VIBRIO CHOLERAE İZOLASYONU VE İDENTİFİKASYONU STANDART LABORATUVAR PROSEDÜRLERİ

Transkript

1 VIBRIO CHOLERAE İZOLASYONU VE İDENTİFİKASYONU STANDART LABORATUVAR PROSEDÜRLERİ Türkiye Halk Sağlığı Kurumu Mikrobiyoloji Referans Laboratuvarları Daire Başkanlığı Ulusal Enterik Patojenler Referans Laboratuvarı Ankara, 2012

2 2

3 İÇİNDEKİLER SAYFA 1 GİRİŞ Kolera Tanısında Laboratuvarın Rolü Laboratuvar Rehberinin Oluşturulma Amacı 6 2 VIBRIO LARIN İZOLASYONU, İDENTİFİKASYONU VE RAPOR EDİLMESİ İÇİN PROSEDÜRLER 2.1 Giriş Örneklerin Toplanması ve Gönderilmesi Örnekleme İçin Gerekli Materyal Örneklerin Alınmasında ve Saklanmasında Dikkat Edilecek Noktalar Örneklerin Gönderilmesinde Dikkat Edilecek Noktalar Örneklerin Kabul Edilmesi İçin Gerekli Minimum Klinik ve Epidemiyolojik Bilgiler 2.3 Primer İzolasyon İçin Laboratuvar Prosedürleri Zenginleştirme Besiyerleri Primer Kültür Besiyerleri Koloni Görünümleri V. cholerae şüpheli izolatlarda tarama testleri 12 3 V. CHOLERAE O1 VE O139 UN SEROLOJİK İDENTİFİKASYONU ve O139 antiserumları ile ön identifikasyon Ogawa ve Inaba antiserumları ile V. cholerae O1 in doğrulanması V. cholerae O139 un doğrulanması V. cholerae O1 Biyotiplerinin Tanımlanması 14 4 VIBRIO LARDA ANTİMİKROBİYAL DUYARLILIK TESTLERİ Disk Difüzyon Yöntemi İnokulumun hazırlanması İnokülasyon Antimikrobiyal diskler İnkübasyon Okuma ve rapor etme V. cholerae da duyarlılık testlerinde özel durumlar Metodun kalite kontrolü

4 SAYFA 5 İZOLATLARIN SAKLANMASI Kısa Süreli Saklama Yatık Nutrient Agar Suşların Saklanması Uzun Süreli Saklama Dondurarak saklama Liyofilizasyon 20 6 V. CHOLERAE NIN RAPOR EDİLMESİNDE LABORATUVARIN SORUMLULUĞU 7 V. CHOLERAE İZOLASYON VE İDENTİFİKASYONUNDA KULLANILAN BESİYERLERİ VE REAJENLER Alkali peptonlu Su Kligler Iron Agar Aminoasit dekarboksilaz-dihidrolaz tesleri için besiyeri Oksidaz reajeni String Test için %0.5 lik sodyum deoksikolat reajeni Alkalen Taurocholate Tellurite Gelatin (Monsur) Agar Thiosulfate Citrate Bile Salt Sucrose (TCBS) Agar Alkış Besiyeri 27 8 KOLERA İÇİN STANDART VAKA TANIMI 28 9 KAYNAKLAR ŞEKİLLER 31 4

5 1. GİRİŞ Vibrio cholerae epidemik ve pandemik koleranın etkenidir. Kolera tarih boyunca en çok korkulan hastalıklardan biri olmuştur. Kayıtlara göre 1817 den günümüze kadar yedi kolera pandemisi olmuştur den önce epidemik koleranın etkeni V.cholerae O1 serogruplarıydı. Ancak 1993 yılında Hindistan ve Bangladeş te yeni tanımlanan O139 serogrubuna bağlı salgınlar bildirildi. O139, V.cholerae O1 gibi enterotoksin oluşturmaktadır. Kültür ve biyokimyasal karakterleri aynı olan bu iki serogrup O spesifik antiserumlarla ayırt edilebilmektedir te Bengal de başlayan bu, O139 serotipi ise sekizinci pandeminin başlangıcı olarak görülmektedir. Epidemiyolojisi ve etken ile ilgili oldukça detaylı bilgiler bulunmasına rağmen, bugün bile yeni bir kolera epidemisinin ne zaman ve nerede patlak vereceğini kestirmemiz neredeyse imkansızdır. Vibrio cinsi, Vibrionaceae ailesinin büyük bir kısmını oluşturmaktadır. Bu cins içinde en az 34 tür tanımlanmıştır. Bunlardan sadece 12 si insanlar için patojen olup diğerleri çevresel izolatlardır ve deniz Vibrio ları olarak adlandırılır. Hücre duvarlarında bulunan O somatik antijenindeki farklılıklara göre 150 nin üstünde farklı serogruba ayrılırlar. Sadece toksijenik serogrup O1 ve O139 epidemik koleraya neden olur. Diğer serogruplarla nontoksijenik O1/O139 serogrupları genellikle sporadik özellikteki ishal olgularından sorumludur, koleraya neden olmazlar. V.cholerae O1, Ogawa, İnaba ve Hikojima serotipleriyle, klasik ve El Tor biyotiplerine ayrılmaktadır. Vibrio lar arasında en önemli iki patojen olan V.cholerae ve V.parahaemolyticus başlıca ishal etkenleri olarak karşımıza çıkmaktadır. Çoğunluğu son yıllarda tanımlanan yeni Vibrio türleri ishale ilaveten yara yeri infeksiyonu, septisemi gibi çeşitli barsak dışı infeksiyonlara neden olurlar. İnsanda Vibrio infeksiyonları, Vibrio larla kontamine su, su ürünleri ve besin maddelerinin alımı ya da bunlarla temas sonucu gelişmektedir. İnsanda hastalığa neden olan Vibrio türleri şunlardır: V.alginolyticus V.harveyi/ V.carchariae V.cholerae V.cincinnatiensis V.damsela V.fluvialis V.furnissii V.hollisae V.metschnikovii V.mimicus V.parahaemolyticus V.vulnificus 1.1 KOLERA TANISINDA LABORATUVARIN ROLÜ Özellikle salgın durumlarında etkenin izolasyonu, uygun tedavi programlarının geliştirilebilmesi ve gerekli bilgilerin elde edilebilmesinde laboratuvarlar kritik önem arz etmektedir. Bir salgın sırasında laboratuvarların yapması gerekenler şu şekilde özetlenebilir: - Salgına neden olan organizmanın identifikasyonu, - Antimikrobiyal duyarlılık paterninin saptanması, - Antimikrobiyal duyarlılık paterninde meydana gelen değişikliklerin saptanması, - Salgının coğrafik dağılımı ve süresinin belirlenmesi. 5

