ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

Transkript

1 ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ Sezen İNAN KARPUZ (Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum ve Nakai) da IN VIVO VE IN VITRO YÖNTEMLERLE TETRAPLOİD BİTKİ ELDE EDİLMESİ BAHÇE BİTKİLERİ ANABİLİM DALI ADANA, 2007

2 ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ KARPUZ ( Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum ve Nakai) DA IN VIVO VE IN VITRO YÖNTEMLERLE TETRAPLOİD BİTKİ ELDE EDİLMESİ Sezen İNAN YÜKSEK LİSANS TEZİ BAHÇE BİTKİLERİ ANABİLİM DALI Bu Tez 05/ 02 /2007 Tarihinde Aşağıdaki Jüri Üyeleri Tarafından Oybirliği İle Kabul Edilmiştir. İmza Prof.Dr. Nebahat SARI DANIŞMAN İmza Doç.Dr. Yeşim YALÇIN MENDİ ÜYE İmza Doç.Dr. Halit YETİŞİR ÜYE Bu Tez Enstitümüz Bahçe Bitkileri Anabilim Dalında Hazırlanmıştır. Kod No: Prof. Dr. Aziz ERTUNÇ Enstitü Müdürü İmza ve Mühür Bu Çalışma Ç. Ü. Rektörlüğü Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi Tarafından Desteklenmiştir. Proje No: ZF 2005 YL15 Not: Bu tezde kullanılan özgün ve başka kaynaktan yapılan bildirişlerin, çizelge, şekil ve fotoğrafların kaynak gösterilmeden kullanımı, 5846 sayılı Fikir ve Sanat Eserleri Kanunundaki hükümlere tabidir.

3 ÖZ YÜKSEK LİSANS TEZİ KARPUZ ( Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum ve Nakai) DA IN VIVO ve IN VITRO YÖNTEMLERLE TETRAPLOİD BİTKİ ELDE EDİLMESİ Sezen İNAN ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BAHÇE BİTKİLERİ ANABİLİM DALI Danışman : Prof. Dr. Nebahat SARI Yıl : 2007, Sayfa : 80 Jüri : Prof. Dr. Nebahat SARI : Doç. Dr. Yeşim YALÇIN MENDİ : Doç. Dr. Halit YETİŞİR Bu çalışma, çekirdeksiz karpuzun temel üretim materyali olan tetraploid karpuz bitkisi elde edilmesine yönelik olarak planlanmıştır. Çalışmada, Crimson Sweet karpuz çeşidi kullanılmış ve iki in vivo ile iki in vitro yöntemin tetraploid bitki elde edilmesine etkileri araştırılmıştır. In vivo yöntemlerin birincisinde 7 farklı dozda (% 0.0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5 ve 0.6) hazırlanan kolhisin çözeltisi, ilk gerçek yaprak oluşumu aşamasında bitkinin büyüme ucuna damlatılmış; diğer yöntemde ise % 0.0, % 0.5 ve % 1.0 dozlarında hazırlanan kolhisin çözeltisine serada büyütülen diploid karpuz bitkilerinin büyüme ucu daldırılmıştır. In vitro da yapılan denemelerde 4 farklı BA dozu (0, 1, 2 ve 4 mg/l) içeren MS kültür ortamlarında kotiledon yapraklarından rejenerasyon sağlanmış, diğer yöntemde ise in vitro diploid mikro çeliklere kolhisinin 3 dozu (% 0.0, 0.5 ve 1.0) uygulanmıştır. Araştırma bulgularına göre Crimson Sweet karpuz çeşidinde tetraploid bitki elde edilmesine yönelik en başarılı uygulamanın in vitro da 4 mg/l BA içeren MS ortamından elde edilen rejenerasyon ile gerçekleştiği ve bu uygulamada katlama oranının % 60.4 olduğu tespit edilmiştir. İkinci başarılı metot olarak in vitro kolhisin uygulamasında (% 0.5 dozu) % 36.4 oranında tetraploid bitki elde edilmiştir. Denemede yer alan in vivo yöntemlerin katlanma başarısı % 5 oranında kalmış ve yeterli bulunmamıştır. In vivo ve in vitro yöntemler sonucu elde edilen bitkilerin ploidi seviyeleri flow sitometri analiz yöntemi ile belirlenmiştir. Tetraploid bitki teşhisinde morfolojik ve sitolojik gözlemlerden de yararlanılmıştır. Anahtar Kelimeler: Karpuz, Kolhisin, Benzyl Adenin, Stomatal özellikler, Flow Sitometri I

4 ABSTRACT MSc. THESIS THE OBTENTION OF TETRAPLOID WATERMELON (Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum ve Nakai) PLANTS BY IN VIVO and IN VITRO METHODS Sezen İNAN DEPARTMENT OF HORTICULTURE INSTITUTE OF NATURAL AND APPLIED SCIENCES UNIVERSITY OF ÇUKUROVA Supervisor : Prof. Dr. Nebahat SARI Year : 2007, Pages: 80 Jury : Prof. Dr. Nebahat SARI : Assoc. Prof. Dr. Yeşim YALÇIN MENDİ : Assoc. Prof. Dr. Halit YETİŞİR This study was planned to produce tetraploid watermelon plant which is the main production material of seedless watermelon. In this study watermelon cultivar Crimson Sweet was used and the effects of 2 in vivo and 2 in vitro methods on the obtention of tetraploid plant were investigated. In the first in vivo method, 7 different colchine solutions (0.0 %, 0.1 %, 0.2 %, 0.3 %, 0.4 %, 0.5 % ve 0.6 %) were applied by droping to the apical growing point at the first true leaf stage in the other technique, the apical growing points of the greenhouse grown plants were immersed in to (0.0 %, 0.5 % and 1.0 %) colchine solution. In the first experiment of in vitro methods, the cotyledons were regenerated in MS medium containing 4 different concentrations (0, 1, 2, 4 mg/l) of BA were added. In the other technique, 3 different colchicine solution (0.0 %, 0.5 % and 1.0 %) were applied to the in vitro diploidmicrocuttings. According to the results, the most succesful method to obtain tetraploid plants of C. Sweet watermelon cultivar was the regeneration in MS medium containing 4 mg/l BA was added and the duplication rate was 60.4 %. The second successful method was the in vitro colchicine application (0.5 %) with rate of 36.4 % tetraploid plants. The duplication rate of in vivo methods was 5 % that was not found enough successful. The ploidy level of the plants which obtained by in vivo and in vitro methods was analysed with flow cytometry. Morphological and cytological observations were also done to determine tetraploid plants. Key words: Watermelon, Colchicine, Benzyl Adenin, Stomatal Characteristics, Flow Cytometry II

5 TEŞEKKÜR Yüksek Lisans öğrenimim boyunca tezimin planlanması, yürütülmesi ve sonuçların değerlendirilmesi sırasında yardımlarını esirgemeyen danışman hocam Sayın Prof. Dr. Nebahat SARI ya sonsuz saygı ve teşekkürlerimi sunarım. Rejenerasyon çalışmalarım sırasında öneri ve deneyimlerinden yararlandığım değerli Hocam Doç. Dr. Yeşim YALÇIN MENDİ ye teşekkürü borç bilirim. Yüksek lisans öğrenimim boyunca desteğini esirgemeyen Sayın Hocam Prof. Dr. Selim ÇETİNER e, Doç.Dr.Yıldız AKA KAÇAR a ve sitolojik çalışmalarım sırasında gösterdiği yakın ilgileri için sayın Prof. Dr. Sinan ETİ ye sonsuz saygı ve teşekkürlerimi sunarım. Yüksek lisans öğrenimim boyunca yardımlarını ve desteklerini esirgemeyen Toros Tarım San. Tic. A.Ş. ye, Toros Tarım San. Tic. A.Ş. Genel Müdür Yardımcısı Sayın İskender İŞÇENER e, Genel Müdür Yardımcısı Sayın Necat HAKSAL a, Toros Agripark İşletme Şefi Sayın İhsan ÜNLÜ ye ve Toros Agripark Biyoteknoloji laboratuvarı mesai arkadaşlarıma sonsuz teşekkür ederim. Tezimin her aşamasında yardımlarını benden esirgemeyen sevgili dostlarım Zir.Yük. Müh. İjlal EKEN ve Zir. Yük. Müh. Manolya YARIMOĞLU na, sevgili kardeşim ve meslektaşım Zir. Müh. Senem İNAN ve sevgili iş arkadaşım Zir. Müh. Belgin BİÇEN e teşekkür ederim. Arazi ve laboratuvar çalışmalarım sırasında bana yardımcı olan arkadaşlarım Ar. Gör. İlknur SOLMAZ, Zir. Müh. Esma KESER e, Zir. Müh. Neslihan AYDINOĞLU na, iş arkadaşlarım Aynur BAĞRIYANIK, Hasan YASİN e ve daha ismini sayamadığım birçok arkadaşıma, tezimin yazılma aşamasındaki yardımlarından dolayı Zir. Müh. Hasan Alp İNAN a teşekkür ederim. Ploidi düzeyinin belirlenmesi için gönderdiğimiz örnekleri bedelsiz olarak analiz eden Enza Zaden (Hollanda) tohum firması yetkililerine ve bu projeyi finansal olarak destekleyen Çukurova Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimine teşekkür ederim. Son olarak da yaşamım boyunca bana göstermiş oldukları maddi-manevi fedakarlıklardan dolayı sevgili aileme teşekkürü bir borç bilirim. III

