DNA HEDEFL LACIN ELEKTROK MYASAL SENSÖRLE

Transkript

1 DNA HEDEFL LACIN ELEKTROK MYASAL SENSÖRLE TAY N Ecem KILINÇ Ezgi KARAGÖZ Özel Ege Lisesi 2009

2 Ç NDEK LER Projenin Amacı.. 2 Giri.. 2 Biyosensör.. 3 laç-dna etkile mesinin DNA biyosensörleri ile algılanması. 4 Yöntem. 5 Elektrotların hazırlanı ı. 5 Çözeltilerin hazırlanı ı 6 Çalı ma basamakları. 7 Sonuçlar ve tartı ma 8 Kaynaklar. 11 1

3 PROJEN N AMACI Tek kullanımlık elektrokimyasal sensör teknolojisini kullanarak, antikanser ilaç sisplatin in DNA ile etkile imini tayin etmek ve ilaç-dna etkile im mekanizmaları açıklayan mevcut yöntemlere kıyasla daha kolay, daha hızlı, daha seçimli ve güvenli bir ekilde ilaç- DNA etkile mesinin tanımlanmasına yönelik alternatif bir yöntem tasarlamaktır. G R Elektrokimyasal sensörler (elektrokimyasal algılayıcı sistemler) Analitik Kimya da oldukça yaygın kullanımı olan cihazlardır. Bu cihazlara IUPAC tarafından getirilen tanım u ekildedir: Kimyasal bile iklere ya da iyonlara seçici ve tersinir bir ekilde cevap veren ve konsantrasyona ba ımlı elektriksel sinyaller olu turan küçültülmü cihazlara elektrokimyasal sensörler denir (1). Bu sensörler, yapılarına enzim, hücre, doku, antikor, DNA, vb. biyolojik maddelerin eklenmesiyle B YOSENSÖR adını almı lardır. Nitel ve nicel analiz yapabilen biyosensörler, biyo (biyolojik kökenli) ve sensör (algılayıcı) kelimelerinden olu maktadır. Di er bir tanım ise; Biri biyokimyasal, di eri ise elektrokimyasal özellikte, birbiri içine geçmi iki çeviriciden olu an algılayıcı cihaz olabilir. Biyokimyasal çevirici analizlenecek madde ile etkile erek onu tanır. Bu etkile me sonucunda olu an madde, elektrokimyasal çevirici tarafından okunabilir bir sayısal de ere çevrilir. Nükleik asitlerden olu an tanıma yüzeyleri, her geçen gün daha ilgi çekici konular halini almaktadır. Bu tür tanıma yüzeyleri, bilinen elektrokimyasal biyosensörlere yeni ve ender boyutlarda özellikler eklemektedir. Bu geli me ile elektrokimyasal DNA biyosensörlerinin gelecekte hasta ba ında yapılacak doktor gözetimindeki analizlerde önemli bir rol oynayaca ı kesindir. Elektrokimyasal yöntemlerle birlikte DNA nın nitel ve nicel analizini yapma amacına yönelik tasarlanan biyosensörlerde tanıma yüzey katmanı olarak DNA kullanılmasına ilgi de giderek artmaktadır (2-4). Nükleik asit (DNA) tanıma yüzeyi içeren biyosensörler, bu yüzey ile etkile ime giren analizlenecek maddenin (karsinojen maddeler, ilaçlar vb.) etkile im mekanizmasının aydınlatılması veya miktarının tayininde veya DNA daki baz dizisi belli bölgelerdeki hibridizasyon olaylarının izlenmesi gibi amaçlarla kullanılabilir (5-8). Analizlenecek maddenin, DNA ile etkile mesi sonucunda, incelenen maddenin veya DNA daki bir bazın sinyalinde meydana gelecek de i iklikler sayesinde tayini yapılabilmektedir. Bazı ilaç molekülleriyle DNA' nın etkile mesi (özellikle de antikanser özellik ta ıyan ilaç molekülleri ile etkile im) ve bu etkile menin geli tirilen yeni yöntemlerle tayin edilmesi; yeni ilaç tasarımları için çok önemlidir. Yine bazı maddelerin (çevresel kirlilik ajanları, toksik molekül, vb.) çift sarmal DNA ile interkalasyon (düzlemsel yapıdaki maddenin DNA çift 2