6 Dünya Sağlık Örgütü epidemilerde riskin belirlenebilmesi için, bir epidemi kontrol komitesinin bulunması gerektiğini; ve bu komitede epidemilerin kontrolü ve etken identifikasyonunda laboratuvarın önemli rol oynamasından dolayı bir mikrobiyoloji uzmanının bulundurulması gerektiğini önermektedir. Koleraya bağlı salgın durumlarında salgının sona erdiği süreyi belirlemek de laboratuvarın bir görevidir. Laboratuvarlar akut sulu diaresi olan hastaların gayta örneklerinin düzenli olarak incelenmesiyle salgının gerçekten sona erip ermediği hakkında bilgi verirler. 1.2 LABORATUVAR REHBERİNİN OLUŞTURULMA AMACI Koleranın epidemik risk olduğu ülkelerde salgın durumunda laboratuvarlar ilk plana çıkmaktadır. Bu anlamda V.cholerae O1-O139 identifikasyonunun yapılabiliyor olması gerekmektedir. Periferideki laboratuvarlar Vibrio spp. olarak ilk izolatın tanısını koyabilmeli, sonra da izolatları hem doğrulama hem de antimikrobiyal duyarlılık için Referans Laboratuvara göndermelidir. Ülkemizde mikrobiyolojik tanıda standardizasyonun önemine dikkatleri çeken bir referans laboratuvarı olarak; bir kaynağa duyulan gereksinimden yola çıkılarak bu rehber hazırlanmıştır. Amacı; Vibrio ların izolasyonu ve identifikasyonunda kullanılan mikrobiyolojik prosedürleri tanımlamak; Vibrio infeksiyonlarının tanısı, tedavisi ve hastalıktan korunmada laboratuvarın klinisyene yardımcı olmasını sağlamaktır. Kolera; Uluslararası Sağlık Düzenlemeleri (DSÖ, 1969) gereğince uluslararası bildirimi zorunlu hastalıklar arasında yer almaktaydı. Haziran 2007 den itibaren uygulamaya giren Uluslararası Sağlık Tüzüğü kapsamında ülkeler her türlü biyolojik, kimyasal ya da nükleer olaylar dahil olmak üzere halk sağlığı risklerini ve acillerini tespit edip değerlendirmek ve DSÖ ye bildirmekle yükümlüdür. Böylece sadece kolera değil salgın oluşturan her türlü enfeksiyon hastalığının DSÖ ye bildiilmesi zorunludur. Bildirimler ülke genelinde hizmet veren bütün sağlık kurumlarından yapılacaktır. Olası bir kolera vakası telefon ile İl Sağlık Müdürlüğüne bildirilecektir. Poliklinikte saptanan vakalar Form 016 ya günlük olarak kaydedilecek ve ay sonunda Form 017/A ile İl Sağlık Müdürlüğüne bildirim yapılacaktır. Ay sonunda sağlık ocaklarından gelen Form 017/A ların icmali İl Sağlık Müdürlüklerince yapılıp aylık olarak Sağlık Bakanlığı Temel Sağlık Hizmetleri Genel Müdürlüğü ne (TSHGM) gönderilecektir. 2. VİBRİO LARIN İZOLASYONU, İDENTİFİKASYONU VE RAPOR EDİLMESİ İÇİN PROSEDÜRLER 2.1 GİRİŞ Laboratuvar çalışmasında tanının olabildiğince hızlı konulması kadar, sonucun doğruluğu da önemlidir. Bununla birlikte araştırmaların kapsamı elde bulunan laboratuvar olanaklarına, laboratuvar personelinin deneyimine ve kuşkusuz mali kaynaklara bağlıdır. Şekil 1 deki akış diyagramı Vibrio ların laboratuvar tanısında önerilen son prosedürleri özetlemektedir. 6

7 2.2 ÖRNEKLERİN TOPLANMASI VE GÖNDERİLMESİ Vibrio ların başarılı bir şekilde izolasyonu için öncelikle gerekli klinik örneklerin uygun bir şekilde alınması ve uygun şartlarda laboratuvara iletilmesi gereklidir. Bu ise iyi bir kurumlar arası koordinasyonla gerçekleştirilebilir. Vibrio infeksiyonlarının esasen bir gastrointestinal sistem hastalığı olduğu düşünüldüğünde başta gayta, rektal sürüntü örnekleri; salgın şüpheli gıda maddelerinden ve sulardan örneklerin alınması uygundur. Alınan örneklerin spesifik besiyerlerine ekilmek üzere mümkün olduğunca çabuk laboratuvara iletilmesi önem taşır. Aynı zamanda klinisyen ön tanı açısından laboratuvarı bilgilendirmelidir Örnekleme için gerekli materyal - Pamuk uçlu eküvyonlar - Gayta kültür kabı - Taşıma besiyeri (Cary-Blair) - Buz kabı - Hasta bilgi ve laboratuvar istek formları Örneklerin alınmasında ve saklanmasında dikkat edilecek noktalar Sulu ishali olan hastalardan örnekler özellikle hastalığın başladığı ilk 4 gün içinde ve antibiyotik tedavisi başlanmadan alınmalıdır. Örneklerin alınacağı kabın temiz olması, deterjan ve dezenfektanla kontamine olmaması gereklidir. Gayta örneklerinin sürgülerden alınmaması gereklidir. Rektal swablarla örnek alınacasaksa swablar rektal sfinkterden 2-3 cm içeri sokularak rotasyon yaptırılmalı, swablarda gözle görülebilir fekal örnek olmalıdır. Gayta örnekleri 2 saat içinde incelenecek ise buzdolabında saklanabilir. Rektal swablar nem kaybını önlemek için hemen bir taşıma besiyerine (Cary-Blair) alınmalıdır. Örnekler alındıktan sonra 48 saat içinde laboratuvara ulaştırılamayacak ise 4 C de korunmalıdır. Kolera şüpheli örnekler eğer soğukta saklama olanakları mevcut değilse 22 C-25 C de transport edilebilirse de soğukta saklamak her zaman tercih edilmelidir. Swab sayısı inoküle edilecek plate sayısına bağlı olarak değişmektedir. Genellikle birden fazla patojen incelenecek ise en az iki gayta ya da rektal swab her hastadan alınmalıdır. Swablar aynı taşıma besiyerine beraber konulabilir. Cary-Blair bir çok patojen için kullanılan yarı katı bir taşıma besiyeridir. Üretici firmanın önerileri doğrultusunda hazırlandıktan sonra 13X100 mm lik tüplere 5-6 ml olacak şekilde dağıtılır. 100 C de 15 dakika sterilize edildikten sonra kullanıma hazırdır. Soğukta ve karanlıkta saklanmalıdır. Volüm kaybı, kontaminasyon ya da renk değişikliği olmadığı sürece bir yıldan uzun süre kullanılabilir. Amies, Stuart besiyerleri de taşıma besiyeri olarak kulllanılabilir. Ancak V.cholerae için Cary- Blair taşıma besiyeri daha üstündür. Buffer gliserol salin Vibrio lar için uygun değildir. Alkali peptonlu su (APS) V.cholerae için transportta kullanılabilir ama bunun da Cary-Blair besiyerine üstünlüğü yoktur. Eğer Cary-Blair taşıma besiyeri mevcut değilse kullanılabilir. Diğer organizmaların aşırı üremesinden dolayı altı saati aşan nakil durumlarında subkültürler APS den yapılmamalıdır. Acil durumlarda (salgın) herhangi bir taşıma besiyeri mevcut değilse örnekler 3X5 cm lik filtre kağıdı, gazlı bez ya da pamuk gibi maddelere emdirilerek nemli ortamlarda kurumaya engel olacak şekilde laboratuvara iletilmelidir. 7