6 İÇİNDEKİLER Sayfa No ÖZ. I ABSTRACT.. II TEŞEKKÜR.. III İÇİNDEKİLER. IV ÇİZELGELER DİZİNİ. VII ŞEKİLLER DİZİNİ... X KISALTMALAR.. XII 1. GİRİŞ ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR In Vivo Tetraploid Bitki Elde Etme Çalışmaları In Vitro Tetraploid Bitki Elde Etme Çalışmaları Triploid Bitkiler ve Ploidi Belirleme Çalışmaları MATERYAL VE METOD Materyal Metod In Vivo Kolhisin Uygulamasıyla Tetraploid Bitki Elde Edilmesi Kotiledon Aşamasındaki Bitkilere Kolhisin Uygulaması Kolhisin Çözeltisine Sürgün Ucu Daldırılması In Vitro Yöntemlerle Tetraploid Bitki Elde Edilmesi Rejenerasyon Ortamında Farklı BA Dozlarının Kullanımı (1). Tohumların Yüzey Dezenfeksiyonu (2). Tohumların Kültür Ortamına Ekimi (3). Kültür Ortamı (4). Kültür Koşulları (5). Rejenerasyon Ortamı ve Eksplantların Rejenerasyon Ortamına Aktarımı (6). Rejenerasyon Sonucu Elde Edilen Sürgünler 30 IV

7 (7). Rejenerasyon Ortamında Farklı BA Dozları Kullanımı ile Elde Edilen Sürgünlerin Sera Koşullarına Alıştırılması (8). Alıştırma Serasındaki Bitkilerin Seraya Dikimi In Vitro Diploid Mikroçeliklere Kolhisin Uygulaması (1). Bitkilerin Kolhisin Çözeltisinde Bekletilmesi (2). Bitkilerin Çoğaltılması (3). Elde Edilen Sürgünlerin Sera Koşullarına Alıştırılması (4). Alıştırma Serasındaki Bitkilerin Seraya Dikimi In Vivo ve In Vitro Denemelerinde Yapılan Ölçüm ve Gözlemler Morfolojik Gözlemler (1). Yaprak Alanı (2). Yaprak Uzunluğu ve Eni (3). Erkek Çiçek Çapı (4). Erkek Çiçek Çevresi (5). Taç Yaprak Genişliği ve Uzunluğu (6). Yumurtalık Çapı ve Yüksekliği (7). Çiçek Tozu Çapı (8). Çiçek Tozu Kolpi (Çimlenme Pilesi) Sayısı Stomatal İncelemeler (1). Stoma Çapı ve Uzunluğu (2). Stoma Yoğunluğu (3). Bekçi Hücrelerindeki Kloroplast Sayısı Flow Sitometri Analizi In Vivo ve In Vitro Denemelerinde Yapılan İstatiksel Analizler ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA In Vivo Kolhisin Uygulamasıyla Tetraploid Bitki Elde Edilmesi Kotiledon Aşamasındaki Bitkilere Kolhisin Uygulaması. 44 V

8 Kolhisin Çözeltisine Sürgün Ucu Daldırılması In Vitro Yöntemlerle Tetraploid Bitki Elde Edilmesi Rejenerasyon Ortamında Farklı BA Dozlarının Kullanımı In Vitro Diploid Mikroçeliklere Kolhisin Uygulaması SONUÇ VE ÖNERİLER 73 KAYNAKLAR ÖZGEÇMİŞ. 80 VI

9 ÇİZELGELER DİZİNİ Sayfa No Çizelge 3.1. MS ortamının içeriği (Murashige ve Skoog, 1962).. 26 Çizelge 3.2. E20A besi ortamının içeriği (Sauton, 1987; Sarı, 1994).. 34 Çizelge yılında in vivo da Crimson Sweet karpuz çeşidine kotiledon aşamasında uygulanan kolhisinin, bitkilerde yaşama oranı ve morfolojik olarak değişikliğe uğrayan bitki sayısı üzerine etkisi. 44 Çizelge yılında in vivo da Crimson Sweet karpuz çeşidine kotiledon aşamasında uygulanan kolhisinin bitkilerde yaşama oranı ve morfolojik olarak değişikliğe uğrayan bitki sayısı üzerine etkisi. 45 Çizelge yılında in vivo da Crimson Sweet karpuz çeşidine kolhisin uygulaması sonrası seraya dikimi yapılan bitkilerde 15 gün aralıklarla yapılan boğum sayısı, bitki uzunluğu ve boğum çapı gözlem ve ölçümleri. 47 Çizelge yılında in vivo da Crimson Sweet karpuz çeşidine kolhisin uygulaması sonrası seraya dikimi yapılan bitkilerde 15 gün aralıklarla yapılan boğum sayısı, bitki uzunluğu ve boğum çapı gözlem ve ölçümleri. 48 Çizelge yılında in vivo da Crimson Sweet karpuz çeşidinin kotiledon aşamasında damlatılarak kolhisin uygulamasının yaprak ve stomatal özelliklere etkisi etkisi Çizelge yılında in vivo da Crimson Sweet karpuz çeşidinin kotiledon aşamasında damlatılarak kolhisin uygulamasının yaprak ve stomatal özelliklere etkisi etkisi Çizelge yılında in vivo koşullardaki Crimson Sweet karpuz çeşidine kotiledon aşamasında damlatılarak kolhisin uygulamasının çiçek özelliklerine etkisi VII

10 Çizelge 4.8. Çizelge 4.9. Çizelge Çizelge Çizelge Çizelge Çizelge Çizelge Çizelge Çizelge Çizelge yılında in vivo da Crimson Sweet karpuz çeşidinin kotiledon aşamasında damlatılarak kolhisin uygulamasının çiçek özellliklerine etkisi ve 2006 yıllarında in vivo da Crimson Sweet karpuz çeşidine kotiledon aşamasında kolhisin uygulamasından sonra seraya aktarılan bitkilerin serada yaşama oranları (%) yılı in vivo da Crimson Sweet karpuz çeşidine kotiledon aşamasında uygulanan kolhisinden sonra bitkilerden elde edilen meyve oranları (%) yılı in vivo da Crimson Sweet karpuz çeşidine kotiledon aşamasında uygulanan kolhisinden sonra bitkilerden elde edilen ploidi düzeyleri yılında in vivo da Crimson Sweet karpuz çeşidinin sürgün uçlarına kolhisin uygulamasının yaprak ve stomatal özelliklerine etkisi yılında in vivo da Crimson Sweet karpuz çeşidinin sürgün uçlarına kolhisin uygulamasının yaprak ve stomatal özelliklerine etkisi yılında in vivo da Crimson Sweet karpuz çeşidinin sürgün uçlarına kolhisin uygulamasının çiçek özelliklerine etkisi yılında in vivo da Crimson Sweet karpuz çeşidinin sürgün uçlarına kolhisin uygulamasının çiçek özelliklerine etkisi yılı in vivo da Crimson Sweet karpuz çeşidinin sürgün ucunun kolhisin çözeltisine daldırılması ile elde edilen meyve oranları (%) yılında in vivo da Crimson Sweet karpuz çeşidine ait bitkilerinin kolhisin çözeltisine sürgün ucu daldırılması ile elde edilen ploidi oranı (%).. 59 Farklı BA dozları uygulamasının in vitro kültürdeki kallus, sürgün ve tomurcuk oluşturma oranlarına etkileri 61 VIII

