Agrobacterium tumefaciens ve Moleküler Genetiği. Kaniye Şahin İ.Ü. Fen Bilimleri Enstitüsü Moleküler Biyoloji ve Genetik

Transkript

1 Agrobacterium tumefaciens ve Moleküler Genetiği Kaniye Şahin İ.Ü. Fen Bilimleri Enstitüsü Moleküler Biyoloji ve Genetik /40

2 Ana başlıklar Agrobacterium tumefaciens in genel özellikleri Tarihçe Taç tümör hastalığı A. tumefaciens genomu T-DNA Agrobacterium ile bitki transformasyonu Biyoteknolojik kullanım 2

3 Agrobacterium tumefaciens Alem: Bacteria Şube: Proteobacteria Sınıf: Alpha Proteobacteria Takım: Rhizobiales Aile: Rhizobiaceae Cins: Agrobacterium Tür: Agrobacterium tumefaciens 3

4 Agrobacterium tumefaciens Çomak şeklinde Gram negatif Flagella ile çevrili Hareketli Minimal besiyerinde yetişebilen Spor oluşturmayan Azot fikse eden rhizobium bakterileriyle bağlantılı Bitki gövdesinin toprağa yakın kısımlarında tümör oluşturan bir bakteri türü 4

5 Tarihçe 1853 Taç tümör hastalığının ilk yazılı bildirimi Fabre, E., Dunal, F., 1853, Observations sur les maladies regantes de la vigne, Bull. Soc. Cent. Agric. Dep. Herault., 40, 46 5

6 Tarihçe 1897 Agrobacterium vitis, üzümde gözlenen taç tümör hastalığının etkeni olarak tanımlandı. Cavara, F., 1897, Tubercolosi della vite. Intorno alla eziologia de alcune malattie di piante coltivate, Stazoni Sperimentale Agrarie Italiane, 30:

7 Tarihçe 1907 Agrobacterium tumefaciens in Paris papatyasında (Argyranthemum frutescens) tümöre neden olduğu bildirildi. Smith, E.F., Townsend, C.O., 1907, A plant-tumor of bacterial origin, Science 24:

8 Tarihçe 1947 Steril bitki tümör dokusunun, kültürde hormonsuz ortamda durmaksızın çoğaldığı gözlenmiş, tümör hücrelerinin Agrobacterium kökenli bir tümör indükleyici (TIP: tumor-inducing principle ) ile transforme edilmiş olabileceği düşünülmüştür. Braun, A.C., 1947, Thermal studies on the factors responsible for tumor initiation in crown-gall, Am. J. Bot., 34:

9 Tarihçe 1956 Tümörlü dokuda düşük moleküler ağırlığa sahip azotlu bileşikler (opinler) tanımlandı. Lioret, C., 1956, Sur la mise en evidence d un acide amine non identifie particulier aux tissus de crowngall, Bull. Soc. Fr. Physiol. Veg., 2: 76 9

10 Tarihçe 1971 A. tumefaciens in 37 C de virülansını kaybettiği ve tümör indükleyici etkenin (TIP) virülent ve avirülent A. tumefaciens ırkları arasında taşınabildiği saptanmıştır A. tumefaciens in virülansının Ti ( tumor inducing ) plazmidine bağlı olduğu, TIP in Ti plazmidinin bir bileşeni olabileceği önerilmiştir. 10

11 1977 Tarihçe Tümör hücrelerinin genomunda Ti plazmidinin T-DNA bölgesi bulunmuş, TIP in T-DNA olduğu anlaşılmıştır. 11

12 Tarihçe 1983 Agrobacterium tumefaciens in vektör olarak kullanılmasıyla gerçekleştirilen ilk bitki transformasyonu 12

13 Tarihçe 13

14 Tarihçe 1985 Düzenleyici vira/virg sistemi, Agrobacterium transformasyonunda sinyal algılama ve genetik materyal geçişinin ana bileşeni olarak saptandı. Stachel, S.E., Zambryski, P.C., 1985, VirA and VirG control the plant-induced activation of the T- DNA transfer process of A. tumefaciens, Cell 46:

15 Tarihçe 1985 ve sonrası T-DNA transfer sürecinin araştırılması Farklı monokotlarda transformasyonun gerçekleştirilmesi Bitkilerin genetik modifikasyonları Agrobacterium tumefaciens transformasyonuyla bağlantılı bitki genlerinin tanımlanması A. tumefaciens (C58) genomunun dizilenmesi 15

16 Taç tümör hastalığı Tümör oluşumunun 2 aşaması vardır: 1. Transformasyon: Tümöre neden olan DNA nın bitki genomuna girmesi 2. Tümörgenez: Bitki hücre metabolizmasının değişimi ile kontrolsüz hücre çoğalması ve Agrobacterium a seçici üstünlük sağlayan besinlerin sentezlenmesi 16

17 Taç tümör hastalığı Taç tümörleri başlarda küçük, beyaz, yumuşak çıkıntılar olarak gözlenir. Büyüdükçe yüzeyi kahverengileşir. Bakteriyle enfekte olan bitkide büyüme yavaşlar, bitki abiyotik şartlara daha duyarlı hale gelir. Tümörlü bölge diğer fitopatojenlerle daha kolay enfekte olabilir. 17

18 A. tumefaciens genomu Genom 5.67 Mb uzunluğundadır protein kodlayan gene sahip olduğu tahmin edilmektedir. Bu proteinlerin 853 ü (%16) diğer yakın organizmalarda gözlenmemiştir. 20 aminoaside karşılık gelen 53 trna bulunmaktadır. Genomun %9 unu düzenleyici genler oluşturur. Virülans etmenlerinin çoğu Ti plazmidinde bulunmaktadır. 18

19 A. tumefaciens genomu A. tumefaciens C58 in genomu 4 replikondan oluşur: Doğrusal kromozom Halkasal kromozom AtC58 plazmidi TiC58 plazmidi 19

20 A. tumefaciens genomu 20

21 A. tumefaciens genomu 21

22 Ti plazmidi 22

23 T-DNA Ti plazmidinde bulunan ve transfer edilen DNA parçasıdır. Her iki ucunda da 25 bç uzunluğunda tekrarlar vardır. Yaklaşık bç uzunluğundadır. Fitohormonları ve opin sentezleyen enzimleri kodlayan genleri içerir. Genetik araştırmalarda ve biyoteknolojik uygulamalarda sıklıkla kullanılır. 23

24 Agrobacterium ile bitki transformasyonu T-DNA oluşumu ve bitki hücresine taşınması için; 1. Bakteriyel kromozoma ait genlerin (chv) kodladığı bazı proteinler, 2. Ti plazmidinde bulunan virülans genler (vir), 3. Çeşitli bitki proteinleri gerekmektedir. 24

25 Transformasyon aşamaları Bitkiye özgü sinyallerin bakteriyel vir bölgesini indüklemesi - fenoller - aldoz monosakkaritler sinyaller membranda - düşük ph bulunan VirA proteini - düşük PO₄ ile algılanır Bakteri-bitki teması - Ti plazmidiyle bağlantılı değil - chva, chvb, psca (exoc), selüloz fibriller 25

26 Transformasyon aşamaları VirD1/D2 protein kompleksinin yardımıyla hareketli tek iplikli T-DNA kopyasının (T ipliği) sentezlenmesi T-DNA nın, VirD2 ve bazı diğer Vir proteinleriyle birlikte kompleks halinde bitki hücresine taşınması T ipliğinin tamamının VirE2 ile kaplanması 26

27 Transformasyon aşamaları Bitki sitoplazmasından geçiş Nükleusa giriş Nükleus içinde taşınma T-DNA nın koruyucu proteinlerden arınması ( uncoating ) Genoma yerleşme 27

28 Transformasyon aşamaları 28

29 29

30 Transformasyon aşamaları Protein VirA, VirG VirD2 VirD1 VirD2 VirC VirE2 VirE1 VirB, VirD4 Görevi Yaralanmış bitki hücrelerinden salgılanan fenolik bileşenleri algılamak ve virulans genleri indüklemek Endonükleaz; T-DNA nın sağ sınırından kesilmesini sağlamak (T ipliği sentezlenmesi başlar) Topoizomeraz; VirD2 nin sınır dizisini tanımasına ve kesmesine yardımcı olmak T ipliğinin 5 ucuna kovalent olarak bağlanarak T-DNA Kompleksi ni oluşturmak ve kompleksin nüklear porlardan geçmesine yardımcı olmak T ipliği sentezinin yüksek verimle ilerlemesini sağlamak T ipliğine bağlanarak onu nükleaz saldırılarından korumak, lipidlerle birleşerek T-kompleksin bitki membranından geçmesini sağlayacak kanallar oluşturmak VirE2 yi Agrobacterium da stabilize eden şaperon Bakteriyel salgılama sisteminin bileşenlerinden; T-kompleksin ve VirE2 nin bitki hücresine geçişi için gerekli 30