8 Örneklerin gönderilmesinde dikkat edilecek noktalar Vibrio ların başarılı bir şekilde izolasyonu; klinik örneklerin uygun bir şekilde alınması ve uygun şartlarda laboratuvara iletilmesi ile yakından ilgilidir. Bu amaçla hastaya antibiyotik başlanmadan önce örnek alınmalıdır. Örnekleme ve transport prosedürlerine tam olarak uyulması gereklidir. Eğer örnekler hemen ekilemeyecek ise uygun taşıma besiyerine konmalıdır. Transport esnasında örnekler +4 C de korunmalı 48 saat içinde laboratuvara iletilmelidir. Toplanan örnekler laboratuvara gönderilmek üzere GÜVENLİ bir şekilde ambalajlanmalıdır. Kullanılan taşıma besiyerinde agar oranı düşük olduğu için tüpler yatık veya gelişigüzel ambalajlandığında besiyeri parçalanır ve eküvyonlar pamuklu kısmından ayrılarak koruma görevi yapmaz. Bunun için tüpler aşağıda tarif edildiği gibi ambalajlanmalıdır: Öncelikle kutunun tabanı ve yan duvarları naylonla kaplanmalı veya sızdırmaz nitelikte bir taşıma kabı kullanılmalıdır. Taban kısmına 3-4 kat süzgeç kağıdı yerleştirilmelidir. Onun üzerine tüplerin dik kalmasını sağlayacak bir tüp standı (supor) konulmalı ve tüpler bu supora dizilmelidir. Tüp suporunun kenarları ve üst kısmı da süzgeç kağıdı ile desteklenmeli ve hasta bilgi formları kutuya konduktan sonra kapak sıkıca kapatılmalıdır Örneklerin kabul edilmesi için gerekli minimum klinik ve epidemiyolojik bilgiler Vibrio enfeksiyonlarının izlenmesinde ve mikrobiyolojik- epidemiyolojik sürveyansın başarılı şekilde yürütülebilmesi için alınan her örnekle beraber hastaya ait klinik ve epidemiyolojik bilgilerin alınması önemlidir. 2.3 PRİMER İZOLASYON İÇİN LABORATUVAR PROSEDÜRLERİ Öncelikle Vibrio türlerinin laboratuvar güvenliği açısından hangi risk grubuna girdiğinin bilinmesi önemlidir. Vibrio türleri Risk Grubu 2 ye girmektedir. Bu türlerle yapılan çalışmalarda P2 düzeyinde laboratuvar koşulları sağlanmalıdır Zenginleştirme besiyerleri Alkali peptonlu su (APS) zenginleştirme, Thiosulfate citrate bile salts sucrose agar (TCBS) selektif agar olarak tavsiye edilmektedir. Bununla birlikte fekal örneklerden V.cholerae izolasyonunda zenginleştirme besiyerleri gerekli değildir. Konvelasan dönemdeki hasta örneklerinde, asemptomatik infeksiyonlarda ve çevresel örneklerde zenginleştirme besiyeri olarak APS tavsiye edilmektedir. APS ye alınan gayta örneğinin besiyerinin volümünün %10 undan fazla olmaması gerekir. Örnekler C de 6-8 saat inkübasyonun ardından TCBS besiyerine APS den bir öze dolusu ve özellikle buyyonun yüzeyinden olacak şekilde ekimler yapılmalıdır. Subkültür öncesi buyyon vortekslenmemelidir. Eğer TCBS agara ekim 6-8 saatten daha geç yapılıyorsa, ikinci bir APS buyyona ekim yapılarak 6-8 saat inkübasyonun ardından bu ikinci buyyondan subkültür yapılması gerekmektedir. 8

9 2.3.2 Primer kültür besiyerleri Kanlı agar C de saat inkübe edilir. TCBS agar C de saat inkübe edilir. Monsur agar C de saat inkübe edilir. Alkış besiyeri C de saat inkübe edilir Koloni görünümleri Kanlı agarda 2-3 mm çapında hemolotik koloniler izlenir. TCBS besiyerinde 2-4 mm çapında, V.cholerae da sukroz fermentasyonuna bağlı sarı-parlak, sukrozu fermente etmeyen Vibrio larda ise yeşil koloniler izlenir. Kültürler inkübatörden alındıktan sonra hızlıca incelenmelidir. Çünkü oda ısısında bekletilecek olursa sarı renkli görünüm yeşil renge dönüşebilmektedir. TCBS de Vibrio türlerinin koloni renkleri aşağıda belirtilmektedir (Tablo 1). Vibrio ve fenotipik olarak benzer diğer cinslerin ayrımında kullanılan özellikler Tablo 2 de özetlenmiştir. V.cholerae serogrup O1 ve O139 un izolasyon ve identifikasyonunda kullanılan akış şeması Şekil 1 de özetlenmiştir. Tablo 1: Vibrio türlerinin TCBS besiyerindeki koloni görünümleri Organizmalar V.cholerae V.alginolyticus V.cincinnatiensis V.damsela V.carchariae V.fluvialis V.furnissii V.hollisae V.parahaemolyticus V.metschnikovii V.vulnificus V.mimicus Aeromonas species Pseudomonas türleri Proteus Enterococcus species TCBS deki koloni görünümü Sarı Sarı sarı Yeşil Sarı /yeşil Sarı Sarı Yeşil Yeşil Sarı Yeşil Yeşil Sarı Mavi /yeşil* Sarı /yeşil* Sarı *Bu koloniler Vibrio ların oluşturdukları kolonilerden daha küçüktür. 9

10 Klinik Örnekler (gaita, rektal sürüntü, kusmuk) Kanlı Agar 37 0 C de 24 saat ink. APS* (isteğe bağlı) 37 0 C de 6-8 saat ink. TCBS Agar C de 24 saat ink. Şüpheli koloniler TCBS-sarı koloniler Kanlı agar-hemolitik kol. oksidaz Aglütinasyon yapıldıktan sonra Referans Lab.a gönder (konfirmasyon ve moleküler epidemiyolojik çalışmalar için) Biyokimyasal testler;kia ekim, glukozdan gaz ve asit oluşumu, indol testi, sitrat kullanımı,voges Proskauer reaksiyonu, üreaz aktivitesi, hareket testi, lizin-ornitin dekarboksilasyonu, arginin dihidrolasyonu,sukroz fermentasyonu, CAMP testi Polivalan Antiserumlarla aglütinasyon REFERANS LABORATUVAR Antibiyotik duyarlılık Serotiplendirme (O1 ve O139) O129 (10 ve 150µg) duyarlılığı Moleküler tiplendirme 1 TCBS: Thiosülfate citrate bile salts sucrose Agar; Toksin varlığının gösterilmesi Şekil 1: V.cholerae serogrup O1 ve O139 un izolasyon ve identifikasyon şeması 10

11 Tablo 2: Vibrio ve fenotipik olarak benzer diğer cinslerin ayrımında kullanılan özellikler Test veya Özellik Reaksiyon veya özellik a Vibrio Photobacterium Aeromonas Plesiomonas Enterobacteriaceae İnsanda ishal veya barsak dışı enfeksiyona yol açma + - d Oksidaz reaksiyonu Üreme için Na + a ihtiyaç gösterme veya stimüle olma Vibriyostatik bileşik O/129 a duyarlılık b D-Mannitol fermentasyonu TCBS de üreme c a Semboller: +, çoğu tür ya da suş pozitif; -, çoğu tür ya da suş negatif b 2, 4-diamino-6, 7-diisopropylpteridine phosphate (150 g lık diskler); O/129 a direnç Hindistan ve Bangladeş teki V. cholerae suşlarında yaygındır. c TCBS te Aeromonas üremesi ticari üretici firmanın ürününe bağlıdır. d Photobacterium damselae bu sınıflandırmanın dışındadır. 11

