeren herhangi bir sıvıyı lavaboya atmadan önce, nötrleştirmeyi ve/veya otoklavlamayı unutmayın. Güvenlik verileri fişi talep üzerine verilmektedir. Kimyasal ürünler doğru laboratuar uygulamalarına göre kullanılmalı ve atılmalıdır. Substrat tamponunun, kromojenin ve durdurma solüsyonunun cilt ve mukozalar ile hiçbir şekilde temas etmesine izin vermeyin (toksisite, tahriş veya yanık riski). Bu test kitinde bulunan kimyasal komponentlerle ilgili tehlikeler ve bunlardan korunma yöntemleri konusunda öneriler için lütfen etiketler üzerinde bulunan ve ayrıca bu kullanım talimatlarının sonunda yer alan resimli grafiklere başvurun. Güvenlik Veri Sayfası adresinde bulunabilir. 8 - REAKTİFLERİN YENİDEN OLUŞTURULMASI Not: Kullanımdan önce, reaktiflerin ortam sıcaklığında (18-30 C) dengelenmesini sağlayın. Mikroplaka (R1) 12 şerit içeren her taşıyıcı çerçeve kapalı alüminyum poşet içine konulmuştur. Poşeti makas veya bıçak ile birleşme noktasının 0,5 ila 1 cm üzerinde kesin. Poşeti açın ve çerçeveyi poşetten çıkarın. Kullanılmayan şeritleri tekrar poşetin içine yerleştirin. Poşeti özenle kapatın ve yeniden +2-8 C sıcaklıkta muhafaza edin. Konsantre yıkama solüsyonu (20X): R2 Solüsyonu damıtık su ile 20 kez sulandırın. Bu şekilde, kullanıma hazır yıkama solüsyonu elde edilir. Bir şerit için 75 ml kullanıma hazır solüsyon gerekir. Homojenleştirin. KONJUGATLAR Anti -HBe Test Konjugatı (R7a) Kullanılan şerit sayısına göre, R7a solüsyonunu önceden sulandırılmış olan R2 solüsyonunda 1/5 oranında sulandırın: Kullanılan şerit sayısı R7a solüsyon hacmi (ml) R2 ile sulandırılmış miktar 1 0, , , , , , , , , ,4 12 Homojenleştirin. Konjugat sırasıyla, kullanıma hazır 80 µl sulandırılmış R2, ardından 20 µl 5X konjugat ilave edilerek, önceden sulandırılmadan da kullanılabilir. Çalkalayın. Ag HBe Test Konjugatı (R7b) R7a konjugatı için kullanılan protokolün aynısını kullanın. 7 [TR]

8 Enzimatik developman solüsyonu (R8 + R9) 1/11 oranında sulandırmaya dikkat ederek, reaktif R9'u reaktif R8'e karıştırın (10 hacim R8 içinde, 1 hacim R9). Homojenleştirin. 1 ila 10 şerit için, 10 ml gerekli ve yeterlidir. 9 - SAKLAMA - SON KULLANMA TARİHİ Kit +2-8 C sıcaklıkta saklanmalıdır C sıcaklıkta saklanan kitteki her unsur kutunun üzerinde belirtilen son kullanma tarihine kadar kullanılabilir (özel bir uyarı bulunmadığı takdirde). R1: Vakumlu poşetin açılmasından sonra, +2-8 C sıcaklıkta muhafaza edilen ve özenle kapatılan orijinal ambalajlarındaki şeritler 1 ay dayanabilir. R2: Sulandırılmış yıkama solüsyonu C sıcaklıkta 2 hafta saklanabilir. Konsantre yıkama solüsyonu (R2) C sıcaklıkta muhafaza edilebilir. R7a: Anti-HBe testinin sulandırılmış konjugatı ortam sıcaklığında (18-30 C) 8 saat saklanabilir. Sulandırılmış