Doç. Dr. Sümer ARAS Danışmanlığında, Biyolog Aylin AYRIM tarafından hazırlanan Türkiye de Bulunan Bazı Ramalina (Ach.) Türlerinin rdna ITS Bölgesi Diz

Transkript

1 ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ TÜRKİYE DE BULUNAN BAZI Ramalina (ACH.) TÜRLERİNİN rdna ITS BÖLGESİ DİZİ ANALİZİ İLE FİLOGENETİK ANALİZİ Aylin AYRIM BİYOLOJİ ANABİLİM DALI ANKARA 2006 Her hakkı saklıdır 1

2 Doç. Dr. Sümer ARAS Danışmanlığında, Biyolog Aylin AYRIM tarafından hazırlanan Türkiye de Bulunan Bazı Ramalina (Ach.) Türlerinin rdna ITS Bölgesi Dizi Analizi İle Filogenetik Analizi adlı tez çalışması 20/10/2006 Tarihinde aşağıdaki jüri tarafından oy birliği ile Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalı nda YÜKSEK LİSANS TEZİ olarak kabul edilmiştir. Başkan: Prof. Dr. Ender YURDAKULOL Ankara Üniversitesi, Biyoloji Anabilim Dalı Üye: Prof. Dr. Gökhan SÖYLEMEZOĞLU Ankara Üniversitesi, Bahçe Bitkileri Anabilim Dalı Üye: Doç. Dr. Sümer ARAS Ankara Üniversitesi, Biyoloji Anabilim Dalı Yukarıdaki sonucu onaylarım. Prof.Dr.Ülkü MEHMETOĞLU Enstitü Müdürü 2

3 ÖZET Yüksek Lisans Tezi TÜRKİYE DE BULUNAN BAZI Ramalina (ACH.) TÜRLERİNİN rdna ITS BÖLGESİ DİZİ ANALİZİ İLE FİLOGENETİK ANALİZİ Aylin AYRIM Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalı Danışman: Doç. Dr. Sümer ARAS Bu çalışma; ülkemizde yayılış gösteren Ramalina liken cinsinden Ramalina polymorpha, Ramalina fastigiata ve Ramalina capitata türlerine ait örneklerin rdna (ITS) bölgelerinin PCR yardımıyla çoğaltılması, ilgili bölge dizi analizi ile incelenmesi, ve incelenen türler arasındaki benzerlik ve farklılıkların ortaya çıkartılması amacıyla yapılmıştır. ITS 1F ve ITS 4 primerleri yardımıyla ilgili bölge çoğaltılmış ve bunu takiben dizi analizi gerçekleştirilmiştir. Çalışılan türler arasındaki genetik yakınlığı bulmak için oluşturulan dört farklı dendrogram sonuçlarından yaralanılarak filogenetik analiz yapılmıştır. Neighbor-Joining dendrogramının analizi sonucu, Ramalina fastigiata (ABD) dışındaki Ramalina türleri üç ana kolda uzanmaktadır. Türkiye- Karabük' ten alınarak çalışılan Ramalina fastigiata türü ile Amerika- Kuzey Carolina' dan elde edilen R. fastigiata dendrogramda birbirlerinden uzak görülmektedir. 2006, 60 sayfa Anahtar Kelimeler : Liken, polimorfizm, rdna, ITS, dizi analizi 3

4 ABSTRACT Master Thesis PHYLOGENETIC ANALYSIS OF SOME SPECIES OF Ramalina (ACH.) FROM TURKEY BY SEQUENCE ANALYSIS OF rdna ITS REGION Aylin AYRIM Ankara University Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Biology Supervisor: Assoc. Prof. Dr. Sümer ARAS This study has been made to show the similarities and the differences among Ramalina polymorpha, Ramalina fastigiata and Ramalina capitata from Ramalina Lichen genus found in our country. rdna (ITS) regions of the samples from these species were amplified with PCR and analysed by sequencing. ITS regions were amplified with the aid of ITS 1F and ITS 4 primers and followed by sequencing. The phylogenetic analysis has been performed using the results of the 4 different dendograms generated to find the genetic closeness between these species. Accoring to Neighbor-Joining dendrogram analysis result, Ramalina fastigiata (USA) barring, Ramalina species split into three main branch. Studying species Ramalina fastigiata which is from Turkey- Karabük and getting from America-North Carolina R. fastigiata show the distance from each other at the dendrogram. 2006, 60 pages Key Words: Lichens, polymorhphism, rdna, ITS, sequence analysis 4