12 2.3.4 V.cholerae şüpheli izolatlarda tarama testleri Fekal örneklerde V.cholerae şüphesi varsa O1 ve O139 serumları ile test öncesi biyokimyasal testlerin uygulanması gerekli değildir. Eğer antiserumların sağlanmasında sorun varsa antiserumlarla test öncesi oksidaz bakılması önerilmektedir. Tablo 3: V.cholerae tanısında kullanılan tarama testleri Tarama testleri Oksidaz testi String test KIA TSI Lizin dekarboksilasyonu Gram boyama Direkt preparat O129 diskine duyarlılık V.cholerae da izlenen reaksiyon Pozitif Pozitif Dip sarı, yüzey kırmızı (Asit/alkali), gaz yok Dip sarı, yüzey sarı (Asit/Asit), gaz yok Pozitif Küçük, Gram negatif kıvrık basiller Küçük, kıvrık, hareketli basiller 150 g lık diske Vibrio türlerinin çoğu duyarlıdır Oksidaz testi: Vibrio türleri oksidaz pozitiftir. Oksidaz testi karbonhidrat içeren besiyerlerindan (TCBS) yapılacak olursa yanlış negatif ya da yanlış pozitif sonuçlar alınabileceğinden test öncesi nutrient veya kanlı agara subkültürlerin yapılması gerekmektedir. 2-3 damla oksidaz reajeni (%1 N,N,N,N -tetramethyl-p-phenylenediamine) filtre kağıdına damlatılır. Koloniden platin özelerle alınan örnek oksidaz reajeni ile incelendiğinde pozitif reaksiyonda 10 saniye içinde mor bir renk ortaya çıkar. Test 10 saniyeden sonra pozitiflik veriyorsa değerlendirilmemelidir. Aynı zamanda pozitif ve negatif kontroller mutlaka kullanılmalıdır String test: Bu test genellikle V.cholerae nın Aeromonas türlerinden ayrımı için kullanılmaktadır. Heart infüzyon agar gibi selektif olmayan bir besiyerinden alınan kolonilerin bir damla %0.5 lik sodyum deoksikolat ile aköz bir süspansiyonu elde edilir. Hücrelerde türbidite kaybına bağlı olarak DNA ortaya çıkmakta ve visköz bir hal almaktadır. Karışım öze ile kaldırıldığında ip şeklinde uzama görülmektedir ki pozitif reaksiyonu işaret etmektedir. V.cholerae pozitif, Aeromonas türleri negatiftir. Diğer Vibrio türleri pozitif ya da zayıf pozitiflik vermektedir KIA ve TSI agar : V.cholerae KIA da dip sarı, yüzey kırmızı (Asit/alkali), gaz ve H 2 S oluşturmaz. TSI agarda ise dip sarı, yüzey sarı (Asit/asit), gaz ve H 2 S oluşturmaz Lizin dekarboksilasyonu: Vibrio türlerinin Aeromonas türlerinden ayrımında kullanılır. V.cholerae lizini dekarboksile eder Gram boyama: Gramla boyandığında koloniler karakteristik olarak virgül şeklinde izlenir Direkt preparat: Karanlık alan ya da faz kontrast mikroskobuyla incelendiğinde tipik olarak virgül şeklinde, hareketli kıvrık basiller izlenir. 12

13 Pteridin O129 diskine duyarlılık ( 10 ve 150 g lık diskler ): Vibrio türlerinin çoğu 150 g lık diske duyarlıdır. Ancak 10 g lık diske duyarlılık farklılık göstermektedir. V.cholerae O1 ve O139 un bazı suşları her iki diske de dirençli olabilir. Vibriostatik bir ajan lan O129 (2,4-Diamino-6,7-di-iso-propylpteridine phosphate) Vibrio ların Gram negatif çomaklar ve özellikle Aeromonas lardan ayrımında kullanılır. Kanlı agar ya da Mueller Hinton agar yüzeyine incelenecek koloniler inoküle edilir. Her bir plağa birer adet 10 g ve 150 g lık O129 diskleri yerleştirilir. 24 saat 35 C de inkübe edilir. İnhibisyon zonları değerlendirilir. O129 a duyarlılık durumu: Aeromonas sp. : Dirençli V.cholerae: Duyarlı V.parahaemolyticus: Kısmen duyarlı 3. V.CHOLERAE O1 VE O139 UN SEROLOJİK İDENTİFİKASYONU 3.1. O1 ve O139 antiserumları ile ön identifikasyon Selektif olmayan bir besiyerinde V.cholerae şüpheli taze kültürlerden polyvalan O1 ve O139 antiserumları kullanılarak lam aglutinasyonu yapılır. Öncelikle O1 antiserumu ile aglutinasyon bakılır. Negatif ise O139 ile aglutinasyon incelenir. İkisinden biriyle pozitiflik saptanmışsa V.cholerae O1 veya O139 ön tanısı ile rapor edilebilir. Daha sonra V.cholerae O1 pozitif saptanan örnekler monovalan Ogawa ve İnaba antiserumlarıyla test edilir Ogawa ve Inaba antiserumları ile V.cholerae O1 in doğrulanması V.cholerae O1 serogrubu Inaba, Ogawa ve Hikojima olmak üzere üç serotipe ayrılmaktadır. Serotip identifikasyonu tipe spesifik O antijenlerini içeren monovalan antiserumlarla yapılmaktadır. Bir V.cholerae O1 izolatının identifikasyonunun doğrulanmasında Ogawa veya Inaba antiserumlarından biri ile pozitiflik vermesi yeterlidir. Eğer izolat Ogawa ve Inaba antiserumlarından biriyle zayıf veya yavaş aglutinasyon veriyorsa ya da aglutinasyon izlenmiyorsa O1 serogrubu değildir. Serotipe spesifik antiserumun absorbe edilmesine bağlı olarak, serotipin biri diğerine göre daha yavaş veya zayıf aglutinasyon verir. Bu nedenle Ogawa ve Inaba antiserumu ile aglutinasyon simultane olarak incelenmeli ve daha hızlı ve güçlü reaksiyon veren kabul edilmelidir. Her iki antiserumla da güçlü ve eşit aglutinasyon nadirdir. Bu durumda izolat referans laboratuvara gönderilmeli ve muhtemel Hikojima serotipi olarak belirtilmelidir. Aglutinasyon testlerinin yapımı için temiz bir lama iki damla steril serum fizyolojik (SF) damlatılır. Selektif olmayan bir besiyerinden öze ile alınan koloniler SF ile emülsifiye edilir ve homojen bir süspansiyon elde edilir. Süspansiyonlardan birine eşit miktarda antiserum damlatılır, diğer süspansiyon kontrol olarak kullanılır. Lamlar nazikçe ve yan çevrilmeyecek şekilde döndürülerek aglutinasyonun gelişip gelişmediği incelenir. 30 saniye-1 dakika arasında antiserum damlattığımız damlada kümeleşme olması pozitiflik anlamına gelmektedir. Eğer kontrol olarak kullandığımız damlada da pozitiflik saptıyorsak bu otoaglutinasyonu gösterir ve değerlendirme yapılmaz. 13

14 Tablo 4: V.cholerae serogrup O1 in serotipleri V.cholerae O1 serotipleri Ogawa antiserumu Inaba antiserumu Ogawa + - Inaba - + Hikojima V.cholerae O139 un doğrulanması V.cholerae şüpheli bir izolat, O139 antiserumu ile reaksiyon veriyor ama polyvalan O1 antiserumu ile reaksiyon vermiyorsa referans laboratuvara gönderilmelidir. V.cholerae O139 un doğrulanmasında, enterotoksin oluşturup oluşturmadığı ve O139 antijeninin varlığı araştırılmalıdır. O139 serogrubu serotip içermemektedir. 3.4 V.cholerae O1 biyotiplerinin tanımlanması V.cholerae O1 suşları bazı biyolojik özelliklerine göre klasik ve El Tor biyotiplerine ayrılmaktadır. Tablo 5: V.cholerae O1 klasik ve El Tor biyotiplerinin ayırıcı özellikleri TEST KLASİK EL TOR String test + + Koyun kanlı agarda beta hemoliz - + Voges-Proskauer testi - + Tavuk eritrositlerinin aglutinasyonu - + Polimiksin B (50 U) duyarlılığı S R Faj IV duyarlılığı S R CAMP - + (+): pozitif test; (-): negatif test; S: duyarlı; R: dirençli El Tor ve non O1 suşlar CAMP pozitif, klasik suşlar CAMP negatiftir. El Tor sosis şeklindeki hemoliz zonu ile daha dar hemoliz yapan non O1 izolatlardan ayrılır. 14