11 Çizelge Çizelge Çizelge Çizelge Çizelge Çizelge Çizelge Çizelge Çizelge Farklı BA dozları uygulamasının in vitro kültürlerdeki çoğalma kat sayısı ve bitki sayılarına etkisi 62 In vitro farklı BA dozları uygulamalarından elde edilen bitkilerde alıştırma serasına çıkarılan bitki sayısı, seraya çıkarılan bitki sayısı ile serada yaşama oranları (%) 64 In vitro da farklı BA dozları uygulamasının serada yetiştirilen bitkilerde yaprak ve stomatal özelliklere etkileri. 65 In vitro da farklı BA dozları uygulamsının serada yetiştirilen bitkilerde çiçek özelliklerine etkileri 66 In vitro da farklı BA dozları uygulamasının ploidi seviyesine etkileri In vitro diploid mikroçeliklere kolhisin uygulaması yapıldıktan sonra yaşayan bitki sayısı, yaşayan bitkilerdeki boğum sayısı, bitki uzunluğu ve kök sayısı. 69 In vitro diploid mikroçeliklere kolhisin uygulaması yapıldıktan sonra elde edilen bitkilerde kolhisinin yaprak ve stomatal özellikler üzerine etkileri.. 70 In vitro diploid mikroçeliklere kolhisin uygulaması yapıldıktan sonra elde edilen bitkilerde çiçek özellikleri. 71 In vitro diploid mikro çeliklere kolhisin uygulaması yapıldıktan sonra elde edilen bitkilerde ploidi düzeyleri (%) 72 IX

12 ŞEKİLLER DİZİNİ Sayfa No Şekil 1.1. Triploid karpuz elde edilmesi (Mohr, 1986; Sarı, 1994). 3 Şekil 3.1. Kotiledon aşamasındaki bitkilere kolhisin uygulaması Şekil 3.2. Kotiledon aşamasında kolhisin uygulanmış bitkilerin seradaki görünümü. 21 Şekil 3.3. a.anthesis döneminden bir gün önce pens yardımıyla kapatılmış dişi çiçek b. Kendileme sonucu meyve tutmuş dişi çiçek c. Bitkideki meyve gelişimi d. Seradan genel bir görünüm 22 Şekil 3.4. a.kolhisin çözeltisine sürgün ucu daldırılmış bitki b. 2 saat kolhisin muamelesinden sonra kolhisin çözeltisinden sürgün ucunun çıkarılması c. Steril saf su ile kolhisinin dokuların üzerinden uzaklaştırılması d. Kolhisin ile muamele edilmiş sürgün ucunun kurdele ile bağlanarak belirtilmesi. 24 Şekil 3.5. Çimlendirme ortamına alınacak tohumların yüzey dezenfeksiyonu 27 Şekil 3.6. In vitro çalışmalarında kullanılan kültür odasından bir görünüm Şekil 3.7. a.beş gün çimlendirme ortamında tutulan tohumdan gelişen genç bitkicik b. Kotiledonların proksimal kısımlarının kesilmesi c. Kesilen eksplantların görünümü d. Eksplantların rejenerasyon ortamına yerleştirilmesi Şekil 3.8. Rejenerasyon ortamında farklı BA dozları kullanımı sonucu elde edilen bitkiler Şekil 3.9. a.in vitro bitkilerin besi ortamından çıkarılması b. In vitro bitkilerin viyollere dikimi c. In vitro bitkilerin alıştırma serasındaki görünümü d. In vitro bitkilerin seraya dikimi sonrası görünümü. 32 Şekil Besi ortamına tohum ekilmesinden 10 gün sonra çimlenen tohumların görünümü.. 33 X

13 Şekil a.in vitro bitkilere kolhisin uygulaması b. Bitkilerin kolhisin çözeltisinde bekletilmesi c. Bitkilerin mikroçeliklere ayrılması d. Mikroçeliklerin E20A besi ortamına yerleştirilmesi Şekil In vitro mikro çeliklere kolhisin uygulaması sonrası E20A besi ortamına alınan bitkilerin görünümü Şekil In vitro bitkilerin sera koşullarına alıştırılması 37 Şekil Portable area meter 4-Cor Model-LI-3000A markalı yaprak alanı ölçümü yapan makine.. 39 Şekil Serada morfolojik gözlem yapımı Şekil x büyütmeli objektif ve 10x büyütmeli oküler mikrometre yardımıyla fotoğrafı çekilmiş yaprak örneği Şekil 4.1. Kotiledon aşamasında farklı kolhisin dozları (% 0.0, % 0.1, % 0.2, % 0.3, % 0.4, % 0.5 ve % 0.6) uygulanmış fidelerin seraya dikiminden önceki görünümü.. 46 Şekil 4.2. Farklı BA dozları içeren rejenerasyon ortamında bulunan eksplantların kültüre alımdan 25 gün sonraki görünümleri. 62 Şekil 4.3. Rejenerasyon ortamında farklı BA dozları ile elde edilmiş sürgünlerin kardeşlendirme ortamındaki görünümü. 63 Şekil 4.4. Kontrol bitkisinde flow sitometri sonucunun bilgisayar ortamındaki görüntüsü. 67 Şekil mg/l BA dozundan elde edilen tetraploid bitkinin ve flow sitometri sonucunun bilgisayar ortamındaki görüntüsü Şekil 4.6. a.farklı konsantrasyonlarda diploid mikro çeliklere kolhisin uygulamasından sonra E20A besi ortamına alınan bitkilerin ilk gözlem tarihindeki görünümleri b. Bitkilerin sera koşullarına çıkarılmadan önceki görünümü XI

14 KISALTMALAR % : Yüzde o C μm μm AgNO 3 BAP BA cm da DNA E20A GA 3 g ha HCl IAA IBA kg l LDL mg mm mm ml NAA MS rpm SÇKM TDZ UV : santigrad derece : Mikrometre : mikromolar : Gümüş nitrat : Benzylamino Purine : Benzile Adenin : santi metre : Dekar : Deoxyribonucleic acid : Çalışmada kullanılan E20A besi ortamı : Giberellic Acid : gram : Hektar : Hidroklorik asit : Indole Asetik Asit : Indole Butirik asit : Kilogram : Litre : Low density lipoprotein : miligram : milimolar : Milimetre : mililitre : Naphthalene acetic acid : Murashige and Skoog besi ortamı : revolutions per minute : Suda Çözünebilir Kuru Madde : Thidiazuran : Ultra Viyole XII

15 1. GİRİŞ Sezen İNAN 1. GİRİŞ Karpuz tarımı, dünyada ve ülkemizde oldukça geniş bir alana yayılmıştır. Dünya da ton karpuz üretimi yapılmaktadır. Türkiye, ton üretimi olan Çin den sonra 2. sırada yer almaktadır. Türkiye den sonra 3. sırada ton üretimi ile İran, 4. sırada ton üretimi ile ABD gelmektedir. Türkiye de ha lık alanda ton sebze üretimi yapılmaktadır. Bu üretimin yaklaşık % 33 ünü Cucurbitaceae familyasına ait sebze türleri oluşturmakta ve karpuz bu familya içerisinde ha üretim alanı ve tonluk üretimi ile 1. sırada yer almaktadır (Anonymous, 2005). Ülkemiz tarımında karpuzun oldukça önemli bir yeri vardır. Karpuz, ülkemizde domates ve patatesten sonra en fazla üretilen üçüncü sebzedir. Üretimin % 35 i Akdeniz Bölgesinde yapılmaktadır. Ege, Güneydoğu Anadolu ve Marmara karpuz üretiminin yapıldığı diğer bölgelerdir (Sarı, 2006). Karpuz meyvesinde oldukça yüksek oranda şeker bulunur. Bu şekerin büyük bir bölümü glikozdan oluşur. Karpuzun değerlendirilen kısmında % 7-10 arasında değişen oranda suda çözünebilir kuru madde (SÇKM) A, B ve C vitaminleri ile bir çok mineral madde bulunmaktadır (Vural ve ark., 2000). Karpuz, iştah açıcı, serinletici ve ferahlatıcı etkiye sahip yazlık bir sebzedir. İnsan sağlığı açısından bakıldığında göz ağrılarına, mide rahatsızlığına, baş ağrılarına iyi geldiği bilinmektedir (Sarı, 2006). Karpuzda antioksidant maddelerden karetenoidler (lycopen ve β-caroten) ile aminoasitlerden arginine ve citrulline bulunur. Likopen kanser riskini azaltır. LDL (low density lipoprotein) yi düşürür. Sperm kalitesini arttırır. Deriyi UV zararından korur (Perkins, 2005). Karpuz meyvesi besleyici özelliği dışında, sıcak havalarda ideal bir serinleticidir. Cucurbitaceae familyasına giren Citrullus cinsi, Afrika, Asya ve Akdeniz in sıcak bölgelerinde yetişen 4 diploid (2n=22) tür içermektedir (Jeffrey, 1975; Whitaker ve Davis, 1962; Robinson ve Decker-Walter, 1997). Dünya da tropik ve subtropik bölgelerde yetiştirilen Cirtullus lanatus (Thunb.) Matsum. ve Nakai, kültür formu Citrullus lanatus var. lanatus ve Güney Afrika ya özgü yabani bir tür olan citron olarak da bilinen Citrullus lanatus var. citroides (Bailey) Mansf. alt 1

