ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

Transkript

1 ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ Fezel NİZAM FLUOKSETIN İN İNSAN PERİFERAL LENFOSİTLERİNDE IN VITRO GENOTOKSİK ETKİLERİ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI ADANA, 2010

2 ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ FLUOKSETIN İN İNSAN PERİFERAL LENFOSİTLERİNDE IN VITRO GENOTOKSİK ETKİLERİ Fezel NİZAM YÜKSEK LİSANS TEZİ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI Bu Tez.. Tarihinde Aşağıdaki Jüri Üyeleri Tarafından Oybirliği/Oyçokluğu ile Kabul Edilmiştir Prof. Dr. Mehmet TOPAKTAŞ Prof. Dr. Rüştü HATİPOĞLU Doç. Dr. Hasan Basri İLA DANIŞMAN ÜYE ÜYE Bu Tez Enstitümüz Biyoloji Anabilim Dalında hazırlanmıştır. Kod No: Prof. Dr. İlhami YEĞİNGİL Enstitü Müdürü Bu Çalışma Ç. Ü. Araştırma Projeleri Birimi Tarafından Desteklenmiştir. Proje No: FEF2009YL57 Not: Bu tezde kullanılan özgün ve başka kaynaktan yapılan bildirişlerin, çizelge ve fotoğrafların kaynak gösterilmeden kullanımı, 5846 sayılı Fikir ve Sanat Eserleri Kanunundaki hükümlere tabidir.

3 ÖZ YÜKSEK LİSANS TEZİ FLUOKSETIN İN İNSAN PERİFERAL LENFOSİTLERİNDE IN VITRO GENOTOKSİK ETKİLERİ Fezel NİZAM ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI Danışman :Prof. Dr. Mehmet TOPAKTAŞ Yıl :2010, Sayfa: 111 Jüri :Prof. Dr. Mehmet TOPAKTAŞ Prof. Dr. Rüştü HATİPOĞLU Doç. Dr. Hasan Basri İLA Bu çalışma, Fluoksetin antidepresanının insanlar için genotoksik risk oluşturup oluşturmadığını, insan periferal kan lenfositlerinde eksojen metabolik aktivatör yokluğunda ve varlığında in vitro kardeş kromatid değişimi (KKD), kromozom anormalliği (KA) ve mikronukleus (MN) testleri ile belirlemek amacıyla yürütülmüştür. Hücreler, eksojen metabolik aktivatör yokluğunda 24 ve 48 saat, eksojen metabolik aktivatör varlığında ise 3 saat boyunca 8, 12, 16 ve 20µg/ml Fluoksetin ile muamele edilmişlerdir. Fluoksetin, insan periferal kan lenfositlerinde metabolik aktivatörün bulunmadığı ve bulunduğu durumda KKD yi uyarmamıştır. Halbuki Fluoksetin metabolik aktivatörün yokluğunda KA oluşumunu hem 24 hem de 48 saatlik muamelelerde kontrole nazaran uyarmıştır. Metabolik aktivatörün varlığında ise en düşük konsantrasyon hariç KA yı uyarmıştır. Ayrıca Fluoksetin eksojen metabolik aktivatörün yokluğunda 24 saatlik muamelede sadece en yüksek konsantrasyonda, 48 saatlik muamelede ise 12µg/ml konsantrasyonda MN oluşumunu artırmış, en yüksek iki konsantrasyonda ise yeterli sayıda iki nukleuslu hücre bulunamamıştır. Metabolik aktivatörün bulunduğunda ise Fluoksetin sadece en yüksek konsantrasyonda MN oluşumunu uyarmıştır. Fluoksetin metabolik aktivatör yokluğunda 24 ve 48 saatlik muamelede PI yi düşürmemiş, MI yi ise 24 saatlik muamelede sadece en yüksek konsantrasyonda, 48 saatlik muamelede ise en yüksek üç konsantrasyonda kontrole nazaran düşürmüştür. Halbuki Fluoksetin NBI yı 24 saatlik muamelede düşürmemiş, 48 saatlik muamelede ise 8, 12 ve 16µg/ml konsantrasyonlarda kontrole nazaran düşürmüştür. Metabolik aktivatörün varlığında ise Fluoksetin PI, MI ve NBI yi düşürmemiştir. Anahtar Kelimeler: Fluoksetin, İnsan Periferal Kan Lenfositi, Kardeş Kromatid Değişimi (KKD), Kromozom Anormalliği (KA), Mikronukleus (MN) I

4 ABSTRACT MSc THESIS IN VITRO GENOTOXIC EFFECTS OF FLUOXETINE ON HUMAN PERIPHERAL LYMPHOCYTES Fezel NİZAM ÇUKUROVA UNIVERSITY INSTITUTE OF NATURAL AND APPLIED SCIENCES DEPARTMENT OF BIOLOGY Supervisor :Prof. Dr. Mehmet TOPAKTAŞ Year :2010, Pages: 111 Jury :Prof. Dr. Mehmet TOPAKTAŞ Prof. Dr. Rüştü HATİPOĞLU Assoc. Prof. Dr. Hasan Basri İLA The aim of the present study was to investigate the genotoxic effects of Fluoxetine, on human peripheral lymphocytes by using sister chromatid exchange (SCE), chromosomal aberration (CA) and micronucleus (MN) tests in absence and presence of metabolic activation system. Cells were treated with 8, 12, 16, 20 µg/ml Fluoxetine for 24 and 48 hours in the absence of a metabolic activation system and 3 hours in the presence of a metabolic activation system. Fluoxetine did not induce SCEs in human peripheral blood lymphocytes both in the absence and presence of the metabolic activator. Whereas Fluoxetine induced CA formation when compared to control for 24-h and 48-h treatment periods in the absence of metabolic activator. In case of metabolic activator presence, fluoxetine induced CA in all concentrations except the lowest concentration. Additionally, Fluoxetine increased MN formation only in highest dose in 24-h treatment and 12µg/ml concentration in 48-h treatment in the absence of metabolic activator. Also in highest two concentrations of 48-h treatment period, enough number of binuclear cells could not count. In case of metabolic activator presence, Fluoxetine induced MN formation only in the highest concentration. In 24-h and 48-h treatment periods Fluoxetine did not decrease PI, but in other hand it decreased MI compared to control only in highest concentration in 24-h treatment and in three highest concentrations in 48-h treatment period. Whereas in 24-h treatment Fluoxetine did not decrease NDI and in 48-h treatment in 8, 12 and 16 µg/ml concentrations Fluoxetine decreased NDI compared to control. On the other hand Fluoxetine did not decrease PI, MI and NDI in the presence of metabolic activator. Key words: Fluoxetine, Human Peripheral Blood Lymphocytes, Sister Chromatid Exchange (SCE), Chromosom Aberration (CA), Micronucleus (MN) II

5 TEŞEKKÜR Tez çalışmalarım sırasında bana her açıdan destek olan, yardımlarını hiçbir zaman esirgemeyen ve kişisel gelişimimde sonsuz sabır gösteren danışman hocam sayın Prof. Dr. Mehmet TOPAKTAŞ a en içten teşekkürlerimi sunarım. Çalışmalarım esnasında, her konuda çok büyük yardımlarını gördüğüm sayın hocam Prof. Dr. Eyyüp RENCÜZOĞULLARI na teşekkürlerimi sunarım. Ayrıca tez çalışmalarım sırasında yine çok büyük yardımlarını gördüğüm, Doç. Dr. Hasan Basri İLA ya, Arş. Gör. Erman Salih İSTİFLİ ye, Arş. Gör. Burak KOÇAK a, Biyolog Mehmet BÜYÜKLEYLA ya, Biyolog Mehmet ARSLAN a, Biyolog Nadire KOPAR a, Biyolog A. Mine YILDIZ a ve Biyolog Handan ERBOĞA ya teşekkür ederim. Çalışmalarım sırasında desteklerini benden esirgemeyen ve her koşulda yanımda yer alan aileme ve arkadaşlarıma da teşekkürü bir borç bilirim. Ayrıca, bu yüksek lisans çalışmasını maddi yönden destekleyen Ç.Ü. Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi yöneticilerine de teşekkür ederim (Proje no:fef2009yl57). III

6 İÇİNDEKİLER SAYFA ÖZ...I ABSTRACT...II TEŞEKKÜR.....III İÇİNDEKİLER.IV ÇİZELGELER DİZİNİ..X ŞEKİLLER DİZİNİ......XII SİMGELER VE KISALTMALAR...XVI 1.GİRİŞ ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Seçici Serotonin Gerialım İnhibitörü (SSGİ) Grubu Antidepresanlar İle Yapılan Genotoksisite ve Kanserojenite Çalışmaları Fluoksetin İle Yapılan Genotoksisite ve Kanserojenite Çalışmaları Fluvoksamin İle Yapılan Genotoksisite ve Kanserojenite Çalışmaları Paroksetin İle Yapılan Genotoksisite ve Kanserojenite Çalışmaları Sertralin İle Yapılan Genotoksisite ve Kanserojenite Çalışmaları Sitalopram İle Yapılan Genotoksisite ve Kanserojenite Çalışmaları Venflaksin ile Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Monoamin Oksidaz İnhibitörü (MAOİ) Grubu Antidepresanlar İle Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Fenelzin İle Yapılan Genotoksisite Çalışmaları İproniazid İle Yapılan Genotoksisite Çalışmaları İzokarboksazid İle Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Moklobemid İle Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Mebanazin İle Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Nialamid ile Yapılan Genotoksisite Çalışmaları 20 IV

7 2.2.7.Selejilin ile Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Tranilsipramin İle Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Trisiklik Antidepresan (TSA) Grubu İle Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Amitriptilin İle Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Desipramin İle Yapılan Genotoksisite ve Kanserojenite Çalışmaları Doksepin İle Yapılan Genotoksisite Çalışmaları İmipramin İle Yapılan Genotoksisite, Sitotoksisite ve Kanserojenite Çalışmaları Karbamazepin İle Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Klomipramin İle Yapılan Genotoksisite ve Kanserojenite Çalışmaları Nortriptilin İle Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Protriptilin İle Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Seçici Noradrenerjik Gerialım İnhibitörü (SNGİ) Maprotilin ile Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Reboksetin ile Yapılan Toksisite Çalışmaları Alfa 2 Adrenoreseptor Antagonistleri Mianserin ile Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Serotonerjik ve Norepinefrin Gerialım İnhibitörleri Duloksetin ile Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Antidepresanlarla Yapılan Genotoksisite ve Kanserojenite Çalışmalarının Sonuçlarının Özet Olarak Açıklanması MATERYAL VE METOD Kullanılan Kimyasal Maddeler ve Deney Ekipmanları Antidepresanlar ve Sınıflandırması Seçici Serotonin Gerialım İnhibitörleri (SSGİ) Monoamin Oksidaz İnhibitörleri (MAOI) Trisiklik Antidepresanlar (TSA) Seçici Noradrenerjik Gerialım İnhibitörleri (NGİ) α-2 Adrenoreseptör Antagonistleri...33 V

8 Serotonin-Noradrenerjik (Norepinefrin) Gerialım İnhibitörleri (SNGİ) Norepinefrin-Dopamin Gerialım İnhibitörleri (NDGİ) Etki Artırıcı Antidepresan İlaçlar (1).Seçici Serotonin Geri-Alım İnhibitörlerinin Etki Mekanizması (2).Seçici Serotonin Geri-Alım İnhibitörlerinin Yan Etkileri Kullanılan Kimyasal Maddeler Fluoksetin ve Kimyasal Özellikleri (1).Fluoksetin in Farmakokinetik Özellikleri (2).Fluoksetin in Kimyasal Yapısı '-Bromo-2'-deoxyuridine (BrdUrd) (Sigma) Cyclophosphamide monohydrate (Sigma) Cytochalasin B (Sigma) Entellan (Merck) Fiksatif Giemsa (Merck) Hipotonik Eriyik Karaciğerin Alınması Karaciğer Homojenat S9 Fraksiyonlarının Hazırlanması Kolkisin (Kolşisin) (Sigma) Kromozom Medyumu Mitomycin C (MMC) (Sigma) Nitrik Asit (HNO 3 ) RPMI1640 Besi Yeri Sıçan Karaciğer Enzimlerinin İndüklenmesi Sorensen Tamponu (Sorensen Buffer) Standart S9 mix (Memeli Karaciğer Fraksiyonu [S9] ) Standart Saline Citrate (SSC) Eriyiği Kullanılan Deney Ekipmanları VI

9 Flow Kabin (Steril Kabin) Hassas Terazi İnkübatör Mikroskop Otoklav pH Metre Santrifüj Su Banyosu Lamların Temizlenmesi Sterilizasyon BrdUrd Eriyiğinin Sterilizasyonu Cyclophosphamide monohydrate nin Sterilizasyonu Saf Suyun Sterilizasyonu Kardeş Kromatid Değişimi (KKD) (Sister Chromatid Exchange= SCE) ve Kromozom Anormalliklerini (KA) (Chromosome Aberration=CA) Saptamak Amacıyla Hücre Kültürünün Yapılması, Preparatların Hazırlanması, Boyanması ve Mikroskobik İnceleme Hücre Kültürünün Yapılması ve Preparatların Hazırlanması (S9 mix siz test) Hücre Kültürünün Yapılması ve Preparatların Hazırlanması (S9 mix li test) Preparatların Boyanması ve Daimi Preparatların Hazırlanması Daimi Preparatlarda Mikroskobik İnceleme KKD Sayısının ve Proliferasyon İndeksinin (PI) (Replikasyon İndeksi=RI) Saptanması (1).KKD Sayısının Saptanması (2).Proliferasyon İndeksi (PI) (Replikasyon İndeksi=RI) nin Saptanması Kromozom Anormallikleri (KA) ve Mitotik İndeksin (MI) Saptanması. 58 VII

10 (1).Kromozom Yapı ve Sayı Anormalliklerinin Saptanması (2).Mitotik İndeksin (MI) Saptanması Mikronukleus (MN) Oluşumunu Saptamak Amacıyla Hücre Kültürünün Yapılması, Preparatların Hazırlanması, Boyanması ve Mikroskobik İncelemeler Hücre Kültürünün Yapılması ve Preparatların Hazırlanması (S9 mix siz test) Hücre Kültürünün Yapılması ve Preparatların Hazırlanması (S9 mix li test) Preparatların Boyanması Mikronukleus Testi İçin Hazırlanan Preparatlarda Mikroskobik İnceleme Mikronukleus Sayısı ve Nukleus Bölünme İndeksinin (NBI) Saptanması Mikroskopta Fotoğraf Çekme İstatistiksel Analiz ve Sonuçların Değerlendirilmesi BULGULAR VE TARTIŞMA Bulgular Fluoksetin in Eksojen Metabolik Aktivatör Bulunmayan Ortamda İnsan Periferal Kan Lenfositlerindeki Genotoksik Etkileri Fluoksetin in Kardeş Kromatid Değişimi (KKD) Üzerindeki Etkileri Fluoksetin in Kromozom Anormallikleri (KA) Oluşumu Üzerindeki Etkileri Fluoksetin in DNA Replikasyonu ve Mitoz Bölünme Üzerindeki Etkileri Fluoksetin in Mikronukleus (MN) Oluşumu ve Nukleus Bölünmesi Üzerindeki Etkileri Fluoksetin in Eksojen Metabolik Aktivatör (S9 mix) Bulunan Ortamda İnsan Periferal Kan Lenfositlerindeki Genotoksik Etkileri.81 VIII

11 Metabolik Aktivatörün (S9 mix) Varlığında Fluoksetin in Kardeş Kromatid Değişimi (KKD) Üzerindeki Etkileri Metabolik Aktivatörün (S9 mix) Varlığında Fluoksetin in Kromozom Anormalliklerinin (KA) Oluşumu Üzerindeki Etkileri Fluoksetin in DNA Replikasyonu ve Mitoz Bölünme Üzerindeki Etkileri Fluoksetin in Mikronukleus (MN) Oluşumu ve Nukleus Bölünmesi Üzerindeki Etkileri Tartışma Fluoksetin in İnsan Periferal Lenfositlerinde Kardeş Kromatid Değişimi (KKD) ve Kromozom Aberasyonu (KA) Üzerindeki Etkisi Fluoksetin in Mikronukleus (MN) Oluşumları Üzerindeki Etkileri Fluoksetin in Hücre Proliferasyonu, Mitoz Bölünme ve Nukleus Bölünmesi Üzerindeki Etkileri SONUÇ VE ÖNERİLER.. 97 KAYNAKLAR ÖZGEÇMİŞ IX

12 ÇİZELGELER DİZİNİ SAYFA Çizelge 2.1. Antidepresanlar ile Yapılan Genotoksisite ve Kanserojenite Çalışmalarının Sonuçları Çizelge 4.1. Değişik Dozlarda Fluoksetin ile 24 ve 48 Saat Muamele Edilmiş Olan İnsan Periferal Kan Lenfositlerinde Hücre Başına Düşen Ortalama KKD Sayısı..67 Çizelge 4.2. Değişik Dozlarda Fluoksetin İle 24 ve 48 Saat Muamele Edilmiş Olan İnsan Periferal Kan Lenfositlerinde Kromozom Anormallik Çeşitleri, Anormal Hücre Oranı, KA/ Hücre.. 69 Çizelge 4.3. Değişik Dozlarda Fluoksetin ile 24 ve 48 Saat Muamele Edilmiş Olan İnsan Periferal Kan Lenfositlerinde Proliferasyon İndeksi (PI) ve Mitotik İndeks (MI) 75 Çizelge 4.4. Değişik Dozlarda Fluoksetin ile 24 ve 48 Saat Muamele Edilmiş Olan İnsan Periferal Kan Lenfositlerinde MN % si ve NBI.. 79 Çizelge 4.5. Eksojen Metabolik Aktivatör Bulunan Ortamda (S9 mix) Değişik Dozlarda Fluoksetin ile Muamele Edilmiş İnsan Periferal Kan Lenfositlerinde Hücre Başına Düşen Ortalama KKD Sayısı.. 82 Çizelge 4.6. Eksojen Metabolik Aktivatör Bulunan Ortamda (S9 mix) Değişik Dozlarda Fluoksetin ile Muamele Edilmiş İnsan Periferal Kan Lenfositlerinde Kromozom Anormallik Çeşitleri, Anormal Hücre Oranı, KA/Hücre.83 Çizelge 4.7. Eksojen Metabolik Aktivatör Bulunan Ortamda (S9 mix) Değişik Dozlarda Fluoksetin ile Muamele Edilmiş İnsan Periferal Kan Lenfositlerinde Proliferasyon İndeksi (PI) ve Mitotik İndeks (MI) 87 Çizelge 4.8. Eksojen Metabolik Aktivatör Bulunan Ortamda (S9 mix) Değişik Dozlarda Fluoksetin ile Muamele Edilmiş İnsan Periferal Kan Lenfositlerinde MN % si ve NBI 88 X

13 XI

14 ŞEKİLLER DİZİNİ SAYFA Şekil 1.1.Değişik ülkelerde 1000 kişi içerisinde yapılan çalışmadan elde edilen sonuçlara göre antidepresan ilaç kullanım durumu...2 Şekil 3.1.Kardeş Kromatid Değişiminin Olduğu ve Olmadığı Durumun Şematik Olarak Gösterilmesi (Topaktaş ve Speit, 1990) 53 Şekil 3.2.Deoxytimidin (dt), Bromodeoxyuridin (BrdUrd) ve Deoxyuridin (du) in kimyasal yapıları.. 54 Şekil 3.3.BrdUrd nin DNA Yapısına Girmesi ile Birinci, İkinci ve Üçüncü Mitoz Bölünmeyi Geçiren Hücrelerin Ayırt Edilmesinin Şematik Olarak Açıklanması (During, 1985: Topaktaş ve Speit, 1990 dan)..56 Şekil 3.4.Birinci mitoz bölünmeyi geçiren hücrenin metafaz kromozomları (X1000).. 57 Şekil 3.5.İkinci mitoz bölünmeyi geçiren hücrenin metafaz kromozomları (X1000).. 57 Şekil 3.6.Üçüncü mitoz bölünmeyi geçiren hücrenin metafaz kromozomları (X1000).. 58 Şekil 3.7.Bir nukleuslu hücre (X1000) 63 Şekil 3.8.İki nukleuslu hücre (X1000). 63 Şekil 3.9.Üç nukleuslu hücre (X1000). 64 Şekil 3.10.Dört nukleuslu hücre (X1000) 64 Şekil 4.1.Kromatid kırığı (B') bulunan metafaz plağı (20µg/ml Fluoksetin ile, 24 saatlik muamele, ) X Şekil 4.2.Kromatid kırığı (B') bulunan metafaz plağı (8 µg/ml Fluoksetin, 48 saatlik muamele, ) X Şekil 4.3.Kromatid kırığı (B') bulunan metafaz plağı (8 µg/ml Fluoksetin, 24 saatlik muamele, ) X Şekil 4.4.Kromozom kırığı (B'') bulunan metafaz plağı (8 µg/ml Fluoksetin, 24 saatlik muamele, ) X Şekil 4.5.Fragment (F) bulunan metafaz plağı (20 µg/ml Fluoksetin, 24 saatlik muamele, ) X XII

15 Şekil 4.6.Kardeş kromatid bileşimi (SU) bulunan metafaz plağı (8 µg/ml Fluoksetin, 24 saatlik muamele, ) X Şekil 4.7.Poliploid hücre kromozomları (8 µg/ml Fluoksetin, 24 saatlik muamele, ) X Şekil 4.8.Kontraksiyonlu kromozoma sahip metafaz plağı (16 µg/ml Fluoksetin, 48 saatlik muamele, ) X Şekil 4.9.S9 mix yokluğunda farklı dozlarda Fluoksetin ile 24 saat muamele edilen insan periferal lenfositlerinde PI nin doza bağlı azalışını gösteren regresyon doğrusu ve korelasyon katsayısı (P<0,048).. 76 Şekil 4.10.S9 mix yokluğunda farklı dozlarda Fluoksetin ile 48 saat muamele edilen insan periferal lenfositlerinde PI nin doza bağlı azalışını gösteren regresyon doğrusu ve korelasyon katsayısı (P< 0,050) 76 Şekil 4.11.S9 mix yokluğunda farklı dozlarda Fluoksetin ile 24 saat muamele edilen insan periferal lenfositlerinde MI in doza bağlı azalışını gösteren regresyon doğrusu ve korelasyon katsayısı (P< 0,000) 77 Şekil 4.12.S9 mix yokluğunda farklı dozlarda Fluoksetin ile 48 saat muamele edilen insan periferal lenfositlerinde MI in doza bağlı azalışını gösteren regresyon doğrusu ve korelasyon katsayısı (P< 0,018) 77 Şekil 4.13.İki mikronukleus içeren iki nukleuslu hücre (8 µg/ml Fluoksetin, 48 saatlik muamele, ) X Şekil 4.14.Mikronukleus içeren iki nukleuslu hücre (8 µg/ml Fluoksetin, 24 saatlik muamele, ) X Şekil 4.15.Mikronukleus içeren iki nukleuslu hücre (20 µg/ml Fluoksetin, 24 saatlik muamele, ) X Şekil 4.16.Kromatid kırığı (B') bulunan metafaz plağı (16 µg/ml Fluoksetin + S9 mix, 3 saatlik muamele, ) X Şekil 4.17.Kromatid kırığı (B') bulunan metafaz plağı (20 µg/ml Fluoksetin + S9 mix, 3 saatlik muamele, ) X Şekil 4.18.Kromozom kırığı (B'') bulunan metafaz plağı (16 µg/ml Fluoksetin + S9 mix, 3 saatlik muamele, ) X Şekil 4.19.İki fragment (F) bulunan metafaz plağı (20 µg/ml Fluoksetin + XIII