15 4. VIBRIO LARDA ANTİMİKROBİYAL DUYARLILIK TESTLERİ Günümüzde antimikrobiyal ilaçlara direnç sorunu dünya çapında artmaktadır. Dolayısıyla V.cholerae O1 ve O139 suşlarında antimikrobiyal duyarlılığın monitorizasyonu kaçınılmaz hal almaktadır. V.cholerae da antimikrobiyal duyarlılık testlerindeki bazı özel konular aşağıda belirtilmektedir. 4.1 Disk-difüzyon yöntemi Bu testte Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) tarafından önerilen agar besiyeri Mueller Hinton Agar (MHA) besiyeridir. Bu besiyeri ticari olarak elde edilebilmekte olup, önerilere uygun olarak hazırlanmalı, otoklavlandıktan sonra su banyosunda C ye soğutulup 4 mm kalınlığında olmak üzere petrilere (15X150 mm lik plaklara yaklaşık ml ) dökülmelidir. Agarın kalınlığı 4 mm den fazla olursa yanlış dirençli, az olduğunda ise yanlış duyarlı sonuçların alınmasına neden olur. Besiyerleri nem kaybını önlemek için plastik torbada saklanmalıdır, hazırlandıktan sonra 7 gün içinde kullanılmalıdır. Besiyerinin ph sı oda ısısında olmalıdır. Kullanımdan hemen önce besiyerinin yüzeyinde fazla nem olduğunda inokülasyon yapılmamasına dikkat edilmelidir. Besiyerleri etüvde kapakları açık olmamak kaydıyla dakika tutulduktan sonra kullanılmalıdır İnokulumun hazırlanması İnokulumun yoğunluğunun standardize edilmesi önemlidir. Yoğun hazırlanan durumlarda yanlış dirençli sonuçların alınması mümkündür. Standart McFarland 0.5 baryum sülfat bulanıklığına göre ayarlanır. Bu süspansiyonda yaklaşık 10 8 cfu/ml yoğunluğunda bakteri vardır ve hazırlandıktan sonra 15 dakika içinde kullanılmalıdır. Kullanımdan önce vorteksle karıştırılmalıdır. Karanlıkta ve oda ısısında saklanmalıdır. Hazırlandıktan 6 ay sonra standart kontrol edilip bozulma saptanırsa yeni bir standart hazırlanmalıdır. Bu bulanıklığa ulaşmak için bir gecelik selektif olmayan bir besiyerinden benzer morfolojiye sahip 4-5 koloni yine 4-5 ml Mueller Hinton Broth a (MHB) aktarılır. 2-8 saat C de inkübe edilip McFarland 0.5 bulanıklığına ayarlanır İnokülasyon İnokulum süspansiyonu hazırlandıktan sonra 15 dakika içinde MHA a inoküle edilmelidir. Steril pamuklu eküvyonun tüpe batırılıp fazla sıvının bırakılmasından sonra inokülasyona geçilir. Tüm agar yüzeyine yaklaşık 60 derecelik açılarla 3 kez yayıldıktan sonra eküvyon son olarak plağın çevresinde gezdirilir.diskler bundan sonra 15 dakika içinde konmalıdır. Diskler konmadan önce nemin absorbe olması için 3-5 dakika beklenmelidir Antimikrobiyal diskler Antimikrobiyal diskler ışıktan korunmalıdır. Bu durum özellikle ışığa duyarlı olan metranidazol, kloramfenikol, ve kinolonlar için önemlidir. Dondurucudan ya da buzdolabından çıkarılan diskler oda ısısına geldikten sonra steril bir pens veya iğne ucu ile agar yüzeyine yerleştirilir. Üzerlerine hafifçe bastırılarak besiyerine tamamen temas etmeleri sağlanmalıdır. Diskler merkezinden merkezine 24 mm olacak şekilde yerleştirilmelidir. 150 mm lik plakta 12, 15

16 100 mm lik plakta ise 4 den fazla disk olmamalıdır. Bazı diskler agar yüzeyine temas eder etmez diffüze olmaya başlar bu nedenle diskin yeri değiştirilmemelidir. Hazır olarak elde edilen diskler uzun süre saklanacaksa ilaca bağlı olarak buzdolabında ya da dondurularak saklanmalıdır. Hemen kullanılacak miktarda diskler 1 hafta kadar buzdolabında saklanabilir. Kutuların kapakları sıkıca kapanmalı ve nemli ortamda tutulmamalıdır. V.cholerae izolatlarının duyarlılık testlerinde önerilen antimikrobiyal ajanlar trimetoprimsülfametaksazol, kloramfenikol, furazolidon ve tetrasiklin dir. Tetrasiklin disklerine duyarlılık aynı zamanda doksisikline de duyarlılığı göstermektedir İnkübasyon Diskler yerleştirildikten sonra en fazla 15 dakika içinde plaklar ters çevrilerek C lik inkübatöre kaldırılır. Bu sürenin uzaması antimikrobiyal ajanın daha fazla diffüze olmasına neden olacaktır Okuma ve rapor etme Plakların inkübasyonu saattir. İnokülasyon işlemi doğru yapılırsa ve inokulumun yoğunluğu tam ayarlanmışsa inhibisyon zonlarının tam yuvarlak olduğu ve plakta yoğun bir üreme olduğu gözlenir. Tek tek düşen kolonilerin varlığı inokulumun yeterince yoğun olmadığını gösterir ki testin tekrarını gerektiren bir durumdur. Zon çapları cetvelle ölçülerek değerlendirilmelidir V.cholerae da duyarlılık testlerinde özel durumlar Disk difüzyon tekniği en sık kullanılan metod olsa da V.cholerae O1 ve O139 için sadece ampisilin, kloramfenikol, sülfonamidler, tetrasiklin ve trimetoprim-sülfametaksazol için zon çapları belirlenmiştir. Eritromisin ve doksisiklin V.cholerae da disk difüzyonla doğru sonuç vermeyeceğinden bu metot uygun değildir. Tetrasiklin diskine duyarlılık doksisikline de duyarlılığı düşündürür. Siprofloksasin, furazolidon ve nalidiksik asit için disk difüzyon sonuçlarının güvenilirliği onaylanmamıştır. V.cholerae için uygun bir yöntem bulunana kadar deneysel olarak Enterobactericeae için belirlenmiş kriterler kullanılarak siprofloksasin e direnci saptamak için disk difüzyon kullanılabilir. Bu yöntem furazolidon ve nalidiksik asit için de uygulanabilir ancak sonuçlar yorumlanırken dikkat edilecek nokta; bu ajanlar intermediate ise dirençli olarak rapor edilmesidir Metodun kalite kontrolü Kalite kontrolünde amaç testin doğruluk ve katiliğinin, vasatların ve disklerin çalışmasının izlenmesi, testi yapan ve okuyan kişilerin takibidir. Bu amaçla genetik stabilitelerine ve bu teste uygunluklarına göre referans suşlar tespit edilmiştir. Kontrol organizma E.coli ATCC

17 Her disk difüzyon testi yapılan gün kontrol suşlarda denenmelidir. Ancak günlük kontrol testlerinde tatminkar sonuç alınırsa bu testlerin sayısı haftada bire indirilir. Her bir ilaç kontrol suşu kombinasyonu için 20 zon çapından bir tanesinin kontrol sınırları dışında olmasına müsaade edilir. V. cholerae için disk difüzyon yöntemi ile ampisilin, tetrasiklin ve trimetoprim-sülfametoksazol sonuçları sıvı mikrodilüsyon ile belirlenmiş sonuçlarla iyi bir korelasyon göstermektedir. Eritromisin için disk difüzyon testi kullanılmamalıdır, çünkü MİK sonuçları ile korelasyon zayıftır. Tablo 7 de V.cholerae ve E.coli ATCC için antimikrobiyal disklerin zon çapları görülmektedir. Tablo 6: Antimikrobiyal duyarlılık testlerinde V.cholerae için kullanılan zon çapları Zon çapları (mm) Antimikrobiyal ajan Diskin potensi ( g) Dirençli Orta Duyarlı Duyarlı E.coli ATCC Ampisilin a 10 <= >= Kloramfenikol a,b 30 <= >= Furazolidon c (V.cholerae için) 100 <18 - >= Trimetoprimsülfametoksazol a 1.25 /23.75 <= >= Sülfonamidler 250 veya 300 <= >= Tetrasiklin a, c 30 <= >= Siprofloksasin a. d, e 5 <= >= Nalidiksik asit e (V.cholerae için) 30 <19 - >= a Kaynak: CLSI (2007) Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Sixteenth Informational Supplement. CLSI document M100-S17 [ISBN ]. CLSI 940 West Valley Road, Suite 1400,Wayne, PA USA. b Disk difüzyon testinde okumalar yapılırken bir çok organizma için minör hatalar olabilir. c Tetrasiklin sonuçları izolatların doksisikline duyarlılığını belirlemek için kullanılabilir; MİK sonuçları ile zayıf korelasyon verdiğinden doksisiklin için disk difüzyon testi kullanılmaz. d Shigella ve Enterobactericeae için disk difüzyon sonuçları belirtilmiştir. CLSI tarafından V.cholerae için kriterler tam olarak belirlenmemiştir. e Sülfizoksazol diski, mevcut sülfonamid preparatlarından herhangi birisi için kullanılabilir. f Multi laboratuvar çalışmalar baz alınmalıdır. NCCLS tarafından V.cholerae için kriterler tam belirlenmemiştir. 17