konjugat ışık almayan bir yerde, ortam sıcaklığında (18-30 C) saklanmalıdır. R7b: Ag-HBe testinin sulandırılmış konjugatı ortam sıcaklığında (18-30 C) 8 saat saklanabilir. Sulandırılmış konjugat ışık almayan bir yerde, ortam sıcaklığında (18-30 C) saklanmalıdır. R8 + R9: Yeniden oluşturulduktan sonra, karanlıkta saklanan reaktifler ortam sıcaklığında (18-30 C) 6 saat boyunca kullanılabilir NUMUNELER Olağan uygulama yöntemleriyle bir kan numunesi alın. Testler sulandırılmamış serum veya plazma numuneleri üzerinde yapılacaktır (numuneler EDTA, heparin, sitrat gibi antikoagülanlar ile alınır). Çok belirgin bir hemoliz test performanslarını etkileyebilir. Agrega içeren numuneler testten önce santrifugasyon ile arıtılmalıdır. Süspansiyon halindeki partiküller veya fibrin agregaları yanlış pozitif sonuçlar elde edilmesine yol açabilir. Tarama 7 gün içinde yapılır ise, numuneler +2-8 C sıcaklıkta saklanacaktır veya -20 C sıcaklıkta dondurulmuş olarak birkaç ay saklanabilecektir. Örnekleri ısıtmak etmeyin. Dondurma/Çözdürme işlemlerini tekrarlamaktan kaçının. 3 defadan fazla dondurulan ve çözdürülen numuneler kullanılmamalıdır. Eğer numuneler taşınacak ise, bunları etyolojik ajanların taşınması ile ilgili yürürlükteki mevzuata uygun şekilde ambalajlayın ve tercihen dondurulmuş olarak taşıyın. KONTAMİNE VEYA HİPERLİPEMİK VEYA HİPERHEMOLİZE TABİ TUTULMUŞ VEYA HİPERPROTEİNLİ SERUMLAR KULLANMAYIN NOT: 100 mg/l'ye kadar bilirubin içeren numunelerde ve ayrıca 36 gr/l'ye kadar triolein içeren lipemik numunelerde ve 2,5 mg/ml'ye kadar hemoglobin içeren hemolizli numunelerde hiçbir etkileşim ispatlanamamıştır. 45 mg/ml albumin ile aşırı yükleme yapılmış negatif numunelerde, oranlarda hiperproteinemiyi takit eden bir azalma gözlemlenmiştir ÇALIŞMA ŞARTLARI Ag HBe ve Anti-HBe testleri aynı plaka üzerinde yapılabilir. Bu durumda, size aşağıdakileri tavsiye ediyoruz: Anti-HBe testi: Sütun 1 ila 6 Ag HBe testi: Sütun 7 ila 12 Yıkama için, asgari hacim, yıkama ve hazne başına 0,55 ml'dir. 8 [TR]

9 a) Anti-HBe test protokolü 1. Yıkama solüsyonunu hazırlayın. 2. Taşıyıcı çerçeve ile gerekli sayıda şeridi koruyucu ambalajdan çıkarın. Kullanılmayan şeritleri tekrar ambalajın içine yerleştirin ve ambalajı kapatın. 3. Kaplara art arda aşağıdaki malzemeleri dağıtın (önerilen plaka planı): A1, B1, C1: 100 µl negatif kontrol (R3) D1: 100 µl pozitif kontrol (R4) E1, F1, G1: 100 µl bilinmeyen numune. Kullanılan sisteme bağlı olarak, kontrollerin konumu veya dağıtım sırası değiştirilebilir. Not: Görsel olarak, şeffaf boş bir kap ile numune içeren (açık sarı) bir kap arasında net bir renk farkı görülebilir. 490 nm'de fotometrik ölçüm yapılarak kaplarda numune olup olmadığı kontrol edilebilir (bkz. bölüm 13: REAKTİF İLAVELERİNİN SPEKTROFOTOMETRİ İLE KONTROL EDİLMESİ). 