5 TEŞEKKÜR Çalışmalarım boyunca benden ilgi ve desteğini hiç esirgemeyen, alanındaki üstün bilgi ve performansını benimle paylaşan değerli danışman hocam sayın Doç. Dr. Sümer ARAS a en içten duygularla teşekkürlerimi sunarım. Araştırmalarım sırasında bana her konuda yardımcı olan sayın Araş. Gör. Demet CANSARAN a teşekkür ederim. Öğrenim hayatım boyunca ilgi ve fedakarlık göstererek, maddi ve manevi desteklerini hiç esirgemeyen ailem, Ali AYRIM, Menşure AYRIM ve Tülin AYRIM a teşekkürü borç bilirim. Aylin AYRIM Ankara, Ekim

6 İÇİNDEKİLER ÖZET...i ABSTRACT...ii TEŞEKKÜR...iii SİMGELER DİZİNİ...vi ŞEKİLLER DİZİNİ...vii ÇİZELGELER DİZİNİ...viii 1. GİRİŞ Substrat Tiplerine Göre Likenler Likenler ve Ekosistem Likenlerin Ekolojik Önemi Hava Kirliliğinde Likenlerin Önemi Likenlerin Ekonomik Önemi Ülkemizdeki Durum Liken Sistematiği Likenlerin Üremeleri Ramalina KURAMSAL TEMELLER Moleküler Belirteçler (Markerlar) Hibridizasyona dayalı belirteçler RFLP : Restriksiyon parçası uzunluk polimorfizmi (Restriction fragment lenght polymorphizm) PCR' a dayalı belirteçler RAPD: Rasgele çoğaltılmış polimorfik DNA (Randomly amplified polymorphic DNA) AFLP : Çoğaltılmış parça uzunluk polimorfizmi (Amplified fragment lenght polymorphism) SSR : Basit dizi tekrarları (Simple sequence repeats) ISSR : Basit dizi tekrarları arası ( Inter-simple sequence repeats) SCAR : Belirlenmiş ve çoğaltılmış polimorfik diziler (Sequence characterized regions) CAPS : Kesilip çoğaltılmış polimorfik diziler (Cleaved amplified polimorphic sequence) ESTs : DNA belirteçleri (Expressed sequence tags) ITS (Internal Transcribed Spacer) ve rdna DNA Dizi Analizi Sanger yöntemi (Enzimatik metot) MATERYAL ve YÖNTEM Liken Materyali Yöntem DNA izolasyonu PCR analizleri Agaroz jel elektroforezi Örneklerin DNA dizi analizi

7 4. BULGULAR TARTIŞMA ve SONUÇ...53 KAYNAKLAR...57 ÖZGEÇMİŞ

8 SİMGELER DİZİNİ ABD Amerika Birleşik Devletleri AFLP Çoğaltılmış Parça Uzunluk Polimorfizmi (Amplified Fragment Lenght Polymorphizm) bç Baz çifti CTAB Setil Trimetil Amonyum Bromid dntp Deoksinükleotit trifosfat dk Dakika EDTA Etilen Diamin Tetraasetik Asit ESTs DNA Belirteçleri (Expressed Sequence Tags) ITS İnternal Ara Bölgeler (Internal Transcribed Spacer) ISSR Basit Dizi Tekrarları Arası (Inter-Simple Sequence Repeats) MEGA Moleküler Evrim Genetik Analizi (Molecular Evolutionary Genetics Analysis) µl Mikrolitre ml Mililitre mm Milimolar nm Nanometre OD Optik dansite PCR Polimeraz Zincir Reaksiyonu (Polimerase Chain Reaction) PVPP Polivinil Poliprolidon RAPD Rasgele Çoğaltılmış Polimorfik DNA (Randomly Amplified Polymorphic DNA) RE Restriksiyon Enzimi RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism)- Restriksiyon Parçası Uzunluk Polimorfizmi rpm Dakikadaki döngü sayısı SCAR Belirlenmiş ve çoğaltılmış polimorfik diziler (Sequence characterized regions) sn Saniye SSLP Basit Dizi Uzunluk Polimorfizmi (Simple Sequence Lenght Polymorphism) SSR Basit Dizi Tekrarları (Simple Sequence Repeats) TBE Tris-Borikasit- EDTA UPGMA Unweighted Pair-Group Metod of Arithmetic Avarage 8