18 5. İZOLATLARIN SAKLANMASI Vibrio izolatlarının birkaç günlük saklamaları için 22 C-25 C de katı besiyerleri kullanılabilir. Eğer kültürler daha uzun süre saklanmak isteniyorsa bu durumda seçilecek olan metod saklama süresine ve laboratuvarın olanaklarına değişmektedir. 5.1 Kısa süreli saklama Enterik bakteriler için kanlı agar, tryptone soy agar ve heart infusion agar saklamak için ideal kültür vasatlarıdır. Bakterilerin metabolizmalarına bağlı oluşan asidik ürünler, hızla canlılığın azalmasına neden olabildiğinden karbonhidrat içeren besiyerleri (KIA, TSI) önerilmemektedir. Saklama besiyeri için tüpler otoklavdan çıktıktan sonra eğik şekilde, yatık kısım kısa olacak şekilde hazırlanır. İnokülasyon için mediumun önce dibine batırılıp sonra yatık kısma doğru saf kolonisi elde edilmiş bakteri kültüründen öze ile ekimler yapılır o C de bir gece inkübe edilir. Tüplerin kapaklarının sıkıca kapanıyor olması, hava almaması gerekmektedir. Bu şekilde o C de karanlıkta saklanabilir. Mediumun kurumasını önlemek için besiyerini kapatacak kadar steril mineral-oil kullanılabilir. Subkültür yapılması durumunda mineral-oil ın atılmasına gerek yoktur. Bu şekilde suşlar birkaç yıl saklanabilir Yatık Nutrient Agar* a) Temiz bir erlen alınır. İçine bir adet manyetik bar konulur. Meat ekstrakt 3.0 g Pepton 5 g Agar g** Distile su 1000 ml b) Yukarıdaki maddeler karıştırılır, kaynayana kadar ısıtılır. ph ölçülür ve 7.2 ye ayarlanır. c) Burgu kapaklı tüplere 5 ml olacak şekilde dağıtılır. d) 121 o C de 15 dakika sterilize edilir Suşların saklanması Öncelikle saklanmak istenen suşun saf kültürü elde edilmiş olmalıdır. Ardından; a) Nutrient agar plağının üzerine izolatın adı ve tarih yazılır. b) İzolatın saf kültüründen, birer öze dolusu olacak şekilde yoğun ekimler yapılır o C de, 24 saat inkübe edilir. *Suşların RSHMB Ulusal Enterik Patojenler Referans Laboratuvarına gönderilmesinde yatık nutrient agar tercih edilecektir. **Suş gönderilirken agar oranının düşürülmesi (12-15 g/l) önerilir. 18

19 c) Önceden hazırlanmış olan yatık nutrient agar besiyeri alınır. Üzerine izolatla ilgili bilgiler kaydedilir. d) Bir öze yardımıyla mediumun önce dibine batırılıp sonra yatık kısma doğru saf kolonisi elde edilmiş bakteri kültüründen ekimler yapılır. e) o C de bir gece inkübe edilir. f) Bu şekilde karanlıkta +4 0 C de saklanır. 5.2 Uzun süreli saklama Bakteri kültürleri dondurularak veya liyofilize edilerek saklanabilir. Bu amaçla kullanılan çeşitli vasatlar vardır. Skim milk, kan, %15-20 gliserol içeren trypton soy broth dondurarak saklamada; skim milk, serum bazlı besiyerleri ve polyvinylpyrrolidone ise liyofilizasyon için kullanılabilir Dondurarak saklama İzolatlar -70 C de ve altında saklanabilir. -20 C de saklama bazı bakterilerin canlılıklarının kaybedebileceğinden dolayı önerilmemektedir. Saklama besiyerinin hazırlanması %16 lık Glycerol lü Buyyon a) 250 ml lik temiz bir erlen alınır. İçine bir adet manyetik bar konulur. Trypton soy broth w/o dextrose (Difco ) Glycerol Distile su 1.0 g 10 ml 40 ml b) Manyetik karıştırıcıda karıştırılır, eritilir. ph ölçülür ve 7.2 ye ayarlanır. c) 115 C de 10 dakika otoklavlanır. d) Ağzı burgu kapaklı, steril, plastik derin dondurucu tüplerine yaklaşık 1.5 ml lik miktarlarda biyogüvenlik kabini altında dağıtılır. 19

20 Suşların saklanması Öncelikle saklanmak istenen suşun saf kültürü elde edilmiş olmalıdır. Ardından; a) İki adet nutrient agar plağının üzerine izolatın adı ve tarih yazılır. b) İzolatın saf kültüründen, birer öze dolusu olacak şekilde yoğun ekimler yapılır. c) 24 saat inkübe edilir d) Önceden %16 lık glycerol buyyon konmuş olan iki adet derin dondurucu tüpü alınır. e) Bir öze yardımıyla bir plaktaki yoğun üremenin tamamı bir tüpe olacak şekilde bakteri toplanır. Tüp içindeki buyyonda homojenize edilir. Vortekslenir. f) Koleksiyon kayıt defterine suşun kimlik bilgileri ve tarih yazılır. g) Tüplerden biri -20 C ye (1-2 yıl için), diğeri -70 C ye (en az 8-10 yıl için) kaldırılır (karışıklığı önlemek için izolatların belirli bir kodlama düzeninde saklama kutularına ve derin dondurucuya yerleştirilmesi gerektiği unutulmamalıdır) Liyofilizasyon Bir çok mikroorganizmanın saklanması için uygun bir yöntemdir. Liyofilizasyonda basıncın azaltılması ile bakteri süspansiyonunun sublimasyonu sağlanıp içindeki su uzaklaştırılmaktadır. Liyofilize edilmiş suşlar 4 C de saklanabilir. 20