4. Her kaba hızlı bir şekilde 50 µl nötrleştirici antijen (R6) ilave edin. Homojenleştirin. Üstünü yapışkan bir filmle örtün; 37 C ± 1 C sıcaklıkta 3 saat ± 10 dakika inkübe edin. Not: Görsel olarak, nötrleştirici antijen R6'nın ilave edilmesinden sonra pembe bir renk gözlemlenebilir. 490 nm'de yapılan fotometrik bir okuma ile kaplarda nötrleştirici antijen R6 bulunup bulunmadığı kontrol edilebilir. (bkz. bölüm 13: REAKTİF İLAVELERİNİN SPEKTROFOTOMETRİ İLE KONTROL EDİLMESİ). 5. R7a konjugat solüsyonunu ilk inkübasyon sona ermeden önce hazırlayın. 6. Yapışkan filmi çıkarın; her kabın içeriğini çekerek atık konteynerine boşaltın, ardından dört kez yıkayın. 7. Önceden sulandırılmış 100 µl R7a konjugat solüsyonunu hızlı bir şekilde her kaba dağıtın (bkz. bölüm 8: REAKTİFLERİN YENİDEN OLUŞTURULMASI) veya, konjugat önceden sulandırılmadan da kullanılabileceğinden, her kaba sırasıyla, 80µl sulandırılmış R2, ardından 20µl R7a konjugatı ilave edin. Homojenleştirin. Üstünü yapışkan bir filmle örtün ve 37 C ± 1 C sıcaklıkta 30 dakika (minimum 25 dakika, maksimum 40 dakika) inkübe edin. Yapışkan filmi çıkarın; her kabın içeriğini çekerek atık konteynerine boşaltın, ardından beş kez yıkayın. Not: Görsel olarak, konjugat R7a'nın ilave edilmesinden sonra mor bir renk gözlemlenebilir. 620 nm'de yapılan fotometrik bir okuma ile kaplarda konjugat R7a bulunup bulunmadığı kontrol edilebilir. (bkz. bölüm 13: REAKTİF İLAVELERİNİN SPEKTROFOTOMETRİ İLE KONTROL EDİLMESİ). 8. Enzimatik developman solüsyonunu (R8 + R9) hazırlayın 9. Her kaba hızlı bir şekilde 80 µl developman solüsyonu ilave edin ve plakayı 30 dakika ± 5 dakika karanlıkta ve ortam sıcaklığında ( C) tutun. Not: Pembe renkte olan developman solüsyonunun dağıtılması, işlemlerin bu aşamasında görsel olarak kontrol edilebilir. Boş bir kap ile pembemsi renkteki developman solüsyonunu içeren bir kap arasında önemli bir renk farkı vardır (otomatik kontrol için paragraf 13'e başvurun: NUMUNE VE REAKTİF İLAVELERİNİN SPEKTROFOTOMETRİ İLE KONTROL EDİLMESİ). 10. Her kaba hızlı bir şekilde 100 µl durdurma solüsyonu (R10) ilave edin. Not: Renksiz olan durdurma solüsyonunun dağıtılması, işlemlerin bu aşamasında görsel olarak kontrol edilebilir. Substratın pembemsi (negatif numuneler için) veya mavi (pozitif numuneler için) olan rengi, durdurma solüsyonu ilave edildikten sonra renksiz hale gelen (negatif numuneler için) veya rengi sarıya dönen (pozitif numuneler için) kaplardan kaybolur. 11. Okuma yapmadan önce 4 dak. bekleyin. Plakanın altını özenle silin ve reaksiyonun sona ermesini müteakip 30 dakika içerisinde 450/620 nm'de optik yoğunluğu okuyun. 9 [TR]