9 ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil 1.1 Saksikol liken...4 Şekil 1.2 Terrikol liken...4 Şekil 1.3 Epifitik liken...4 Şekil 1.4 Karayosunuyla birlikte görülen Cladonia...5 Şekil 1.5 Foliose Likenlerinin morfolojik yapısı...9 Şekil 1.6 Lobaria pulmonaria...10 Şekil 1.7 Parmelia caperata...10 Şekil 1.8 Fructicose likenlerinin morfolojik yapısı...10 Şekil 1.9 Cladonia rangiformis...11 Şekil 1.10 Usnea subfloridana...11 Şekil 1.11 Crustose likenlerin morfolojik yapısı...11 Şekil 1.12 Lecanora muralis...11 Şekil 1.13 Graphis scripta...11 Şekil1.14 Squamulose likenlerinin morfolojik yapısı...12 Şekil 1.15 Neophyllis melacarpa...12 Şekil 1.16 Sored ile eşeysiz üreme...13 Şekil 1.17 Askus içinde sporlar...13 Şekil 1.18 Askosporlar...13 Şekil 2.1 ITS bölgeleri...24 Şekil 2.2 Sanger yöntemi ile DNA dizi analizi...28 Şekil 2.3 DNA dizi analizi...29 Şekil 3.1 Ramalina polymorpha...30 Şekil 3.2 Ramalina capitata...31 Şekil 3.3 Ramalina fastigiata...31 Şekil 4.1 Örneklerin Maximum Parsimony dendrogramı...39 Şekil 4.2 Örneklerin Neighbor- Joining dendrogramı...40 Şekil 4.3 Örneklerin UPGMA Unweighted Pair-Group Method of Arithmetic Avarage) dendrogramı...41 Şekil 4.4 Örneklerin Minimum evolution dendrogramı

10 ÇİZELGELER DİZİNİ Çizelge 3.1 Ramalina örneklerinin lokaliteleri...30 Çizelge 4.1 Gen Bankasından elde edilen örnekler...38 Çizelge 4.2 Dendrogramda gösterilen örneklerin simgelendirilmesi...43 Çizelge 4.3 Kullanılan örneklere ait benzerlik indeksi...44 Çizelge 4.4 Örneklerin ITS bölgelerinin sıralanmış DNA sekansı

11 1. GİRİŞ Likenler, mantarların alglerle ortak yaşam kurarak oluşturdukları canlılardır. Ancak araştırıcılar tarafından önceleri yosun olarak isimlendirilmiş ve bitkiler alemine yerleştirilmişlerdir. Mikroskobun keşfiyle birlikte likenlerin aslında iki canlıdan meydana geldiği görülmüş, ancak görünümleri sebebiyle bitki olarak sınıflandırılmaya devam edilmiştir. Daha sonra bütün likenler, Lichenes adı altında toplanmış, hatta bazı araştırıcılar tarafından ayrı bir bölüm (divisio) olarak kabul edilmişlerdir. Günümüzde likenler, mantar ve alglerin oluşturduğu simbiyotik birlikler olarak nitelendirilmektedir. Bu birlikte, mantar, besin açısından tamamen alge bağlı olduğu ve aldığı fotosentez ürünlerini hemen algin tekrar kullanamayacağı bir forma dönüştürdüğü için kontrollü bir parazitizm olduğu da söylenebilir. Mantarlar aleminin (Fungi) çeşitli sınıflarındaki bir çok cinsin türleri, likenleri meydana getirmektedir. Çoğunlukla Ascomycota, daha nadir olarak da Basidiomycota sınıfları likenleri oluşturur. Mantarlar aleminin alt kategorilerine doğru inildikçe, liken oluşturma ile ilgili bir miktar özelleşme ayırt edilir. Örneğin Ascomycota sınıfının Lecanoromycetidae alt sınıfında liken oluşumu çok yoğundur, bazı alt sınıf, takım ve hatta cinslerde ise hem liken oluşturan, hem de oluşturmayan türler bulunur. Arthonia cinsi bu durumun en iyi örneklerinden biridir. Bu cinsin bazı türleri liken oluşturur, bazıları ise parazittir. Günümüzdeki sınıflandırma anlayışına göre likenler biyolojik bir birlik olarak kabul edilmekte, verilen isim likenin mantarına atfedilmektedir. Likenin yapısına katılan algler, çoğunlukla Cyanobacteria (Cyanophyta, Mavi Yeşil Algler), Chlorophyta (Yeşil Algler), nadiren de Chrysophyta (Altın Rengi Algler) ya aittir. Cyanobacteria dan Nostoc, Gloeocapsa, Chlorophyta lardan Trentepohlia, Trebouxia cinslerinin türleri yaygın olarak katılan alglerdir. 11