21 6 VIBRIO CHOLERAE NIN RAPOR EDİLMESİNDE LABORATUVARIN SORUMLULUĞU Bilindiği üzere, Temel Sağlık Hizmetleri Genel Müdürlüğünün 2004/129 sayılı "Bulaşıcı Hastalıkların İhbarı ve Bildirim Sistemi" genelgesi ile; 2005 yılı Ocak ayından itibaren yürürlüğe konan "Bulaşıcı Hastalıkların İhbarı ve Bildirim Sistemi " yönergesi ve "Bulaşıcı Hastalıkların İhbarı ve Bildirim Sistemi Standart Tanı, Sürveyans ve Laboratuvar Rehberi"nde yer alan Grup D etkenlerinin bildirimi doğrudan laboratuvarlar tarafından yapılmaktadır. Bu şekilde güncellenen sürveyans sistemi; laboratuvarların, bulaşıcı hastalıklar sürveyans sistemine doğrudan veri sağlamasına olanak sağlamıştır. İlgili rehberde, bildirimi istenilen bazı mikroorganizmaların tür düzeyinde tiplendirilmesine ilişkin ise referans laboratuvarlara suşların gönderilmesi ve bu şekilde özellikle Grup D etkenlerinin tür ve serogrup düzeyinde tiplendirilmesi suretiyle sistemin, ülkeye özgü mikroorganizma türlerinin belirlenmesine ışık tutması hedeflenmiştir. Bulaşıcı hastalıklar sürveyans sistemine göre hastayı gören hekim tarafından bildirimi zorunlu bir enfeksiyon etkeni olmakla birlikte, standart vaka tanımına göre kesin vaka bildirimi için laboratuvardan doğrulanmış olması gerekmektedir. Kolera şiddetli dehidratasyona neden olduğundan, V. cholerae O1 ve O139 un izole ve identifiye edildiğinde acilen hastanın doktoruna bildirilmelidir. Vaka aynı zamanda İl Sağlık Müdürlüğü ne hemen telefonla bildirilmelidir. Koloni morfolojisi, üreme ve biyokimyasal özellikleri V. cholerae ile uyumlu bulunan suşlar, ileri identifikasyon, tiplendirme, antimikrobiyal duyarlılık testleri ve toksin varlığının tespiti için nutrient agarda Referans Laboratuvara gönderilmelidir. V. cholerae şüpheli suşlar nutrient agara yoğun şekilde pasajlandıktan, üçlü paketleme sistemine göre (bkz. Genel Hususlar kitapçığı, Enfeksiyöz Materyalin Paketlenmesi ve Transportu: Genel İlkeler) ve kargo ile laboratuvara gönderilir. Nutrient agarın tercihen vidalı kapaklı plastik tüplerde hazırlanması ve ekim yapıldıktan sonra olası bir sızmayı engelemek için kapağın etrafının parafilm ile sarılması önerilir. Plak besiyerine pasajlanacaksa bir gece 37 C de inkübe edilip, koloniler üredikten sonra gönderilir. Suşların beraberinde, suşlara ait bilgileri içeren suş bilgi formu da (Şekil 2) doldurularak paketin içine yerleştirilir. Paket aşağıdaki adrese kargo ile gönderilir. Paket gönderilmeden önce laboratuvar, telefon veya e-posta ile bilgilendirilir. Gönderi Adresi: Refik Saydam Hıfzıssıhha Merkezi Başkanlığı Salgın Hastalıklar Araştırma Müdürlüğü Ulusal Enterik Patojenler Referans Lab oratuvarı Cemal Gürsel Cad. No: Sıhhiye-ANKARA Tel: Faks:

22 Refik Saydam Hıfzıssıhha Merkezi Başkanlığı Salgın Hastalıklar Araştırma Müdürlüğü Ulusal Enterik Patojenler Referans Laboratuvarı SUŞ BİLGİ FORMU Suş No Adı Soyadı Prot. No Hastanın Yaşı Cinsiyeti Yaşadığı Şehir Seyahat Öyküsü Başvurusu Vaka Epidemiyolojik özellik Örneğin orijini Örneğin Cinsi Suşun İzole Edildiği Tarih SONUÇ Not ÖRNEK Ahmet Güven K Ankara Adana Yatan hasta/ Poliklinik Hasta/ Taşıyıcı Sporadik/ Salgın İnsan/ Gıda/ Su Kan Vibrio cholerae Şekil 2: Suş Bilgi Formu 22

23 7 V.CHOLERAE İZOLASYON VE İDENTİFİKASYONUNDA KULLANILAN BESİYERLERİ VE REAJENLER 7.1 Alkali peptonlu su (APS) Pepton NaCl Distile su 10.0 g 10.0 g ml Yukarıdaki karışım 3N NaOH ile ph sı 8.5 olacak şekilde ayarlanır. Tüplere dağıtıldıktan sonra 121 C de 15 dakika otoklavlanır. 4 C de ph değişimi ve buharlaşma olmadığı sürece 6 aydan uzun süre saklanabilir. Kullanım öncesi kalite kontrolü yapılmalıdır Kligler Iron Agar (KIA) ve TSI agar Materyal: Kligler Agar Base Distile su 55 g 1000 ml Not: TSI besiyerinin KIA dan tek farklı içerisinde sukroz bulunmasıdır. Hazırlanması: Üretici firmanın önerileri doğrultusunda, erlen içine 55 g Kligler Agar base konur ve içine distile su eklenir. Isıtılarak iyice eritilir. ph 7.4 e ayarlanır. 16 X 25 cm boyutundaki tüplere 5-7 ml olacak şekilde dağıldıktan sonra, 121 C de 15 dakika otoklavlanır. Tüpler yatık pozisyonda, dip kısmı 3 cm, yüzeyi 2 cm olacak şekilde ayarlanarak dondurulur. Etiketlenerek besiyerinin adı, hazırlanma ve son kullanma tarihleri yazılır. Kapaklı tüplerde 4 C de 6 ay saklanabilir. Kullanım öncesi kalite kontrolü yapılmalıdır. Testin yapılışı: Öze ile incelenecek bakteri kolonisi KIA besiyerinin ortasından dibe 1 cm kalana kadar batırılır. Daha sonra besiyerinin yatık kısımına zigzag çizerek ekim yapılır. 35 C de saat inkübe edilir. Testin değerlendirmesi: Reaksiyon besiyerinin iki ayrı bölgesinde meydana gelir. Yüzeyde oluşan reaksiyon aerobik, dip kısımda oluşan reaksiyon ise anaerobiktir. Yüzey asit dip asit Bakteri hem laktozu hem de glukozu fermente etmektedir. Yüzey alkali - dip asit Bakteri glukozu fermente etmekte, laktozu etmemektedir. Yüzey alkali - dip alkali Bakteri nonfermenterdir. 23

24 Besiyerinde hava kabarcıkları veya çatlakların varlığı bakterilerin gaz oluşturduğunu gösterir. Kalite kontrol: Siyah rengin oluşması ise H 2 S oluşumunu gösterir. Her yeni besiyeri hazırlandığında kalite kontrol çalışması yapılır. Kalite kontrolunde kullanılacak bakteriler aşağıdaki tabloda sunulmaktadır. Tablo 7: KIA ve TSI agar besiyerlerinin kalite kontrolünde kullanılan suşlar Bakteri Sonuç Dip Yüzey Gaz H 2 S E.coli ATCC Asit Asit + - Salmonella Typhimurium ATCC Asit Alkali + + Shigella flexneri ATCC Asit Alkali - - Pseudomonas aeroginosa ATCC Alkali Alkali - - Sınırlandırma: Test saat içinde okunup değerlendirilmelidir. Erken okumalar yanlış asit- asit, geç okumalar ise yanlış alkali-alkali sonuç olarak değerlendirilebilir. Fazla H 2 S üretimi glukoz reaksiyonunu maskeleyebilir. Eğer bu durum gözlenirse glukoz fermentasyonu vardır. Eğer gözlenmiyorsa gaz üretimi kontrol edilmelidir. TSI ve KIA Enterobacteriaceae, non-enterik Gram negatif basiller ve çeşitli aerobik Gram pozitif basillerin identifikasyonunda kulanılmaktadır Amino asit dekarboksilaz-dihidrolaz testleri için besiyeri Bir aminoasidin dekarboksilasyonu karboksil grubunun amin ve CO 2 oluşturmak üzere enzimatik parçalanmasıdır. Bazı bakteriler aminoasidin dekarboksilasyonuna neden olan enzimlere (dekarboksilaz) sahiptirler. Dekarboksilaz enzimleri bir indikatör varlığında renk değişikliği ile basitçe görülebilirler. Dekarboksilaz aktivitesini saptamak için biz laboratuvarımızda Moeller dekarboksilaz medium kullanılmaktadır. Test edilecek aminoasit bakteri inokülasyonundan önce mediuma eklenir. Tüpler anaerobik olarak inkübe edilir. İnkübasyonun başlangıcında bütün tüpler sarı olabilirse de bunun nedeni ortamdaki çok az glukozun fermentasyonudur. Eğer lizin dekarboksilasyonu oluyorsa alkali aminler oluşmakta ve besiyerindeki indikatör madde olan brom krezol moruna bağlı olarak mor renkte bir görünüm oluşmaktadır. 24