10 b) Ag HBe test protokolü 1. Yıkama solüsyonunu hazırlayın. 2. Taşıyıcı çerçeve ile gerekli sayıda şeridi koruyucu ambalajdan çıkarın. Kullanılmayan şeritleri tekrar ambalajın içine yerleştirin ve ambalajı kapatın. 3. Kaplara art arda aşağıdaki malzemeleri dağıtın (önerilen plaka planı): A1, B1, C1: 100 µl negatif kontrol (R3) D1: 100 µl pozitif kontrol (R5) E1, F1, G1: 100 µl bilinmeyen numune Kullanılan sisteme bağlı olarak, kontrollerin konumu veya dağıtım sırası değiştirilebilir. Not: Görsel olarak, şeffaf boş bir kap ile numune içeren (açık sarı) bir kap arasında net bir renk farkı görülebilir. 490 nm'de fotometrik ölçüm yapılarak kaplarda numune olup olmadığı kontrol edilebilir (bkz. bölüm 13: REAKTİF İLAVELERİNİN SPEKTROFOTOMETRİ İLE KONTROL EDİLMESİ). 4. Üstünü yapışkan bir filmle örtün; 37 C ± 1 C sıcaklıkta 3 saat ± 10 dakika inkübe edin. 5. R7b konjugat solüsyonunu ilk inkübasyon sona ermeden önce hazırlayın. 6. Yapışkan filmi çıkarın; her kabın içeriğini çekerek atık konteynerine boşaltın, ardından dört kez yıkayın. 7. Önceden sulandırılmış 100 µl R7b konjugat solüsyonunu hızlı bir şekilde her kaba dağıtın (bkz. bölüm 8: REAKTİFLERİN YENİDEN OLUŞTURULMASI) veya konjugat önceden sulandırılmadan da kullanılabileceğinden, her kaba sırasıyla, 80 µl sulandırılmış R2, ardından 20 µl R7b konjugatı ilave edin. Homojenleştirin. Üstünü yapışkan bir filmle örtün ve 37 C ± 1 C sıcaklıkta 30 dakika (minimum 25 dakika, maksimum 40 dakika) inkübe edin. Filmi çıkarın; her kabın içeriğini atık konteynerine boşaltın, ardından beş kez yıkayın. Not: Görsel olarak, konjugat R7b'nin ilave edilmesinden sonra turkuaz mavisi bir renk gözlemlenebilir. 620 nm'de yapılan fotometrik bir okuma ile kaplarda konjugat R7b bulunup bulunmadığı kontrol edilebilir. (bkz. bölüm 13: REAKTİF İLAVELERİNİN SPEKTROFOTOMETRİ İLE KONTROL EDİLMESİ). 8. Enzimatik developman solüsyonunu (R8 + R9) hazırlayın 9. Her kaba hızlı bir şekilde 80 µl developman solüsyonu ilave edin ve plakayı 30 dakika ± 5 dakika karanlıkta ve ortam sıcaklığında ( C) tutun. Not: Pembe renkte olan developman solüsyonunun dağıtılması, işlemlerin bu aşamasında görsel olarak kontrol edilebilir. Boş bir kap ile pembemsi renkteki developman solüsyonunu içeren kap arasında önemli bir renk farkı vardır. (otomatik kontrol için paragraf 13'e başvurun: NUMUNE VE REAKTİF İLAVELERİNİN SPEKTROFOTOMETRİ İLE KONTROL EDİLMESİ). 10. Her kaba hızlı bir şekilde 100 µl durdurma solüsyonu (R10) ilave edin. Not: Renksiz olan durdurma solüsyonunun dağıtılması, işlemlerin bu aşamasında görsel olarak kontrol edilebilir. Substratın pembemsi (negatif numuneler için) veya mavi (pozitif numuneler için) olan rengi, durdurma solüsyonu ilave edildikten sonra renksiz hale gelen (negatif numuneler için) veya rengi sarıya dönen (pozitif numuneler için) kaplardan kaybolur. 