12 Likenlerin iki ayrı canlı grubuna ait bireylerden oluşması ve ortak yaşamın çok uzun süreli olabilmesi bir çok araştırıcının dikkatini çekmiş, laboratuvar ortamında likeni oluşturan üyelerin (biyontların) ayrı ayrı üretilmesine, tekrar liken oluşturulmasına yönelik deneyler yapılmış, biyontlar arasındaki ilişki anlaşılmaya çalışılmıştır. Mantar ve algin liken oluşumu aşamasında son derece seçici davrandığı görülmüştür. Bununla birlikte çok yaygın olan bazı liken türlerinde ilk oluşum aşamasında çimlenen mantar sporunun kendine özel alg türünü bulmadan önce ortamdaki başka alglerle de bir süre ortak yaşam kurabildiği, doğru algi buluncaya kadar bir süre şekilsiz bir yığın halinde canlılığını sürdürebildiği görülmüştür (Kence 2005). Likenler alg ve mantar partnerlerinin ayrıyken üretemedikleri yalnızca liken oluşturduklarında fizyolojik birliktelikleri sonucu ürettikleri depo maddelerinin çoğu asit özellikte olduğundan "liken asitleri" de denilen 600 kadar sekonder bileşiğe sahiptir. Likenler yapılanmalarıyla, yaşadıkları çevre koşulları, mineral zenginlikler dahil birçok konuda bize direkt bilgi verirler. Örneğin, hava kirliliğinden, temizliğine tutundukları kayanın minerallerine ve iklim koşullarına kadar birçok etkiye göre renk ve gelişme gösterdiklerinden, bu konular hakkında bilgi sahibi olmamızı sağlamaktadırlar. Işık ve nem gibi çevre faktörleri, likenlerin içindeki fotobiyont tipini seçişini belirler ve likenler de fotobiyontlara göre formlarını oluştururlar. Mikobiyontlar, fotobiyontları likenin içine hapsederek beslenirler. Bazı örümcekler (Araneae) likenlerin ışığı yutma özelliğinden yararlanarak ağlarını gizlemektedirler. Fotosentez sırasında karbondioksit kullanmaları, global ısınmaya karşı oldukça önemli görevler üstlenmektedir. Likenlerin dünya yüzeyinin %8'ini kapladığını ve tundralarda kilometrelerce alana hükmettiklerini düşündüğümüzde, ekolojik rolünün ne kadar önemli olduğunu tahmin edebilmekteyiz. 12