4 sarmalı arasına girerek yerle mesi), baza seçimli ba lanma vb. yollarla etkile imi sonucu bir ürünün olu ması, bu ürüne duyarlı elektrokimyasal DNA biyosensör tasarımını getirmi tir. Bir kimyasal maddenin veya metabolitin DNA ile etkile imi sonrasında DNA da olu abilecek yan ürünlerin (=adduct) kısa zamanda tespiti kanser ara tırmaları için çok önemlidir (9). Madde-DNA etkile iminin sonucunda, çalı manın türüne göre elde edilen madde sinyali ya da DNA daki bir bazın sinyalindeki artma veya azalmaya ba lı olarak elektrokimyasal tayin gerçekle tirilmektedir. Bu amaçla kullanılan DNA modifiye edilmi camsı karbon elektrotlar (GCE), karbon pastası elektrotlar (CPE), perde baskılı karbon (SCPE) ve altın perde baskılı elektrotlar (Au-SCPE), Altın elektrotlar (AuE) ve asılı civa damla elektrodu (HMDE) incelenen maddelerin mikromolar ve hatta nanomolar konsantrasyonlarının dahi, kısa bir biriktirme a aması sonrası güvenli ölçümlerini mümkün kılmaktadır (10-14). Çalı mamızın amacı, tek kullanımlık elektrokimyasal sensör teknolojisini kullanarak, antikanser ilaç sisplatin in DNA ile etkile imini tayin etmek ve ilaç-dna etkile im mekanizmaları açıklayan mevcut yöntemlere kıyasla daha kolay, daha hızlı, daha seçimli ve güvenli bir ekilde ilaç-dna etkile mesinin tanımlanmasına yönelik alternatif bir yöntem tasarlamaktır. B YOSENSÖR: Biyosensörler biyolojik tepkimelerde hedef analizlenecek maddeleri tayin etmek için kullanılan küçük algılayıcı cihazlardır. Birbiri içine geçmi biri biyokimyasal, di eri elektrokimyasal özellikteki iki çeviriciden olu maktadır. Biyokimyasal kısmın görevi analizlenecek maddeyle etkile erek onu tanımaktır. Bu tanıma olayının sonucunda bir biyokimyasal ürün de olu abilmektedir. Biyosensörün ikinci kısmı olan elektrokimyasal kısım ise, bu tanıma olayını okunabilir (ölçülebilir) bir sayısal de ere çevirmekle görevlidir (15). ( ekil 1) ekil 1: Biyosensörün yapısı Tanıma yüzeyi olarak DNA nın kullanıldı ı biyosensörlere DNA biyosensörleri adı verilir. DNA tanıma yüzeyleri, dizisi belli hibridizasyon olaylarının izlenmesinde veya bu yüzey ile etkile ime giren analizlenecek maddelerin (karsinojen madeler, ilaçlar, vb.) tayininde kullanılabilir. 3

5 deal bir biyosensörün sahip olması gereken özellikler: 1. Seçicilik 2. Kullanım Ömrü 3. Kalibrasyon Gereksinmesi 4. Tekrarlanabilirlik 5. Stabilite 6. Yüksek Duyarlılık 7. Yeterli Düzeyde Tayin Sınırı 8. Geni Ölçüm Aralı ı 9. Hızlı Cevap Zamanı 10. Hızlı Geriye Dönme Zamanı 11. Basitlik ve Ucuzluk 12. Küçültülebilirlik ve Sterilize edilebilirlik LAÇ-DNA ETK LE MES N N ELEKTROK MYASAL DNA B YOSENSORLER LE ALGILANMASI: DNA hedefli ilaç tasarımında, ilaç-dna etkile mesinin önemli bir yeri vardır. Yeni sentezlenen küçük moleküllerin DNA ya ba lanması ve onunla etkile mesi, yeni ilaçların tasarımında oldu u kadar, DNA yı algılama yöntemlerinin geli tirilmesinde ve çevreye zararlı maddelerin algılanmasında da önemlidir (16-23). DNA ve ilaç arasındaki moleküler etkile im, bu bile iklerin hızlı görüntülenmesi ve aygıtların geli tirilmesi için önemlidir. laçların DNA ya ba lanması ile ilgili çe itli etkile im türleri vardır. Bu etkile im çe itleri, elektrostatik ba lanma, çapraz ba lanma ve interkalasyonla etkile medir. laç-dna etkile imini elektrokimyasal biyosensörle tayin ederken izlenen yol; Etkile im öncesi ve sonrası mevcut ilaç sinyalindeki ve/veya DNA daki elektroaktif bazlar, guanin ve adenin sinyalindeki de i im ölçülür ve bu de i ime göre etkile im hakkında yorum yapılır(24). ( ema) ema: laç DNA etkile mesinin elektrokimyasal DNA biyosensörlerle algılanması 4