16 S9 mix, 3 saatlik muamele, ) X Şekil 4.20.Poliploid hücre kromozomları ( 20 µg/ml + S9 mix, 3 saatlik muamele, ) X Şekil 4.21.Mikronukleus içeren iki nukleuslu hücre (12 µg/ml Fluoksetin + S9 mix, 3 saatlik muamele, ) X Şekil 4.22.İki mikronukleus içeren iki nukleuslu hücre (16 µg/ml Fluoksetin + S9 mix, 3 saatlik muamele, ) X Şekil 4.23.Mikronukleus içeren iki nukleuslu hücre (20 µg/ml Fluoksetin + S9 mix, 3 saatlik muamele, ) X XIV

17 XV

18 SİMGELER VE KISALTMALAR 5-HT :5-hidroksitriptamin, serotonin AH : Anormal Hücre ATM : Atmosfer B : Kromatid Kırığı B : Kromozom Kırığı BrdUrd : 5 -Bromo-2 -Deoxyuridine BSO : L-butionin Sulfoksimin CA : Chromosome Aberration camp : Siklik Adenozin Monofosfat CE : Chromatid Exchange CHO : Chinese Hamster Ovary CHL : Chinese Hamster Lung Cell CRE : Camp/Ca +2 responsive element Cyp : Cyclophosphamide monohydrate Cyt-B : Cytochalasin-B DNA : Deoksiribonukleik Asit DS : Disentrik Kromozom dt : Deoksitimidin du : Deoxyuridine F : Fragment G-6-P : Glukoz-6-fosfat GSH : Glutatyon HNO 3 : Nitrik asit IPCS : International Programme on Chemical Safety ISCN : International System for Human Cytogenetic Nomenclature (Uluslararası İnsan Sitogenetik Adlandırma Sistemi) i.m. : İntramüsküler i.p. : İntraperitonal KA : Kromozomal Anormallikleri XVI

19 KCl : Potasyum klorür KD : Kromatid Değişimi KKB : Kardeş Kromatid Bileşimi KKD :Kardeş Kromatid Değişimi MAO-A : Monoamin Oksidaz tip-a MAOI : Monoamin Oksidaz İnhibitörü MGA :Minimal Glikoz Agar MgCl 2 : Magnezyum klorür MI :Mitotik indeks MLA : Mouse Lymphoma Assay MMC :Mitomycin C MN :Mikronükleus MNBC : Micronucleated binucleated cell MNNE : Mikronukleuslu normokromatik eritrosit MNPE : Mikronukleuslu polikromatik eritrosit NAC : N-asetyl cystein NaCl :Sodyum klorür NADP : Nikotinamid adenin dinukleotid fosfat NaSSA : Noradrenerjik ve Spesifik Serotonerjik Antidepresan NBI : Nukleus Bölünme İndeksi NDGİ : Norepinefrin-Dopamin Gerialım İnhibitörü NGİ : Norepinefrin (Noradrenalin) Gerialım İnhibitörü NKCA : Natural Killer Cell Activity (Doğal Öldürücü Hücre Aktivitesi) P : Poliploidi PI : Proliferasyon İndeksi PK : Pozitif Kontrol r : Korelasyon katsayısı RPMI : Roswell Park Memorial Institute Medium RI : Replikasyon İndeksi ROS : Reactive Oxygen Species rpm : Revolution Per Minute (devir/dakika) XVII

20 S9mix : Metabolik Aktivatör SNGİI : Seçici Noradrenerjik Gerialım İnhibitörü SCD : Sister Chromatid Differentiation (Kardeş Kromatidlerin Farklılaşması) SCE : Sister Chromatid Exchange (Kardeş Kromatid Değişimi) SSC :Standart Saline Citrate SSGI : Seçici Serotonin Gerialım İnhibitörü T : Translokasyon TSA : Trisiklik Antidepresan UDS : Unscheduled DNA Synthesis (Zamansız DNA Sentezi) UV : Ultraviyole WHO : World Health Organisation (Dünya Sağlık Örgütü) XVIII

21 XIX

22 1. GİRİŞ Fezel NİZAM 1. GİRİŞ Antidepresanlar, depresyon ya da distimi (kronik depresyon) gibi rahatsızlıkları dindirmek amacıyla kullanılan psikiyatrik ilaç, besin maddeleri veya bitkisel maddeler (ot, yaprak, meyve) için kullanılan terimdir. Literatürlere göre antidepresanlar, depresyon tedavisinde %94 başarı sağlamaktadırlar ( Günümüzde, toplumsal ve kişisel problemlerin artması ile depresyon vakaları sık rastlanır duruma gelmiş, antidepresanlar da en çok aranılan ilaç gruplarından biri olmuştur. Depresyon kişide kalıtımsal, hormonsal ya da çevresel problemler sonrasında gelişen, beyinde serotonin metabolizmasının bozulması ile ortaya çıkan tıbbi bir rahatsızlık olarak nitelendirilebilir. Depresyon, uzmanlar tarafından kanserden sonra çağın en önemli ikinci hastalığı olarak değerlendirilmektedir ( bilim.com). Türkiye de son dört yılda antidepresan kullanımı %85 oranında artmıştır yılında 14 milyon 138 bin kutu antidepresan tüketilirken, bu rakam 2006 yılı verilerine göre 22 milyon 651 bine, 2007 yılında ise 26 milyon 246 bine çıkmıştır. Türkiye de antidepresan kullanımının özellikle yaş arasında yoğunlaştığı gözlenmektedir ( Brezilya da antidepresan kullanımı 1994 yılında %8.4 iken, 2003 yılında %31.6 ya kadar yükselmiştir ( Şekil 1.1 de ise 1993 ve 1998 yıllarında İsveç, Fransa, Avustralya, Amerika Birleşik Devletleri, Kanada, İngiltere, Almanya ve İtalya da 1000 kişilik bir popülasyonda belirlenen günlük doza göre antidepresan ilaç satışlarının değişim durumu gösterilmektedir (McManus ve ark., 2000) yılları arasında İngiltere deki antidepresan kullanımı %234 artmıştır ( Kolombiya da 1996 ve 2004 yılları arasında antidepresan kullanımı %3.4 ten %7.2 ye çıkmıştır (Raymond ve ark., 2007). İstatistiksel verilerden de anlaşılacağı gibi antidepresan kullanımı dünya çapında gün geçtikçe artmaktadır. 1

23 1. GİRİŞ Fezel NİZAM Şekil 1.1.Değişik ülkelerde 1000 kişi içerisinde yapılan çalışmadan elde edilen sonuçlara göre antidepresan ilaç kullanım durumu (McManus ve ark., 2000). Antidepresanlar keşfedilmeden önce depresyon tedavisi için uyarıcı etkisi olan maddeler kullanılmıştır. Endişe (anksiyete) ve heyecanlılık halini düşürmek için çeşitli uyuşturucu ilaçlar ve amfetaminler bağımlılık yapıcı doğası ve yan etkileri yüzünden kullanımından vazgeçilene kadar antidepresanların yerini tutmuşlardır. Psikofarmakoloji dünyasındaki esas devrim, 1950 li yıllarda antidepresanların keşfedilmesidir. 20. yüzyılın başlarına kadar, araştırıcılar depresyon belirtilerini dindiren ilacın sentezlemesi için birçok farklı madde denemişlerdir. Bu çalışmalar sonucunda ilk antidepresan 1957 yılında tüberküloz tedavisinde kullanılan iproniazid in doktorların dikkatini çekmesi ile keşfedildi. İproniazid, esas tedavi amacının haricinde, tüberküloz hastalarında yan etki olarak alışılmadık mutluluk hallerine neden olmuştur. Kısa süre sonra bu ilaç, depresyon belirtilerini dindirmek için kullanılmaya başlanmıştır ( Test maddemiz olan, ilk etkili Seçici Serotonin Gerialım İnhibitörü (SSGİ) Fluoksetin in keşfi ise 1970 lerde Eli Lilly firmasından Bryan Molly ve arkadaşları tarafından gerçekleştirilmiştir ( Antidepresif ilaçların, depresyonu tedavi etme özellikleri bir kenara bırakıldığında, uzun süre bilinçsizce kullanılmaları metabolitlerin birikmesine ve dolayısıyla kanser gelişimine neden olabilmektedir. Bu bilgiler ışığında 2

24 1. GİRİŞ Fezel NİZAM antidepresanlar ve kanser arasındaki bağlantı bazı araştırıcıların ilgisini çekmiştir. Brandes ve ark. (1992), kemirgen hayvanlar üzerinde yaptıkları çalışmada Amitriptilin ve Fluoksetin türü ilaçların kanser gelişimini artırdığını tespit etmişlerdir. Graf ve Schaik (1991), Drosophila modellerinde, Desipramin ve İmipramin in genotoksik etkiye sahip olduğunu açıklamışlardır. La Bella ve Brandes (1996), trisiklik antidepresanların yapısal özellikleri dolayısıyla histamin bağlanmasını inhibe ettikleri ve sitokrom P450 monooksijenazın katalitik aktivitesinin azalmasına yol açtıkları için malign gelişimini aktive ettiklerini açıklamışlardır. Tam tersi görüşler de gündemdedir. Sauter (1987) ve Sauter (1989), trisiklik antidepresanların (TSA) sitotoksik ajan olarak kabul edilmesi gerektiğini, insanların doku kültüründe bu ajanların potansiyel faydalı etkileri olabileceğini ifade etmişlerdir. Aynı araştırmacılar kanser hastalarında destek tedavide önemli bir yer tutan trisiklik antidepresan ilaçların in vitro insan renal kanserleşmiş böbrek hücrelerinde sitotoksik özelliklerinin ön plana çıktığını ileri sürmüşlerdir. TSA nın yapı olarak bağlandığı nükleotidlere bakılarak antrasiklinlere benzer etkileri olduğunu, ayrıca kanser hücrelerinde membran fonksiyon bozukluklarına da yol açtıkları gösterilmiştir. Steingart ve Cotterchio (1995), antidepresif ilaçların kanser gelişimine etkileri üzerinde çok sayıda çalışma yapmışlardır ile 1993 yılları arasında dört insan modeli ve dokuz deneysel modeli incelemişlerdir. İnsan çalışmalarında Amitriptilin türevleri ile karaciğer tümörü arasında pozitif ilişki tespit edilmiş, pankreas kanseri arasında ise herhangi bir ilişki belirlenememiştir. Ayrıca Amitriptilin, Nortriptilin, Desipramin ve Fenelzin türevlerinin meme kanseri riskini artırdıkları tespit edilmiştir. Tutton ve Barkla (1982), antidepresan ilaçların bifazik etkisi olduğunu, düşük konsantrasyonların tümör gelişimini artırdığını, yüksek konsantrasyonların tümör gelişimini yavaşlattığını bildirmişlerdir. Kromozom mutasyonları ile ilgili genetik değişimler birçok insan genetik hastalıklarının sebebidir. Somatik hücrelerin onkogen ya da tümör süpressör 3

25 1. GİRİŞ Fezel NİZAM genlerinde değişmelere sebep olan kromozom mutasyonları ve ilgili olayların insanlarda ve deney hayvanlarında kanserin uyarılmasında rol oynadığına dair birçok kanıt bulunmaktadır (OECD TG ). Antidepresan ilaçların kullanımı ve kanser oluşumu arasındaki ilişki birçok araştırıcı tarafından ele alınmış, fakat görüldüğü gibi tutarsız bulgular elde edilmiştir. Bundan dolayı ilaç ve kimyasalların potansiyel zararlı etkileri göz önüne alındığında, yeni ilaçların yaygın kullanımlarına bağlı olarak genotoksik etkilerinin test edilmesi önem arz etmektedir (Jaju, 1984). Bugün kısa süreli genotoksisite testleri olarak bilinen ve bir kimyasal maddenin genotoksik veya anti-genotoksik olup olmadığının belirlenmesinde kullanılan metotlar; kardeş kromatid değişimi (KKD) (Sister Chromatid Exchange=SCE) (Tucker ve ark., 1993), kromozom aberasyonu (KA) (Chromosome Aberration=CA) (Carrano ve Natarajan, 1988; Anderson, 1988; Hagmar ve ark., 1994) ve mikronükleus (MN) (Heddle ve ark., 1991, Fenech, 2002) testleridir. Mutajen ve kanserojenlerin genotoksik risklerini belirlemede kullanılan en hassas yöntemlerden biri, periferal kan lenfositlerindeki kromozom anormalliği (KA) frekansının değerlendirilmesidir (Carrano ve Natarajan, 1988; Anderson, 1988; Hagmar ve ark. 1994). Kromozom anormallikleri DNA düzeyindeki zararın bir sonucu olarak ortaya çıkar. Örneğin, kromozom kırıkları DNA daki onarılmamış çift zincir kırıklarından ve yeni yapıya sahip kromozomların meydana gelmesi de, DNA daki zincir kırıklarının yanlış onarılmasından kaynaklanabilir (Savage, 1993). KA oluşum mekanizmasının farklı dokularda benzer olmasından dolayı, lenfositlerdeki anormallik seviyesinin, kansere eğilimli dokulardaki anormallik seviyesini gösterdiği ve böylece kanser riskinin de göstergesi olduğu düşünülmektedir (Albertini ve ark., 2000; Bonassi ve ark. 2000; 2004; 2005; 2007). Yüksek KA frekansı (gap hariç), KA artışını başlatan sebebe bakmaksızın yüksek kanser riski olduğunu önceden gösterebilir. Hem kromatid tipi hem de kromozom tipi KA ları kanser riskinin göstergesidir. Fakat kromozom tipi KA lerinin kromatid tipi KA lerine göre daha iyi bir belirleyici olduğuna dair kanıtlar vardır (Norppa, 2004; Norppa ve ark. 2006; Boffetta ve ark. 2006). Genotoksik riski belirlemede kullanılan diğer yöntemlerden biri, periferal kan lenfositlerindeki kardeş kromatid değişimi (KKD) frekansının belirlenmesidir 4

26 1. GİRİŞ Fezel NİZAM (Tucker ve ark. 1993). Kardeş kromatid değişimleri, DNA çift zincir kırıklarının homolog rekombinasyon yoluyla onarılmasını gösteren kardeş kromatidlerin homolog lokusları arasında DNA replikasyon ürünlerinin değişimidir (Sonoda ve ark. 1999; Helleday, 2003). Mutajen ve kanserojen olduğu bilinen maddelere maruz kalan insan ve hayvanların hücrelerinde KKD frekansının arttığı bulunmuştur (Perry ve Evans, 1975; Albertini ve ark. 2000). Ayrıca, tek-gen mutasyonlarının artışı ile KKD frekansı arasında lineer bir ilişki olduğu da saptanmıştır (Carrano ve ark, 1978). Benzer bir ilişkinin KKD nin artışıyla in vivo tümörlerin oluşumu arasında da olduğu Cheng ve ark. (1981) tarafından bildirilmiştir. KA nin aksine KKD tek başına genotoksik riski belirlemede yetersizdir. Fakat, KKD deneysel çalışmalarda indikatör test olarak insanlarda genotoksik etkileri göstermede uygun bir yöntem olarak kullanılmaya devam etmektedir (Norppa ve ark. 2006). Genotoksisite ve kanserojenitenin belirlenmesinde kullanılan sitogenetik metodlardan bir diğeri ise mikronukleus (MN) testidir (Heddle ve ark. 1991; Fenech, 2002). Bonassi ve ark. (2007) na göre periferal kan lenfositlerindeki yüksek MN frekansı insanlarda kanser riskini göstermektedir. Periferal kan lenfositlerinde kromozom hasarının göstergesi olarak MN un kullanılması ilk kez 1976 yılında Contryman ve Heddle tarafından öne sürülmüştür (Bonassi ve ark. 2001). Daha sonra sitokinez-bloklama mikronukleus metodunun Fenech ve Morley (1985) tarafından geliştirilmesiyle, nukleus bölünmesini tamamlamış hücrelerdeki MN lar incelenmeye başlanmıştır. MN asentrik kromozom ya da kromatid kırıklarından ve tüm kromozomlar ya da kromatidlerin anafazda geri kalmasından dolayı (kalgın kromozom) telofazda oluşan kardeş nukleusun dışında rastlanan küçük nukleuslardır (Surrallés ve ark. 1995). Ayrıca multipolar anafaz ve telofaz da MN oluşumuna sebep olmaktadır (Topaktaş ve Rencüzoğulları, 2010). MN oluşumuna neden olabilen kromozom kaybı ya da kromozomların ayrılamaması (non-disjunction) kanser ve yaşlanmada gözlenen önemli olaylardan biridir. Bu durum, muhtemelen iğ iplikçiklerinde, sentromerde bozulma ya da metafazdan önce kromozom yapısının yoğunlaşması sonucu oluşmaktadır (Dellarco ve ark. 1985). Böylece, MN testi ile hem klastojenik hem de anöjenik etkiler belirlenebilmektedir (Kirsch-Volders ve ark. 1997; Norppa ve Falck, 2003). Yapılan çalışmalarda, kanser hastalarından alınan 5

27 1. GİRİŞ Fezel NİZAM periferal kan lenfositlerindeki MN frekansında belirlenen artış, kanser oluşan hedef dokudaki MN frekansı kadar bulunmuştur (Cheng ve ark. 1996; Duffaud ve ark. 1997). Ayrıca, Fenech ve ark. (1999) nın, uluslararası işbirliği ile yaptıkları insan mikronukleus projesindeki bulguları, MN ile kanser arasındaki ilişkiyi açıkça desteklemiştir. Bu çalışmada test maddesi olarak kullanılan Fluoksetin ile yapılan kanserojenite ve genotoksisite çalışmalarından bazıları şunlardır: Serotonin geri alımının spesifik inhibitörlerinden biri olan Fluoksetin in hücre proliferasyonu ve tümör gelişimi üzerine etkisi Tutton ve Barkla (1982) tarafından araştırılmıştır. Bu ajanın sıçanlarda dimetilhidrazin ile uyarılmış kolon tümöründe hücre bölünmesini baskıladığı ve insan kolonik tümörlerinin gelişimini 2/3 oranında yavaşlattığı bulunmuştur. Brandes ve Hermonat (1984) Fluoksetin in anti-östrojen bağlanma bölgesi/hücre içi histamin reseptörlerine (H 1C ) bağlanarak kanserojen varlığında malign gelişim promotörü olarak davrandığını belirtmişlerdir. Bendele ve ark. (1992) fare ve sıçanlara günlük dozda Fluoksetin vererek, Fluoksetin hidrokloridin kanserojen olup olmadığını araştırmışlardır. Deneyler sonucunda Fluoksetin in tümör ve neoplazma oluşumuna bir etkisi olmadığı belirlenmiştir. Fluoksetin, Seçici Serotonin Gerialım İnhibitörleri (SSGI) nin doğal ölümcül hücre aktivitesi (NKCA) üzerine olası etkilerini ölçmek amacıyla lenfoid hücre kültürü ile birlikte inkube edilmiştir. Antidepresanların NKCA yı in vivo ve in vitro kuvvetlendirici etkisi, farmakoterapi süresinde lenfoma hücreleri ile direk ilaç etkileşimini göstermektedir (Frank ve ark., 1999). Fluoksetin in, membran depolarizasyonu ile stimule edilen CRE-bağlantılı (Camp/Ca +2 cevaplayıcı eleman) gen transkripsiyonunu engellediği Schwaninger ve ark. (1995) tarafından bulunmuştur. Abdul ve ark. (1995) Fluoksetin in konsantrasyona bağlı olarak prostat kanser hücrelerinin proliferasyonunu engellediğini saptamışlardır. Steingart ve ark. (1995) nın yürüttüğü çalışmada, Fluoksetin in tümör promotorü ve antineoplastik ajan olduğunu gözlemişlerdir. 6

28 1. GİRİŞ Fezel NİZAM Spanová ve ark. (1997) Fluoksetin in sıçan glioblastoma ve insan nöroblastoma hücrelerinde apoptozu uyardığını belirtmişlerdir. Depresyon için Fluoksetin ile tedavi görmüş bayanlarda kardeş kromatid değişim analizi deneyleri Dündaröz ve ark. (1999) tarafından gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmada, depresyonlu bayan hastaların periferik lenfositlerinde kardeş kromatid değişim (KKD) yöntemi kullanılarak uzun süre Fluoksetin kullanımının DNA üzerine olası toksik etkisi araştırılmıştır. Sonuçlar, KKD sıklığının uzun süre Fluoksetin kullanan kadınlarda kontrol grubuna nazaran istatistiksel olarak anlamlı derecede arttığını göstermiştir. Slamon ve ark. (2001) sıçan C6 glioma hücre kültüründe alkalin comet testi kullanılarak 24 saat akut Fluoksetin muamelesinin DNA ya etkisini araştırmışlardır. Ayrıca ekzogen glutatyon (GSH) eklenmesi ve L-butionin sulfoksimin (BSO) ile ön muamelenin etkisine de bakılmıştır. Antidepresan konsantrasyonuna paralel olarak, C6 hücrelerindeki DNA hasarları da belli derecede artmıştır. Ayrıca ekzogen GSH ve BSO DNA hasarını artırmıştır. Lawlor ve ark. (2003) biyolojik çalışmalarda antidepresanların göğüs kanseri riskini artırabileceği bilgisinden yola çıkarak 31 öncü ilaç firmasının veri bankasını taramışlar ve Fluoksetin in herhangi bir kanser riski artışına neden olmadığını, fakat denemelerdeki kısa sürenin bağlantıyı belirlemek için yetersiz olduğunu belirtmişlerdir. Belowski ve ark. (2004) antidepresan ilaçların, farelerin makrofajlarında sitotoksisitesini incelemişler ve in vivo deneylerde Fluoksetin in tek dozda makrofajlarda sitotoksik etki gösterdiğini saptamışlardır. Aynı zamanda Fluoksetin ile dört gün boyunca muamele edilen makrofajlarda bu kimyasalın sitotoksik etkisinin azaldığı gözlenmiştir. Aynı ilaç 56 gün süreyle verildiğinde makrofajlarda herhangi bir sitotoksik etki gözlenmemiştir. Fluoksetin in vitro deneylerde makrofajlarda sitotoksik etki göstermemiştir. Sonuçta, bu antidepresan ilaç türü, dozu ve muamele süresine bağlı olarak, makrofajlarda sitotoksik aktivite göstermektedir. Arimochi ve Morita (2006) antidepresanların kolorektal tümör hücrelerinin proliferasyonu üzerindeki etkisini insan HT29 kolon karsinoma hücreleri ve 7