16 1. GİRİŞ Sezen İNAN türlerinden oluşmaktadır (Whitaker ve Bemis, 1976; Robinson ve Decker-Walter, 1997). Kabuklarından turşu ve konserve yapımından yararlanılan Citrullus lanatus var. citroides in beyaz veya açık yeşil olan meyve eti acıdır. Tohumları haşlanarak veya un haline getirilerek tüketilir (Robinson ve Decker-Walter, 1997). Karpuzda en önemli meyve kalite özelliklerinden birisi tohum iriliğidir. Ülkemizde yöresel olarak yetiştirilen karpuz genotiplerinin çoğunluğunda tohumlar iridir (Sarı ve ark., 2005). 10 yıl öncesine kadar ülkemizde yöresel çeşitlerin yetiştiriciliği ve tüketimi ağırlıklı iken, günümüzde tohum firmaları tarafından küçük tohumlu F 1 hibritler geliştirilerek piyasaya sürülmüştür. Karpuzda tohumlar meyve etine gömülü olarak veya dağınık bir şekilde bulunur. Kalite açısından en önemli özelliklerden birisi çeşitlerdeki tohum miktarı ve iriliğidir. Tüketim esnasında bu çekirdeklerin ağızdan çıkarılması tüketiciyi hoşnut bırakmamaktadır. Karpuz meyvesindeki aşırı tohum sayısı uluslararası marketlerde istenmeyen bir duruma gelmiştir. Çekirdeksiz karpuz çalışmalarına 1939 yılında Dr. Kihara başlamıştır. Araştırıcı yıllarında triploid karpuz üretiminde başarılı olmuştur ve çekirdeksiz karpuz üretimi hızla yaygınlaşmaya devam etmektedir (Lucier ve Lin, 2001). Çekirdeksiz karpuz, çekirdeğinin olmamasından ve diploid karpuzlara göre tadının daha güzel olmasından dolayı bir çok tüketici tarafından tercih edilmektedir (Marr ve Gast, 1991). Çekirdeksiz karpuzlar triploid (3n=3x=33) hibritlerdir (Kihara, 1951). Triploid tohum elde edilmesi için tetraploid hatların ana ebeveyn olarak kullanılması gerekmektedir. Diploid hatların tetraploid polenlerle tozlanması sonucunda boş ve steril tohumlar meydana geldiği Mohr, (1986) tarafından bildirilmekle birlikte, bu boş tohumların içerisinde endospermsiz embriyo da oluşabildiği Sarı, (1994) tarafından tespit edilmiştir. Şekil 1.1 de triploid karpuz elde edilmesi şekilsel olarak gösterilmiştir. 2

17 1. GİRİŞ Sezen İNAN Şekil 1.1. Triploid karpuz elde edilmesi (Mohr, 1986; Sarı, 1994) Tohumsuz kültürler için, tetraploid (4x=44) dişi birey ile diploid (2x=22) erkek bireyin tozlanmasıyla hibritler oluşur. Oluşan tohumlar triploid (3x=33) dir. Triploid bitkide üç set kromozom vardır ve bu üç set kromozom bölünemediğinden dolayı triploid hibritlerin dişi bireyleri kısırdır ve meyveler tohumsuzdur. Triploid bitkilerin erkek organları kısırdır, üretim sırasında dişi çiçekte uyartım olması için triploid karpuz yetiştiriciliğinde arazinin 2/3 triploid - 1/3 diploid olacak şekilde bitki yetiştiriciliğinin yapılması gerekmektedir. Triploid karpuz kültürlerinin geliştirilmesi için yapılacak ıslah sürecinde, katlanacak tohum için ebeveyn seçimi, tetraploid hatların geliştirilmesi için ek zaman, meyve anormalliği ve kısırlık için ek seçim, 3

18 1. GİRİŞ Sezen İNAN diploid hatların eliminasyonu, hibrit üretimi ve test edilmesi, diploid tozlayıcı üretimi gibi problemler meydana getirmektedir. Diploid hatların belirlenmesi, tetraploid bitkilerin elde edilmesi (kolhisin, doku kültüründe rejenerasyon, sıcaklık şoku, X- ışınları yöntemleri kullanılarak), tetraploid hatların geliştirilmesi, hibritlerin üretimi ve test edilmesi triploid çeşit ıslahında kullanılan basamaklardır. İyi bir triploid çeşitte yüksek çimlenme oranı, hızlı ve güçlü büyüme, iyi meyve tutumu ve yüksek verim özelliklerinin bulunması gerekmektedir ( McCuistion ve Wehner, 2005). Günümüzde kromozom katlaması için bitki ıslahçıları tarafından en yaygın kullanılan kimyasal maddelerden biri kolhisindir. Bu madde güz çiğdeminin (Colchicum automnale L.) köklerinden elde edilen alkoloid yapısında kuvvetli bir zehir olup; renksiz, alkol, kloroform ve soğuk suda eriyen; sıcak suda ve eterde erimeyen bir maddedir. Kimyasal formülü C 22 H 25 O 6 olarak gösterilir. Kolhisin, uygulandığı dokuların hücrelerinde mitoz bölünmenin metafaz safhasında iğ ipliklerinin oluşumunu engeller ve dolayısı ile replikasyona uğramış kromozomların kutuplara çekilmesini önleyerek, kromozom sayısının iki katına çıkmasını sağlar (Köksal, 1999). Türkiye, karpuz üretiminde Çin den sonra dünyada üretim bakımından ikinci sırada yer almasına ve karpuzun ikincil gen merkezlerinden biri olmasına rağmen, çekirdeksiz karpuz tohum üretimi bulunmamaktadır. İsrail, ABD ve İspanya gibi ülkelerde çekirdeksiz karpuz tohumluk üretimi yapılmaktadır. Çin, Avusturalya, ABD ve İsrail gibi ülkelerde toplam ekili karpuz alanlarının çoğunluğu çekirdeksiz karpuz olarak yetiştirilmektedir. Ülkemizde bazı ticari firmalarca çekirdeksiz karpuz çeşitleri piyasaya sunulmakta, fakat tohum fiyatının yüksekliği ve çıkış düzensizlikleri sebebiyle üretici tarafından fazla ilgi görmemektedir. Sadece ihracata yönelik bazı firmaların yapmış oldukları üretimler bulunmaktadır. Planlanan bu araştırma ile -ileride yerli çekirdeksiz karpuz çeşitleri geliştirme hedefiyle çekirdeksiz karpuz üretiminin ilk ve en önemli aşaması olan tetraploid ana ebeveyn geliştirilmesi için farklı in vivo ve in vitro yöntemler araştırılmış ve en etkili protokol belirlenmeye çalışılmıştır. 4