13 Likenlerin bölgesel dağılımı ayrı bir çalışma konusudur. Kaya üzerlerinde düşük ph' lı yerlerde demir renkli Acarospora sinopica tipi bulunur. Böyle demir sülfitli yerlerde bakteriler sülfürik asit oluşturduğunda ph düşer. Lecidea inops ise bazik (yüksek ph' lı) ve bakırlı kaya yüzeylerde bulunur. Güney yarımkürede Tazmanya, Yeni Zelanda ve Güney Amerika'da iki yüzden fazla makroliken bulunur. Güneşin çok olduğu ağaçların azaldığı yüksek yerlerde liken türü artar. Yağmur ormanlarındaki likenler ise farklı bir seyir izlerler. Bu bölgelerde 4.5 ay gibi kısa sürede büyüyüp ölürler. Bazıları ölü balık gibi kokar. Sebebi trimetilamin oluşumudur. Tropik yağmur ormanlarında fotobiyont bölüm fazladır ve bunlar nemli ortama dayanıklıdır. Deniz kıyısında bulunan liken türleri tuzlu suya dayanıklıdır. Arktik tundradaki likenler geyik yemi olurlar. Xantharia parietina gibi bazı likenler güneşin bol olduğu yerlerde canlı renkliyken gölgeli yerde grileşebilmektedirler. Granit üzerinde oluşan likenin üzerinde toz beyaz gibi gözüken kalsiyum oksalat maddesi bulunur. Bazen likenin ağırlığının %20'sine ulaşabilen bu maddenin, gelen ışığın yansıtılması konusunda faydalı olduğu düşünülmektedir. Likenleri bazen gerçek renklerinde göremeyişimizin sebebi de bu sayılmaktadır (Atabay 2006). 1.1 Substrat Tiplerine Göre Likenler Saksikol: Kalkerli ve silisli kaya, taş, duvar beton kiremit vb. üzerinde gelişen likenlerdir (Şekil 1.1). 13

14 Şekil 1.1 Saksikol liken Terrikol: Toprakta gelişen likenlerdir (Şekil 1.2). Şekil 1.2 Terrikol liken Epifitik: Ağaç kabukları gövde ve dalları veya odun, tahta, kütükler vb. bitkiler üzerinde gelişen likenlerdir (Şekil 1.3). Şekil 1.3 Epifitik liken Musikol: Doğrudan karayosunları üzerinde gelişen likenlerdir (Şekil 1.4). 14

15 Şekil 1.4 Karayosunuyla birlikte görülen Cladonia Likenikol: Başka liken türleri üzerinde gelişen likenlerdir. 1.2 Likenler ve Ekosistem Liken komüniteleri kutuplardan çöllere kadar çok farklı ve diğer bitkiler için zor olan çevre şartlarında yayılış gösterebilmektedir. Örneğin çıplak kayalar, buzlar, çöller, denizler gibi. Kurak habitatlarda, likenler kendilerine havada uçuşmaları ve rüzgarla dağılmalarına imkan tanıyan bir büyüme şekli gösterirler. Ürettikleri özel liken bileşikleri, geliştirdikleri çeşitli fizyolojik uyumlar onların en ekstrem çevre koşullarına bile rahatlıkla uymalarını sağlamaktadır. Sağlam çakıllı okyanus sahilleri en zengin liken florasına sahiptir. Yüksek dağlık alanlarda, yeterli gün ışığı ve neme sahip temiz havası olan bölgelerde liken florası zenginlik gösterir (Çobanoğlu 2006). 1.3 Likenlerin Ekolojik Önemi Likenler, ekolojik açıdan oldukça önemli bitkilerdir ve ekolojik süksesyonda öncüdürler. Likenler, tutundukları kayaları salgıladıkları liken asitleriyle yavaş yavaş parçalayarak kaya üzerinde ince bir toprak tabakası oluştururlar. Daha sonra liken 15