6 YÖNTEM KULLANILAN C HAZLAR VE K MYASAL MADDELER Ölçümler ve deneyler esnasında kullanılan tüm cihaz, donanım ve yazılımlar; Terazi (Mettler Toledo AB204-S ) Ses titre imli temizleyici (Bandelin Sonorex) ph-metre (Orion 420A) Manyetik karı tırıcı (Biosan MS 3000) Vorteks (Biosan V1) Potansiyostat (AUTOLAB 302, GPES 4,9 yazılımlı; Eco Chemie,Hollanda) Ag/AgCl referans elektrot (BAS) Platin tel (Yardımcı elektrot olarak kullanıldı) Çalı ma elektrodu (kalem grafit elektrot-pge) Asetik Asit (%99-100) (Merck) Hidroklorik asit (%37) (Merck) Sodyum Hidroksit (Merck) Sisplatin (Sigma) Tris (hidroksimetil)aminometan hidroklorür (Sigma) Sodyum klorür (Sigma) Tüm çalı malarda sterilize edilmi deiyonize su kullanıldı. Deneysel çalı malar oda sıcaklı ında ( ) C de gerçekle tirildi. ekil 2. Bilgisayara ba lı elektrokimyasal ölçüm cihazı ekil 3.Üçlü elektrot sistemi Elektrotların Hazırlanı ı Kalem Ucu Grafit Elektrot (PGE) hazırlanı ı: Grafit uç içeren kalem elektrodun tekrarlanabilirli inin daha iyi olması, daha dü ük tayin sınırı, ucuz ve tek kullanımlık olması sebebiyle bu elektrodun kullanılmasına artan bir ilgi bulunmaktadır (16,22). 5

7 Çalı mada kullanılan kalem ucu elektrot; Tombo HB kalem uçlarının 3 cm boyutunda kesilmesiyle hazırlandı. ( ekil 4) ekil 4: Kalem ucu elektrot. 0,02 M Tris HCl tampon çözeltisinin hazırlanı ı (ph 7,0): Kullanılan 0,02 M Tris HCl tampon çözeltisi litresinde 3,152 g Trizma HCl içermektedir. Çözeltinin ph'sının 4,8 de erine ula ması için gerekli kontrol, 0,1 N NaOH ve / veya 0,1 N HCl ilavesiyle ph-metre ile gerçekle tirilir. Asetat tampon çözeltisinin hazırlanı ı: Kullanılan 0,5 M asetat tampon çözeltisi litresinde 2,722 g. CH 3 COONa.3H 2 O ve 1,154 ml CH 3 COOH (%99, 1.05 g/ml) içermektedir. NaCl deri imi 20 mm olacak ekilde 1,17 g NaCl ilave edilmi tir. Hazırlanan asetat tamponunun ph de eri 4,8 dir. Sisplatin (cis-ddp) Hakkında Genel Bilgi: Açık yapı formülü: Kapalı kimyasal formül: Pt(NH 3 ) 2 CI 2 Kimyasal adlandırma: cis-diamminedichloroplatinum(ii) Kimyasal Özellikleri: Molekül a ırlı ı, g/mol dür. Farmakolojik özellikleri: Sisplatin (cis-ddp), klinikte prostat, meme, pankreas, ba ve boyun, akci er, uterus, yemek borusu, kolorektum, penis ve pediatrik tümörlerde tek ba ına veya di er antineoplastik ajanlarla kombine halde kullanılmaktadır. cis-ddp hücre bölünmesini engelleyen ajanlara benzer biyokimyasal özelliklere sahiptir. Non-spesifik olarak hücre siklusunu etkiler, böylece DNA'da çapraz ba lar olu turarak DNA sentezine karı mı olur. DNA-RNA sentezini inhibe ederek sitotoksik etki gösterir (25,27). 6