19 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Sezen İNAN 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Dr. Kihara tarafından çekirdeksiz karpuz çalışmalarına 1939 yılında başlanmış ve 1951 yılında ilk çalışma yayınlanmıştır. Daha sonra konuyla ilgili çalışmalar değişik ülkelerde devam etmiştir. Çekirdeksiz karpuz elde edilmesinin ana materyali tetraploid hat elde etmektir. Bu amaca ulaşmak için çalışmalar in vivo ya da in vitro koşullarda yürütülebilir In Vivo Tetraploid Bitki Elde Etme Çalışmaları Lower ve Johnson (1969), tetraploid karpuz hatları elde edebilmek için fidelerin büyüme noktalarına % 0.3 lük kolhisin uygulamasını 24 saat içinde 2 damla, 52 saat içinde 8 damla, 80 saat içinde 8 damla veya ekimden önce tohumları 6-24 saat (6 saat aralıklarla) % 0.1-% 0.2 kolhisin çözeltisine bandırmak suretiyle bir çalışma yürütmüşlerdir. Çalışmada, Charleston Gray 133 ve Princeton çeşitleri kullanılmış, araştırma sonucunda Princeton çeşidinin tetraploidiye Charleston Gray 133 e göre daha iyi yanıt verdiği tespit edilmiştir. Araştırıcılar, Princeton çeşidinde 8 damla kolhisin uygulamasının (52 ve 80 saatte) % 6 oranında tetraploid uyartımı sağladığı; C. Gray çeşidinde bu oranın % 4 düzeyinde bulunduğunu bildirmişlerdir. İki damla (24 saat) kolhisin uygulamasının C. Gray çeşidinde hiç yanıt vermediğini; Princeton çeşidinde ise % 3 düzeyinde tetraploidi oluşturduğu saptanmıştır. Tohumların 24 saat % 0.1 lik veya 18 saat % 0.2 lik kolhisin çözeltisinde bekletilmesinin % 0-20 oranlarında tetraploidi oluşturduğu belirlenmiştir. Araştırıcılar tohum daldırma yönteminin, büyüme ucuna damlatma yöntemine göre daha etkili olduğunu belirtmişlerdir. Sugar Baby karpuz çeşidine kotiledon aşamasındayken kolhisin uygulaması ile Karchi ve ark. (1981), tetraploid "Alena" çeşidini geliştirmişlerdir. Araştırıcılar, Alena karpuz çeşidinin açık tozlanan, üstün kalitede, yoğun kültür şartlarına adapte olan özellikte olduğunu bildirmişlerdir. Sugar Baby e göre bu çeşidin yapraklarının daha geniş ve kalın, çiçeklerinin daha geniş, taç yapraklarının dip kısımlarının renkli, tohumlarının daha iri, meyve ağırlığının ortalama 4 kg ve meyve başına yaklaşık 70 5

20 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Sezen İNAN tohum içerdiği, ayrıca meyve etinin koyu kırmızı, sert ve şeker oranının % 12.5 un üzerinde olduğu, kabuk renginin siyah-yeşil ve olgunlaşmanın "Sugar Baby" e göre 7-10 gün daha sonra olduğu tespit edilmiştir. Li ve ark. (2002), sarı meyve kabuğuna sahip 2608 (YPW) numaralı karpuz hattında tetraploid bitki elde etmek için kolhisin uygulamasının etkisini araştırmışlardır. Örtü altı koşullarında şubat ayında ekilen tohumlardan gelişen fidelere % 0.2 dozunda kolhisin, 1-2 gerçek yapraklı aşamada uygulanmıştır. Kolhisinin organlarda yaptığı mutasyon ve fizyolojik değişimlerin incelendiği araştırmada; morfolojik, mikroskopik ve hibridizasyon etkisi farklı ploidi belirleme metodları ile çalışılmıştır. Araştırma sonucunda tetraploidi oranı % 12.4 olarak saptanmış, tetraploidlerin diploidlerle melezlenmesi ile triploid bitkiler geliştirilmiştir. Koh (2002), yaptığı çalışmada tetraploid karpuz üretim metodları geliştirmeyi amaçladığını ve bu amaçla, antimitotik etmenler olan kolhisin (% 0.05, 0.10, 0.20 ve 0.50) ve oryzalini (5, 15, 30 ve 60 μm) genç fidelere uyguladığını bildirmiştir. Araştırmada, erken gelişme dönemlerinde eklenen değişik antimitotik etmenlerin, tetraploidleşme düzeyi üzerine etkileri ve diploid-tetraploid arasındaki farklılıklar araştırılmıştır. Genç fidelere 48 saat boyunca % 0.2 lik kolhisin ve 60 μm oryzalin uygulandığında, bitkilerin % 50 sinden fazlasında sürgün gelişiminin zayıfladığını, bitkilerin tetraploid olma düzeyinin fidelere saat süreyle % 0.2 lik kolhisin uygulamasının, 24 saat 5-30 μm oryzalin uygulaması kadar yüksek olduğunu bildirmiştir. Diploid ve tetraploid bitkiler karşılaştırıldığında; bekçi hücrelerdeki kloroplast miktarı, anter şekli, erkek çiçekteki polen miktarı ve yaprak şekilleri arasında farklılıklar olduğu belirlenmiştir. Flow sitometri sonucu elde edilen analiz sonuçları birçok tetraploid bitkinin miksoploid olduğunu göstermiştir. Tetraploid bitkilerde her bir meyve başına düşen tohum miktarının diploidlere göre yaklaşık 1/10 u kadar daha az olduğunu ve bir çoğunun da boş embriyo oluşturduğunu bildirmiştir. Yetişir ve Sarı (2003), 9 farklı kavun geriye melezinden ışınlanmış polen tekniği ile geliştirilmiş haploidlerin dihaploidizasyon oranını yükseltmek için, in vivo sürgün ucu daldırma yöntemini denemişlerdir. Araştırma sonucunda haploid 6

21 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Sezen İNAN kavunların dihaploid hale getirilmesi için in vivo sürgün ucu daldırma yöntemiyle kavunda % 90 ın üzerinde katlanma meydana geldiği tespit edilmiştir. Jaskani ve ark. (2004a), yaptıkları çalışmada diploid karpuz hatlarına kolhisin uygulayarak tetraploid hatları geliştirdiklerini bildirmişlerdir. Araştırıcılar 10 karpuz hattına ait fidelerin gerçek yapraklarına 3 gün boyunca günde 2 defa olmak üzere % 0.2, % 0.4 ve % 0.6 dozlarında kolhisin uygulaması yapmışlardır. Çalışma sonunda hatların kolhisin dozlarına farklı tepkiler verdiği bulunmuş, buna göre en yüksek ölüm oranının % 0.6 konsantrasyonda uygulanmış olan kolhisin miktarında olduğu belirlenmiştir. Araştırıcılar kolhisin uygulanmış fidelerin tetraploid olup olmadığını belirlemek için kloroplast sayısına, DNA içeriğine ve bitkilerin morfolojisine bakıldığını belirtmişlerdir. Stomadaki herbir bekçi hücresinin kloroplast sayısının diploid bitkilerde 5-7, tetraploid bitkilerde olarak bulunduğunu bildirmişlerdir. Poliploidi miktarının % 0.2 lik kolhisin uygulamasında fazla bulunduğunu, bununla birlikte farklı hatlarda % % 5.5 arasında tetraploidi görüldüğünü bildirmişlerdir. Tetraploid bitkilerin, diploid bitkilere göre yapraklarının daha geniş ve erkek çiçeklerinin daha büyük olduğu bildirilmiştir. Polen morfolojisine bakıldığında diploid bitkilerde 3, tetraploidlerde 4 polen kolpisi (çimlenme pilesi) tespit edilmiştir. Zhang ve ark. (2005), Wuzihuangyu nın, M863 in T948 ile melezlenmesi ile geliştirilmiş yeni çekirdeksiz sarı-etli karpuz çeşidi olduğunu bildirmişlerdir. Ana ebeveyn olarak kullanılan M863 ün kolhisin ile katlanarak tetraploid olarak elde edildiği ve diploid T948 hattı ile tozlandığı bildirilmiştir. Geliştirilen F 1 hibrit çekirdeksiz karpuzda olgunlaşmanın ve meyve gelişiminin erken (28-30 gün) olduğu, tüm vejetasyon süresinin gün olduğu, bitkilerin güçlü gelişim gösterdikleri ve meyve tutumunun iyi olduğu tespit edilmiştir. Kolhisin uygulaması ile geliştirilen tetraploid ebeveynle melezleme neticesinde oluşturulan bu çekirdeksiz hibritte; ortalama meyve ağırlığı kg ve meyve şekli yuvarlak, ortalama sera verimi 5.25 ton/da ve ortalama tarla verimi 4.5 ton/da olarak belirlenmiştir. Araştırmacılar, Wuzihuangyu nın sarı meyve etli, gevrek sulu, az lifli içeriğe sahip olduğunu ve şeker içeriğinin kabuğa yakın kısımlarda az fark göstermekle beraber, aşağı yukarı % olduğunu bildirmişlerdir. Bitkinin Fusarium solgunluğu, hastalıklar ve 7