31 Transformasyon aşamaları Mikrotübüller, aktin ve ara filament ağlarının bulunduğu sitoplazma, büyük moleküllerin geçişini engeller. T-kompleksin, çoğu DNA virüsleri gibi hücre nükleusuna, bitkinin hücreiçi taşıma sisteminin yardımıyla girdiği düşünülmektedir. 31

32 Transformasyon aşamaları Transformasyon sürecinde bitkinin hücresel metabolizmasına en bağımlı aşama T-DNA entegrasyonudur. Tek iplikli T-DNA, çift iplikli hale getirilir. Bitki, bu molekülü kırık DNA parçası olarak algılar ve genomuna dahil eder. 32

33 Agrobacterium ile bitki transformasyonu T-DNA oluşumu ve bitki hücresine taşınması için; 1. Bakteriyel kromozoma ait genlerin (chv) kodladığı bazı proteinler, 2. Ti plazmidinde bulunan virülans genler (vir), 3. Çeşitli bitki proteinleri gerekmektedir. 33

34 Agrobacterium un biyoteknolojide kullanımı Agrobacterium un bitkilere gen transfer edebilme yeteneği, biyoteknolojide özellikle bitki ıslahında çok kullanılmaktadır. Ti plazmidindeki tümör indükleyici genler çıkarılır ve istenilen gen, seçimi kolaylaştıracak bir marker genle beraber plazmide eklenir. 34

35 Agrobacterium un biyoteknolojide kullanımı Protoplast kültürleri, yaprak diskleri gibi bitki materyalleri, değiştirilmiş plazmide sahip bakteri ile enfekte edilir. Transformasyonun gerçekleştiği parçalar alınarak bitki doku kültüründe yetiştirilir. Daha iyi transformasyon için bitki de manipüle edilebilir. 35

36 Agrobacterium un biyoteknolojide kullanımı A. tumefaciens, doğada dikotil bitkilerde 90 aileden yüzlerce türü enfekte edebilir. Laboratuvar çalışmalarıyla bu sayı daha da arttırılmıştır. Sadece enfekte edilemeyen bitkiler değil; bakteriler, mantarlar ve insan hücrelerinde de başarılı çalışmalar yapılmıştır. 36

37 Agrobacterium un biyoteknolojide kullanımı Agrobacterium kaynaklı transformasyon aşamalarının aydınlatılması; - taç tümör hastalığının önlenebilmesi - hücre içi genetik düzenin anlaşılması - yeni ve dayanıklı türlerin oluşturulması - türe özgü ticari kasetlerin üretilmesi için öncülük edecektir. 37

38 Teşekkür ederim. 38

39 Referanslar McCullen, C.A., Binns, A.N., 2006, Agrobacterium tumefaciens and plant cell interactions and activities required for interkingdom macromolecular transfer, Annu. Rev. Cell Dev. Biol., 22: Escobar, M.A., Dandekar, A.M., 2003, Agrobacterium tumefaciens as an agent of disease, Trends in Plant Science, 8: Citovsky, V., Kozlovsky, S.V., Lacroix, B., Zaltsman, A., Dafny- Yelin, M., Vyas, S., Tovkach, A., Tzfira, T., 2007, Biological systems of the host cell involved in Agrobacterium infection, Cellular Microbiology, 9:

40 Referanslar Tzfira, T., Citovsky, V., 2006, Agrobacterium-mediated genetic transformation of plants: biology and biotechnology, Current Opinion in Biotechnology, 17: Nester, E.W., ve diğ., 2001, The genome of the natural genetic engineer Agrobacterium tumefaciens C58, Science, vol. 294: tml (22 Ekim 2008) (27 Ekim 2008) 40