8 cis-ddp çözeltisinin hazırlanı ı: 1000 g/ml lik ana stok çözeltisi, dimetilsülfoksit (DMSO) ile hazırlandı.15 g/ml lik seyreltik çözeltileri, 0,5 M Asetat tamponu (ph 4,8) içerisinde hazırlandı. DNA çözeltilerinin hazırlanı ı : Buza ı timus bezinden elde edilen DNA (=Calf Thymus DNA); çift sarmal DNA (dsdna) stok çözeltileri, 1000 g/ml konsantrasyonunda TE çözeltisi (10 mm Tris-HCl, 1 mm EDTA, ph 8,0) ile hazırlandı ve sıfır derecenin altında saklandı. dsdna nın seyreltik çözeltisi, deneyden kısa bir süre önce 0,5 M Asetat tamponu (ph 4,8) ile hazırlandı. zlenen çalı ma basamakları : Kalem grafit elektrodun (PGE) hazırlanması : Çalı mada kullanılan kalem grafit elektrot, Tombo kalem uçlarının 3.0 cm boyutunda kesilmesiyle hazırlandı (16,26). Elektrokimyasal hücre içerisinde 1.0 cm kalacak ekilde kalem içerisine yerle tirildi. Kalem grafit elektrodun (PGE) aktivasyonu: PGE, 0,05 M ABS içersinde +1,4 V uygulanarak 30 saniye süre ile karı tırılmayan ortamda aktive edildi. PGE yüzeyine dsdna immobilizasyonu: Yüzeyi aktive edilmi PGE, asetat tamponu (ph 4,8) içinde hazırlanmı olan 16 μg/ml konsantrasyonda dsdna çözeltisine daldırıldı. 7.5 dakika pasif adsorpsiyon yöntemiyle elektrot yüzeyine DNA immobilizasyonu (yüzeye tutturulması) gerçekle tirildi. cis-ddp ile dsdna ile etkile imi: 1- Elektrot Yüzeyinde ilaç-dna etkile imi: dsdna immobilize edilmi PGE, 15 μg/ml sisplatin çözeltisi içerisinde 15 dakika süreyle pasif adsorbsiyon yöntemiyle DNA, cis-ddp ile etkile tirildi. Daha sonra, 5 sn süreyle elektrodun yıkama i lemi asetat tamponu (ph 4,8) kullanılarak gerçekle tirildi. Voltametrik ölçüm, üçlü elektrot kullanılarak a a ıda belirtildi i ekilde yapıldı. 2- Çözelti fazında ilaç-dna etkile imi: Yüzeyi aktive edilmi PGE, içinde 16 ppm dsdna ve 15 ppm cis-ddp (1:1) olacak ekilde vial içinde karı tırılıp pasif adsorpsiyon yöntemine göre 15 dakika etkile tirildi. Yıkama i lemi asetat tamponu (ph 4,8) ile yapıldı. Voltametrik ölçüm, üçlü elektrot kullanılarak a a ıda belirtildi i ekilde yapıldı. Ölçüm: +0,2 V ile +1,4 V arasında, 30mV/s tarama hızı ve 50 mv luk puls genli inde tarama yapılarak asetat tamponu (ph 4,8) içersinde ölçüm gerçekle tirildi. +1,00 V civarında gözlenen guanin yükseltgenme sinyali, DPV tekni i ile ölçülerek, ilaç-dna etkile mesi elektrokimyasal olarak tayin edildi. 7

9 SONUÇLAR ve TARTI MA Elektrot yüzeyine tutturulmu dsdna, 15 μg/ml cis-ddp ile 15,30 ve 60 dakika gibi farklı etkile im sürelerince elektrot yüzeyinde etkile imi sonrasında, guanin yükseltgenme sinyalindeki de i im incelendi. Yapılan bu çalı mada etkile im süresi arttıkça, etkile im sonrası guanin sinyalindeki azalmanın arttı ı gözlendi. Guanin sinyalinde 15 dakika için % 17,6; 30 dakika için %13,7 ve 60 dakika için % 36 lık bir azalmanın oldu u tespit edildi. En belirgin azalmanın 60 dakikada oldu u saptandı ( ekil 5A-5B). ekil 5A. 15, 30 ve 60 dakika gibi farklı sürelerde 15 μg/ml cis-ddp ile dsdna nın elektrot yüzeyindeki etkile imi sonucu ölçülen guanin sinyallerindeki de i imi gösteren voltamogramlar: (a) etkile im öncesi guanin yükseltgenme sinyali, (b) 15 dak, (c) 30 dak, (d) 60 dakika süresince cis-ddp ile etkile en dsdna daki guanin yükseltgenme sinyali. ekil 5B. 15, 30 ve 60 dakika gibi farklı sürelerde 15 μg/ml cis-ddp ile dsdna etkile imi sonucu ölçülen guanin sinyallerindeki de i imi gösteren histogram. (a) etkile im öncesi guanin yükseltgenme sinyali, (b) 15 dak, (c) 30 dak, (d) 60 dakika süresince cis-ddp ile etkile en dsdna daki guanin yükseltgenme sinyali. 8