29 1. GİRİŞ Fezel NİZAM Fluoksetin kullanarak araştırmıştır. Sonuçlar, bu antidepresanın muamele süresine bağlı olarak hücre canlılığını düşürdüğünü göstermektedir. Bu sonuçlar, Fluoksetin in sitotoksik olabileceğini ve hücre döngüsü ilerlemesi ile insan HT29 kolon karsinoma hücrelerinde oksidatif olmayan apoptik ölümü uyarabileceğini göstermektedir. Thibaut ve Porte (2008) fibratların, antiinflamatuar ve antidepresan ilaçların balık hepatoma hücresi PLHC-1 üzerine etkileri araştırmışlardır. Bu çalışmada 11 farmasötik ilacın sitotoksisite ve sitokrom P450 1A (CYP1A) fonksiyon etkileşimine bakarak balık hepatoma hücre hattı üzerine etkisini araştırılmıştır. Test edilen farmasötikler arasındaki Fluoksetin sitotoksik etki göstermiştir. 24 saatlik 20 µm Fluoksetin muamelesinde hücre yaşayabilirliği %52 e düşmüştür. Brambilla ve Martelli (2009) nın yapmış oldukları derleme çalışmasında piyasadaki 472 farmasötiğin genotoksisite ve karsinogenezini araştırmışlar, seçici serotonin geri alım inhibitörleri grubundan Fluoksetin in bakteriyel mutasyon ve in vivo sitogenotoksisite testlerinde negatif sonuç verdiğini belirtmişlerdir. Brambilla ve ark. (2009), bir başka derleme çalışmasında antidepresan ve antipsikotiklerden olan Fluoksetin in Salmonella typhimurium ile geri mutasyon, sıçan primer hepatosit hücrelerinde UDS (zamansız DNA sentezi), fare lenfoma hücrelerinde gen mutasyonu, sıçan kemik iliği hücrelerinde in vivo KKD, fare ve sıçanlarda uzun süreli karsinogenez testlerinde negatif sonuç verdiğini açıklamışlardır. De Castro-Prado ve ark. (2009) Aspergillus nidulans ta Fluoksetin in rekombinogenik aktivitesini araştırmışlardır. Çalışma için Aspergillus nidulans ın heterozigot diploid ırkı tercih edilmiştir. Belirlenen konsantrasyonlardaki Fluoksetin homozigotlaşmayı artırmıştır. Yine aynı çalışmada Fluoksetin in supresor gen fonksiyon kaybına neden olarak, kanser hastalarında depresyon tedavisinden sonra sekonder malign oluşumunu uyardığı saptanmıştır. Yukarda belirtildiği gibi Fluoksetin ile bazı genotoksisite, kanserojenite ve sitotoksisite testlerinde negatif, bazı testlerde ise pozitif sonuç alınmıştır. Bu durum göz önünde bulundurulacak olursa, Fluoksetin in genotoksik risk taşıyıp taşımadığı hakkında daha belirgin sonuca varmak için başka testlerle de bu durumun bir kere 8

30 1. GİRİŞ Fezel NİZAM daha kontrol edilmesi gerekmektedir. Ayrıca Fluoksetin in KA ve MN testi ile genotoksisitesi de araştırılmamıştır. Bu araştırma, seçici serotonin geri alım inhibitörü olan Fluoksetin in insan periferal lenfositlerinde metabolik aktivatör yokluğunda ve varlığında genotoksik etkiye sahip olup olmadığını in vitro kardeş kromatid değişimi (KKD), kromozom aberasyonu (KA) ve mikronukleus (MN) testleri ile araştırmak amacıyla yürütülmüştür. 9

31 1. GİRİŞ Fezel NİZAM 10

32 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Fezel NİZAM 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bu çalışmada test maddesi olarak kullanılan ve bir antidepresan olan Fluoksetin Seçici Serotonin Gerialım İnhibitör grubuna girmektedir ( Antidepresanlar; Seçici Serotonin Gerialım İnhibitörleri (SSGİ), Monoamin Oksidaz İnhibitörleri (MAOİ), Trisiklik Antidepresanlar (TSA), Seçici Noradrenarjik Gerialım İnhibitörleri (SNGİ), Alfa-2 Adrenoreseptör Antagonistleri, Serotonerjik ve Norepinefrin İnhibitörleri, Norepinefrin-Dopamin Gerialım İnhibitörleri ve Etki Artırıcı Antidepresan İlaçlar olmak üzere sekiz gruba ayrılır (Shelton, 2003). Antidepresanlar ile yapılan genotoksisite, kanserojenite ve sitotoksisite çalışmaları aşağıda özetlenmiştir Seçici Serotonin Gerialım İnhibitörü (SSGİ) Grubu Antidepresanlar İle Yapılan Genotoksisite ve Kanserojenite Çalışmaları Kelly ve ark. (1999), Moorman ve ark. (2003), Fulton-Kehoe ve ark. (2006) göğüs kanseri oluş sıklığı ile antidepresan ilaç kullanımı arasındaki ilişkiyi araştırmışlardır. Çalışmada seçici serotonin gerialım inhibitörü kullanan hastalar seçilmiştir. Sonuçlar bu gruptaki antidepresan kullanımı ile bağlantılı göğüs kanserine yakalanma riski olmadığını ortaya çıkarmıştır Fluoksetin İle Yapılan Genotoksisite ve Kanserojenite Çalışmaları Serotonin geri alımının spesifik inhibitörlerinden biri olan Fluoksetin in hücre proliferasyonu ve tümör gelişimi üzerine etkisi Tutton ve ark. (1982) tarafından araştırılmıştır. Bu ajanın sıçanlarda dimetilhidrazin ile uyarılmış kolon tümöründe hücre bölünmesini baskıladığı ve insan kolonik tümörlerinin gelişimini 3 te 2 oranında yavaşlattığı bulunmuştur. Brandes ve Hermonat (1984) Fluoksetin in anti-östrojen bağlanma bölgesi/hücre içi histamin reseptörlerine (H 1C ) bağlandığını, kanserojen varlığında malign gelişim promotörü olarak davrandığını belirtmişlerdir. 11

33 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Fezel NİZAM Bendele ve ark. (1992) fare ve sıçanlara günlük dozda Fluoksetin vererek, Fluoksetin hidroklorid in kanserojen olup olmadığını araştırmışlardır. Deneyler sonucunda Fluoksetin in tümör ve neoplazma oluşumuna bir etkisi olmadığı belirlenmiştir. Abdul ve ark. (1995) Fluoksetin in konsantrasyona bağlı olarak prostat kanser hücrelerinin proliferasyonunu engellediğini gözlemlemişlerdir. Fluoksetin in, membran depolarizasyonu ile stimule edilen CRE-bağlantılı (Camp/Ca +2 cevaplayıcı eleman) gen transkripsiyonunu engellediği Schwaninger ve ark. (1995) tarafından bulunmuştur. Steingart ve Cotterchio (1995) nın yürüttüğü çalışmada, Fluoksetin in tümör promotorü ve antineoplastik ajan olduğu gözlemişlerdir. Spanova ve ark. (1997) Fluoksetin in sıçan glioblastoma ve insan nöroblastoma hücrelerinde apoptozu uyardığını belirtmişlerdir. Depresyon için Fluoksetin ile tedavi görmüş bayanlarda kardeş kromatid değişim analizi deneyleri Dündaröz ve ark. (1999) tarafından gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmada, depresyonlu bayan hastaların periferik lenfositlerinde kardeş kromatid değişim (KKD) yöntemi kullanılarak uzun süre Fluoksetin kullanımının DNA üzerine olası toksik etkisi araştırılmıştır. Sonuçlar, KKD sıklığının uzun süre Fluoksetin kullanan kadınlarda kontrol grubuna nazaran istatistiksel olarak anlamlı derecede arttığını göstermiştir. Fluoksetin, SSGI ların doğal ölümcül hücre aktivitesi (NKCA) üzerine olası etkilerini ölçmek amacıyla lenfoid hücre kültürü ile birlikte inkube edilmiştir. Antidepresanların NKCA yı in vivo ve in vitro kuvvetlendirici etkisi, farmakoterapi süresinde lenfoma hücreleri ile direk ilaç etkileşimi göstermektedir (Frank ve ark., 1999). Slamon ve ark. (2001) sıçan C6 glioma hücre kültüründe alkalin comet testi kullanılarak 24 saat akut Fluoksetin muamelesinin DNA ya etkisini araştırmışlardır. Ayrıca ekzogen glutatyon (GSH) eklenmesi ve L-butionin sulfoksimin (BSO) ile ön muamele etkisine de bakılmıştır. Antidepresan konsantrasyonuna paralel olarak, C6 hücrelerindeki DNA hasarları da belli derecede artmıştır. Ayrıca ekzogen GSH ve BSO DNA hasarını artırmıştır. 12

34 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Fezel NİZAM Lawlor ve ark. (2003) biyolojik çalışmalarda antidepresanların göğüs kanseri riskini artırabileceği bilgisinden yola çıkarak 31 öncü ilaç firmasının veri bankasını taramışlar ve Fluoksetin in herhangi bir kanser riski artışına neden olmadığını, fakat denemelerdeki kısa sürenin bağlantıyı belirlemek için yetersiz olduğunu belirtmişlerdir. Belowski ve ark. (2004) antidepresan ilaçların, farelerin makrofajlarında sitotoksisitesini incelemişler ve in vivo deneylerde Fluoksetin in tek dozda makrofajlarda sitotoksik etki gösterdiğini saptamışlardır. Aynı zamanda Fluoksetin ile dört gün boyunca muamele edilen makrofajlarda sitotoksik etkinin azaldığı gözlenmiştir. Aynı ilaç 56 gün süreyle verildiğinde makrofajlarda herhangi bir sitotoksik etki gözlenmemiştir. Fluoksetin in vitro deneylerde makrofajlarda sitotoksik etki göstermemiştir. Sonuçta, bu antidepresan ilaç türü, dozu ve muamele süresine bağlı olarak, makrofajlarda sitotoksik aktivite göstermektedir. Arimochi ve Morita (2006) antidepresanların kolorektal tümör hücrelerinin proliferasyonu üzerindeki etkisini insan HT29 kolon karsinoma hücreleri ve Fluoksetin kullanarak araştırmışlardır. Sonuçlar, bu antidepresanın muamele süresine bağlı olarak hücre canlılığını düşürdüğünü göstermiştir. Bu sonuçlar, Fluoksetin in sitotoksik olabileceğini ve hücre döngüsü ilerlemesi ile insan HT29 kolon karsinoma hücrelerinde oksidatif olmayan apoptik ölümü uyarabileceğini göstermiştir. Thibaut ve Porte (2008) fibratların, antiinflamatuar ve antidepresan ilaçların balık hepatoma hücresi PLHC-1 üzerine etkileri araştırmışlardır. Bu çalışmada 11 farmasötik ilacın sitotoksisite ve sitokrom P450 1A (CYP1A) fonksiyon etkileşimine bakarak balık hepatoma hücre sırası üzerine etkisi araştırılmıştır. Test edilen farmasötikler arasındaki Fluoksetin sitotoksik etki göstermiştir. 24 saatlik 20 µm Fluoksetin muamelesinde hücre yaşayabilirliği %52 e düşmüştür. Brambilla ve Martelli (2009), yapmış oldukları derleme çalışmasında kullanımda olan 472 farmasötiğin genotoksisite ve kanserogenezini araştırmışlar, seçici serotonin geri alım inhibitörleri grubundan Fluoksetin in bakteriyel mutasyon ve in vivo sitogenotoksisite testlerinde negatif sonuç verdiğini belirtmişlerdir. Brambilla ve ark. (2009), bir başka derleme çalışmasında antidepresan ve antipsikotiklerden olan Fluoksetin in S. typhimurium ile geri mutasyon, sıçan primer 13

35 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Fezel NİZAM hepatosit hücrelerinde UDS (zamansız DNA sentezi), fare lenfoma hücrelerinde gen mutasyonu, sıçan kemik iliği hücrelerinde in vivo KKD, fare ve sıçanlarda uzun süreli kanserogenez testlerinde negatif sonuç verdiğini açıklamışlardır. De Castro-Prado ve ark. (2009) Aspergillus nidulans ta Fluoksetin in rekombinogenik aktivitesini araştırmışlardır. Çalışma için Aspergillus nidulans ın heterozigot diploid ırkı tercih edilmiştir. Belirlenen konsantrasyonlardaki Fluoksetin homozigotlaşmayı artırmıştır. Yani rekombinasyonu uyarmıştır. Fluoksetin in supresor gen fonksiyon kaybına neden olarak, kanser hastalarında depresyon tedavisinden sonra sekonder malign oluşumunu uyardığı saptanmıştır Fluvoksamin İle Yapılan Genotoksisite ve Kanserojenite Çalışmaları Kronik antidepresan Fluvoksamin muamelesinin, olgun sıçan hipokampusunda proliferasyonu ve dolayısıyla nörogenezi artırdığı Malberg ve ark. (2000) tarafından gözlenmiştir. Belowski ve ark. (2004) antidepresan ilaçların, farelerin makrofajlarında sitotoksisitesini incelemişler ve in vivo deneylerde Fluvoksamin in tek dozda makrofajlarda sitotoksik etki gösterdiğini saptamışlardır. Aynı zamanda Fluvoksamin ile dört gün boyunca muamele edilen makrofajlarda sitotoksik etki azalmıştır. Aynı ilaçlar 56 gün süreyle verildiğinde makrofajlarda herhangi bir sitotoksik etki gözlenmemiştir. Fluvoksamin, in vitro deneylerde makrofajlarda sitotoksik etki göstermemiştir. Sonuçta, bu antidepresan ilaç türü, dozu ve muamele süresine bağlı olarak, makrofajlarda sitotoksik aktivite göstermiştir. Brambilla ve Martelli (2009), yapmış oldukları derleme çalışmasında pazarlanmış 472 farmasötiğin genotoksisite ve kanserogenezini araştırmışlar, seçici serotonin geri alım inhibitörleri grubundan Fluvoksamin in bakteriyel mutasyon ve in vivo sitogenotoksisite testlerinde negatif sonuç verdiğini belirtmişlerdir. Ayrıca Fluvoksamin in in vitro sitogenotoksisite testlerde de etkisiz olduğu gösterilmiştir. Bu ilacın aynı zamanda hamsterlar üzerinde de kanserojenik etkisinin olmadığı bildirilmiştir. 14

36 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Fezel NİZAM Paroksetin İle Yapılan Genotoksisite ve Kanserojenite Çalışmaları Spanova ve ark. (1997) Paroksetin in sıçan glioblastoma ve insan nöroblastoma hücrelerinde apoptozu uyardığını belirtmişlerdir. Antidepresan tedavisi ile göğüs kanseri riski arasındaki ilişki Cotterchio ve ark. (2000) tarafından araştırılmıştır. Bu çalışmada, iki seneden uzun süre Paroksetin kullanımının göğüs kanseri riskinin artışına neden olabileceği belirlenmiştir. Green (2003) Paroksetin üzerine yaptığı genel çalışmada, Paroksetinin bakteriyel mutasyon testi, fare lenfoma testi, DNA sentez testleri, fare kemik iliğinde kromozom aberasyon testi ve in vitro insan lenfositlerindeki testlerde gözlenebilir genotoksik etkisi olmadığını kanıtlamıştır. Farklı Seçici Gerialım İnhibitörleri nin kanser hücreleri üzerindeki sitotoksisitesi Rosetti ve ark. (2006) tarafından araştırılmıştır. Çalışma serotonin geri alımında spesifik olan Paroksetin in, çeşitli kemirici ve insan kanser hücre kültürlerinin büyümesini engelleme yeteneklerini saptamak için yürütülmüştür. Sonuçta Paroksetin in kemirici ve insan orijinli tümör hücrelerinde sitotoksik olduğu saptanmıştır. İnsan osteosarkoma hücrelerinde Paroksetin ile uyarılmış apoptoz (p38 MAP kinaz ve kaspaz-3 yolaklarındaki aktivasyon) Chou ve ark. (2008) tarafından araştırılmıştır. Bu çalışma sonucunda insan osteosarkoma hücre kültüründe (MG63), Paroksetin; konsantrasyon ve zamana bağlı olarak hücrenin yaşayabilirliğini azaltmıştır. Paroksetin in, apoptoza neden olup olmadığı propidium iodid boyama metoduyla belirleme çalışması yapılmış ve çalışma sonucunda test maddesinin apoptoza neden olduğu ve kaspaz-3 aktivitesini artırdığı saptanmıştır. Ayrıca Paroksetin endoplazmik retikulumda bulunan intrasellüler Ca +2 naklini ve ekstrasellüler kültürden Ca +2 akışı ile ilişkili [Ca +2 ] i artışını uyarmıştır. Sonuçta Paroksetin in MG63 hücrelerinde p38 MAPK-bağlantılı kaspaz-3 aktivasyonu aracılığı ile Ca +2 den bağımsız apoptozu uyardığı saptanmıştır. Thibaut ve Porte (2008) fibratların, antiinflamatuar ve antidepresan ilaçların balık hepatoma hücresi PLHC-1 üzerine etkilerini araştırmışlardır. Bu çalışmada 11 farmasötik ilacın sitotoksisite ve sitokrom P450 1A (CYP1A) fonksiyon etkileşimine 15

37 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Fezel NİZAM bakarak balık hepatoma hücresi üzerine etkisi araştırılmıştır. Test edilen farmasötikler arasındaki Paroksetin sitotoksik etki göstermiştir. 24 saatlik 20 µm Paroksetin muamelesinde hücre yaşayabilirliği %6 düşmüştür. Brambilla ve Martelli (2009) nin yapmış oldukları derleme çalışmasında kullanılan 472 farmasötiğin genotoksisite ve kanserogenezini araştırmışlardır. Bu çalışmada yer alan Paroksetin bakteriyel mutasyon, in vivo ve in vitro sitogenotoksisite testinde ve sıçan lenfoma testi (MLA) nde negatif sonuçlar vermiştir. Bu ilacın dominant letal etkisinin de olmadığı belirlenmiştir. Sıçanlarda yapılan kanserogenez testinin sonucunun ise pozitif olduğu bildirilmiştir Sertralin İle Yapılan Genotoksisite ve Kanserojenite Çalışmaları Seçici serotonin geri alım inhibitörü grubu antidepresanların en yaygın kullanıma sahip olanı Sertralindir. Davies ve Kluwe (1998) Sertralin ile muamele edilmiş fareler üzerinde yapılan üreme çalışmalarında yeni doğmuş yavru sayısı ve yavruların büyümesinde azalma gözlemişlerdir. Buna rağmen yapılan bir dizi test sonucunda Sertralinin genotoksik olmadığı ortaya çıkmıştır. Yine Sertralin in klastojenitesi Bozkurt ve ark. (2004) tarafından araştırılmıştır. Bu araştırıcılar yaygın anksiyete bozukluğu (sıkıntı, kaygı ve endişe duygularını kontrol altına alamama durumu) ve majör depresyon hastaları ile sağlıklı gönüllü grupları arasında (Sertralin ile tedavi edilen ve edilmeyen) KKD frekansı bakımından istatistiksel olarak anlamlı farklılıklar bulmuşlardır. Her iki hasta grubu, sağlıklı kontrol gruplarına göre yüksek KKD frekansı göstermişlerdir. Grupları arasında kromozom aberasyonu (KA) frekansı bakımından ise istatistiksel farklar gözlenmemiştir. Brambilla ve Martelli (2009), pazarlanmış 472 farmasötiğin genotoksisite ve kanserojenite araştırmalarında Sertralin in bakteriyel mutasyon, in vivo ve in vitro sitogenotoksisite testlerinde negatif sonuç, fare ve sıçanlarda yapılan kanserojenite testinde pozitif sonuç verdiğini açıklamışlardır. 16

38 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Fezel NİZAM Sitalopram İle Yapılan Genotoksisite ve Kanserojenite Çalışmaları Serotonin geri alımının spesifik inhibitörlerinden biri olan Sitalopram ın hücre proliferasyonu ve tümör gelişimi üzerine etkisi Tutton ve Barkla (1982) tarafından araştırılmıştır. Bu ajanın sıçanlarda dimetilhidrazin ile uyarılmış kolon tümöründe hücre bölünmesini baskıladığı ve insan kolonik tümörlerinin gelişimini 3 te 2 oranında yavaşlattığı bulunmuştur. Bir başka çalışmada Xia ve ark. (1999) Sitalopramın insan akut myeloid lösemi HL-60 hücrelerinde apoptotik hücre ölümünü uyardığını gözlemişlerdir. Antidepresan tarafından uyarılmış apoptoz, elektron mikroskobu ve konvansiyonel agaroz jel elektroforezi ile belirlenmiştir. Antidepresanlar tarafından uyarılmış kaspaz aktivitesi, intrasellüler reaktif oksijen türünün (ROS) fazla miktarda oluşumuna yol açmıştır. Sonuçlar antidepresanlardan Sitalopramın kaspaz-3 bağımlı yolaklar aracılığı ile apoptozu uyardığını ve bu durumun antineoplastik etki mekanizması hakkında ipucu verdiğini göstermiştir Venflaksin ile Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Farklı Seçici Gerialım İnhibitörleri nin kanser hücreleri üzerindeki sitotoksisitesi Rosetti ve ark. (2006) tarafından araştırılmıştır. Çalışma norepinefrin ile dopamin taşınmasını engelleyen Venflaksin in çeşitli kemirici ve insan kanser hücre kültürlerinin büyümesini engelleme yeteneklerine bakmak için yürütülmüştür. Sonuçta Venflaksin in kemirici ve insan orijinli tümör hücrelerinde sitotoksik olmadığı saptanmıştır. 17