11. Okuma yapmadan önce 4 dak. bekleyin. Plakanın altını özenle silin ve reaksiyonun sona ermesini müteakip 30 dakika içerisinde 450/620 nm'de optik yoğunluğu okuyun. c) Aynı plaka üzerinde Anti-HBe ve Ag HBe test protokolü Protokoller daha önce tanımlananlar ile tamamen aynıdır. Sadece plaka üzerindeki diziliş düzeni farklıdır. Anti-HBe testi: Sütun 1 ila 6 Ag HBe testi: Sütun 7 ila [TR]

11 12 - HESAPLAMALAR VE SONUÇLARIN YORUMLANMASI a) Anti-HBe testi 1. Negatif kontrollerin ortalama optik yoğunluğunu hesaplayın: R3 OPTİK YOĞUNLUĞU Örnek: Negatif Kontrol R3 OPTİK YOĞUNLUK 1 1, , ,552 Toplam = 4,569 Ortalama R3 Optik Yoğunluğu = 4,569 / 3 = 1,523 Optik Yoğunluk değeri ortalamadan %25 sapma gösterdiğinde, bir negatif kontrolün değerini elimine etmek mümkündür. Bu durumda, ortalamayı diğer iki değer üzerinden hesaplayın. 2. Eşik değerin hesaplanması Her plaka için, eşik değer: Eşik değer = VS = R3 OPTİK YOĞUNLUĞU x 0,4 Örnek: R3 OPTİK YOĞUNLUĞU = 1,523 VS = 1,523 x 0,4 = 0, Anti-HBe testinin onaylanması R3 OPTİK YOĞUNLUĞU > 0,900 R4 OPTİK YOĞUNLUĞU < 0, Oranların hesaplanması Her numune için oranı hesaplayın: Oran= Numune Optik Yoğunluk Değeri/VS 5. Sonuçların Yorumlanması Oranı 0,9 değerine eşit veya bu değerin altında olan tüm numuneler pozitif kabul edilir (oran 0,9). Oranı 1,1 değerinin üzerinde olan tüm numuneler negatif kabul edilir (oran > 1,1). 0,9 ile 1,1 arasındaki oranlar için (0,9 < oran 1,1), daha sonra alınacak bir numunede tekrar anti HBe araştırması yapılması tavsiye edilir. Pozitif numunelerin çift olarak tekrar teste tabi tutulması tavsiye edilir. Testin tekrarlanmasından sonra, 2 çiftten en az birinin değeri pozitif ise, numune pozitif addedilir. b) Ag HBe testi 1. Negatif kontrollerin ortalama optik yoğunluğunu hesaplayın: R3 OPTİK YOĞUNLUĞU Örnek: Negatif Kontrol R3 OPTİK YOĞUNLUK 1 0, , ,026 Toplam = 0,071 Ortalama R3 OPTİK YOĞUNLUĞU= 0,071 / 3 = 0,024 OPTİK YOĞUNLUK değeri ortalamadan %25 sapma gösterdiğinde, bir negatif kontrolün değerini elimine etmek mümkündür. Bu durumda, ortalamayı diğer iki değer üzerinden hesaplayın. 11 [TR]

12 2. Eşik değerin hesaplanması Her plaka için, eşik değer: Eşik değer = VS = R3 OPTİK YOĞUNLUĞU + 0,025 Örnek: R3 OPTİK YOĞUNLUĞU = 0,024 Adım = 0,025 VS = 0,024+ 0,025 = 0, Ag HBe testinin onaylanması R3 OPTİK YOĞUNLUĞU < 0,060 R5 OPTİK YOĞUNLUĞU > 0, Oranların hesaplanması Her numune için oranı hesaplayın: Numune Opt. Yoğ. Oran = VS 5. Sonuçların Yorumlanması Oranı 1 değerinin altında olan tüm numuneler negatif kabul edilir (oran < 1). Oranı 1 değerine eşit veya bu değerin üstünde olan tüm numuneler pozitif kabul edilir (oran 