10 Çözelti fazında yapılan çalı mada, dsdna, 15 μg/ml cis-ddp çözeltisi ile 1:1 oranında karı tırıldı ve 15,30 ve 60 dakika gibi farklı sürelerde etkile tirildi. Etkile im sonucunda guanin yükseltgenme sinyalindeki de i im incelendi. Etkile im sonrası guanin yükseltgenme sinyalinde belirgin bir artı ın oldu u ve etkile im süresi arttıkça guanin sinyalindeki artı ın giderek arttı ı gözlendi. En belirgin artı ın 60 dakikada oldu u saptandı ( ekil 6A ve 6B). cis-ddp nin dsdna ile çözelti bazında etkile imi sonrasında sinyalde gözlenen artı ın, DNA nın çift sarmal yapısının bozulup tek sarmal yapısına dönü mesi sonucunda elde edilebilece i eklinde yorumlanabilir. ekil 6A. 15, 30 ve 60 dakika, sürelerde 15 μg/ml cis-ddp ile dsdna nın çözelti bazında etkile imine ait voltamogramlar. (a) etkile im öncesi guanin yükseltgenme sinyali, (b) 15 dak, (c) 30 dak, (d) 60 dakikadaki etkile im sonrası guanin yükseltgenme sinyali. ekil 6B. 15, 30 ve 60 dakika gibi farklı sürelerde 15 μg/ml cis-ddp ile dsdna nın etkile imi sonucu ölçülen guanin sinyallerindeki de i imi gösteren histogram: (a) etkile im öncesi guanin yükseltgenme sinyali, (b) 15 dak, (c) 30 dak, (d) 60 dakika süresince cis-ddp ile etkile en dsdna daki guanin yükseltgenme sinyali. 9

11 Cis-DDP nin dsdna ile etkile mesi sonucunda, guanin yükseltgenme sinyalindeki de i im, DPV tekni i kullanılarak tek kullanımlık grafit sensör teknolojisi ile elektrokimyasal olarak tayin edildi. Pasif adsorpsiyon yöntemi kullanılarak hazırlanan tek kullanımlık DNA sensörü ile elektrot yüzeyindeki cis-ddp DNA etkile im sonrası guanin yükseltgenme sinyalinde azalma gözlendi ve önceki çalı malarımızda elde etti imiz sonuçlara benzerlik gösterdi i saptandı (27). Sinyaldeki azalmanın, cis-ddp nin guanin bazlarına spesifik ba lanması sonucunda elde edilebilece i eklinde yorumlanabilir. Çözelti fazındaki etkile im sonrası gözlenen guanin sinyalindeki artı ın ise, cis-ddp ile dsdna nın etkile imi sonucunda DNA nın çift sarmal yapısının bozulup tek sarmal yapısına dönü mesi sonucunda elde edilebilece i eklinde yorumlanabilir. laç-dna etkile imlerinin hızlı ve seçimli bir ekilde gerçekle tirilebilecek elektrokimyasal tayini, gelecekte tasarımlanacak yeni bir ilacın, DNA ile etkile me türünün saptanmasında önemli rol oynamaktadır. laç-dna kompleksinin fonksiyonlarının incelenip ve bu fonksiyonel özelliklerin belirlenmesi, ilaç moleküllerinde hedeflerine göre yapmamız gereken tasarımlar için önemlidir. Gerçekle tirilen bu çalı manın amacı; DNA ya hedefli yeni bile iklerin DNA ile etkile im türlerinin, elektrokimyasal olarak belirlenmesini sa lamak böylece, ilaç-dna etkile im mekanizmalarının kolay, hızlı, daha seçimli ve güvenli bir ekilde tanımlanmasını sa layabilmektir. Ayrıca, tek kullanımlık grafit sensör teknolojisinin kullanımı, antikanser ilaç olan maddenin az miktarlarında çalı mayı mümkün kılabilecek, pahalı ajanlar gerektiren ve zaman alıcı yöntemlere alternatif bir yöntem olmasını sa layacaktır. Sonuç olarak, çalı mamızda geli tirilen tek kullanımlık grafit sensör teknolojisi ile hem DNA, hem de çe itli antikanser ilaçların DNA ile etkile im ürünlerinin elektrokimyasal tayini, daha kolay, daha hızlı ve daha güvenilir bir ekilde yapılabilecektir. TE EKKÜR Çalı malarımız sırasında bize danı manlık yapan Doç. Dr. Kadriye Arzum Erdem Gürsan a, gereksinim duydu umuz cihaz ve malzemelerinin kullanımına izin veren Ege Üniversitesi, Eczacılık Fakültesi ne te ekkür ederiz. 10