22 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Sezen İNAN antraknoza kontrol bitkilerine göre daha dayanıklı olduğunu ve bu çeşidin Çin in Auhui, Jiangsu, Shanghai ve Zhejiang bölgelerinde yetiştiriciliğe uygun olduğunu belirtmişlerdir In Vitro Tetraploid Bitki Elde Etme Çalışmaları Song ve ark. (1988); karpuzda triploid tohumlardan in vitro koşullarda ürettikleri fidelerden aldıkları kotiledon parçalarından geliştirilen tomurcukları, 2 mg/l BA eklenmiş MS ortamında kültüre almışlardır. Köklendirme ortamı olarak IBA içeren ¼ MS ortamının kullanıldığı çalışmada bitki in vivo koşullara aktarılmış, daha sonra aşılanmış ve tarla koşullarına dikilmiştir. In vivo koşullarda aşılanmış ve in vitro koşullarda geliştirilmiş triploid bitkilerin arazi koşullarında iyi geliştiği, yüksek şeker içeriği ile C vitamini içeriğine sahip, iyi kalitede meyve verdiği tespit edilmiştir. Helmle-Janosi ve ark. (1992), Citrullus lanatus cv. Erwyn F 1 de yaptıkları bir çalışmada, eksplant büyüklüğünün hızlı çoğaltımı etkilediğini tespit etmişlerdir. 0.5 cm den daha büyük eksplantların 0.1 mg/l NAA ve 1 mg/l BA eklenen MS ortamında en yüksek hızlı çoğaltım oranını verdiğini belirtmişlerdir. Kallus oluşumu 0.5 cm den küçük eksplantlarda daha fazla olmuştur. Büyüme düzenleyicilerden yoksun ½ oranında MS ortamında rejenerasyonda başarı elde edildiği araştırıcılar tarafından tespit edilmiştir. Compton ve ark. (1993b), aseptik koşullarda çimlenen karpuz fidelerinden alınan 21 günlük sürgün uçlarını, 8 hafta süresince BA, kinetin (0, 1, 5 veya 10 μm) ve thidiazuron (TDZ; 0, 0.1, 1 ya da 5 μm) içeren katı MS ortamında inkübe etmişlerdir. Araştırmada, optimum BA seviyesi (1 μm) içeren ortamlar, TDZ nin en iyi (0.1 μm) ve kinetinin 10 μm konsantrasyonuyla karşılaştırılmıştır. BA içeren ortamlarda yaklaşık kat daha fazla aksiller sürgünlerin oluşumu gözlenmiştir. Çeşitli diploid ve tetraploid genotiplerin 1 μm BA içeren ortamda aksiller sürgünlerinin uzun süreli hızlı çoğaltma yeteneklerinin gözlendiği çalışmada, genotiplere göre aksiler sürgün sayısı açısından, Bush Jubilee ve Jubilee ΙΙ nin, Minilee, Dixielee ve tetraploid genotiplere göre daha fazla olduğu tespit edilmiştir. 8

23 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Sezen İNAN Genotiplerin çoğunluğunda kültüre alındığı ilk dönemlerde, eksplant başına sürgün sayısının düşük olduğu ( ), 2-3 ayda ( ) en üst noktaya ulaştığı ve 6 ayda ( ) ye düştüğü bildirilmiştir. Bunun tam tersi ise "Bush Jubilee" genotipinde eksplant başına sürgün sayısının, kültürün 1. ayında en yüksek değerde (11.7) olduğu, 6. alt kültürde ise 7.7 ye düştüğü ifade edilmiştir. Köklenen sürgünlerin oranının genotip ve kültür süresine bağlı olarak % 60 ile % 100 arasında olduğunu, dış koşullara alıştırılmış bitkilerin oranının ise % 21 - % 96 arasında değiştiğini bildirmişlerdir. Bu prosedüre göre 250 fide kullanılarak 3 ayda bitki üretildiğini bildirmişlerdir. Compton ve Gray (1994a), yaptıkları çalışmada 4 karpuz hattında (F92U8, SP90-1, SP90-2, SP90-4) 2, 4, 6, 8, 10 günlük çimlenme (1 litresinde MS + 20 g şeker mg myo-inositol + 2 mg glycine mg pyridoxine HCl mg nicotinic asit mg thiamine HCl + 7 gram agar olan ortam içerisine tohum ekimi yapılmış) sürelerinden sonra aldıkları kotiledon eksplantlarını, 8 hafta rejenerasyon ortamında tuttuktan sonra gelişen sürgünleri 4 hafta sürgün geliştirme ortamında kültüre almışlardır. Burada rejenerasyon ortamı için MS + 30 gram şeker + 10 μm N- (phenylmethyl)-1 H purin-6 amine (BA), sürgün geliştirme ortamı için MS + 20 gram şeker kullanıldığını belirtmişlerdir. Bu çalışma sonunda elde edilen bulgularda en yüksek sürgün miktarı 2 günlük çimlendirilmiş tohum kotiledonlarından ve F92U8 (% 66) ve SP90-2 (% 60) hatlarından elde edilmiştir. 4 günlük çimlendirilmiş tohum kotiledonlarından elde edilen SP90-4 genotipinde % 40 oranında sürgün bulunduğu bildirilmiştir. Araştırmacıların yaptıkları bu çalışmada 2 ve 4 günlük çimlendirilmiş tohum kotiledonlarından elde edilen sonuçlarda sürgün miktarının daha çok bulunduğu kaydedilmiştir. Compton ve ark. (1994b), diploid karpuz çeşidi Mickylee kotiledonlarının 6 hafta sürgün rejenerasyon ortamına alınması ile adventif sürgün elde edildiğini bildirmişlerdir. 1-2 cm lik sürgün uçlarının 1 μm IBA lı ortama transfer edilmesi ile bitkilerin elde edildiğini belirtmişlerdir. Rejenerasyon yolu ile elde edilmiş tetraploid ve diploid bitkileri, yapraklarındaki bekçi hücrelerinde bulunan kloroplast miktarı ile tanımlamışlardır. Her bitkide en az 30 bekçi hücresi çifti sayılarak yürütülen araştırmada, diploid bitkilerde ortalama 11.2, tetraploid rejenerantlarda

24 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Sezen İNAN kloroplast sayılmıştır. Kendileme yapılan tetraploidlerde tohum elde edilmiş ve elde edilen bireylerin triploid hibrit üretimi için diploid tozlayıcılar ile melezlendiğini bildirmişlerdir. In vitro tetraploid bitki oluşumunun, triploid hibrit tohum üretiminde kullanılmak üzere yüksek kalitede tetraploid bitki üretimi için kullanılabileceğini belirtmişlerdir. Tang ve ark. (1994), triploid karpuzları in vitro da çimlendirerek elde ettikleri kotiledon yapraklarından gelişen tomurcuk eksplantlarını 16 farklı ortam içerisinde kültüre almışlardır. Araştırmacılar MS ortamı içerisine 3 mg/l BA ilave edildiğinde yüksek rejenerasyon sağlandığını (% 93.33) ve çoğalma katsayısının da 8.71 olduğunu bulmuşlardır. Bu bitkileri, farklı BA ve IAA kombinasyonları içeren 9 değiştirilmiş MS ortamına alan araştırmacılar, 2 mg/l BA ve 1 mg/l IAA içeren MS ortamının iyi sonuç verdiğini ve ilk 20 generasyonda 5, 10 generasyonda ise 8 ortalama çoğalma katsayısı verdiğini bildirmişlerdir. Böylece, 6 ayda sekiz generasyon ( ) üretilmiştir. Bu bitkilerin, Lagenaria siceraria var. clavata anacına aşılanmadan önce MS ortamına 2 mg/l BA + 1 mg/l IAA+2 mg/l GA 3 (gibberellik asit) eklenmesiyle geliştirildiğini belirtmişlerdir. Aşılanan bitkilerin % 90 ından fazlasının yaşadığı ve % 95 inden fazlasının da toprağa aktarıldıktan sonra yaşadığı gözlenmiştir. Compton ve ark. (1996), Dixielee, Jubilee II, Mickylee, Minilee ve Royal Sweet karpuz çeşitlerinin kotiledon eksplantlarının kullanımı ile 6 haftalık sürgün rejenerasyon ortamında adventif sürgünlerin elde edildiğini bildirmişlerdir. Araştırmada, rejenerasyon sonucunda elde edilen bitkilerin ploidi düzeyleri bekçi hücrelerindeki kloroplast miktarı sayılarak belirlenmiştir. Tetraploid rejenerasyonlarda kloroplast sayısının 19.1, diploidlerde 11.2 olduğu ve tetraploid olduğu belirlenen bitkilerin diploid tozlayıcı ile melezlenerek triploid tohum üretim etkisinin saptandığı bildirilmiştir. Rejenerasyon sonucu tetraploid sürgün elde etme oranı çeşitler arasında önemli bir farklılık göstermemekle birlikte, % 5-20 arasında değişmiş, Mickylee çeşidinden elde edilen tetraploid bitkiler kendilenmiş ve tohum oluşturmuşlardır. Araştırıcılar, bu çalışma ile doku kültürü yöntemiyle etkili fertil ve kimerik olmayan tetraploid bitkilerin elde edildiğini ve bu bitkilerin triploid hibrit ıslahında 10