39 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Fezel NİZAM 2.2.Monoamin Oksidaz İnhibitörü (MAOİ) Grubu Antidepresanlar İle Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Fenelzin İle Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Brambilla ve ark. (1982) beş hidrazin türevi antidepresanın genotoksik aktivitesini, bir dizi kısa süreli in vivo ve in vitro test ile incelemişlerdir. Bu beş antidepresan ajandan biri hidrazin grubu taşıyan Fenelzin in intraperitonal veya oral yolla verildiğinde, farenin karaciğer ve akciğer hücre kromozomlarında DNA fragmentleri oluşturduğu ve farelerin kemik iliği hücrelerinde KKD oluşumunu uyardığı saptanmıştır. Steingart ve Cotterchio (1995), antidepresanlar ile kanserin bağlantısı veya antidepresanların neoplastik gelişim üzerine olan etkisini insanlar ve deney hayvanları üzerinde araştırmışlardır. Sonuçta Fenelzin in göğüs kanseri riskini artırabildiğini gözlemişlerdir. Brambilla ve Martelli (2009), pazarlanmış 472 farmasötiğin genotoksisite ve kanserojenitesini araştırdıkları çalışmalarında monoaminoksidaz inhibitörleri grubunda yer alan Fenelzin in, bakteriyel mutasyon testinin üç deneyinden ikisinde pozitif, birinde negatif sonuç verdiğini belirtmişlerdir. Ayrıca araştırıcılar bu ilacın in vivo sitogenotoksisite testinde pozitif sonuç verdiğini belirtmişlerdir İproniazid İle Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Brambilla ve ark. (1982) beş hidrazin türevi antidepresandan biri olan İproniazid in genotoksik aktivitesini, bir dizi kısa süreli in vivo ve in vitro test ile incelemişlerdir. Çalışmada, İproniazid intraperitonal veya oral yolla verildiğinde, farenin karaciğer ve akciğer hücre kromozomlarında DNA fragmentleri oluşmadığı; fakat kemik iliği hücrelerinde KKD oluşumunu uyardığı saptanmıştır. Brambilla ve Martelli (2009), pazarlanmış 472 farmasötiğin genotoksisite ve kanserojenezini açıklayan çalışmalarında monoaminoksidaz grubundan İproniazid ile yapılan araştırmalarda, bakteriyel mutasyon testinde 2 denemede de negatif, in vivo 18

40 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Fezel NİZAM sitogenotoksisite deneylerde ise pozitif sonuç alındığını belirtmişlerdir İzokarboksazid İle Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Brambilla ve ark. (1982) beş hidrazin türevi antidepresanın genotoksik aktivitesini, bir dizi kısa süreli in vivo ve in vitro test ile incelemişlerdir. Bu beş hidrazin grubu taşıyan antidepresan ajandan biri de İzokarboksazid dir. Çalışma sonucunda, intraperitonal veya oral yolla verilen İzokarboksazid in, farenin karaciğer ve akciğer hücre kromozomlarında DNA kırılmalarını ve kemik iliği hücrelerinde KKD oluşumunu uyardığı saptanmıştır. Brambilla ve Martelli (2009), pazarlanmış 472 farmasötiğin genotoksisite ve kanserogenezini açıklayan çalışmalarında monoaminoksidaz grubundan İzokarboksazid ile yapılan araştırmalarda, bakteriyel mutasyon testinde 2 denemede de negatif, in vivo sitogenotoksisite deneylerde ise pozitif sonuç alındığını belirtmişlerdir Moklobemid İle Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Moklobemid, Ames testi, sıçan kemik iliğinde mikronukleus testi, Çin hemster V79 hücrelerinde, sıçan hepatositlerinde ve insan lenfositlerinde yapılan çalışmalarda genotoksik etki göstermemiştir ( Mebanazin İle Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Brambilla ve ark. (1982) beş hidrazin türevi antidepresanın genotoksik aktivitesini, bir dizi kısa süreli in vivo ve in vitro test ile incelemişlerdir. Beş antidepresan ajandan biri Mebanazin dir. Bu çalışmanın sonuçlarına göre Mebanazin intraperitonal veya oral yolla verildiğinde, farenin karaciğer ve akciğer hücre kromozomlarında DNA fragmentleri oluşturmuş; fakat kemik iliği hücrelerinde KKD oluşumunu uyarmamıştır. 19

41 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Fezel NİZAM Nialamid ile Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Brambilla ve ark. (1982) beş hidrazin türevi antidepresanın genotoksik aktivitesini, bir dizi kısa süreli in vivo ve in vitro test ile incelemişlerdir. Nialamid bu hidrazin grubu taşıyan beş antidepresan ajandan biridir. Bu çalışmada, Nialamid intraperitonal veya oral yolla verildiğinde, farenin karaciğer ve akciğer hücrelerinde DNA kırılmalarını, kemik iliği hücrelerinde de KKD oluşumunu uyardığı saptanmıştır Selejilin ile Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Parkinson hastalığı ve depresyon tedavisinde kullanılan Selejilin hidroklorit ile yapılan in vivo sıçan kemik iliği mikronukleus testi ile bu ilacın insan klinik dozunda klastojenik ve sitotoksik potansiyeli Subramanya ve ark. (1993) tarafından araştırılmış ve sonuçlar bu ilacın test edilen dozlarda mikronukleus oluşumunu uyarmadığını ve sitotoksik olmadığını göstermiştir Tranilsipramin İle Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Slamon ve ark. (2001) sıçan C6 glioma hücre kültüründe alkalin comet testi kullanılarak 24 saat akut Tranilsipramin muamelesinin DNA ya etkisini araştırmışlardır. Antidepresan konsantrasyonuna paralel olarak, C6 hücrelerindeki DNA hasarlarının da belli derecede arttığı saptanmıştır. 2.3.Trisiklik Antidepresan (TSA) Grubu İle Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Kelly ve ark. (1999) ve Fulton-Kehoe ve ark. (2006) göğüs kanseri oluş sıklığı ile antidepresan ilaç kullanımı arasındaki ilişkiyi araştırmışlardır. Çalışmada trisiklik antidepresan kullanan vakalar seçilmiştir. Sonuçlar bu gruptaki antidepresan kullanımı ile bağlantılı göğüs kanserine yakalanma riski olmadığını ortaya çıkarmıştır. 20

42 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Fezel NİZAM Tamim ve ark.(2006) geçmiş yirmi yılda TSA ya maruz kalan bayanlarda göğüs kanseri riskinin artışını destekleyici kanıtlar bulamamışlardır Amitriptilin İle Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Brandes ve Hermonat (1984) Amitriptilin anti-östrojen bağlanma bölgesi/hücre içi histamin reseptörlerine (H 1C ) bağlandığını, kanserojen varlığında malign gelişim promotörü olarak davrandığını belirtmişlerdir. Amitriptili nin in vitro insan lenfosit kültüründe genotoksisite ve sitotoksisitesi Saxena ve Ahuja (1988) tarafından araştırılmıştır. Bu çalışmada plazma seviyesinde denenen tüm konsantrasyonlarda Amitriptilin in genotoksik olmadığı gözlenmiştir. Ancak kromozom aberasyonu ve kardeş kromatid değişim frekansı yüksek konsantrasyonlarda plazma seviyesine göre 4-40 katı artış göstermiş, mitotik indeks ise herhangi bir konsantrasyonda değişim göstermemiştir. Van Schaik ve Graf (1991) beş trisiklik antidepresanın Drosophila melanogaster de somatik kanat mutasyonu ve rekombinasyonu testleri ile genotoksisitesini araştırmışlardır. Bu çalışmada Amitriptilin denenmiştir. Sonuçlar, Amitriptilin in 100 mm a kadarki konsantrasyonlarda genotoksik olmadığını göstermiştir. Amitriptilin in, membran depolarizasyonu ile stimule edilen CRE-bağlantılı (Camp/Ca +2 cevaplayıcı eleman) gen transkripsiyonunu engellediği Schwaninger ve ark. (1995) tarafından bulunmuştur. Steingart ve Cotterchio (1995), antidepresanlar ile kanserin bağlantısı veya antidepresanların neoplastik gelişim üzerine olan etkisini tüm insanlar ve deney hayvanları üzerinde araştırmışlardır. İnsanlar üzerinde yürütülen çalışmada Amitriptilin ile karaciğer kanseri arasında bir ilişki bulunmuş fakat pankreas kanseri ile herhangi bir ilişki bulunamamıştır. Ayrıca Amitriptilin in göğüs kanseri riskini artırabildiği ve tümör gelişimini uyardığı gözlenmiştir. Slamon ve ark. (2001), sıçan C6 glioma hücre kültüründe alkalin comet testi kullanılarak 24 saat akut Amitriptilin muamelesinin DNA ya etkisini araştırmışlardır. Antidepresan konsantrasyonuna paralel olarak, C6 hücrelerindeki DNA hasarları da 21

43 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Fezel NİZAM belli derecede artmıştır. Lawlor ve ark. (2003), biyolojik çalışmalarda antidepresanların göğüs kanseri riskini artırabileceği bilgisinden yola çıkarak 31 öncü ilaç firmasının veri bankası taramışlar ve Amitriptilin in herhangi bir kanser riski artışına neden olmadığını, fakat denemelerdeki kısa sürenin bağlantıyı belirlemek için yetersiz olduğunu belirtmişlerdir. Arimochi ve Morita (2006) antidepresanların kolorektal tümör hücrelerinin proliferasyonu üzerindeki etkisini insan HT29 kolon karsinoma hücreleri ve trisiklik antidepresanlardan Amitriptilin kullanarak araştırmışlardır. Sonuçlar, bu antidepresanın muamele süresine bağlı olarak hücre canlılığını düşürdüğünü göstermektedir Desipramin İle Yapılan Genotoksisite ve Kanserojenite Çalışmaları Van Schaik ve Graf (1991) beş trisiklik antidepresanın Drosophila melanogaster de somatik kanat mutasyonu ve rekombinasyonu testleri ile genotoksisitesini araştırmışlardır. Bu çalışmada, Desipramin in 1 mm ın üstündeki konsantrasyonlarda açıkça genotoksik olduğu saptanmıştır. Desipramin in, HIT VE PC-12 hücrelerinde membran depolarizasyonu ile stimule edilen CRE-bağlanılı (Camp/Ca +2 cevaplayıcı eleman) gen transkripsiyonunu engellediği Schwaninger ve ark. (1995) tarafından bulunmuştur. Ayrıca camp tarafından uyarıldıktan sonra, Desipramin in transkripsiyon üzerinde bir etkisi olmadığı saptanmıştır. Steingart ve Cotterchio (1995), antidepresanlar ile kanserin bağlantısı veya antidepresanların neoplastik gelişim üzerine olan etkisini insanlar ve deney hayvanları üzerinde araştırmışlar ve Desipramin in göğüs kanseri riskini artırabileceğini gözlemişlerdir. Fare kemik iliğinde in vivo Desipramin muamelesi ile oluşan KKD, Panigua- Perez ve ark. (2002) tarafından araştırılmış, sonuçlar, bu kimyasalın bileşiklerin etkilerinin doza bağlı durum gösterdiğini ve en yüksek konsantrasyonda KKD yi kontrole nazaran 4 kat artırdığını, mitotik indeksi ise düşürdüğünü göstermiştir. 22

44 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Fezel NİZAM Hücre proliferasyonu ise bu kimyasaldan etkilenmemiştir. Bu sonuçlar Desipramin in genotoksik potansiyeli olduğunu göstermektedir. Belowski ve ark. (2004) antidepresan ilaçların, farelerin makrofajlarında sitotoksisitesini incelemişler ve in vivo deneylerde Desipramin ile dört gün boyunca muamele edilen makrofajlarda sitotoksik etkinin azaldığını, aynı ilaç ile 56 gün süreyle muamele edildiğinde ise makrofajlarda herhangi bir sitotoksik etki gözlenmediğini belirtmişlerdir. Desipramin in vitro deneylerde makrofajlarda sitotoksik etki göstermemiştir. Sonuçta, bu ilaç türü, dozu ve muamele süresine bağlı olarak, makrofajlarda sitotoksik aktivite göstermemiştir. Arimochi ve Morita (2006) antidepresanların kolorektal tümör hücrelerinin proliferasyonu üzerindeki etkisini insan HT29 kolon karsinoma hücreleri ve trisiklik antidepresanlardan Desipramin kullanarak araştırmışlardır. Sonuçlar, bu antidepresanın muamele süresine bağlı olarak hücre canlılığını düşürdüğünü göstermiştir. Ayrıca ileri çalışmalar, Desipramin in glutatyon (GSH) tarafından azaltılmış katalaz veya N-asetilsistein (NAC) ile engellenebilen apoptotik hücre ölümüne neden olduğunu göstermiştir. Dahası Desipramin in ilaç konsantrasyonuna bağlı olarak hücre döngüsü ilerlemesini G0/G1 fazında veya G2/M fazında durdurduğu ortaya çıkmıştır. Bu sonuçlar, Desipraminin sitotoksik olabileceğini ve hücre döngüsü ilerlemesi ile insan HT29 kolon karsinoma hücrelerinde oksidatif olmayan apoptotik ölümü uyarabileceğini göstermiştir. Abdel-Razaq ve ark. (2007) antidepresanların Çin hamster yumurtalık hücrelerinde (Chinese hamster ovary = CHO), gen transkripsiyonunda siklikampcevabı üzerindeki etkilerini araştırmışlardır. Araştırmada Desipramin in, in vitro ortamda monoamin ve siklikamp- bağımsız mekanizmalar yoluyla gen transkripsiyonunu değiştirebileceği bulunmuştur. Farelerde Desipramin tarafından uyarılmış mikronukleus oluşumu Madrigal- Brujaidor ve ark. (2008) tarafından araştırılmış, uygulamanın ilk haftasından itibaren mikronukleuslu polikromatik eritrosit (MNPE) ve mikronukleuslu normokromatik eritrosit (MNNE) oluşumunda dikkate değer bir artış olduğu saptanmıştır. Dördüncü haftada Desipramin in etkisi kontrol grubuna göre yaklaşık yedi kat fazla olmuştur. Ayrıca çalışılan kimyasalın kemik iliğinde mitoz bölünmeyi olumsuz yönde 23

45 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Fezel NİZAM etkilediği saptanmıştır. Brambilla ve Martelli (2009), piyasadaki 472 farmasötiğin genotoksisite ve kanserogenezini araştırıldığı bir çalışma yayınlamışlardır. Bu çalışmada trisiklik antidepresanlar (TCA) grubundan Desipramin in bakteriyel mutasyon testinde negatif, in vivo sitogenotoksisite testinde pozitif, farede kanserogenez testi deneylerinin birinde pozitif, diğerinde negatif sonuç verdiği belirtilmiştir. Madrigal-Bujaidar ve ark. (2010) farede İmipramin ve Desipramin tarafından uyarılan kromozomal aberasyonları araştırmışlardır. Çalışmanın sonucunda Desipramin için test edilen dozlarda kromozom hasarında artış olduğu belirlenmiştir Doksepin İle Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Doksepinin, membran depolarizasyonu ile stimule edilen CRE-bağlantılı (Camp/Ca +2 cevaplayıcı eleman) gen transkripsiyonunu engellediği Schwaninger ve ark. (1995) tarafından bulunmuştur İmipramin İle Yapılan Genotoksisite, Sitotoksisite ve Kanserojenite Çalışmaları Psikiyatrik hastalarda İmipramin in kromozomlar üzerine olan etkileri Fu ve ark. (1978) tarafından araştırılmış ve İmipramin in hücre proliferasyonu üzerinde olumsuz etkisinin olduğu, fakat kromozomal anormallik frekansında artış yapmadığı saptanmıştır. Kullanılan trisiklik antidepresanların sitotoksik aktivitesini araştıran Sauter (1987), bu gruptan İmipramin in renal kanser hücrelerinde bölünmeyi durdurduğu saptamıştır. İmipramin in insan lenfosit kültüründeki genotoksisitesini araştıran Saxena ve Ahuja (1988), mitoz bölünmenin bu kimyasaldan etkilenmediğini fakat en üst plazma düzeyindeki ve bu seviyeden daha yüksek dozlarda kromozomal hasarlarda artışa neden olduğunu, kardeş kromatid değişimi (KKD) frekansının ise sadece 24

46 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Fezel NİZAM plazma düzeyinin üstündeki konsantrasyonlarda arttığını saptamışlardır. Mitotik indeks herhangi bir konsantrasyonda değişim göstermemiştir. Van Schaik ve Graf (1991) beş trisiklik antidepresanın Drosophila melanogaster de somatik kanat mutasyonu ve rekombinasyonu testleri ile genotoksisitesini araştırmışlardır. Bu çalışmada elde edilen sonuçlara göre İmipramin 1 mm ın üstündeki konsantrasyonlarda açıkça genotoksik etki göstermiştir. İmipramin in, membran depolarizasyonu ile stimule edilen CRE-bağlanılı (Camp/Ca +2 cevaplayıcı eleman) gen transkripsiyonunu engellediği Schwaninger ve ark. (1995) tarafından bulunmuştur. Bir başka çalışmada Xia ve ark. (1999) İmipramin in insan akut myeloid lösemi HL-60 hücrelerinde apoptotik hücre ölümünü uyardığını gözlemişlerdir. Antidepresan tarafından uyarılmış apoptoz, elektron mikroskobu ve konvansiyonel agaroz jel elektroforezi ile belirlenmiştir. Antidepresanlar tarafından uyarılmış kaspaz aktivitesi, intrasellüler reaktif oksijen türünün (ROS) artmasına neden olmuştur. Sonuçlar antidepresanlardan İmipramin in kaspaz-3 bağımlı yolaklar aracılığı ile apoptozu teşvik ettiğini ve bu durumun antineoplastik etki mekanizması hakkında ipucu verdiğini göstermiştir. Slamon ve ark. (2001) sıçan C6 glioma hücre kültüründe alkalin comet testi kullanılarak 24 saat akut İmipramin muamelesinin DNA ya etkisini araştırmışlardır. İmipramin konsantrasyonuna paralel olarak, C6 hücrelerindeki DNA hasarları da belli derecede artmıştır. Dündaröz ve ark. (2002), üriner kontrolün sağlanması gereken yaştan sonra istemsiz idrar kaçırma durumu (primer nokturnal enürezis) için İmipramin ile tedavi edilen çocuklarda comet testi ile yapılan çalışmada DNA hasarlarının istatistiksel olarak fazla olduğunu (P< 0.05) açıklamışlardır. In vivo çalışılmış fare kemik iliği hücrelerinde İmipramin in KKD yi uyarıcı etkisi olup olmadığı, Paniagua-Perez ve ark. (2002) tarafından incelenmiştir. Sonuçlar, test maddesinin ikinci dozdan itibaren (20mg/kg) KKD indükleyicisi olduğunu göstermiştir. Bu çalışmada bileşiklerin etkilerinin doza bağlı durum gösterdiği ve en yüksek dozun kardeş kromatid değişimini kontrol grubuna göre dört kat artırdığı saptanmıştır. Hücre proliferasyonu etkilenmemiş, fakat mitotik indeks en 25

47 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Fezel NİZAM yüksek doz muamelesi ile düşmüştür. Lawlor ve ark. (2003) biyolojik çalışmalarda antidepresanların göğüs kanseri riskini artırabileceği bilgisinden yola çıkarak 31 öncü ilaç firmasının veri bankasını taramışlar ve İmipramin in herhangi bir kanser riski artışına neden olmadığını, fakat denemelerdeki kısa sürenin, bağlantıyı belirlemek için yetersiz olduğunu belirtmişlerdir. Arimochi ve Morita (2006) antidepresanların kolorektal tümör hücrelerinin proliferasyonu üzerindeki etkisini insan HT29 kolon karsinoma hücreleri ve trisiklik antidepresanlardan İmipramin kullanarak araştırmışlardır. Sonuçlar, bu antidepresanın muamele süresine bağlı olarak hücre canlılığını düşürdüğünü göstermiştir. Farelerde İmipramin tarafından uyarılmış mikronukleus oluşumu Madrigal- Brujaidor ve ark. (2008) tarafından araştırılmış ve uygulamanın ilk haftasından itibaren mikronukleuslu polikromatik eritrosit (MNPE) ve mikronukleuslu normokromatik eritrosit (MNNE) oluşumunda dikkate değer bir artış olduğu saptanmıştır. Dördüncü haftada İmipramin, kontrol grubuna göre üç katı mikronukleus oluşumuna neden olmuştur. Ayrıca çalışılan kimyasalın kemik iliğinde mitoz bölünmeyi olumsuz yönde etkilediği saptanmıştır. İmipramin, bakteriyel mutasyon testinde negatif, in vitro sitogenotoksisite testinde üç denemenin birinde pozitif, birinde negatif, birinde de belirsiz, in vivo sitogenotoksisite testinde pozitif sonuç vermiştir (Brambilla ve Martelli, 2009). Madrigal-Bujaidar ve ark. (2010) farede İmipramin ve Desipramin tarafından uyarılan kromozomal aberasyonlarını araştırmışlardır. Çalışmanın sonucunda İmipramin için test edilen dozlarda kromozom hasarında belli bir artış olduğu belirlenmiştir Karbamazepin İle Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Çelik (2006), Karbamazepin in genotoksisitesini in vitro lenfosit kültüründe mikronukleus testi ile araştırmış ve bu ilacın en düşük doz (6 μg/ml) hariç diğer dozlarda genotoksik olduğunu ve doz ile bağlantılı olarak proliferasyon indeksinin 26

48 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Fezel NİZAM düştüğünü göstermiştir. Karbamazepin in Drosophila kanat nokta mutasyon testi sonucunda, en yüksek iki dozda kanat başına oluşan mutasyonlara bakarak genotoksik olduğu ve Drosophila melanogaster larvalarında da toksik etki yarattığı Sarıkaya ve Yüksel (2008) tarafından gösterilmiştir Klomipramin İle Yapılan Genotoksisite ve Kanserojenite Çalışmaları Kullanılan trisiklik antidepresanların sitotoksik aktivitesini araştıran Sauter (1987), bu gruptan Klomipramin in renal kanser hücrelerinde gelişim inhibisyonu gösterdiğini saptamıştır. Klomipramin, membran depolarizasyonu ile stimule edilen CRE-bağlanılı (Camp/Ca +2 cevaplayıcı eleman) gen transkripsiyonunu engellediği Schwaninger ve ark. (1995) tarafından bulunmuştur. Steingart ve Cotterchio (1995) nın yürüttüğü çalışmada, Klomipramin in tümör promotorü ve antineoplastik ajan olduğu gözlenmiştir. Xia ve ark. (1999), Klomipramin in insan akut myeloid lösemi HL-60 hücrelerinde apoptotik hücre ölümünü uyardığını gözlemişlerdir. Antidepresan tarafından uyarılmış apoptoz, elektron mikroskobu ve konvansiyonel agaroz jel elektroforezi ile belirlenmiştir. Antidepresanlar tarafından uyarılmış kaspaz aktivitesi, intrasellüler reaktiv oksijen türünün (ROS) artışına neden olmuştur. Sonuçlar, antidepresanlardan Klomipramin in kaspaz-3 bağımlı yolaklar aracılığı ile apoptozu uyardığını ve bu durumun antineoplastik etki mekanizması hakkında ipucu verdiğini göstermiştir. Abdel-Razaq ve ark. (2007) antidepresanların model hücre sisteminde, gen transkripsiyonunda siklik AMP-cevabı üzerindeki etkilerini araştırmışlardır. Araştırmada kullanılan Klomipramin in, in vitro ortamda monoamin ve sikli AMPbağımsız mekanizmalar yoluyla gen transkripsiyonunu modifiye edebileceğini saptanmıştır. 27