1). Pozitif numunelerin çift olarak tekrar teste tabi tutulması tavsiye edilir. Testin tekrarlanmasından sonra, iki çiftten en az birinin değeri pozitif ise, numune pozitif addedilir REAKTİF İLAVELERİNİN SPEKTROFOTOMETRİ İLE KONTROL EDİLMESİ 1 - Anti-HBe testi Numune ve kontrol ilavesinin kontrol edilmesi Kaplarda numune ve kontrol bulunup bulunmadığı 490 nm'de yapılacak fotometri ölçümü ile kontrol edilebilir. OPTİK YOĞUNLUK değeri 0,050'nin üzerinde olmalıdır. Görsel olarak, şeffaf boş bir kap ile numune içeren (açık sarı) bir kap arasında net bir renk farkı gözlemlenebilir. Nötrleştirme Ag ilavesinin (R6) kontrol edilmesi Kaplarda R6 bulunup bulunmadığı, 490 nm'de yapılan bir okuma vasıtasıyla, OPTİK YOĞUNLUK delta değerinin hesaplanması ile kontrol edilebilir. OPTİK YOĞUNLUK Delta Değeri = (numune (veya kontrol) ve nötrleştirici antijen R6 mevcut iken 490 nm'de kabın OY değeri) (sadece numune (veya kontrol) mevcut iken 490 nm'de kabın OY değeri). OPTİK YOĞUNLUK farkı 0,150'nin üzerinde olmalıdır. Görsel olarak, R6'nın ilave edilmesinden sonra pembe bir renk gözlemlenebilir. Konjugat (R7a) ilavesinin kontrol edilmesi Konjugat bulunup bulunmadığı 620 nm'de yapılan fotometrik bir okuma ile kontrol edilebilir. OPTİK YOĞUNLUK değeri 0,070 ile 0,200 arasında olmalıdır (0,070 OY 0,200) Görsel olarak, R7a'nın ilave edilmesinden sonra mor bir renk gözlemlenebilir. Developman solüsyonu ilavesinin kontrol edilmesi (R8+R9) Developman solüsyonu bulunup bulunmadığı, 490 nm'de yapılan fotometrik bir okuma ile kontrol edilebilir. OPTİK YOĞUNLUK değeri 0,100'ün üzerinde olmalıdır. 12 [TR]

13 Görsel olarak, developman solüsyonunun ilave edilmesinden sonra, pembe bir renk gözlemlenebilir. 2 - HBe Ag testi Numune ve kontrol ilavesinin kontrol edilmesi Kaplarda numune ve kontrol bulunup bulunmadığı 490 nm'de yapılacak fotometri ölçümü ile kontrol edilebilir. OPTİK YOĞUNLUK değeri 0,050'nin üzerinde olmalıdır. Görsel olarak, şeffaf boş bir kap ile numune içeren (açık sarı) bir kap arasında net bir renk farkı gözlemlenebilir. Konjugat (R7b) ilavesinin kontrol edilmesi Konjugat bulunup bulunmadığı 620 nm'de yapılan fotometrik bir okuma ile kontrol edilebilir. OPTİK YOĞUNLUK değeri 0,210'un üzerinde olmalıdır. Görsel olarak, R7b'nin ilave edilmesinden sonra turkuaz mavisi bir renk gözlemlenebilir. Developman solüsyonu ilavesinin kontrol edilmesi (R8+R9) Developman solüsyonu bulunup bulunmadığı, 490 nm'de yapılan fotometrik bir okuma ile kontrol edilebilir. OPTİK YOĞUNLUK değeri 0,100'ün üzerinde olmalıdır. Görsel olarak, developman solüsyonunun ilave edilmesinden sonra, pembe bir renk gözlemlenebilir PERFORMANSLAR Aşağıda özetlenen Monolisa HBe Ag/Ab PLUS testinin sonuçları kan donörlerinden, hastaneye yatırılmış hastalardan ve ticari panellerden alınan numuneleri kullanan iki kuruluşta değerlendirmeye tabi tutulmuştur. Ayrıca, analitik duyarlılık PEI standardı yardımıyla belirlenmiştir. 