25 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Sezen İNAN yüksek kalitede kullanılabilecek materyal olduğunu tespit etmişlerdir. Ayrıca kloroplast yoğunluğu, yumurtalık çapı, erkek çiçeklerin taç yaprak genişliği, anter çapı ve yaprak boy/genişlik oranlarının bitki ploidi belirlemede iyi göstergeler olduğunu bildirmişlerdir. Sarı ve Abak (1996), karpuzda yaptıkları çalışmada elde ettikleri haploid bitkileri katlamak için in vitro koşullarda farklı kolhisin dozları (% 0.5 ve % 1) ile dört farklı uygulama süresini (1, 2, 4 ve 6 saat) denemişlerdir. Uygulama, Sugar Baby, Halep Karası ve Crimson Sweet çeşitlerinin 3-4 haftalık in vitro haploid mikroçeliklerine yapılmıştır. Haploid bitkilerden dihaploid bitkilerin elde edilmesi için in vitro mikroçeliklerin % 0.5 lik kolhisin çözeltisinde 4 saat tutulması ile % 1 lik kolhisin çözeltisinde 2 saat tutulmasının en uygun yöntem olduğu belirtilmiştir. Araştırıcılar % 0.5 yoğunlukta kolhisin uygulanan bitkilerin % 64 ünün yaşadığını ve % 56 sının gelişerek yeni bir bitkiye dönüştüğünü bildirmişlerdir. % 1 kolhisin dozunda yaşama ve gelişme oranlarının % 40 olduğu belirtilmiş, kolhisin uygulama süreleri arasında 6 saat uygulamasının en fazla bitki ölümüne neden olduğu, düşük doz ve kısa sürelerde ise bitkilerin haploid kaldığı belirtilmiştir. Li ve ark. (1999), in vitro kromozom katlaması üzerine kolhisin, dinitroanilines ethalfluralin ve oryzalinin etkisini araştırmışlardır. Araştırıcılar, karpuzdan izole edilen tek tomurcukları sıvı MS ile % 3 şeker ve 10 μm BA içeren farklı kolhisin (100, 500, 1000 veya 1500 μm), dinitroaniline (5, 10, 50 veya 100 μm) ortamlarında kültüre almışlardır. Kültüre alınan bütün ortamlar karanlık koşullarda 3, 6 veya 9 gün çalkalayıcıda 100 rpm hızda çalkalanmışlardır. Uygulama görmüş tomurcuklar kolhisin ve dinitroaniline içermeyen fakat % 0.7 agar içeren aynı ortama tekrar transfer edilmişlerdir. Araştırıcılar, uygulama yapılan tüm sürgünlerin kromozom katlaması uygulamasında yaşadığını, fakat yaprak uçlarında küçük bazı kararmalar gözlendiğini belirtmişlerdir. Oryzaline yerine 9 gün 10 μm dinitroaniline kullanılmasının % 50 tetraploid bitki elde edilmesine neden olduğu ve kolhisin kullanımı ile birlikte, uygulamanın 30 gün daha etkili olarak ortaya çıktığı bildirilmiştir. Compton (2000), karpuz kotiledonlarının organogenik yetenekleri üzerine eksplant büyüklüğü ile çeşit etkilerini araştırdığı bir diğer çalışmada; kotiledonların 11

26 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Sezen İNAN proksimal bölgelerinden hazırlanan eksplantlarda yaklaşık % 52 oranında organogenesis tespit edilirken, bu oranın kotiledonun distal bölgelerinde sadece % 6 oranında kaldığını saptamışlardır. Araştırıcılar, sürgün oluşumunun basal eksplantlar tarafından sınırlandırıldığını, fakat distal bölgelerde hiçbir spesifik bölgenin sürgün oluşumunu sınırlandırmadığını bildirmişlerdir. Sürgün oluşturan eksplant yüzdesinin Sweet Gem, Crimson Sweet ve Minilee de yüksek olduğunu belirtmişlerdir. Eksplant büyüklüğünün Yellow Doll da adventif sürgün rejenerasyonunu etkilemediğini saptamışlardır. Bunun da çeşit ve eksplant büyüklüğü arasında önemli bir bağlantı olduğunu bildirmişlerdir. Araştırıcılar bu çalışma ile çeşitlerin çok azının in vitro prosedürlere yanıt verdiği ve sürgün rejenerasyonu için çok az miktarda etkili hücreye sahip olduğunu saptamışlardır. Guo ve ark. (2000), yaptıkları çalışmada in vitro kültürde eksplant kaynağı olarak 5 farklı diploid karpuz çeşidinde kotiledon kullandıklarını bildirmişlerdir. Adventif sürgün ayırt edilmesinde eksplantların sürgün oluşturma oranı çoğalma katsayısı, sürgün anormallik yüzdesi ve tetraploid çeşitlerde eksplantın alındığı yer ve ortam içeriğindeki hormon konsantrasyonunu etkilediğini belirtmişlerdir. Tetraploid bitkilerin, sürgünlerin apikal hücrelerindeki kromozom sayısının incelenmesi ile kolayca tespit edildiğini bildirmişlerdir. Tetraploid bitkilerin diploid bitkilere göre kültür ortamında besi stresine karşı adaptasyonunun daha iyi olduğunu yaptıkları çalışmada bildirmişlerdir. Çürük ve ark. (2003), kavunda transgenik bitki elde edilmesine yönelik yaptıkları bir çalışmada; Revigal, Topmark ve Kırkağaç kavun çeşitleri ile C. sativus. Lcv.Taoz hıyar çeşidinin hipokotil eksplantlarını kullanmışlardır. Araştırmada, 4.4 µm BA içeren MS ortamında hızlı ve direkt rejenere olan çoklu sürgün oluştuğunu gözlemişlerdir. Hipokotillerin rejenerasyonundan yaklaşık % 100 diploid sürgünler elde edilirken, kotiledon eksplantlarından oluşan rejenerasyonda % 40 dan % 70 e kadar değişen oranlarda poliploid bitki oluşumu saptanmıştır. Revigal kavun çeşidinin kotiledon eksplantlarının rejenerasyon için ışığa ihtiyaç duyduğu, bununla birlikte hipokotil eksplantlarının hem karanlık hem de aydınlıkta rejenerasyona uğradığını gözlemişlerdir. 12