49 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Fezel NİZAM Nortriptilin İle Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Van Schaik ve Graf (1991) beş trisiklik antidepresanın Drosophila melanogaster de somatik kanat mutasyonu ve rekombinasyonu testleri ile genotoksisitesini araştırmışlardır. Çalışmada, Nortriptilin in 100 mm a kadarki konsantrasyonlarda genotoksik olmadığı saptanmıştır. Steingart ve Cotterchio (1995) nın yürüttüğü çalışmanın amacı, antidepresanlar ile kanserin bağlantısı veya antidepresanların neoplastik gelişim üzerine olan etkisini insanlar ve deney hayvanları üzerinde araştırmışlar ve Nortriptilinin göğüs kanseri riskini artırabildiğini gözlemişlerdir. Brambilla ve Martelli (2009), pazarlanmış 472 farmasötiğin genotoksisite ve kanserogenezinin araştırıldığı bir çalışma yayınlamışlardır. Bu çalışma içerisinde incelenen birçok ilaç arasında antidepresanlar da yer almaktadır. Çalışmada bu farmasötiklerden biri olan Nortriptilin in bakteriyel mutasyon testinde negatif sonuç verdiği belirtilmiştir Protriptilin İle Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Van Schaik ve Graf (1991) beş trisiklik antidepresanın Drosophila melanogaster de somatik kanat mutasyonu ve rekombinasyonu testleri ile genotoksisitesini araştırmışlardır. Sonuçlar, Protriptilin in 100 mm a kadarki konsantrasyonlarda genotoksik olmadığını göstermiştir Seçici Noradrenerjik Gerialım İnhibitörü(SNGİ) Maprotilin ile Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Maprotilin, membran depolarizasyonu ile stimule edilen CRE-bağlantılı (Camp/Ca +2 cevaplayıcı eleman) gen transkripsiyonunu engellediği Schwaninger ve ark. (1995) tarafından bulunmuştur. 28

50 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Fezel NİZAM Reboksetin ile Yapılan Toksisite Çalışmaları Baldwin ve Carabal (1999) hayvan modelleri ile yaptıkları çalışmada, Reboksetin in düşük toksisitesi olduğunu göstermişlerdir Alfa 2 Adrenoreseptor Antagonistleri Mianserin ile Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Mianserin, membran depolarizasyonu ile stimule edilen CRE-bağlantılı (Camp/Ca +2 cevaplayıcı eleman) gen transkripsiyonunu engellediği Schwaninger ve ark. (1995) tarafından bulunmuştur Serotonerjik ve Norepinefrin Gerialım İnhibitörleri Duloksetin ile Yapılan Genotoksisite Çalışmaları Pereira ve ark. (2009) Duloksetin in subakut muamelesinden sonra beyin dokusundaki ve kandaki DNA hasarlarını comet testi ile araştırmışlardır. Sonuçlara göre duloksetin genotoksik etki göstermemiştir 2.7. Antidepresanlarla Yapılan Genotoksisite ve Kanserojenite Çalışmalarının Sonuçlarının Özet Olarak Açıklanması Antidepresanlarla yapılan Genotoksisite ve kanserojenite çalışmalarından elde edilen sonuçlar özet olarak Çizelge 2.1. de verilmiştir. 29

51 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Fezel NİZAM Çizelge2.1.Antidepresanlarla yapılan genotoksisite ve kanserojenite çalışmalarının sonuçlar S İlaçlar Bak. Mut. İn vitro sitogenetik MLA İn vivo sitogenetik Kars. Fenelzin P - - P P/N - İproniazid N N N P-KKD, KA N/N - İzokarboksazid N N - P-KKD, KA -/- - Mebazin N N - P-KA N/N - Moklobemid N - N N N/N - Nialamid N - N P-KKD, KA N/N - Selejilin N N - N -/- - Transilsipromin N /- - Amitriptilin N P - P-MN -/- N Desipramin N - - P -/- P Doksepin N /- - İmipramin N P - P-MN, KKD P/P P Karbamazepin N P-MN - - -/P P Klomipramin N/N P Nortriptilin N N Protriptilin N EsSitalopram P P N - N/P - Fluoksetin N P-KKD N N N/N P Fluvoksamin N N - N N/N - Paroksetin N N N N P/P - Sertralin N P-KKD* N-KA** F/S Som. Mut. Ve Rek. N N P/P - Sitalopram P P N N -/P - Mirtazapin N N - N P/P - Venlafaksin N N - N N/N - Duloksetin N N N N P/- - (1- MAOI, 2-TCA, 3-SSRI, 4-Alfa-2 A.A., 5-Ser. Ve Nor. G.A.I. N, Negatif; P, Pozitif; -, Literatürde bu çalışmaya rastlanmamıştır.; Bak. Mut., Bakteriyel Mutasyon Testi.; MLA, Sıçan Lenfoma Testi.; Kars F/S, Fare ve Sıçan Kanserogenez bulguları.; Som. Mut. Ve Rek., Somatik Mutasyon ve Rekombinasyon Testi. İn vivo sitogenetik; MN= mikronukleus, KA= kromozom aberasyonu, KKD= kardeş kromatid değişimi. İn vitro sitogenetik; MN= mikronukleus, KA= kromozom aberasyonu, KKD= kardeş kromatid değişimi. *Bozkurt ve ark. (2004) **Brambilla ve Martelli (2009)). 30

52 3. MATERYAL VE METOD Fezel NİZAM 3. MATERYAL VE METOD Bu çalışmada test maddesi olarak bir antidepresan olan Fluoksetin ilacı, materyal olarak da sigara içmeyen yaşları birbirine yakın sağlıklı iki erkek (20 ve 23 yaşlarında) ve iki bayandan (21 yaşında) alınan periferik kan kullanılmıştır Kullanılan Kimyasal Maddeler ve Deney Ekipmanları Bu çalışmada test maddesi olarak kullanılan Fluoksetin bir antidepresan ilaçtır. Antidepresanlar şu şekilde sınıflandırılır: Antidepresanlar ve Sınıflandırılması Depresyon tedavisinde kullanılan antidepresan ilaçlar kimyasal yapılarına ya da etki tarzlarına göre sınıflandırılabilirler. Antidepresanlar erken dönem etkileriyle sinaptik değişiklikler ve uzun dönem etkileriyle de reseptörler üzerinde değişiklikler yaparlar (Aslan, 2003) Seçici Serotonin Gerialım İnhibitörleri (SSGİ) Depresyonun olası nedeni, sinyallerin nöronlar arası iletimini sağlayan kimyasal olan serotoninin beyinde az miktarda bulunmasıdır. SSGİ leri presinaptik nöronlardan serotonin (5-hidroksitriptamin = 5-HT) geri alımını engelleme prensibi ile etki gösterirler. Böylece sinapslardaki 5-HT seviyesinin yükselmesi sağlanır. Eli Lilly firmasından kimyager Klaus Schmiegel ve Bryan Molly ilk SSGİ olan Fluoksetin i keşfetmişlerdir. Bu ilaç sınıfı: Essitalopram Fluoksetin Fluvoksamin Paroksetin Sertralin Sitalopram ı içermektedir. 31

53 3. MATERYAL VE METOD Fezel NİZAM Bu gruptaki antidepresanların Trisiklik antidepresanlar ve Monoamin Oksidaz İnhibitörleri ne göre daha az yan etkileri vardır. Bu grubun yan etkileri arasında uyuşukluk, ağız kuruluğu, asabiyet, endişeli ruh hali, uykusuzluk, iştah azlığı, kilo artışı ve seksüel fonksiyonda düşüş vardır. Çalışmalar bu ilaçların clock genes (Circadian Locomotor Output Cycles Kaput or CLOCK) olarak bilinen transkripsiyon faktörleri ile etkileştiğini, böylece bu ilaçların bağımlılık ve obezite gibi yan etkiler de oluşturabildiğini göstermektedir Monoamin Oksidaz İnhibitörleri (MAOI) Bu gruptaki ilaçlar diğer antidepresan tedavilerinin etkisiz olduğu durumlarda kullanılırlar. MAOI ler, nörotransmiter dopamin, serotonin ve norepinefrinin yıkımından sorumlu monoamin oksidaz enzimini engellemek suretiyle çalışırlar. TSA lar kadar etkili olsalar da, tehlikeli yan etkileri ve belli yiyeceklerle (triyamin içerenler) etkileşim ihtimalinden dolayı daha az tercih edilmektedirler. Fenelzin İproniazid İzokarboksazid Mebanazin Moklobemid Nialamid Selejilin Transilsipromin bu gruba giren antidepresanlardandır Trisiklik Antidepresanlar (TSA) Trisiklik antidepresanlar, antidepresan ilaçların en eski sınıfıdır. Günümüzde daha seçici ve güvenilir ilaçların gelişimi ile TSA lar daha az tercih edilir olmuşlardır. TSA lar norepinefrin ve serotonin gibi belli transmiterlerin geri alımını engellerler. Bununla birlikte histaminik, kolinerjik ve alfa-1 adrenerjik reseptör bölgelerini bloke ederler. Bu antidepresanların kalp atış hızının artması, uyuşukluk, 32

54 3. MATERYAL VE METOD Fezel NİZAM ağız kuruluğu, kabızlık, idrar kaçırma, bulanık görüş, baş dönmesi, akıl karışıklığı ve seksüel bozukluk gibi yan etkileri vardır (Feighner, 1999). TSA lar major depresyonun belirli gruplarında güçlü etki göstermelerinden dolayı hala kullanılmaktadırlar. Bu gruptaki ilaçlar: Amitriptilin Desipramin Doksepin Dosulepin İmipramin Karbamazepin Klomipramin Nortriptilin Protriptilin Trimipramin dir Seçici Noradrenerjik Gerialım İnhibitörleri (NGİ) Bu gruba giren ilaçlar norepinefrin yolu ile etki ederler. NGİ lerinin konsantrasyon ve motivasyon üzerine pozitif etkileri olduğu düşünülmektedir. Atomoksetin Mazindol Maprotilin Reboksetin Viloksazin bu gruba giren bazı antidepresan ilaçlardandır α-2 Adrenoreseptör Antagonistleri Bu grup antidepresanlar, presinaptik α-2 adrenerjik reseptörlerini ve belli serotonin reseptörlerini engelleyerek, norepinefrin (noradrenalin) ve serotonin nörotransmisyonunun artması sonucu etki gösteren yeni bir ilaç sınıfıdır. Yan 33

55 3. MATERYAL VE METOD Fezel NİZAM etkileri; uyuşukluk, artan açlık hissi ve kilo alımı olabilir. Bu sınıfa giren ilaçlar; Mianserin Mirtazapin dir Serotonin Noradrenerjik (Norepinefrin) Gerialım İnhibitörleri (SNGİ) Serotonin-norepinefrin gerialım inhibitörleri norepinefrin (noradrenalin) ve 5- HT i etkileyerek çalışan yeni antidepresan grubudur. SSGİ leri ile benzer yan etkileri vardır. Bu grup; Desvenlafaksin Duloksetin Milnasipram Venlafaksin gibi ilaçları içerir Norepinefrin-Dopamin Gerialım İnhibitörleri (NDGİ) Dopamin ve norepinefrin (noradrenalin) gerialımını engellemek suretiyle işlev yaparlar. Bu grupta; Bupropion yer almaktadır Etki Artırıcı Antidepresan İlaçlar Bazı antidepresanların, etki artırıcı ilaçlar ile kombine halde kullanılmasının daha iyi sonuç verdiği belirlenmiştir. Bu etki artırıcı ilaçlar; Buspiron Gepiron Nefazodon Tandospiron Trazodon dur. 34

56 3. MATERYAL VE METOD Fezel NİZAM (1). Seçici Serotonin Geri-Alım İnhibitörlerinin Etki Mekanizması SSGİ lar, etkinliklerini 5-hidroksitriptamin (5-HT) geri alımını inhibe ederek gösterirler. SSGİ leri, genel olarak 5-HT1A ve 5-HT2 reseptör yoğunluğunu dengelerler. 5-HT1A bağlanma yerleri somatodendritik ve presinaptik oto reseptörler ve postsinaptik reseptörlerdir. Bunlar hipokampal bölgede bulunurlar, kronik antidepresan kullanımından sonra duyarlılıklarında azalma olur. 5-HT2 reseptörleri hipokampus, korteks ve spinal kortta postsinaptik olarak yerleşmiştir. Uyaranın postsinaptik iletimini inhibe ederler. Major depresyonda 5-HT2 bağlanma yerlerinde reseptörlerin arttığı (upregulation) saptanmıştır. SSGİ lerin belirgin noradrenerjik aktivitesi yoktur. Hayvan çalışmalarında 5-HT sistemi, merkezi dopamin sistemi üzerinde kuvvetli inhibitör etki göstermiştir. Teorik olarak, SSGİ lerin dopaminerjik iletimi azaltmaları gerekir. Bazı çalışmalarda, SSGİ ler Amfetamin, Metilfenidat gibi dopaminerjik ajanların fazla aktivite göstermesine neden olmuşlardır. Genel olarak SSGİ ların dopaminerjik sistem üzerine yan etikleri yoktur. Diğer antidepresanlara göre yarılanma ömürleri uzundur ( (2). Seçici Serotonin Geri-Alım İnhibitörlerinin Yan Etkileri En sık görülen yan etkiler; çarpıntı, uyku bozukluğu, irade dışı titreme (tremor), cinsel işlev bozuklukları (özellikle anorgazmi) ve baş ağrısıdır. Çok nadir olarak, eklem ağrısı (artralji), lenf bezlerinin şişerek büyümesi (lenfadenopati), uygunsuz antidiüretik hormon salınımı sendromu, agranülositoz (akyuvar sayısının azalması), hipoglisemi bildirilmiştir. Çok nadir, fakat öldürücü olabilen bir yan etki merkezi serotonerjik sendromdur. Bu genellikle ikinci bir serotonin arttırıcı ajanla birlikte kullanıldığında (özellikle MAOI ile) görülür. Karın ağrısı, diare, terleme, ateş, taşikardi (kalbin hızlı atması hastalığı), kan basıncında artış, deliryum (akut beyin yetmezliği), miyokloni (kaslarda aniden ortaya çıkan, düzensiz ritimli, şiddeti değişken ve asimetrik bir dağılım gösteren kasılma), irritabilite (uyaranlara gereğinden fazla tepki göstermek), hostilite (saldırganlık), mizaç değişiklikleri gibi yan etkiler görülür. Hiperpireksi (vücut sıcaklığının 40,5 C'nin üzerine çıkması; ateş 35

57 3. MATERYAL VE METOD Fezel NİZAM yükselmesi), kardiovasküler şok ve ölüm olabilir ( journals/4/15.pdf) Kullanılan Kimyasal Maddeler Fluoksetin ve Kimyasal Özellikleri Bu çalışmada test maddesi olarak Fluoksetin ilacı kullanılmıştır. Fluoksetin 1987 yılında ticari pazara giren ve günümüzde Eli Lilly firması tarafından Prozac ticari adı ile kullanılan antidepresan ilaçtır. Fluoksetin başlıca santral nöronlarda serotonin geri alımını inhibe ederek (Selective Serotonine Reuptake Inhibitor = SSRI) antidepresan etkinlik gösterdiği düşünülmektedir ( Fluoksetin). Test maddemiz olan bu antidepresan oral yollarla verilebilir. Mevcut diğer antidepresanlardan ayrı kimyasal yapıya sahip bir ilaçtır. Trisiklik ve tetrasiklik yapıdaki bileşiklerden farklıdır. Fluoksetin in antidepresan etkisi başlıca santral nöronlarda serotonin gerialımını inhibe etmesine bağlanmaktadır. Selektif olarak bu maddenin gerialımını bloke eder; fakat norepinefrinin gerialımını etkilemezler. İnsanlar üzerinde yapılan incelemelerle Fluoksetin in, kan hücrelerindeki (plateletlerde) serotonini bloke ettiği kanıtlanmıştır. Fluoksetin kolayca kana geçer. Tek dozda 40 mg verildiğinde 6-8 saat sonra kan düzeyi en yüksek seviyeye erişir. Kan proteinlerine % 94.5 oranında bağlanır. Karaciğerde aktif olan norfluoksetine dönüşür. Yine hepatik metabolizma sonucu vücuttan atılır. Fakat eliminasyon yarı ömrü 2-3 gün kadardır. Norfluoksetinde ise yarılanma süre oldukça uzundur (7-9 gün). Bu nedenle sürekli ve yüksek dozda ilaç alımında vücutta birikme görülür. 30 gün süreyle 40 mg Fluoksetin alımında kan seviyesi ng/ml, norfluoksetinde ng/ml arasında değiştiği saptanmıştır. Ancak bu düzeyin sınırsız olarak yükselmesi söz konusu değildir. Karaciğer bozukluğunda Fluoksetin eliminasyonu etkilenerek gecikebilir, fakat böbrek hastalarında ilacın farmakokinetik davranışı değişmemektedir. Ancak sürekli doz uygulamasında metabolitlerin birikimi söz konusu olabilir. 36

58 3. MATERYAL VE METOD Fezel NİZAM (1). Fluoksetin in Farmakokinetik Özellikleri Emilim: Fluoksetin oral uygulamadan sonra yüksek oranda emilir. Pik zamanı: Doruk plazma konsantrasyonlarına 6-8 saat içerisinde ulaşılır. Plazma Proteinlerine Bağlanma: Fluoksetin plazma proteinlerine yüksek oranda bağlanır ve yaygın dağılım gösterir. Birkaç haftalık tedaviden sonra plazma konsantrasyonları kararlı duruma ulaşır. Uzun süreli tedavideki plazma konsantrasyonları, 4-5 haftalık tedavideki konsantrasyonlara yakındır. Metabolizma: Fluoksetin karaciğerde metabolize olarak Fluoksetin kadar aktif norfluoksetine ve idrarla atılan bazı tanımlanmamış metabolitlere dönüşür. Atılım: Fluoksetin in atılım yarı ömrü 4-6 gün, aktif metabolitinin atılım yarı ömrü ise 4-16 gündür. %2.5-5 Fluoksetin, %10 norfluoksetin olarak idrarla atılır (2). Fluoksetin in Kimyasal Yapısı Ticari adı: Prozac Kimyasal adı: (RS)-N-methyl-3-phenyl-3-[4-(trifluoromethyl) phenoxy]propan-1-amine Kapalı formülü: C 17 H 18 F 3 NO Açık formülü: Molekül ağırlığı: 309,3 g/mol CAS No:

59 3. MATERYAL VE METOD Fezel NİZAM '-Bromo-2'-deoxyuridine (BrdUrd) (Sigma) BrdUrd kardeş kromatidlerin farklı boyanmasını belirleyebilmek amacıyla kullanılmıştır. BrdUrd eriyiği bidistile su içerisinde hazırlanmış, daha sonra 0.2 µm por çapındaki membran filtre (Sartorius marka) ile steril edilmiştir. Bu eriyikten 50 µl alınarak kültür tüplerine ilave edildiğinde kültür, son konsantrasyonu 10 µg/ml olacak şekilde BrdUrd içermiştir. Kimyasal adı: 5'-Bromo-2'-deoxyuridine Kapalı formülü: C 9 H 11 BrN 2 O 5 Molekül ağırlığı: g/mol Erime noktası: C CAS No: Sigma No: B Cyclophosphamide monohydrate (Sigma) Cyclophosphamide monohydrate bu çalışmanın S9 mix li deneyide pozitif kontrol olarak kullanılmıştır. Kimyasal adı: N,N-bis(2-chloroethyl)-1,3,2-oxazaphosphinan-2-amine 2- oxide Kapalı formülü: C 7 H 15 Cl 2 N 2 O 2 P*H 2 O Açık formülü: Molekül ağırlığı: g/mol Erime noktası: C CAS No:

60 3. MATERYAL VE METOD Fezel NİZAM Cytochalasin B (Sigma) Mikronukleus (MN) testinde, hücre bölünmesi sırasında sitokinezi engellemek ve iki nukleuslu hücreler oluşturmak amacıyla kullanılmıştır. 5 mg Cytochalasin B yi, 3 ml %50 lik alkolde çözerek 6mg/ml stok çözelti elde edilir. Kimyasal adı: Cytochalasin B Kapalı formülü: C 29 H 37 NO 5 Molekül ağırlığı: g/mol Erime noktası: ºC Kaynama noktası: ºC Saflık düzeyi: %98 CAS No: Açık formülü: Sigma No: C Entellan (Merck) Hazırlanan preparatları daimi hale getirmek amacıyla lam ile lameli birbirine yapıştırmak için kullanılan şeffaf yapışkan sıvıdır (Cat. No. 7961) Fiksatif KKD ve KA yı incelemek amacıyla yapılan preparasyon için kullanılan 39

61 3. MATERYAL VE METOD Fezel NİZAM fiksatif, 1 hacim glasial asetik asit in 3 hacim metanol ile karıştırılması sonucu hazırlanmıştır. MN inceleme amacıyla yapılan preparasyon için ise iki farklı fiksatif kullanılmıştır. İlk fiksatif muamelesi için 1 kısım glasial asetik asit 5 kısım metanol ile karıştırıldıktan sonra bu karışım 1/1 oranında %0.9 NaCl ile seyreltilmesiyle (1/5/6) hazırlanmıştır. Diğer fiksatifler ise NaCl ilave edilmeden (1/5) kullanılmıştır. Fiksatif kullanılmadan iki saat önce hazırlanmış ve buzdolabında saklanmıştır. Her seferinde preparat yapım işleminden iki saat önce taze olarak hazırlanıp kullanılmıştır Giemsa (Merck) Giemsa boyası Merck firmasından (Cat. No. 9204) temin edilmiştir. Sorensen tamponu içinde hazırlanıp, filtre edilmiş % 5 lik boya eriyiği, kromozomları ve MN testinde nukleusları boyamak için kullanılmıştır Hipotonik Eriyik % 0.4 lük KCI (Merck) hipotonik eriyik olarak kullanılmıştır. Eriyik bidistile su içerisinde stok halinde hazırlanıp, ağzı kapalı cam kap içerisinde buzdolabında (+ 4 C) saklanmıştır. Her preparasyondan yaklaşık bir saat önce yeterli miktarda hipotonik eriyik alınmış, inkübatör ile 37 C ye kadar ısıtılarak kullanılmıştır Karaciğerin Alınması Temiz S9 preparasyonu elde etmek için karaciğer steril şartlarda alınmıştır. Yöntem: Boyunları kırılarak (servikal dislokasyon) ile öldürülen hayvanların göğüs bölgesi tıraş edilmiştir. Tıraş edilen bölge %70 lik etanol ile silinmiştir. Tüyler kesilmeyecekse göğüs bölgesi iyice steril edilir. Steril aletlerle göğüs bölgesindeki deri açılmış ve iyice gerdirilmiş, tekrar alkol ile temizlendikten sonra göğüs bölgesi steril makas ile açılmıştır. Kontaminasyonu engellemek için göğüs kafesi açılırken 40