1 - HBe Ag Özgüllük 200 kan donöründen oluşan bir popülasyonda incelenen özgüllük oranı, %100 [%98,51 - %100], (GA %95) olarak bulunmuştur. Özgüllük oranı ayrıca hastaneye yatırılmış hastalardan alınan numunelerde de incelenmiş ve %100 [%99,28 %100] GA % 95 (416/416) olarak bulunmuştur. Hepatit B'ye bağlı olmayan farklı patoloji özelliklerine sahip 195 numune (viral ve bakteriyel enfeksiyonlar, romatoid, otoantikor, veya anti-fare faktörleri açısından pozitif numuneler, miyelom numuneleri, hamile kadınlardan alınan numuneler) teste tabi tutulmuştur. Bu popülasyonun özgüllük oranı %99,49 idi [%97,18- %99,99] (GA %95), yani 194/195 numune negatif bulunmuştur. 1 miyelom numunesi diskordans göstermektedir. Analitik Duyarlılık PEI Standardı yardımıyla belirlenen duyarlılık limiti 0,64 UI/ml [0,49 0,84] (GA %95) olarak bulunmuştur. Klinik Duyarlılık Duyarlılık, kronik hepatit hastalarından, ticari panellerden ve serokonversiyonlardan elde edilen 203 numune üzerinde test edilmiştir. Bu numunelerin tamamı üzerindeki duyarlılık %99,51 [%97,29 - %99,99] (GA %95) yani 202/203 numunedir. Hassasiyet Monolisa HBe Ag/Ab Plus (HBe Ag) testinin hassasiyeti 4 numune yardımıyla belirlenmiştir: HBe Ag açısından 1 negatif, 1 zayıf pozitif, 1 orta pozitif, 1 güçlü pozitif. 13 [TR]

14 Test içi inceleme, her numunenin aynı test sırasında 30 kez teste tabi tutulması ile gerçekleştirilmiştir. Testler arası inceleme, her numunenin çift olarak 20 gün boyunca günde 2 teste tabi tutulması ile gerçekleştirilmiştir. Sonuçlar şöyledir: Tablo 1: Test içi n = 30 Numune 1 Numune 2 Numune 3 Numune 4 Oranların 0,356 5,29 27,24 45,56 ortalaması Standart sapma 0,05 0,35 0,63 2,88 Varyasyon Katsayısı (%) 14,20 6,53 2,31 6,33 Tablo 2: Testler arası n = 80 Numune 1 Numune 2 Numune 3 Numune 4 Oranların 0,51 8,19 27,33 46,35 ortalaması Standart sapma 0,12 1,17 3,26 4,98 Varyasyon Katsayısı (%) 23,86 14,27 11,92 10, HBe Ac Özgüllük 200 kan donöründen oluşan bir popülasyonda incelenen özgüllük oranı, %100 [%98,51 - %100], (GA %95) olarak bulunmuştur. Özgüllük oranı ayrıca hastaneye yatırılmış hastalardan alınan 206 numunede de incelenmiş ve %98,54 [%95,80 %99,70] GA %95 (203/206) olarak bulunmuştur. Hepatit B'ye bağlı olmayan farklı patoloji özelliklerine sahip (viral ve bakteriyel enfeksiyonlar, romatoid, otoantikor veya anti-fare faktörleri açısından pozitif numuneler, miyelom numuneleri, hamile kadınlardan alınan numuneler) 198 numune teste tabi tutulmuştur. 