27 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Sezen İNAN Yalçın Mendi ve ark. (2003), Crimson Sweet karpuz çeşidinde yaptıkları çalışmada steril edilmiş tohumların MS ortamında çimlendirildiğini ve 5 günlük tohum kotiledonlarından alınmış eksplantların benzyl adenine (BA) (0, 5, 10, 20 μm) ve indole-3-acetic acid (IAA) (0, 0.5, 5 μm) kombinasyonları içeren MS rejenerasyon ortamında kültüre alındığını belirtmişlerdir. Araştırma sonucunda maksimum sürgün gelişimi, 10 μm BA μm IAA ve 20 μm BA (% 75 ve % 78) içeren rejenerasyon ortamında direkt organogenesis yoluyla oluşmuştur. Jaskani ve ark. (2004d), ploidi değişimini (özellikle tetraploid elde edilmesi için) teşvik etmek için karpuzlara in vitro kültürde antimitotik etmen olan kolhisin ile uygulama yapmışlardır. Araştırmada yöntem olarak; kotiledon eksplantı, tohumun embriyogenik ucu, epikotil ve hipokotil in enine kesitlerinin BA (1μM) ve kolhisin (% 0.01, % 0.05 ve % 0.1) içeren MS ortamında kültüre alınması seçilmiştir. 4-7 gün sonra eksplantlar kolhisinsiz ortamda kültüre alınmıştır. Araştırma sonucunda; kolhisinin in vitro rejenerasyona negatif etkisinin olduğu belirtilmiş, bununla birlikte, fidelerin hipokotil kısımlarının % 0.01 kolhisin içerisinde maksimum kallus oluşturduğu tespit edilmiştir. Kotiledon eksplantlarının % 0.01 konsantrasyonundaki kolhisinde 4 gün kültüre alınanlardan daha fazla ve hızlı sürgün oluşturduğu belirlenmiştir. Maksimum kök oluşumu ve kök sayısı embriyogenik eksplantlarda gözlenmiştir. Sonuçta, karpuz rejenerasyonunda eksplantların kotiledon ve embriyogenik uçları düşük kolhisin konsantrasyonunda (% 0.01) optimum olarak tespit edilmiştir. Krug ve ark. (2005), Citrullus lanatus da kültür ortamı içerisine sitokinin eklenmesi ile kotiledon parçalarından in vitro organogenesis yolu ile sürgün ucu elde edilmesini amaçladıkları bir çalışmada, eksplant olarak 1, 3 ve 5 günlük çimlenen tohumlardan distal ve proksimal kotiledon bölgelerini kullanmışlardır. Araştırma sonucunda in vitro organogenesisin karpuzda yüksek bulunduğu, üç günlük çimlenen tohumlardan alınan kotiledonların proksimal bölgelerini MS ortamı içerisine aldıklarını, bu ortam içerisine BAP (1 mg/l) ve hindistan cevizi suyu (% 10) eklediklerini belirtmişlerdir. Bu çalışmada, karpuzda organogenesisin, kallus oluşturmaksızın, eksplantın epidermal ve subepidermal katmanlarından meydana geldiği tespit edilmiştir. Ayrıca adventif sürgünlerin, sürgün ucu meristemleri ve 13

28 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Sezen İNAN yaprak primordiasının gelişmesiyle karakterize olduğu ve şişkinlik oluşumlarında adventif gözlerin gelişmediği gözlenmiştir Triploid Bitkiler ve Ploidi Belirleme Çalışmaları Gonzalez ve Ayuso (1991), triploid karpuz ıslahında meydana gelen son gelişmeler ışığında; geçmişte ticari karpuz yetiştiriciliğinde karşılaşılan ve istenmeyen; düzensiz meyve şekli, yüksek tohum fiyatı ve elverişsiz yetiştirme tekniği gibi bazı olumsuzlukların günümüzde bertaraf edildiğini bildirmişlerdir. Sarı ve ark. (1999b), karpuzda ploidi düzeyi belirlemede kromozom sayımı, flow sitometri, stoma boyu, bekçi hücrelerindeki kloroplast sayısı ve morfolojik gözlemlerin Sugar Baby ve Halep Karası çeşitlerine ait haploid ve dihaploid bitkilerinde karşılaştırmasını yapmışlardır. Sonuç olarak tüm yöntemlerin karpuzda haploid bitkilerin dihaploid bitkilerle ayrımında başarıyla kullanılabileceği belirtilmiştir. Kromozom sayımları ve morfolojik gözlemlerin uzun zaman alması, flow sitometri için pahalı bir cihaza gerek duyulması, diğer taraftan stoma ölçümlerinin ve kloroplast sayımlarının pratik bir alternatif yöntem olduğu bildirilmiştir. Yapılan incelemelerde; diploid bitkilerde stoma uzunluğunun μm, stoma çapının 18 μm ve kloroplast sayısının adet/stoma olduğu, haploid bitkilerin ise μm stoma uzunluğuna, μm stoma çapına ve 6-7 adet/stoma kloroplast sayısına sahip oldukları tespit edilmiştir. Sitometri yöntemine ait bulguların kromozom sayımları ile tam bir uyum gösterdiği bildirilmiştir Rhodes ve Zhang (1999), kontrollü tozlanmanın hibrit karpuz tohumu üretiminde temel rol aldığını ve erkek kısırlığının kullanımının çok büyük çaba gerektirdiğini bildirmişlerdir. Başarılı tohum üretiminin, iyi kültür koşulları ve zamanında hasat yapılmasına bağlı olduğunu, triploid tohum üretim miktarının, diploid hibrit tohum üretim miktarından çok olduğunu bildirmişlerdir. Tetraploid ebeveynlerin gelişiminin, kolhisin dışındaki kromozom katlayıcı etmenler ve doku kültürü kullanımı ile daha çok arttığını belirtmişlerdir. Triploid hibritlerin, dişi ebeveynden gelen iki kromozom ve bir tane de baba ebeveynden gelen kromozom ile tüketiciye daha fazla sayıda çeşit sunabildiği gibi hastalıklara dayanıklılık gibi yeni 14

29 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Sezen İNAN stratejiler de sunabildiğini belirtmişlerdir. Yeni triploidler, yeni bir hastalık sorunu karşısında hızlı bir şekilde çeşit geliştirmeye olanak sağladığı için pazar isteklerinin karşılanmasını sağlayabilirler. Liu ve Wang (2002), karpuz (Citrullus lanatus) ve kavun (Cucumis melo) un haploid ve poliploid (triploid ve tetraploid) lerinin geliştirilmesi için yapılan ıslah sürecinin kromozomal durumunu araştırmışlardır. Haploid bitkilerin geliştirilmesini kapsayan tekniklerde, haploidlerde kromozom katlaması, tetraploid bitkilerin regenerasyonuna in vitro ve in vivo etkenleri ve kavunda triploid ıslahı ve farklı ploidi seviyelerini araştırmışlardır. Jaskani ve ark. (2004b), çimlenme döneminde kolhisin uygulanmış tetraploid karpuz bitkilerinin DNA içeriklerinin belirlenmesinde kullanılan flow sitometrik analiz yöntemini, diğer ploidi belirleme metodları (bekçi hücrelerindeki kloroplast sayımı, kromozom sayımı, yaprak büyüklüğü, çiçek büyüklüğü, polen kolpi sayısı ve tohum özellikleri) ile karşılaştırmışlardır. Araştırıcılar flow sitometrik analiz yönteminin, tetraploid bitkilerde kloroplast miktarının belirlenmesinden daha hızlı bir yöntem olduğunu bildirmişlerdir. Bekçi hücrelerindeki kloroplast sayılarının her bir hücrede diploid karpuzlarda 5-7, tetraploidlerde olduğu bildirilmiş, kromozom sayım metodunun yorucu, fakat diğer metotlar gibi uygulanabilir olduğunu, bununla birlikte bu metodun tetraploidi belirlemede fazla yere ve zamana ihtiyaç duyacağı belirtilmiştir. Tetraploid bitkilerde, yaprak genişliğinin, çiçek büyüklüğünün ve polen kolpi sayısının da ayırt edici kriterler olduğu, bunun tohumların büyüklüğü, tohum kabuğunun kalınlığı ve dolgunluğunun da tetraploid bitkilerin diploidlerden ayrılabilmesi için önemli kriter olduğu bildirilmiştir. Jaskani ve ark. (2004c), triploid karpuz üretim programında, tetraploid karpuzların üretim hattı olarak kullanıldığını bildirmişlerdir. Araştırmada, kolhisin uygulaması ile elde edilmiş tetraploid bireyler, diploidlerle meyve karakteri, tohum morfolojisi ve çimlenme açısından karşılaştırılmışlardır. Araştırmacılar, tetraploidlerin, diploidlere göre kalın meyve kabuğuna sahip olduğunu (17.6 mm), fakat meyve başına düşük sayıda tohum verdiğini, diploid tohumlara göre tetraploid tohumların uzunluğunun (9.1 mm), eninin (6.3 mm) ve kalınlığının (2.8 mm) arttığını belirtmişlerdir. Tetraploid meyvelerin tohum kabuğunun uzunlamasına eksen 15