62 3. MATERYAL VE METOD Fezel NİZAM özofagus ve bağırsakların yırtılmamasına dikkat edilmiştir. Daha sonra karaciğer alınmıştır Karaciğer Homojenat S9 Fraksiyonlarının Hazırlanması Karaciğer S9 fraksiyonlarının hazırlanması Garner ve ark. nın (1972) metoduna göre yapılmıştır. Çalışmanın bütün aşamaları 0-4ºC de steril ortamda ve steril ekipmanlarla yapılmıştır. Çıkarılan taze karaciğer darası alınmış petri kabına konulmuş, tartılmış ve her bir gramına 1 ml olacak şekilde soğuk 0.15 M KCl ilave edilmiştir. Sıçan karaciğeri yaklaşık g civarındadır. Karaciğer soğuk KCl ile birkaç defa yıkanmıştır. KCl ile yapılan yıkama, steril doku eldesi ve hemoglobinin uzaklaştırılması için gereklidir. Hemoglobin, sitokrom P450 enzimlerinin aktivitelerini yok edebilir. Yıkanan karaciğer, 3 ml/gr olacak şekilde 0.15 M KCl içeren bir kaba aktarılmış, steril makas ile dilimlenmiş ve homojenize edilmiştir. Homojenat 9000 g de 10 dk. santrifüj edilmiş ve süpernatant (S9 fraksiyonu) başka bir tüpe alınmıştır. Steriliteden şüphelenilmesi durumunda sterilite kontrolü yapılabilir. Sterilite kontrolü için histidin-biyotin içeren MGA besi yerine ekim yapılır. 1 ml lik S9 fraksiyonu yaklaşık 250 mg karaciğer mikrozom fraksiyonu içerir. Bu S9 fraksiyonunun protein miktarı da yaklaşık 40 mg/ml dir. Taze S9 fraksiyonları 1 ml olacak şekilde ependorf tüplerine paylaştırılmıştır. -20ºC de dondurulmuş ve -80ºC de saklanmıştır. Mutajenite çalışmaları için S9 fraksiyonu gerekli olduğunda, donmuş S9 fraksiyonu oda ısısında çözülür ve kuru buz üzerinde korunur. S9 mix ise, S9 çözüldüğü anda hazırlanmalıdır. S9 mix in sterilitesi de denenebilir. Kontaminasyon olması durumunda S9 mix 0.45 µm lik membran filtre ile steril edilebilir. Fakat filtre ile sterilizasyonda enzimlerin kaybolma riski vardır ve zorunlu olmadıkça uygulanmamalıdır. Zaten yukarıda da belirtildiği gibi aseptik şartlarda çalışılması durumunda kontaminasyon olması son derece zayıf bir ihtimaldir. Sıçan karaciğeri dışında sıçanların akciğeri, fare ve hamster karaciğeri ve hatta insan otopsi karaciğeri bile S9 fraksiyonu elde etmek için kullanılabilir. İşlemler yukarıda belirtilen şekilde yapılmasına rağmen akciğer dokusunu 41

63 3. MATERYAL VE METOD Fezel NİZAM homojenize etmek zordur. Çünkü akciğerde bulunan fibröz tabaka onun homojenizasyonunu zorlaştırır. Ayrıca, karaciğer steril olmasına rağmen akciğer bakteri florası içerebilir. Eğer sterilizasyon gerekiyorsa, S9 fraksiyonu, mix ile karıştırıldıktan sonra filtre edilmelidir, aksi takdirde filtreyi tıkar. Vakum ile yapılan filtrasyon S9 enzimlerini denatüre edebilmektedir. Bunun yerine, basınç ile filtrasyon daha yararlıdır. S9 mix li ortamda test maddesi ile muamele yapılacağı zaman her tüpe 0.5 ml S9 mix ilave edilir. Standart S9 mix hazırlanması 20 ml için 100 ml için Sıçan karaciğer S9 fraksiyonu...2 ml 10 ml MgCl 2 - KCl tuzları ml 1.25 ml G-6-P g 0.2 g NADP g g 0.2 M fosfat buffer ml ml Steril saf su...20 ml ye 100 ml ye tamamlanır. tamamlanır Kolkisin (Kolşisin) (Sigma) Kolkisin (Colchicine) (Sigma Cat. No. C9754), preparatların hazırlanmasında mitotik zehir olarak kullanılmıştır. Kolkisin eriyiği steril saf su içerisinde hazırlanmış ve kromozom medyumunun her mililitresinde 0.06 µg olacak şekilde (0.06 µg/ml) 2.5 ml lik kromozom medyumuna ilave edilmiştir. Kolkisin e ait özellikler aşağıda verilmiştir. Kimyasal adı: Colchicine Kapalı formülü: C 22 H 25 NO 6 Molekül ağırlığı:

64 3. MATERYAL VE METOD Fezel NİZAM Etil asetat içeriği: %3.4 Kloroform içeriği: < %0.1 Sigma No: C Kromozom Medyumu Bu çalışmada Gibco firmasının ürettiği PB Max. Kromozom medyumu (cat. no ) hücre kültürü için kullanılmıştır. PB Max medyumu tam medyumdur. Fakat heparin içermemektedir. Bu medyum her tüpe 2.5 ml olacak şekilde paylaştırılmış ve bu miktarlarda kullanılmıştır. Kültür tüpleri steril olarak temin edilmiştir Mitomycin C (MMC) (Sigma) Mitomycin C, bu çalışmanın metabolik aktivasyonsuz deneyinde (S9 mix siz) pozitif kontrol olarak kullanılmıştır. Stok, 2 mg Mitomycin C yi 30 ml steril saf suda çözerek elde edilir. Kimyasal adı: 6-Amino-1,1a,2,8,8a,8b-hexahydro-8-(hydroxymethyl)-8amethoxy-5-methyl-azirino[2',3':3,4] pyrrolo[1,2-a]indole-4,7- dione carbamate (ester) Kapalı formülü: C 15 H 18 N 4 O 5 Açık formülü: Molekül ağırlığı: g/mol Erime noktası: >360ºC CAS No:

65 3. MATERYAL VE METOD Fezel NİZAM Nitrik Asit (HNO 3 ) Lamları temizlemek amacıyla 1 N çözelti olarak hazırlanmıştır. Plastik şişede saklanarak her defasında tekrar tekrar kullanılmıştır RPMI1640 Besi Yeri Bu besi yeri metabolik aktivatör (S9 mix) varlığında hücrelerin muamelesinden sonra test maddesinin ve S9 mix in kültür ortamından uzaklaştırılması sırasında kullanılmıştır Sıçan Karaciğer Enzimlerinin İndüklenmesi 3-Metilkolantren ml ye 64 mg olacak şekilde mısır yağında eritilmiş ve 80 mg/kg vücut ağırlığı olacak şekilde 0.5 ml i.p. olarak erkek sıçanlara uygulanmıştır. Sıçanlar bununla 5 gün boyunca muamele edilmiştir. Bu süre içerisinde sıçanlar normal besin ile beslenmiştir. Öldürülmeden 12 saat önce sıçanlara sadece su verilmiş, yiyecek verilmemiştir. Süre sonunda sıçanlar boyunları kırılarak öldürülmüştür. Karaciğer enzimleri için diğer türlerin birçok dokusu kullanılabilmesine rağmen genel olarak enzimlerin aktivasyonu açısından en iyisi sıçan karaciğeridir. Karaciğer enzimlerine S9 adı verilir. Metabolik aktivasyona ihtiyaç duyan (indirekt mutajenler) kanserojenlerin araştırılmasında en etkili yol indüklenmiş hayvanlardan hazırlanacak S9 un kullanılmasıdır. Karaciğer enzimlerini indükleyen maddeler içerisinde en iyisi Aroclor 1254 olmasına rağmen, phenoborbitol ve 3-metilkolantren de bu amaç için rahatlıkla kullanılabilir. 44

66 3. MATERYAL VE METOD Fezel NİZAM Sorensen Tamponu (Sorensen Buffer) KKD ni incelemek amacıyla preparat yapımı sırasında preparatlar Sorensen tamponu içerisinde UV lambası ile ışınlandırılmıştır. Ayrıca bu tampon %5 lik Giemsa boyası hazırlanmasında da kullanılmıştır. Bu tampon eriyik tampon A ve tampon B olmak üzere iki stok çözelti halinde hazırlanmış olup bu çözeltiler çalışmanın amacına uygun olarak birbirleriyle değişik miktarlarda karıştırılarak kullanılmıştır. Hazırlanışı: Tampon A:11.34 gr KH 2 PO ml saf su içinde eritilmiştir (ph=4.8). Tampon B:14.83 gr Na 2 HPO 4.12H 2 O 250 ml saf su içinde eritilmiştir (ph=9.3) Standart S9 mix (Memeli Karaciğer Fraksiyonu [S9] ) Bu deneyin 2. bölümünde test maddesinin indirekt mutajenik etkiye sahip olup olmadığını belirlemek amacıyla sıçan karaciğerinden elde edilen enzimler ile magnezyum-potasyum tuzları ve sodyum-fosfat tamponunun kombinasyonundan oluşan S9 mix kullanılmıştır Standart Saline Citrate (SSC) Eriyiği gr tri sodyum sitrat (C 6 H 5 Na 3 O 7.2H 2 O) tartılarak bir miktar saf su içerisinde eritilmiştir. Daha sonra 21.9 gr NaCI tartılarak yine saf su içerisinde ancak ayrı bir kapta eritilmiştir. İki eriyik, bir şişeye dökülerek iyice karıştırılmış ve üzerine 500 ml oluncaya kadar saf su ilave edilmiştir. Hazırlanan bu stok eriyik 5 SSC dir ve bu eriyik buzdolabında saklanmıştır. KKD yi incelemek için deney yapılırken bu stoktan 20 ml alınarak üzeri 100 ml oluncaya kadar saf su ile tamamlanmış ve elde edilen 1 SSC eriyiği kullanılmıştır. 45

67 3. MATERYAL VE METOD Fezel NİZAM Kullanılan Deney Ekipmanları Flow Kabin (Steril Kabin) Hücre kültürü tüplerine kromozom mediumu konulması, kan ekiminin yapılması, test eriyikleri ve S9 mix in hazırlanması ve kültür tüplerine ilave edilmesi sırasında steril bir ortam olarak, % 99.9 partikül tutma özellikli filtreye sahip, 1500 m 3 /h emiş kapasiteli, UV ve flüoresan ampulü olan LABORMED marka flow kabin kullanılmıştır Hassas Terazi Hava akımlarına karşı özel cam paravanlarla korunan ve 0,0001 gr hassasiyetindeki GEC AVERY marka terazi kimyasalların tartılmasında kullanılmıştır İnkübatör Hücre kültürünün yapılmasında ve bazı eriyiklerin 37ºC ye kadar ısıtılmasında Incucell marka 0ºC -100ºC ayarlanabilir inkübatör kullanılmıştır Mikroskop Koordinat cetveli ve immersiyon objektifi olan OLYMPUS marka binoküler ışık mikroskobu preparat incelemeleri sırasında kullanılmıştır. Fotoğraflar ise yine Olympus marka mikroskopta dijital olarak çekilmiştir Otoklav S9 mix hazırlanması sırasında kullanılan ekipmanların ve eriyiklerin steril edilmesi HIRAYAMA marka otoklav ile sağlanmıştır. 46

68 3. MATERYAL VE METOD Fezel NİZAM ph Metre Kimyasalların ph değerlerini saptamak için WTW 315i (Germany) marka ph metre kullanılmıştır Santrifüj Rotor çapı 21 cm olan ve 4000 rpm e kadar yükselebilen devir hızı, 99 dk. lık zaman ayarlayıcı, açılabilir başlığa sahip ve 28 tüp kapasiteli HETTICH UNIVERSAL marka santrifüj çalışmalarda kullanılmıştır Su Banyosu Hücre kültürü preparatları hazırlandıktan sonra, kardeş kromatidlerin farklı boyanmasında kullanılan SSC eriyiğinin 58-60ºC de sabit kalmasını sağlamak amacıyla BM 302 NÜVE marka 0-60ºC ayarlanabilir su banyosu kullanılmıştır Lamların Temizlenmesi Kültür süresinin bitiminden iki gün önce etiketli olan lamlar şaleye dizilerek üzerlerini iyice örtecek şekilde 1 N nitrik asit konmuştur. Şalenin ağzı kapatılarak bu şekilde 24 saat bekletilmiştir. Süre bitiminde lamlar yarım saat akan çeşme suyunda iyice yıkanmıştır. Lamlar 3-4 defa saf sudan geçirildikten sonra şale saf su ile doldurularak buzdolabında saklanmıştır Sterilizasyon BrdUrd Eriyiğinin Sterilizasyonu BrdUrd eriyiği steril bir erlen içinde bulunan ve steril olan saf su içinde 5'- bromo-2'-deoxyuridine maddesinin eritilmesiyle hazırlanmıştır. Bu eriyik steril 47

69 3. MATERYAL VE METOD Fezel NİZAM şartlarda por çapı 0.2 µm olan bakteri filtresinden (Sartorius, membran filtre) geçirilerek steril edilmiştir. Sonra vida kapaklı steril cam kültür tüplerine konulan bu eriyik, etrafı alüminyum folyo ile kapatılarak buzdolabında saklanmıştır Cyclophosphamide monohydrate nin Sterilizasyonu 270 mg (0.27 g) cyclophosphamide monohydrate, içinde 30 ml destile su bulunan bir beherde eritildikten sonra Millipore sterilizasyon aygıtı kullanılarak por çapı 0.2 µm olan bakteri filtresinden (Sartorius, membran filtre) geçirilerek steril edilmiştir Saf Suyun Sterilizasyonu Temiz bir vida kapaklı 100 ml lik kültür şişesine saf su doldurularak şişenin ağzı pamukla iyice kapatılmıştır. Sterilizasyon esnasında otoklavdaki buhardan pamuğun ıslanmaması için üzeri alüminyum folyo ile örtülmüştür. Şişedeki saf su otoklavda 1.2 atm buhar basıncında ve 121ºC de 20 dk. steril edilmiştir Kardeş Kromatid Değişimi (KKD) (Sister Chromatid Exchange= SCE) ve Kromozom Anormalliklerini (KA) (Chromosome Aberration=CA) Saptamak Amacıyla Hücre Kültürünün Yapılması, Preparatların Hazırlanması, Boyanması ve Mikroskobik İnceleme İnsanlarda genotoksik etkiye sahip olabilecek mutajenlerin ve kanserojenlerin genotoksik etkilerinin saptanması başta KKD, KA ve MN testleri yardımıyla olabilmektedir. Bu tür çalışmalar planlanırken, uygulanırken ve yorumlanırken uluslararası yönergelere uygun hareket edilmesi zorunluluğu bulunmaktadır. Bundan dolayı Fluoksetin in insan lenfositlerindeki genotoksik etkilerinin olup olmadığının araştırıldığı bu çalışma Albertini ve ark. (2000) ları tarafından yayınlanan IPCS (The International Programme on Chemical Safety) yönergesine göre gerçekleştirilmiştir. 48

70 3. MATERYAL VE METOD Fezel NİZAM Hücre Kültürünün Yapılması ve Preparatların Hazırlanması (S9 mix siz test) Bu çalışmada KKD ve KA ni saptamak amacıyla hücre kültürünün yapılması ve preparatların hazırlanması Evans (1984), Perry ve Thompson (1984) un metotlarına uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Sağlıklı ve sigara içmeyen yaşları birbirine yakın iki erkek (20 ve 23 yaşlarında) ve iki bayandan (21 yaşında) alınan 1/10 oranında heparinize edilmiş kan örnekleri kromozom medyumlarına steril şartlarda 6 damla (0.2 ml) (Rencüzoğulları ve Topaktaş, 1991) ekilmiştir. Yine steril şartlarda ve daha önce hazırladığımız BrdUrd eriyiğinden her tüpe son konsantrasyonu 10 µg/ml olacak şekilde ilave edilerek iyice karıştırılmış ve hücre kültürü inkübatörde 37±1 C de 72 saat için inkübe edilmiştir. Fluoksetin in etkisini incelemek için kültür süresinin bitiminden 24 ve 48 saat önce Fluoksetin in daha önce belirlenmiş son konsantrasyonları 8, 12, 16 ve 20 µg/ml olacak şekilde sıvı Fluoksetin den kültür tüplerine ilave edilmiştir. Test maddesi Fluoksetin sıvı halde olduğu için çözücü kontrol kullanılmamıştır. Ayrıca 24 ve 48 saatlik muamele sürelerinde pozitif kontrol olarak MMC kullanılmıştır. MMC tüplere son konsantrasyonu 0.25 µg/ml olacak şekilde ilave edilmiştir. Kültür süresinin bitiminden 2 saat önce (yani kültürün 70. saatinde) her tüpe hazırlanan kolkisin eriyiğinden ilave edilmiş (0.06 µg/ml) ve tüpler hafifçe sallanarak iyice karıştırılmıştır. Hücreler 2 saat süresince (37 C de) kolkisin ile ön muameleye tabi tutulmuştur. Kültür süresi olan 72. saatin bitiminde kültür tüpleri 2000 rpm de 5 dk. santrifüj edilmiş, süpernatant atılmıştır. Dipte kalan ve hücreleri ihtiva eden ml lik sıvı iyice karıştırıldıktan sonra tüplere, etüvde 37 C de tutulan hipotonik eriyik ilave edilmiştir. Bu eriyiğin ilavesi damla damla ve karıştırarak yapılmıştır ve hücre süspansiyonu pipetaj yapılarak homojen hale getirilmiştir. Aksi halde hücrelerde kümeleşme olmakta ve amaca uygun olmayan preparatlar hazırlanmaktadır. Her tüpe 5 ml hipotonik eriyik ilave edildikten sonra tüpler, ağzı kapatılarak inkübatöre konulmuştur. Hücreler 5 dk. hipotonik eriyikte 37 C de 49

71 3. MATERYAL VE METOD Fezel NİZAM muamele edilmiştir. Sürenin sonunda tüpler 15 dk rpm de santrifüj edilmiş, süpernatant atılmıştır. Daha sonra hipotonik eriyik ilavesinde olduğu gibi yavaş yavaş ve karıştırarak her tüpe 5 ml olacak şekilde soğuk fiksatif ilave edilmiştir. Oda sıcaklığında 20 dk. fiksatif ile muamele edilen hücreler 1200 rpm de 10 dk. santrifüj edilmiş ve süpernatant atıldıktan sonra tüplere tekrar fiksatif ilave edilmiştir. Bu işlem 3 kere tekrarlanmıştır. 3. fiksatif muamelesinin sonunda tüpte kalan sıvının tamamen berraklaştığı görülmüştür. Eğer sıvı berraklaşmamışsa tekrar fiksatif muamelesine devam etmek gerekir. Her fiksatif ilavesinden sonra tüpler santrifüj edilerek üstteki sıvı atılmıştır. Son santrifüjden sonra dipte ml sıvı kalacak şekilde süpernatant atıldıktan sonra preparat yapma işlemine geçilmiştir. Tüpün dibinde toplanan hücreler pasteur pipeti ile karıştırılarak homojen hale getirilmiştir. Pasteur pipetine 4-5 damla olacak şekilde bu hücre süspansiyonundan çekilmiştir. Özel olarak hazırlanmış düzeneğe tutturulan pasteur pipetinden daha önce temizlenmiş ve saf su içerisinde buzdolabında saklanmış lamların üzerine 50 cm yükseklikten farklı alanlara 1 er damla olmak üzere hücre süspansiyonu damlatılarak (her lama 3-4 damla) hücrelerin ve dolayısıyla kromozomların lam üzerinde yayılması sağlanmıştır. Hücre süspansiyonunun lamlara damlatılması esnasında damlaların üst üste düşmemesine dikkat edilmiştir. Bu şekilde hazırlanan preparatlar kurumak üzere 24 saat oda sıcaklığında bekletilmiştir Hücre Kültürünün Yapılması ve Preparatların Hazırlanması (S9 mix li test) Fluoksetin in indirekt genotoksik etkisini araştırmak amacıyla hücre kültürünün bitiminden 24 saat önce (kültürün 48. saatinde) 8, 12, 16 ve 20 µg/ml Fluoksetin 0.5 ml S9 mix ile birlikte tüplere ilave edilmiştir. Yine her deneyin bir kontrolü ve S9 mix siz deneyden farklı olarak cyclophosphamide ilave edilmiş bir pozitif kontrolü vardır. Pozitif kontrolde, kültür tüpüne cyclophosphamide son konsantrasyonu 28 μg/ml olacak şekilde ilave edilmiştir. Kontrol, pozitif kontrol ve 50

72 3. MATERYAL VE METOD Fezel NİZAM test maddesi ile muamele edilen tüplere 0.5 ml S9 mix ilave edilmiştir. 3 saat 37ºC de inkübasyonun ardından (hücre kültürünün 51. saati) tüpler 2000 rpm de 5 dk. santrifüj edilmiş, süpernatant atılmış ve böylece ortamdaki S9 mix in de uzaklaştırılması sağlanmıştır. Daha sonra hücreleri yıkamak için her bir tüpe 2 ml RPMI 1640 medyumu (37ºC) ilave edilmiş ve tüpler 2000 rpm de 5 dk. santrifüj edilmiştir. Santrifüj sonunda süpernatant atılmış ve ikinci defa 2 ml RPMI 1640 uygulaması yapılmıştır. Yine 2000 rpm de 5 dk. santrifüjün ardından süpernatant atılmış ve tüplere bu defa 2 ml Gibco PBMax Besiyeri (37ºC) ve son konsantrasyonu 10 µg/ml olacak şekilde BrdUrd eriyiği ilave edilerek 72. saatin sonuna kadar 37ºC de inkübasyona devam edilmiştir. Kültür süresinin bitiminden 2 saat önce (kültürün 70. saatinde) her tüpe hazırlanan kolkisin eriyiğinden 20 μl (0.06 μg/ml) ilave edilmiş ve tüpler hafifçe sallanarak karıştırılmıştır. Bu aşamadan sonra yapılan işlemler deneyin S9 mix siz bölümü ile aynıdır Preparatların Boyanması ve Daimi Preparatların Hazırlanması Bir kromozoma ait kardeş kromatidlerin farklı boyanmasını (Sister Chromatid Differentiation = SCD) sağlamak amacıyla Speit (1984), Speit ve Haupter in (1985) geliştirdikleri metod modifiye edilerek kullanılmıştır. Bu amaçla bir günlük preparatlar ışınlama kabına konarak üzeri bir film şeklinde Sorensen tamponu ile örtülecek şekilde kapatılmıştır. Işınlama eriyiği 5 ml Sorensen Tampon A, 5 ml Sorensen Tampon B alınıp bu karışımın destile su ile 100 ml ye tamamlanmasıyla hazırlanmıştır (ph=6.8). Işınlama eriyiğinin az ya da fazla olmasının kardeş kromatidler arasındaki kontrast farkını önemli derecede etkilediği görülmüştür. Bu şekilde ince bir tabaka halinde ışınlama eriyiği ile örtülen preparatlar, karanlıkta 15 cm yükseklikten 30 W lık 254 nm dalga boyunda ışık yayabilen tek ultraviyole lambası ile 30 dk. ışınlandırılmıştır. Işınlama bittikten sonra preparatlar 1 SSC eriyiği içerisinde 60ºC (±2 ºC) de 60 dk. inkübe edilmiştir. 51