12 KAYNAKÇA 1. Wang, J.; Rivas, G.; Cai, X.; Palecek, E.; Nielsen, P.; Shiraishi, H.; Dontha, N.; Luo, D.; Parrado, C.; Chicharro, M.; Farias, P. A. M.; Valera, F. S.; Grant, D. H.; Ozsoz, M.; Flair, M. N. Anal. Chim. Acta, 1997, 347, Wang, J.; Cai, X.; Rivas, G.; Shiraishi, H.; Farias, P. A. M.; Dontha, N. Anal. Chem., 1996, 15, Wang, J.; Rivas, G.; Cai, X.; Dontha, N.; Shiraishi, H.; Luo, Valera, F. S. Anal. Chim. Acta, 1997, 337, Wilson, E. K. Chem. & Engin. News, 1998, 76, Wang, J. Biosensors & Bioelectronics, 1998, 13, Wang, J.; Rivas, G.; Cai, X.; Chicharro, M.; Parrado, C.; Dontha, N.; Begleiter, A.; Mowat, M.; Palecek, E.; Nielsen, P. E. Anal. Chim Acta, 1997, 344, Karadeniz, H.; Erdem, A.; Caliskan A.; Pereira C. M.; Pereira E. M.; Ribeiro J. A.; Electrochemistry Communications, 2007, 9, Wang, J.; Rivas, G.; Fernandes, J. R.; Paz, J. L. L.; Jiang, M.; Waymire, R. Anal. Chim. Acta, 1998, 375, Mikkelsen, S. R. Electroanalysis, 1996, 1, Millan, K. M.; Saraullo, A.; Mikkelsen, S. R. Anal. Chem., 1994, 66, Erdem, A.; Kerman, K.; Meric, B; Akarca, U. S.; Ozsoz, M. Electroanalysis, 1999, 11, Erdem, A.; Meric, B.; Kerman, K.; Dalbasti, T.; Ozsoz, M. Electroanalysis, 2001, 13, Erdem, A.; Kerman, K.; Meric, B; Akarca, U. S.; Ozsoz, M., Anal. Chim. Acta, 2000, 422, Karadeniz, H.; Alparslan, L.; Erdem, A.; Karasulu, E. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2007, 45, Coulet, P. R. (1991). What is a Biosensor?, Chapter 1; Biosensor principles and applications, Editörler; L.J.Blum, P.R. Coulet, Marcel Dekker Inc., New York, Wang, J.; Kawde, A.-N.; Erdem, A.; Salazar M. A.; Analyst, 2001, 126, Wang, J. Nucl. Acids Res., 2000, 28, Palecek, E.; Fojta, M. Anal. Chem., 2001, 73, 75A. 19. Erdem, A.; Ozsoz, M. Anal. Chim. Acta, 2001, 437, Erdem, A.; Ozsoz, M. Turkish Journal of Chemistry, 2001, 25, Jelen, F.; Erdem, A.; Palecek, E. Bioelectrochemistry, 2002, 55,

13 22. Karadeniz, H.; Gulmez, B.; Sahinci, F.; Erdem, A.; Kaya, I.G.; Unver, N.; Kivcak, B.; Ozsoz, M. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2003, 33, Querioz, M.R.P.; Castanheira, E.M.S.; Carvalho, M.S.D.; Abreu, A.S.; Ferreira, P.M.T.; Karadeniz, H.; Erdem, A. Tetrahedron, 2008, 2, Erdem, A.; Ozsoz, M. Electroanalysis, 2002, 14, Wong, E.; Giandomenico, C.M. Chem. Rev., 1999, 99, Ozsoz M., Erdem A., Kara P., Kerman K., Ozkan D. (2002). Electroanalysis, 15: Erdem, A.; Kosmider, B.; Osiecka, R.; Zyner, E.; Ochocki, J.; Ozsoz, M. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2005, 38 (4),