3 numune pozitif bulunmuştur (2 HCV numunesi ve 1 romatoid faktör numunesi). Bu popülasyonun özgüllük oranı %98,48 idi [%95,64- %99,69] (GA %95), yani 195/198 numune negatif bulunmuştur. Bu numuneler tekrar teste tabi tutulmuştur; romatoid faktör numunesi tekrar pozitif bulunmuştur; 2 HCV numunesi tekrar, ya negatif ya da şüpheli bulunmuştur. Klinik Duyarlılık Duyarlılık, kronik hepatit hastalarından ve ticari panellerden elde edilen 220 numune üzerinde test edilmiştir. Bu numunelerin duyarlılığı %98,64 [%96,07 - %99,72] (GA %95) yani 217/220 numunedir. Hassasiyet Monolisa HBe Ag/Ab Plus (HBe Ac) testinin hassasiyeti HBe Ac açısından 1 negatif, 1 zayıf pozitif, 1 orta pozitif, 1 güçlü pozitif numune olmak üzere, 4 numune yardımıyla belirlenmiştir. Test içi inceleme, her numunenin aynı test sırasında 30 kez teste tabi tutulması ile gerçekleştirilmiştir. Testler arası inceleme, her numunenin çift olarak 20 gün boyunca günde 2 teste tabi tutulması ile gerçekleştirilmiştir. Sonuçlar şöyledir: 14 [TR]

15 Tablo 1: Test içi n = 30 Numune 1 Numune 2 Numune 3 Numune 4 Oranların 3,15 0,69 0,42 0,03 ortalaması Standart sapma 0,05 0,04 0,04 0,00 Varyasyon Katsayısı (%) %1,7 %5,7 %10,5 %6,6 Tablo 2: Testler arası n = 80 Numune 1 Numune 2 Numune 3 Numune 4 Oranların 2,39 0,81 0,59 0,3 ortalaması Standart sapma 0,23 0,077 0,09 0,01 Varyasyon Katsayısı (%) %9,6 %9,5 %14,5 %39, KAYNAKÇA 1 - MIYAKAWA Y.; MAYUMI M.; (1985) Hepatitis Be antigen and antibody (HBe Ag/Anti-HBe) in Hepatitis B. Academic Press., chap. 4: KANNO A.; OHORI H., MATSUDA K.; NAKAYAMA H.; MIYAZAKI Y.; ISHIIM.; SUZUKI H.; OHTSUKI M.; GOTO Y. (1987) Virological significance of HBe Ag subtypes (HBe Ag/1 and HBe Ag/2) in patients with type B hepatitis. Hepatology; 7 (1) BRECHOT C.; (1987) Les marqueurs et la prévention des infections par le virus de l'hépatite B en Encyclopédie Médicochirurgicale; Instantanés Médicaux, 4; THIERS V.; BOUCHARDEAU F.; COUROUCE A.M.; TIOLLAIS P.; BRECHOT C., (1986) L'ADN du virus de l'hépatite B comme marqueur de multiplication virale: comparaison avec l'antigène HBe et l'anticorps anti Hbe. La Presse Médicale: 15: LAROUZE B., PENALBA C., DAZZA M.C. (1983) Signification des marqueurs sériques du virus de l'hépatite B. Biologiste et praticien; 56; ALDERSHVILE J., FROSNER G.G.; NIELSEN J.O.; HARDT F. DEINHARTD F.; SKINHOJ P., (1980) Hepatitis Be antigen and antibody measured by radioimmuno-assay in acute hepatitis B surface antigen positive hepatitis. J. Infect. dis.: 141 (3), TAKAHASHI K.; IMAI M., TSUDA F., TAKAHASHI T., MIYAKAWA Y. MAYUMI M. (1976) Association of Dane particles with e antigen in the serum of asymptomatic carriers of hepatitis B surface antigen. J. of Immunol. 117 (1); [TR]

16 16 [TR]

17 17 [TR]

18 18 [TR]

19 19 [TR]

20 20 [TR]