73 3. MATERYAL VE METOD Fezel NİZAM hazırlanmıştır. İnkübasyon süresi bitmeden 15 dk. önce % 5 lik Giemsa boya eriyiği % 5 lik Giemsa boyasının hazırlanması: 4 ml tampon A, 4 ml tampon B ve 4 ml Giemsa karıştırılarak üzerine 80 ml oluncaya kadar saf su ilave edilmiştir (ph=6.72). Sonra bu boya dik bir şale içerisine filtre kâğıdı yardımıyla süzülmüştür. İnkübasyon süresinin sonunda preparatlar 1 SSC eriyiğinden alınarak doğrudan boya içerisine konmuş ve yaklaşık olarak 40 dk. boya içerisinde bekletilmiştir (kardeş kromatidler arasındaki en iyi kontrast farkı bu sürenin sonunda elde edilmiştir). Bu sürenin sonunda preparatlar boyadan çıkarılmış ve üç ayrı kaptaki saf sudan geçirilerek preparatların üzerindeki fazla boyanın akması sağlanmıştır. Bundan sonra preparatlar dik vaziyette kurumaya bırakılmıştır. Boyanmış preparatlar kuruduktan sonra entellan ile kapatılarak daimi hale getirilmiştir Daimi Preparatlarda Mikroskobik İnceleme Hazırlanmış olan daimi preparatlar OLYMPOS CX21 marka ışık mikroskobunda immersiyon objektifi ile incelenmiştir ( = 1000 büyütmede). Bu incelemeler sırasında kardeş kromatid değişimi sayısı (KKD) ve kromozomal anormallikler belirlenmiştir. Aynı preparatlarda birinci, ikinci ve üçüncü mitoz bölünmeyi geçiren hücrelerin sayısı ve toplam hücre içerisinde mitoz bölünmeyi geçiren hücrelerin sayısı saptanmıştır. Bu incelemeler sonucunda proliferasyon indeksi (PI) ve mitotik indeks (MI) saptanmıştır KKD Sayısının ve Proliferasyon İndeksinin (PI) (Replikasyon İndeksi=RI) Saptanması (1). KKD Sayısının Saptanması KKD sayısı, her kişinin kan kültürüne ait preparatlardan iyi dağılmış ve ikinci mitozu geçiren 25 hücrede (dört kişiden toplam 100 hücre) saptanmıştır. KKD sayısı 52

74 3. MATERYAL VE METOD Fezel NİZAM bir kromozomun açık boyanmış kromatidindeki koyu boyanmış parçaların veya koyu boyanmış kromatidindeki açık boyanmış parçaların sayılmasıyla belirlenmiştir. Ortadan bir parça değişimi olmuş ise bu iki KKD olarak değerlendirilmiştir (Şekil 3.1.a). Uçtan parça değişimi olmuş ise bu da bir KKD olarak sayılmıştır (Şekil 3.1.b). Ancak bu incelemeler esnasında kromatidlerin primer boğum bölgelerinden dönüm yapıp yapmadıklarına dikkat etmek gerekir. Bu durumda kromozomlarda KKD yoktur (Şekil 3.1.c). Şekil 3.1. Kardeş Kromatid Değişiminin Olduğu ve Olmadığı Durumun Şematik Olarak Gösterilmesi (Topaktaş ve Speit, 1990) (2). Proliferasyon İndeksi (PI) (Replikasyon İndeksi=RI) nin Saptanması Fluoksetin in DNA replikasyonu üzerindeki etkilerini araştırmak amacıyla PI bulunmuştur. Her kişinin kan kültüründen yapılan preparatlardan tesadüfi seçilmiş 100 hücrenin incelenmesiyle PI belirlenmiştir. Bu incelemeler sırasında gözlenen birinci, ikinci ve üçüncü mitoz bölünmeyi geçiren hücreler sayılmıştır. Bu verilerden yola çıkılarak her bir kişinin kan kültüründeki PI şu şekilde hesaplanmıştır: 53

75 3. MATERYAL VE METOD Fezel NİZAM M1: Birinci mitozu geçiren hücrelerin sayısı M2: İkinci mitozu geçiren hücrelerin sayısı M3: Üçüncü mitozu geçiren hücrelerin sayısı Birinci, ikinci ve üçüncü metafaz plakları şu şekilde ayırt edilmiştir (Topaktaş ve Speit. 1990): BrdUrd, deoxytimidin (dt) ve deoxyuridin (du) birbirlerinin anoloğu olan bileşiklerdir. BrdUrd, dt ve du arasındaki tek fark taşıdıkları heterosiklik benzen halkasındaki beşinci C atomuna bağlanan grupların farklı olmasından kaynaklanmaktadır. Beşinci C atomuna bağlanan grup dt de CH 3, BrdUrd de Br ve du de H atomudur (Şekil 3.2). HN O CH3 HN O Br HN O H O N O N O N HO CH 2 O HO CH 2 O HO CH 2 O OH OH OH Deoxytimidin (dt) Bromodeoxyuridin (BrdUrd) Deoxyuridin (du) Şekil 3.2. Deoxytimidin (dt), Bromodeoxyuridin (BrdUrd) ve Deoxyuridin(dU) in kimyasal yapıları. BrdUrd, DNA nın yapısında bulunan timin bazlarının anoloğu olduğundan kültür ortamına BrdUrd eklendiğinde hücreler DNA larını replike ettikleri esnada (birinci S fazında) yeni sentezlenen polinukleotid ipliği içine timinin yerine ortamda 54

76 3. MATERYAL VE METOD Fezel NİZAM bulunan BrdUrd girecektir. Böyle hücrelerin kromozomları boyandığında bir kromozomun her iki kromatidi de (BrdUrd/dT : dt/brdurd) homojen koyu renkte boyanacaktır. Bu hücreler birinci mitoz bölünmeyi geçiren hücrelerdir (Şekil 3.3 A ve Şekil 3.4). Birinci mitoz bölünmeyi geçiren hücrelerden meydana gelen yavru hücreler tekrar S fazına girdiğinde (BrdUrd li ortamda ikinci S fazı) timin içeren polinukleotid ipliğine komplementer olarak sentezlenen yeni DNA ipliğinde BrdUrd yer alacaktır. Bu iki polinukleotid ipliği bir kromozomun koyu boyanan kromatidini (BrdUrd/dT) oluşturacaktır. BrdUrd içeren ipliğe komplementer olarak sentezlenen yeni ipliğe de BrdUrd girecektir ve bir kromatidi oluşturan iki polinukleotid ipliği de BrdUrd içereceğinden (BrdUrd/BrdUrd) bu kromatid, aynı kromozomun açık boyanan kromatidini oluşturacaktır (BrdUrd/BrdUrd). İşte bu hücrenin metafaz devresinde kromozomlar boyandığında tüm kromozomların kromatidlerinden birisi koyu diğeri açık renkte boyanacaktır (BrdUrd/dT : BrdUrd/BrdUrd). Bunlarda ikinci mitoz bölünmeyi geçiren hücrelerdir (Şekil 3.3 B ve Şekil 3.5). Bu hücreler tekrar S fazına girdiğinde (BrdUrd li ortamda üçüncü S fazı) ikinci mitozda açık boyanan kromatidden (BrdUrd/BrdUrd) tüm polinukleotid ipliklerine BrdUrd girmiş olan bir kromozom meydana gelecektir ve bu kromozomun her iki kromatidi de açık boyanacaktır (BrdUrd/BrdUrd:BrdUrd/BrdUrd). İkinci mitozda koyu boyanan kromatidden ise (dt/brdurd), bir kromatidin her iki ipliği BrdUrd li ve diğer kromatidinin bir ipliği timinli diğer ipliği BrdUrd li olan bir kromozom (BrdUrd/BrdUrd:dT/BrdUrd)oluşacaktır. Bu kromozom da boyandığında bir kromatidi koyu renkte, diğer kromatidi açık renkte olacaktır. İşte böyle hücrenin metafaz devresinde preparat yapıldığında bazı kromozomların her iki kromatidi açık renkte, bazı kromozomların bir kromatidi açık diğer kromatidi koyu renkte boyanacaktır. Bu hücreler de üçüncü mitoz bölünmeyi geçiren hücrelerdir (Şekil 3.3 C ve Şekil 3.6). İşte bu şekilde birinci, ikinci ve üçüncü mitoz bölünmeyi geçiren hücreler ayırt edilmiş, 100 hücre içinde bu hücrelerin sayısı saptanmış ve elde edilen veriler kullanılarak yukarıdaki formüle göre PI hesaplanmıştır. 55

77 3. MATERYAL VE METOD Fezel NİZAM Şekil 3.3.BrdUrd nin DNA Yapısına Girmesi ile Birinci, İkinci ve Üçüncü Mitoz Bölünmeyi Geçiren Hücrelerin Ayırt Edilmesinin Şematik Olarak Açıklanması (During, 1985 e göre Topaktaş ve Speit, 1990 dan). 56

78 3. MATERYAL VE METOD Fezel NİZAM 10 µm Şekil 3.4.Birinci mitoz bölünmeyi geçiren hücrenin metafaz kromozomları (X1000). 10 µm Şekil 3.5.İkinci mitoz bölünmeyi geçiren hücrenin metafaz kromozomları (X1000). 57

79 3. MATERYAL VE METOD Fezel NİZAM 10µm Şekil 3.6.Üçüncü mitoz bölünmeyi geçiren hücrenin metafaz kromozomları(x1000) Kromozom Anormallikleri (KA) ve Mitotik İndeksin (MI) Saptanması (1).Kromozom Yapı ve Sayı Anormalliklerinin Saptanması Her bir kişiden hazırlanan preparatlardan iyi dağılmış kromozomlara sahip toplam 100 hücre (dört kişiden toplam 400 hücre) KA yı saptamak amacıyla incelenmiştir. Bu hücrelerde gözlenen yapı ve sayı anormallikleri kaydedilmiştir. KA lı hücrelerin yüzdelerinin hesaplanmasında sadece yapısal kromozom aberasyonları göz önünde bulundurulmuştur. İncelenen bu 100 hücre içinde anormallik taşıyan hücrelerin yüzdesi ile toplam KA sayısı hesaplanmıştır. Toplam KA sayısı incelenen hücre sayısına bölünerek hücre başına düşen KA sayısı (KA/Hücre) saptanmıştır. Bu çalışmada gap lar anormallik olarak değerlendirilmemiştir (Mace ve ark. 1978). Gap lar ile kromatid ve kromozom tipi kırıkları arasındaki farklar şu şekilde ayırt edilmiştir (Preston, 1987 e göre; Kauderer ve ark den): Gap larda, kromatidin birinde (kromatid tipi gap) veya kromatidin 58

80 3. MATERYAL VE METOD Fezel NİZAM her ikisinde (kromozom tipi gap) görülen boyanmamış bölge bir kromatidin kalınlığından daha azdır. Kırıklarda bir kromatiddeki (kromatid tipi kırık) veya her iki kromatiddeki (kromozom tipi kırık) boyanmamış bölge bir kromatidin kalınlığından daha fazladır. İşte bu ölçülere göre gap ve kromatid kırıkları birbirinden ayırt edilmiştir. Mace ve ark. (1978) ise gap bölgesinde DNA ipliğinde kırık olmadığını elektron mikroskobu fotoğraflarında göstermişlerdir. Bu çalışmada kromatid kırığı ve tek kol birleşmesi gibi anormallikler kromatid tipi anormallik olarak değerlendirilmiştir. Ayrıca kromozom kırığı, kardeş kromatid birleşmesi, kromatid değişimi, halka kromozom, fragment ve disentrik kromozom oluşumu gibi anormallikler de kromozom tipi anormallikler olarak değerlendirilmiştir (2).Mitotik İndeksin (MI) Saptanması Fluoksetin in mitoz bölünme üzerine etkilerini belirlemek amacıyla MI saptanmıştır. MI i belirlemek için her bir kişiye ait preparatlarda toplam 3 bin hücre incelenmiş ve bunlar arasında mitoz bölünme geçiren hücrelerin sayısı kaydedilmiştir. 3 bin hücre içinde mitoz bölünme geçiren hücrelerin oranı yüzde cinsinden hesaplanarak MI saptanmıştır. 3.5.Mikronukleus (MN) Oluşumunu Saptamak Amacıyla Hücre Kültürünün Yapılması, Preparatların Hazırlanması, Boyanması ve Mikroskobik İncelemeler Hücre Kültürünün Yapılması ve Preparatların Hazırlanması (S9 mix siz test) In vitro mikronukleus testinde Rothfuss ve ark. (2000) nın geliştirdikleri yöntem modifiye edilerek kullanılmıştır. Bu yönteme göre, sağlıklı ve sigara içmeyen yaşları birbirine yakın iki erkek ve iki bayandan alınan 1/10 oranında heparinize edilmiş kan örnekleri kromozom medyumlarına steril şartlarda 6 damla 59

81 3. MATERYAL VE METOD Fezel NİZAM (0.2 ml) ekilmiştir ve hücreler 37±1ºC de 68 saat inkübe edilmiştir. Çalışmada kullanılan antidepresan ilacın etkisini belirlemek için son konsantrasyon 8, 12, 16, 20 µg/ml olacak şekilde Fluoksetin kültür ortamına, kültürün başlangıcından 20 ve 44 saat sonra ilave edilmiştir. Ayrıca her deneyin bir kontrolü, bir de pozitif kontrol grubu vardır. İnkübasyonun başlangıcından 44 saat sonra her tüpe konsantrasyonu 6 µg/ml olacak şekilde sitokalasin-b maddesi ilave edilmiş ve böylece bölünen hücrelerde sitokinez engellenmiştir. İnkübasyonun sonunda, kültür tüpleri 2000 rpm de 5 dk. santrifüj edilerek süpernatant atılmış ve hücrelerin bulunduğu tüplere hipotonik eriyik (%0.4 KCI) ilave edildikten sonra tüpler inkübasyon yapmaksızın direkt olarak santrifüje alınmıştır. Hipotonik eriyik, kültüre yavaş yavaş ve pipetaj yapılarak ilave edilmiştir. Kültür tüpleri 1200 rpm de 10 dk. santrifüj edilmiş ve süpernatant atılarak birinci fiksatif (1/5/6=glasiyal asetik asit/metanol/%0.9 NaCI) ilave edilmiş ve hücreler bu fiksatif ile muamele edilmiştir. Birinci fiksatif ile oda sıcaklığında 15 dk. muameleden sonra 1200 rpm de 10 dk. daha santrifüj edilen tüplere iki kez glasiyal asetik asit/ metanol (1/5) ilavesi yapılarak 10 dk. oda sıcaklığında fiksatif muamelesi yapılmıştır. Sonra santrifüj yapılarak süpernatant atılmış ve kültür tüplerinin dibinde toplanmış olan hücreler resüspanse edilmiştir. Daha sonra, hücre süspansiyonu soğuk ve temiz lamlar üzerine 10 cm yükseklikten damlatılarak preparatlar hazırlanmıştır Hücre Kültürünün Yapılması ve Preparatların Hazırlanması (S9 mix li test) Fluoksetin in indirekt genotoksik etkisinin olup olmadığını araştırmak amacıyla kültürün bitiminden 24 (kültürün başlangıcından 44 saat sonra) saat önce 8, 12, 16 ve 20 μg/ml Fluoksetin 0.5 ml S9 mix ile birlikte tüplere ilave edilmiştir. Yine her deneyin bir kontrolü ve S9 mix siz deneyden farklı olarak cyclophosphamide ilave edilmiş bir pozitif kontrolü vardır. Pozitif kontrolde, kültür tüpüne cyclophosphamide son konsantrasyonu 28 μg/ml olacak şekilde ilave edilmiştir. Kontrol ve pozitif kontrol tüplerine de 0.5 ml S9 mix ilave edilmiştir. 3 saat 37ºC de inkübasyonun ardından (hücre kültürünün 47. saati) tüpler 2000 rpm de 5 dk. santrifüj edilmiş, süpernatant atılmış ve böylece ortamdaki S9 mix in de 60

82 3. MATERYAL VE METOD Fezel NİZAM uzaklaştırılması sağlanmıştır. Daha sonra hücreleri yıkamak için her bir tüpe 2 ml RPMI 1640 medyumu (37ºC) ilave edilmiş ve tüpler 2000 rpm de 5 dk. santrifüj edilmiştir. Santrifüj sonunda süpernatant atılmış ve ikinci defa 2 ml RPMI 1640 uygulaması yapılmıştır. Yine 2000 rpm de 5 dk. santrifüjün ardından süpernatant atılmış ve tüplere bu defa 2 ml Gibco PBMax Besiyeri (37ºC) ve son konsantrasyonu 6 µg/ml olan sitokalasin-b eriyiği ilave edilerek 68. saatin sonuna kadar 37ºC de inkübasyona devam edilmiştir. Bu aşamadan sonra yapılan işlemler deneyin S9 mix siz bölümü ile aynıdır Preparatların Boyanması Hazırlanan preparatlar bir gün sonra Sorensen tamponunda hazırlanmış %5 lik Giemsa boyası ile 7-8 dk. boyanmış ve üç ayrı kapta bulunan saf sudan geçirilerek kurumaya bırakılmıştır. Kuruma işleminden sonra preparatlar entellan ile kapatılarak incelemeye hazır hale getirilmiştir Mikronukleus Testi İçin Hazırlanan Preparatlarda Mikroskobik İnceleme Hazırlanan daimi preparatlar OLYMPUS marka ışık mikroskobunda 10 40=400 büyütmede incelenmiştir Mikronukleus Sayısı ve Nukleus Bölünme İndeksinin (NBI) Saptanması Mikronukleus sayısını belirlemek amacıyla her bir kişiye ait daimi preparatlarda her kişinin, her muamele grubu ve kontrollerinde iki nukleusa sahip (binukleer) toplam 1000 hücre (Şekil 3.8) incelenmiş ve bu binukleer hücreler içerisinden mikronukleuslu olanlar saptanmıştır. Ayrıca incelenen hücrelerde toplam mikronukleus sayısı belirlenmiştir. Toplam mikronukleus sayısında MN % si hesaplanmıştır. Binukleer hücre ve mikronukleus ayırımı Titenko-Holland ve ark. (1997) ve Fenech (2000) e göre yapılmıştır: (1) Hücreler belirgin sitoplazmasıyla yuvarlak ya da oval görünüme sahip olmalıdır; (2) Benzer olarak, nukleuslar belirgin nukleus zarıyla çevrili yuvarlak ya da oval olmalıdır; (3) İçerisinde MN sayılan hücreler 61

83 3. MATERYAL VE METOD Fezel NİZAM sadece bir nukleus bölünmesi geçiren hücrelerdir; (4) MN lar sadece ana nukleusun 1/3 ü ya da daha küçük olduklarında hesaba katılmalıdır; (5) MN lar ana nukleus gibi boyanmalıdır; (6) MN lar ana nukleustan açık bir şekilde ayrılmış olmalıdır. Sitokinez bloklama yönteminin en önemli yararı, bölünen hücre populasyonunda nukleus bölünmesinin ilerleyişini ve çoğalmasını belirleyecek imkanı vermesidir. Bu durum, sitokalasin-b ilavesinin ardından oluşan bir nukleuslu, iki nukleuslu, multinukleuslu (>2) hücrelerin sayılmasıyla yapılır. Nukleus bölünme indeksi (NBI) Eastmond ve Tucker (1989) tarafından önerilen formüle göre hesaplanmıştır. NBI= (MI + 2 MII + 3 MIII + 4 MIV) / N Formüle göre, MI bir nukleuslu (Şekil 3.7), MII iki nukleuslu (Şekil 3.8), MIII üç nukleuslu (Şekil 3.9), MIV dört nukleuslu (Şekil 3.10) hücrelerin sayısını, N ise toplam hücre sayısını göstermektedir. NBI nin hesaplanması kimyasal veya fiziksel bir maddenin sitotoksik etkisini göstermede önemli bilgiler sağlar (Fenech, 1997). Bu nedenle, MN bakımından incelenen preparatlar daha sonra nukleus bölünme indeksini (NBI) belirlemek için tekrar incelenmiştir. Bu çalışmada NBI için, her bir kişinin preparatlarından tesadüfi seçilmiş alanlarda toplam 1000 hücre (4 kişi 4000 hücre) incelenmiştir. 62

84 3. MATERYAL VE METOD Fezel NİZAM 10 µm Şekil 3.7.Bir nukleuslu hücre (X1000). 10µm Şekil 3.8.İki nukleuslu hücre (X1000). 63

85 3. MATERYAL VE METOD Fezel NİZAM 10µm Şekil 3.9.Üç nukleuslu hücre (X1000). 10µm Şekil 3.10.Dört nukleuslu hücre (X1000). 64

86 3. MATERYAL VE METOD Fezel NİZAM 3.6.Mikroskopta Fotoğraf Çekme Fotoğraf çekme işlemi OLYMPUS marka trinoküler mikroskoba bağlı dijital fotoğraf makinesinde 1000 büyütmede yapılmıştır (Olympus CX31RTSF, 7.1 Megapixel). 1., 2. ve 3. mitoz bölünmeyi geçiren hücrelerin, sık rastlanan ve ilginç olan KA ların, mikronukleuslu binukleer hücreler ile 1, 2, 3, 4 nukleuslu hücrelerin fotoğrafları çekilmiştir. 3.7.İstatistiksel Analiz ve Sonuçların Değerlendirilmesi Mikroskobik inceleme sonucunda elde edilen KA, KKD, MI, PI, MN ve NBI parametrelerine ait veriler için her bir muameleli grubun ortalamaları ile kontrol kültürlerinin ortalamaları arasındaki farkın önemli olup olmadığı t-testi metodu ile kontrol edilmiştir. Doz-etki ilişkisini ortaya koymak amacıyla regresyon ve korelasyon analizleri yapılmış, regresyon denklemi ve korelasyon katsayısı (r) bulunmuş ve regresyon doğrusu çizilmiştir. Mikroskobik incelemeler sonucunda elde edilen bulgular çizelge ve grafikler halinde verilmiştir. 65

87 3. MATERYAL VE METOD Fezel NİZAM 66

88 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Fezel NİZAM 4.BULGULAR VE TARTIŞMA 4.1.Bulgular Fluoksetin in Eksojen Metabolik Aktivatör Bulunmayan Ortamda İnsan Periferal Kan Lenfositlerindeki Genotoksik Etkileri Fluoksetin in Kardeş Kromatid Değişimi (KKD) Üzerindeki Etkileri Dört farklı konsantrasyondaki (8, 12, 16 ve 20µg/ml) Fluoksetin ile 24 ve 48 saat muamele edilen insan periferal lenfositlerinde saptanan ortalama kardeş kromatid sayıları (KKD/Hücre) Çizelge 4.1. de görülmektedir. Fluoksetin, 24 ve 48 saat muamele sürelerinde kontrole göre KKD sayısını artırmamıştır (Çizelge 4.1). Çizelge 4.1.Değişik Dozlarda Fluoksetin ile 24 ve 48 Saat Muamele Edilmiş Olan İnsan Periferal Kan Lenfositlerinde Hücre Başına Düşen Ortalama KKD Sayısı. Test Maddesi Muamele Süresi (saat) Konsantrasyon (µg/ml) Min-Max KKD KKD/Hücre±SH Kontrol ± 0.08 MMC (PK) ± 3.72 Fluoksetin ± b ±0.41 b ± 0.69 b ±0.49 b 3 MMC (PK) ± 8.75 Fluoksetin a: Kontrol ile; b: Pozitif Kontrol ile aradaki fark önemlidir. a 1 b 1 : P 0.05 a 2 b 2 : P 0.01 a 3 b 3 : P ±0.37 b ± 0.56 b ±0.23 b ± 1.19 b 2 67