25 Moeller dekarboksilaz medium (ph: 6.8) Bacto pepton Bacto yeast extract Bacto dekstroz Bacto brom cresol purple Distile su 5 g 3 g 1 g 0.02 g 1000 ml Yukarıdaki maddeler tartılıp 121 C de 15 dakika sterilize edildikten sonra test edilecek aminoasitten 10 g filtre edilerek eklenmekte ve sonuçta %1 lik konsantrasyonda olmaktadır Oksidaz reajeni N,N,N,N -tetramethyl-p-phenylenediamine dihydocholide Distile su 0.05 g 5.0 ml Oksidaz reajeni distile su içinde kaynatılmadan çözünür. Reajen günlük olarak hazırlanmalıdır. Testte pozitif ve negatif kontroller her zaman kullanılmalıdır String test için % 0.5 lik sodyum deoksikolat reajeni Sodyum deoksikolat Steril distile su 0.5 g ml Steril distile su içine sodyum deoksikolat eklenerek iyice karışması sağlanır. Karışım oda ısısında 6 aydan fazla süre saklanabilir. Test öncesi pozitif (V.cholerae O1) ve negatif (E.coli) kontroller mutlaka kullanılmalıdır. 7.6 Alkalen Taurocholate Tellurite Gelatin Agar Besiyeri (Monsur, ph: 8.5) Trypticase Sodyum klorür Sodyum taurokolat Sodyum karbonat Gelatin Agar Distile su 10.0 g 10.0 g 5.0 g 1.0 g 30.0 g 15.0 g 1000 ml 25

26 Öncelikle sodyum klorür ve agar eritilir. Daha sonra gelatin ve diğerleri eritilip ph 8.5 e ayarlanır. 121 C de 15 dakika sterilize edilir. Su banyosunda C ye soğutulduktan sonra potasyum tellüritin son konsantrasyonundan (1/ / ) ilave edilir. Plaklara 20 ml olacak şekilde dağıtılır. Hazırlanan plaklar beş gün içinde kullanılmalıdır. Bu besiyerinde 24 saatin sonunda özellikle proteus lar V.cholerae yı taklit ederek üreyebilirler. Bu arada candida lar, bazı aerop basiller, mucor lar ve Klebsiella larda üreyerek yanılmalara neden olabilirler. Bunun için kolonilerin dikkatlice incelenmesi ve tamamlayıcı testlerin uygulanması gerekmektedir. 7.7 Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose Agar (TCBS) (LAB 96, ph: 8.6) Yeast extract Pepton Sodyum tiosülfat Sodyum sitrat Safra tuzları Sukroz Sodyum klorür Ferrik sitrat Bromtimol mavisi Timol mavisi Agar Distile su 5.5 g 10.0 g 10.0 g 10.0 g 9.0 g 17 g 10.0 g 1.0 g 0.04 g 0.04 g 15 g 1000 ml Kaynatılarak iyice çözünmesi sağlandıktan sonra su banyosunda C ye soğutulduktan sonra plaklara dökülür. Petrilerin kapakları yaklaşık 20 dakika kadar aralık bırakılarak agar yüzeyinin kuruması sağlanır. 4 C de 1 hafta kadar saklanabilir. Kullanım öncesi kalite kontrolünün yapılması gerekmektedir. V.cholerae kolonileri parlak sarı renkte, E.coli kolonileri ise üremez ya da translusent koloniler şeklinde görülmelidir. 26

27 7.8 Alkış besiyeri Tryptone Safra tuzları Yeast ekstrakt Sodyum klorür Sodyum karbonat Agar Fenol red Distile su 10.0 g 5.0 g 3.0 g 10.0 g 1.5 g 17 g g 1000 ml Yukarıda verilen maddeler su banyosunda eriyinceye kadar tutulur. PH 9 a ayarlanır. 121 C de 15 dakika sterilize edilir. Su banyosunda C ye soğutulduktan sonra aseptik şartlar altında %1 lik potasyum tellüritten 2.5 ml, %30 luk sakkarozdan 150 ml ilave edilerek plaklara dökülür. Bu besiyerinde gerek potasyum tellürit ve gerekse sakkarozun redüksiyonundan yararlanılmıştır. Böylece tek besiyeri ile izolasyon şansı en yüksek seviyede tutulmaya çalışılmıştır. 27

28 8. KOLERA İÇİN STANDART VAKA TANIMI Klinik Tanımlama: Bir kişide şiddetli dehidratasyon bulguları ile seyreden ve/veya başka nedenlerle açıklanamayan akut sulu ishalin görülmesi veya Kişinin bu semptomlarla seyreden hastalıktan ölmesi. Tanı için laboratuvar kriterleri: Klinik örneklerden Vibrio cholerae O1 veya O139 un izole edilmesi Vaka sınıflaması: Olası Vaka: Klinik tanımlama ile uyumlu vaka. Kesin Vaka: (a) Tanı için laboratuvar kriterleri ile doğrulanmış olası vaka (b) (Salgın esnasında) bir kesin vaka ile epidemiyolojik bağlantılı olası vaka. [NOT: Kültürden V.cholerae izole eden, ancak O1 ve O139 tiplendirmesi yapamayan laboratuvarlar izolatlarını bir üst laboratuvara veya Referans Laboratuvara göndermek zorundadır! Ayrıca toksin üretiminin gösterilmesi için tüm izolatlar Referans Laboratuvarına sevk edilmelidir! Standart Laboratuvar Prosedürlerine göre antibiyotik direnci araştırılmalıdır.] RSHMB Ulusal Enterik Patojenl er Referans Lab or atuva rı 28

29 9. KAYNAKLAR 1. WHO/CDS/CSR/EDC/99.8 Laboratory Methods for the Diagnosis of Epidemic Dysentery and Cholera. Centers for Disease Control and Prevention Atlanta, Georgia Wells J. Salmonella serotype Typhi, Shigella, and Vibrio cholerae. Manual for the Laboratory Identification and Antimicrobial Susceptibility Testing of Bacterial Pathogens of Public Health Importance in the Developing.World. CDC National Center for Infectious Diseases and World Health Organization Department of Communicable Disease Surveillance and Response, 2003: Health Protection Agency. Susceptibility testing. National Standard Method BSOP 45 Issue Health Protection Agency (2007). Identification of Vibrio species. National Standard Method BSOP ID 19 Issue Akgün Y. Vibrio cholerae ve diğer Vibrio türleri in: Topçu AW, Söyletir G, Doğanay M (eds) İnfeksiyon Hastalıkları ve Mikrobiyolojisi Nobel Tıp Kitabevleri 2002: s CLSI (2007) Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Sixteenth Informational Supplement. CLSI document M100-S17 [ISBN ]. CLSI 940 West Valley Road, Suite 1400,Wayne, PA USA. 7. Abbott SL, Janda JM, Johnson JA, Farmer III JJ. Vibrio and Related Organisms. In: Murray PR, Baron EJ, Jorgensen JH, Landry ML, Pfaller MA. (eds). Manual of Clinical Microbiology 9 th Edition Washington DC American Society of Microbiology 2007; RSHMB Ulusal Enterik Patojenl er Referans Lab or atuva rı 29

30 30 RSHMB Ulusal Enterik Patojenl er Referans Lab or atuva rı

31 10. ŞEKİLLER Şekil 3: Kolerada pirinç suyu şeklinde gaita görünümü Şekil 5: V. cholerae kolonilerinin kanlı agardaki görünümleri Şekil 4: Cary-Blair taşıma besiyeri Şekil 6: V. cholerae kolonilerinin TCBS agardaki görünümleri RSHMB Ulusal Enterik Patojenl er Referans Lab or atuva rı 31

32 Şekil 7: V. cholerae nın KIA ve TSI agardaki görünümleri Şekil 10: Modifiye CAMP testi Şekil 8: Pozitif oksidaz reaksiyonu Şekil 11: String test Şekil 9: V. cholerae nın antiserumlarla aglütinasyonu Şekil 12: Antibiyogram plağı RSHMB Ulusal Enterik Patojenl er Referans Lab or atuva rı 32

33 33 RSHMB Ulusal Enterik Patojenl er Referans Lab or atuva rı