89 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Fezel NİZAM Fluoksetin in Kromozom Anormallikleri (KA) Oluşumu Üzerindeki Etkileri Dört farklı konsantrasyonda (8, 12, 16 ve 20µg/ml) Fluoksetin ile 24 ve 48 saat muamele edilen insan periferal lenfositlerinde saptanan kromozom anormallik çeşitleri, kromozom anormalliğine sahip anormal hücre yüzdesi ve hücre başına düşen kromozom anormallikleri (KA/Hücre) Çizelge 4.2. de görülmektedir. Fluoksetin, tüm dozlarda ve muamele sürelerinde anormal hücre (AH) % sini kontrole nazaran önemli derecede artırmıştır (Çizelge 4.2.). Ayrıca KA/Hücre sayısı da 48 saatlik muamelede 8 µg/ml konsantrasyon hariç, diğer tüm konsantrasyonlarda istatistiki bakımdan önemli bir artış göstermiştir (Çizelge 4.2.). Yani Fluoksetin kromozom aberasyonu oluşumunu uyarmıştır. Ancak bu artış pozitif kontrol olan MMC deki kadar olmamıştır. Periferal lenfositlerindeki KA oluşumundaki artış ile doz arasında herhangi bir ilişki bulunamamıştır. Fluoksetin ile muamele edilen insan periferal lenfositlerinde kromatid tipi anormalliklerden özellikle kromatid kırığı (Şekil 4.1., Şekil 4.2., Şekil 4.3.) en fazla görülen anormallikler arasında sayılabilir. Kromozom tipi anormalliklerden özellikle kromozom kırığı(şekil 4.4.), fragment (Şekil 4.5.) ve kardeş kromatid bileşimi (sister union)(şekil 4.6.) gibi yapısal kromozom anormalliklerine ve poliploidi (Şekil 4.7.) gibi kromozom sayısal anormalliklerine rastlanmıştır. Ayrıca Fluoksetin ile muamele edilen 24 saatlik en düşük doz hariç, diğer tüm doz ve muamele sürelerinde dikkate değer miktarda kromozom kontraksiyonu gözlenmiştir (Şekil 4.8.). 68

90 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Fezel NİZAM Çizelge 4.2.Değişik Dozlarda Fluoksetin İle 24 ve 48 Saat Muamele Edilmiş Olan İnsan Periferal Kan Lenfositlerinde Kromozom Anormallik Çeşitleri, Anormal Hücre Oranı, KA/ Hücre. Test Maddesi Muamele Süre (saa) Kons. (µg/ml) Toplam Anormallikler B B F T DS KD KKB P Anormal Hücre (%) si ± SH 4.25±0.47 KA/Hücre±SH ± Kontrol MMC (pozitif kontrol) ± ± ±3.32 a ±0.03a ±3.88 a ±0.01a2b2 Fluoksetin ±0.50 a3 b3 0.17±0.00a3b ±2.32 a ±0.02a2 MMC (pozitif kontrol) ± ± ±1.91 a1b ±0.04b2 Fluoksetin ±2.68 a1b ±0.03a1b2 16* 20** ±1.91 a1b ±0.01a1b ±1.61 a1b ±0.01a2b3 B : Kromatid kırığı, B : Kromozom kırığı, F: Fragment, T: Translokasyon, DS: Disentrik kromozom, KD: Kromatid değişimi, KKB: Kardeş kromatid birleşmesi (sister union), P: Poliploidi. a: Kontrol ile ; b: Pozitif kontrol ile karşılaştırmada fark önemlidir. a1b1: P < 0.05 a2b2: P < 0.01 a3b3: P < * 378 hücre incelendi ** 158 hücre incelendi. 69

91 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Fezel NİZAM 10µm Şekil 4.1.Kromatid kırığı (B') bulunan metafaz plağı (20µg/ml Fluoksetin, 24 saatlik muamele, ) X µm Şekil 4.2.Kromatid kırığı (B') bulunan metafaz plağı (8 µg/ml Fluoksetin, 48 saatlik muamele, ) X

92 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Fezel NİZAM 10µm Şekil 4.3.Kromatid kırığı (B') bulunan metafaz plağı (8 µg/ml Fluoksetin, 24 saatlik muamele, ) X µm Şekil 4.4.Kromozom kırığı (B'') bulunan metafaz plağı (8 µg/ml Fluoksetin, 24 saatlik muamele, ) X

93 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Fezel NİZAM 10µm Şekil 4.5.Fragment (F) bulunan metafaz plağı (20 µg/ml Fluoksetin, 24 saatlik muamele, ) X µm Şekil 4.6.Kardeş kromatid birleşmesi (SU) bulunan metafaz plağı (8 µg/ml Fluoksetin, 24 saatlik muamele, ) X

94 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Fezel NİZAM 10µm Şekil 4.7.Poliploid hücre kromozomları (8 µg/ml Fluoksetin, 24 saatlik muamele, ) X µm Şekil 4.8.Kontraksiyonlu kromozoma sahip metafaz plağı (16 µg/ml Fluoksetin, 48 saatlik muamele, ) X

95 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Fezel NİZAM Fluoksetin in DNA Replikasyonu ve Mitoz Bölünme Üzerindeki Etkileri Fluoksetin in DNA replikasyonu üzerine etkisi proliferasyon indeksi (PI)(replikasyon indeksi (RI)) nin, mitoz bölünme üzerindeki etkisi ise mitotik indeks (MI) in bulunması yoluyla saptanmıştır. Dört farklı konsantrasyondaki (8, 12, 16 ve 20µg/ml) Fluoksetin ile 24 ve 48 saat muamele edilen insan periferal lenfositlerinde saptanan PI ve MI Çizelge 4.3. de görülmektedir. Fluoksetin 24 ve 48 saatlik muamele sürelerinde proliferasyon indeksini genel olarak düşürmesine rağmen sadece 16 µg/ml konsantrasyonunda Fluoksetin ile 48 saat muamele edilen grupta kontrol ve pozitif kontrole nazaran farkın önemli olduğu bulunmuştur (Çizelge 4.3.). PI ndeki bu düşüş 24 ve 48 saatlik muamele süresinde doza bağlı olarak gerçekleşmiştir (Şekil 4.9., Şekil 4.10.). Hem 24 hem de 48 saat muamele sürelerinde Fluoksetin genel olarak MI yi düşürmüştür. Ancak bu düşüş 24 saat muamele edilen grupta en yüksek dozda, 48 saat muamele edilen grupta ise en yüksek iki dozda hem kontrol hem de pozitif kontrole nazaran önemli bulunmuştur. 24 ve 48 saat muamele edilen gruplardaki MI deki düşüş konsantrasyona bağlı durum göstermiştir (Şekil 4.11 ve 4.12.). 74

96 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Fezel NİZAM Çizelge 4.3. Değişik Dozlarda Fluoksetin ile 24 ve 48 Saat Muamele Edilmiş Olan İnsan Periferal Kan Lenfositlerinde Proliferasyon İndeksi (PI) ve Mitotik İndeks (MI). Test Maddesi Süre (saat) Muamele Kons. (µg/ml) M1 M2 M3 PI±SH MI±SH Kontrol ± ±0.41 MMC (PK) ± ± ± ±0.25 Fluoksetin ± ± ± ± ± ±0.30 a 2 b 1 MMC (PK) ± ± ± ±0.93 Fluoksetin * ± ±0.06 a 2 b ±0.61 a ±0.45 a 2 b 1 20** ± ±0.18 a 3 b 3 a: Kontrol ile; b: Pozitif Kontrol ile aradaki fark önemlidir. a 1 b 1 : P 0.05 a 2 b 2 : P 0.01 a 3 b 3 : P * 392 hücre incelenmiştir. ** 225 hücre incelenmiştir. 75

97 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Fezel NİZAM PI = doz 2,1 S 0, R-Sq 90,6% R-Sq(adj) 85,8% 2,0 y = X r = PI 1,9 1,8 1, Konsantrasyon (µg/ml) Şekil 4.9.S9 mix yokluğunda farklı dozlarda Fluoksetin ile 24 saat muamele edilen insan periferal lenfositlerinde PI nin doza bağlı azalışını gösteren regresyon doğrusu ve korelasyon katsayısı (P< 0.048). 1,8 1,7 PI = doz S 0, R-Sq 90,3% R-Sq(adj) 85,4% 1,6 1,5 y = X r = PI 1,4 1,3 1, Konsantrasyon (µg/ml) Şekil 4.10.S9mix yokluğunda farklı dozlarda Fluoksetin ile 48 saat muamele edilen insan periferal lenfositlerinde PI nin doza bağlı azalışını gösteren regresyon doğrusu ve korelasyon katsayısı (P< 0.050) 76

98 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Fezel NİZAM 5,0 4,5 4,0 MI = MI = ,064 - doz 0,1672 doz y y = = X - 0,436X ,576 r = - 1 r = 0,938 S 0, R-Sq 100,0% R-Sq(adj) 99,9% MI MI 3,5 3, Konsantrasyon (µg/ml) (µg/ml) Şekil 4.11.S9mix yokluğunda farklı dozlarda Fluoksetin ile 24 saat muamele edilen insan periferal lenfositlerinde MI in doza bağlı azalışını gösteren regresyon doğrusu ve korelasyon katsayısı (P< 0.000). MI = doz 3,0 S 0, R-Sq 96,4% R-Sq(adj) 94,7% 2,5 2,0 y = X r = MI 1,5 1, Konsantrasyon (µg/ml) Şekil 4.12.S9mix yokluğunda farklı dozlarda Fluoksetin ile 48 saat muamele edilen insan periferal lenfositlerinde MI in doza bağlı azalışını gösteren regresyon doğrusu ve korelasyon katsayısı (P< 0.018). 77

99 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Fezel NİZAM Fluoksetin in Mikronukleus (MN) Oluşumu ve Nukleus Bölünmesi Üzerindeki Etkileri Fluoksetin in dört farklı konsantrasyon (8, 12, 16 ve 20µg/ml) ile 24 ve 48 saat muamele edilen insan periferal lenfositlerinde mikronukleus oluşumu ve nukleus bölünmesi üzerine etkileri Çizelge 4.4. de görülmektedir. Fluoksetin 24 saat muamele süresinde sadece en yüksek dozda, 48 saat muamele süresinde ise 12 µg/ml dozda mikronukleus (MN) oluşumunu kontrole göre uyarmıştır. Ayrıca en yüksek iki konsantrasyondaki (16 µg/ml ve 20 µg/ml) Fluoksetin ile 48 saat muamele edilen gruplarda yeterli sayıda binukleer hücre bulunmamıştır. İki nukleuslu hücrelerde değişik sayı ve büyüklüklerde mikronukleusa rastlanmıştır (Şekil 4.13., 4.14., 4.15.) Fluoksetin in nukleus bölünmesi üzerindeki etkisi nukleus bölünme indeksi (NBI) bulunarak saptanmıştır. Fluoksetin ile 24 saat muamele edilen kültürde NBI kontrol ve pozitif kontrole göre genel olarak düşüş göstermiştir, fakat bu düşüş önemli değildir. Buna karşılık Fluoksetin ile 48 saat muamele edilen kültürde NBI kontrol ve pozitif kontrole göre istatistiki açıdan önemli derecede azalmıştır (Çizelge 4.4.). 78

100 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Fezel NİZAM Çizelge 4.4.Değişik Dozlarda Fluoksetin ile 24 ve 48 Saat Muamele Edilmiş Olan İnsan Periferal Kan Lenfositlerinde MN % si ve NBI. Test Maddesi Muamele Süre (saat) Kons. (µg/ml) % MN Nukleus Sayısına Göre Hücrelerin Dağılımı NBI±SH Kontrol ± ±0.00 MMC (PK) ± ± ±0.17 b ±0.26 Fluoksetin ±0.05 b ±0.07 a1 b ± ± ± ±0.06 MMC (PK) ± ± ±0.27 b3 Fluoksetin 12* 1.36±0.08 a1 b ** ±0.05 a1b ±0.06 a1b ±0.00 a3b3 *: 3100 hücre incelenmiştir; **: 3000 hücre incelenmiştir., a: Kontrol ile; b: Pozitif Kontrol ile aradaki fark önemlidir. a1b1: P 0.05 a2b2: P 0.01 a3b3: P

101 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Fezel NİZAM 10µm Şekil 4.13.İki mikronukleus içeren iki nukleuslu hücre (8 µg/ml Fluoksetin, 48 saatlik muamele, ) X µm Şekil 4.14.Mikronukleus içeren iki nukleuslu hücre (8 µg/ml Fluoksetin, 24 saatlik muamele, ) X

102 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Fezel NİZAM 10µm Şekil 4.15.Mikronukleus içeren iki nukleuslu hücre (20 µg/ml Fluoksetin, 24 saatlik muamele, ) X Fluoksetin in Eksojen Metabolik Aktivatör (S9 mix) Bulunan Ortamda İnsan Periferal Kan Lenfositlerindeki Genotoksik Etkileri Metabolik Aktivatörün (S9 mix) Varlığında Fluoksetin in Kardeş Kromatid Değişimi (KKD) Üzerindeki Etkileri Dört farklı konsantrasyonda (8, 12, 16 ve 20 µg/ml) Fluoksetin ile eksojen metabolik aktivatör varlığında muamele edilen insan periferal lenfositlerinde saptanan ortalama kardeş kromatid sayısı (KKD/Hücre) Çizelge 4.5. de görülmektedir. Fluoksetin metabolik aktivatör bulunan ortamda KKD yi uyarmamıştır. Fluoksetin ile muameleli grubun kontrol ile arasındaki fark önemsizken, pozitif kontrol ile muameleli grup arasındaki fark önemlidir (Çizelge 4.5.). 81

103 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Fezel NİZAM Çizelge 4.5. Eksojen Metabolik Aktivatör Bulunan Ortamda (S9 mix) Değişik Dozlarda Fluoksetin ile Muamele Edilmiş İnsan Periferal Kan Lenfositlerinde Hücre Başına Düşen Ortalama KKD Sayısı. Test Maddesi Muamele Süresi (saat) Konsantrasyon (µg/ml) Min-Max KKD KKD/Hücre±SH Kontrol + S9 mix ± 0.45 Cyp (PK) + S9 mix ± 0.93 Fluoksetin + S9 mix ± 0.42 b ±0.47 b ± 0.37 b ± 0.54 b 2 a: Kontrol ile; b: Pozitif Kontrol ile aradaki fark önemlidir. a 1 b 1 : P 0.05 a 2 b 2 : P 0.01 a 3 b 3 : P Metabolik Aktivatörün (S9 mix) Varlığında Fluoksetin in Kromozom Anormalliklerinin (KA) Oluşumu Üzerindeki Etkileri Metabolik aktivatörlü (S9 mix) ortamda dört farklı konsantrasyonda Fluoksetin ile muamele edilen insan periferal lenfositlerinde KA lı hücrelerin oranında en yüksek üç konsantrasyonda (12, 16, 20 µg/ml) kontrole nazaran önemli artış gözlenmiştir (Çizelge 4.6.). Aynı zamanda tüm konsantrasyonlarda hücre başına düşen KA sayısında da önemli artış saptanmıştır (Çizelge 4.6.). Yani Fluoksetin metabolik aktivatör varlığında da KA oluşumunu uyarmıştır. Fluoksetin eksojen metabolik aktivatör varlığında kromatid kırığı (Şekil 4.16., Şekil 4.17.,), kromozom kırığı (Şekil 4.18.), fragment (Şekil 4.19.) ile poliploidi (Şekil 4.20.) gibi kromozom yapı ve sayı anormalliklerine neden olmuştur. 82

104 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Fezel NİZAM Çizelge 4.6.Eksojen Metabolik Aktivatör Bulunan Ortamda (S9 mix) Değişik Dozlarda Fluoksetin ile Muamele Edilmiş İnsan Periferal Kan Lenfositlerinde Kromozom Anormallik Çeşitleri, Anormal Hücre Oranı, KA/Hücre. Test Maddesi Süre (saat) Muamele Kons. (µg/ml) Anormallikler B B F KKB DS T KD P Anormal Hücre (%) ± SH KA/Hücre ± SH ± ± Kontrol + S9 mix P.K. + S9 mix ± ± ± 1.19 b1 0.09±0.00a1b3 12 Fluoksetin + S9 mix ± 1.03 a ±0.01a2b ± 1.31 a ±0.02a ± 1.10 a1b ±0.02a1 a: Kontrol ile; b: Pozitif Kontrol ile karşılaştırmada fark önemlidir. a1b1: P < 0.05 a2b2: P < 0.01 a3b3: P <

105 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Fezel NİZAM 10µm Şekil 4.16.Kromatid kırığı (B') bulunan metafaz plağı (16 µg/ml Fluoksetin + S9 mix, 3 saatlik muamele, ) X µm Şekil 4.17.Kromatid kırığı (B') bulunan metafaz plağı (20 µg/ml Fluoksetin + S9 mix, 3 saatlik muamele, ) X

106 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Fezel NİZAM 10µm Şekil 4.18.Kromozom kırığı (B'') bulunan metafaz plağı (16 µg/ml Fluoksetin + S9 mix, 3 saatlik muamele, ) X µm Şekil 4.19.İki fragment (F) bulunan metafaz plağı (20 µg/ml Fluoksetin + S9 mix, 3 saatlik muamele, ) X

107 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Fezel NİZAM 10µm Şekil 4.20.Poliploid hücre kromozomları ( 20 µg/ml + S9 mix, 3 saatlik muamele, ) X Fluoksetin in DNA Replikasyonu ve Mitoz Bölünme Üzerindeki Etkileri Fluoksetin in DNA replikasyonu üzerine etkisi proliferasyon indeksinin (PI), mitoz bölünme üzerinde etkisi ise mitotik indeksin (MI) hesaplanması yoluyla saptanmıştır. Fluoksetin, eksojen metabolik aktivatörün bulunduğu ortamda PI yı ve MI yı kontrole göre önemli derecede düşürmemiştir (Çizelge 4.7.). 86

108 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Fezel NİZAM Çizelge 4.7. Eksojen Metabolik Aktivatör Bulunan Ortamda (S9 mix) Değişik Dozlarda Fluoksetin ile Muamele Edilmiş İnsan Periferal Kan Lenfositlerinde Proliferasyon İndeksi (PI) ve Mitotik İndeks (MI). Test Maddesi Süre (saat) Muamele Kons. (µg/ml) M1 M2 M3 PI±SH MI±SH Kontrol + S9 mix ± ±0.48 Cyp (PK) + S9 mix ± ±0.32 Fluoksetin + S9 mix ± ± ±0.06 b ± ± ± ± ±0.57 a: Kontrol ile; b: Pozitif Kontrol ile aradaki fark önemlidir. a 1 b 1 : P 0.05 a 2 b 2 : P 0.01 a 3 b 3 : P Fluoksetin in Mikronukleus (MN) Oluşumu ve Nukleus Bölünmesi Üzerindeki Etkileri İnsan periferal lenfositlerinde Fluoksetin, metabolik aktivatörlü ortamda sadece en yüksek konsantrasyonda MN oluşumunu kontrole nazaran artırmıştır. Diğer konsantrasyonlardaki MN oluşumundaki artış önemli değildir (Çizelge 4.8.). Fluoksetin ile muamele edilen insan periferal kan lenfositlerinde genel olarak farklı sayı ve büyüklükte MN gözlenmiştir (Şekil 4.21., 4.22., 4.23.). Fluoksetin in nukleus bölünmesi üzerindeki etkisini belirlemek için nukleus bölünme indeksi (NBI) saptanmıştır. Fluoksetin NBI yı kontrol ve pozitif kontrole göre istatistiksel olarak önemli düzeyde düşürmemiştir (Çizelge 4.8.). 87

109 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Fezel NİZAM Çizelge 4.8.Eksojen Metabolik Aktivatör Bulunan Ortamda (S9 mix) Değişik Dozlarda Fluoksetin ile Muamele Edilmiş İnsan Periferal Kan Lenfositlerinde, MN % si ve NBI. Test Maddesi Süre (saat) Muamele Kons. (µg/ml) % MN Nukleus Sayısına Göre Hücrelerin Dağılımı NBI±SH Kontrol + S9 mix ± ±0.06 Cyp (PK) + S9 mix ± ±0.04 8* 2.72± ± Fluoksetin + S9 mix ± ± ± ± ±0.16 a ±0.02 *: 3728 hücre incelenmiştir. a: Kontrol ile; b: Pozitif kontrol ile aradaki fark önemlidir. a1b1: P 0.05 a2b2: P 0.01 a3b3: P

110 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Fezel NİZAM 10µm Şekil 4.21.Mikronukleus içeren iki nukleuslu hücre (12 µg/ml Fluoksetin + S9 mix, 3 saatlik muamele, ) X µm Şekil 4.22.İki mikronukleus içeren iki nukleuslu hücre (16 µg/ml Fluoksetin + S9 mix, 3 saatlik muamele, ) X

111 4. BULGULAR VE TARTIŞMA Fezel NİZAM 10µm Şekil 4.23.Mikronukleus içeren iki nukleuslu hücre (20 µg/ml Fluoksetin + S9 mix, 3 saatlik muamele, ) X Tartışma Fluoksetin in İnsan Periferal Lenfositlerinde Kardeş Kromatid Değişimi (KKD) ve Kromozom Aberasyonu (KA) Üzerindeki Etkisi Bu çalışmada, Fluoksetin in insan periferal lenfositlerinde metabolik aktivatörün yokluğunda ve varlığında KKD yi uyarmadığı saptanmıştır. Brambilla ve Martelli (2009) ile Brambilla ve ark. (2009) nın yapmış oldukları derleme çalışmalarına dayanarak sıçan kemik iliği hücrelerinde Fluoksetin in KKD yi uyarmadığını açıklamışlardır. Bu sonuçlar bizim sonuçlarımızı destekler yöndedir. Ancak depresyon tedavisi için 6-19 ay Fluoksetin kullanmış yaşları arasında değişen 30 hamile bayanda KKD analizi Dündaröz ve ark. (1999) tarafından yapılmış ve araştırıcılar uzun süre Fluoksetin kullanan bayanların periferal lenfositlerinde KKD nin kontrol grubuna göre artığını saptamışlardır. Bu sonuçların bizimkilerden farklılık göstermesi Fluoksetin in uzun süreli kullanımından kaynaklanmaktadır. Zira Fluoksetin, kullanıldıktan 6 8 saat sonra kana geçer ve kan proteinlerine %94,5 90