16 parçaları ve orada gelişen karayosunlarının da katılmasıyla organik maddenin sürekli artması sonucu oluşan humus üzerinde daha yüksek bitkilerin gelişmesine olanak sağlarlar. Böylece likenler bitki örtüsünün gelişim sürecinde öncü bitkilerdir (Cansaran 2003). - Erozyonu önlemeye yardımcı olurlar (toprak likenleri toprağı hifleri ile tutarak dağılmasını önler). - Toprak oluşumunu sağlarlar (taş ve kayaları salgıladıkları asitler ile parçalayarak ufalanmasını sağlarlar). - Toprakta yüksek bitkiler için gerekli olan organik maddelerin artmasını sağlarlar. - Bazı fauna üyeleri için yuva görevi yaparlar. - Likenlerle beslenen hayvanlar için besin görevi yaparlar. - Dekoratif açıdan zengin görünüm sağlarlar (Japon bahçe süsleme sanatında kullanılırlar). 1.4 Hava Kirliliğinde Likenlerin Önemi Likenler hava kirliliğine olan duyarlılıkları nedeniyle yaşadıkları bölgenin kirlilik derecesini gösteren indikatör görevi görürler. Likenler özellikle havadaki SO 2 miktarından çok etkilenirler ve bu nedenle hava kirliliğini ölçmede kullanılırlar. Likenler yüksek bitkiler gibi kök, gövde, yaprak gibi organlara sahip olmadıkları için kirleticileri de nem ve yağmur suları ile birlikte tallus yüzeyleriyle emerler. Hava kirliliği yüksek olan bölgelerde bazı türler (özellikle dalsılar ve bazı yapraksılar) hemen ortadan kalkar ve onların yerini daha dayanıklı kabuksu türler alır. 1.5 Likenlerin Ekonomik Önemi Ekonomik açıdan ise tıpta, besin ve parfümeri sanayiinde eski çağlardan bu yana kullanılmaktadır. Son yıllarda likenlerin oluşturdukları özel bileşiklerin antimikrobial, 16

17 antiproliferatif, antinosiseptif, antiinflamatuar, analjezik, etkileri bulunmuş olup çok farklı bilim dallarına yönelik çalışmalara konu olmaya başlamışlardır. Kullanım alanlarının başında tıbbi amaçlar gelmektedir. Çok eskiden beri likenlerin batıl inançlara dayalı olarak tedavide kullanıldığı bilinmektedir. Örneğin, tallusu sarı renkli olan "Xanthoria parietina" sarılık tedavisinde, "Lobaria pulmonaria" ise alveollü tallus yüzeyinden dolayı akciğer hastalıkları tedavisinde kullanılmıştır. Halen Avrupa, Amerika ve Uzakdoğu da bir çok liken türünden yararlanılarak göğüs yumuşatıcı ve boğaz pastilleri gibi preparatlarda liken maddeleri kullanılmaktadır. Usnea türlerinin antibakterial etkileri saptanmıştır ve usnik asitten antiseptik kremler yapılmaktadır. Ayrıca antifungal, antikansorojen ve antiviral etkileri de tespit edilmiştir. Kuzey Avrupa ülkelerinde ren geyiğinin besinini oluşturan Cetraria islandica' nın çayının eskiden beri öksürüğe iyi geldiği bilinmektedir. Algler mineral, vitaminler ve iz elementler bakımından zengindir. Bundan dolayı Pasifik ülkeleri, Çin ve Japonya başta olmak üzere, dünyanın bir çok yerinde insan ve hayvan gıdalarında yaygın bir şekilde kullanılmaktadır. Japonların kişi başına 6.7 kg ile günümüzde öncekinden olduğundan daha fazla deniz yosunu tükettiği görülmektedir. Mannit bakımından zengin olan "Lecanora esculenta" Asya ülkeleri ve Arabistan'da ekmek unu ve develerin besini olarak kullanılmaktadır. Uzakdoğu, Kuzey Amerika ve kıtlık dönemlerinde de olsa, Avrupa da besin amaçlı tüketimine ilişkin bilgiler bulunmaktadır. Kıtlık yıllarında una karıştırılarak ekmek yapımında kullanılan manna grubuna ait likenler (Aspicilia cinsinin genellikle toprak üzerinde serbest yaşayan türleri), Türkiye de İç ve Doğu Anadolu da toprak üzerinde oldukça yaygındır. Ayrıca bir çok kaynakta likenlerin sıcak suyla ıslatılarak, liken bileşiklerinden gelen acı tadı giderildikten sonra yiyecek olarak kullanıldığı bilinmektedir. 17

18 Liflerden giysi üretmeye başlayan insanoğlu, likeni çok eski zamandan beri bu lifleri ve yünleri boyamakta kullanmaktadır. Roccella türlerinden kimyada kullanılan turnusol boyası ve orsey isimli kırmızı ve mor boya maddeleri elde edilir. Cladonia rangiformis' den etil alkol elde edilmektedir. Ayrıca likenler öğütülerek, bir çok baharata dolgu maddesi olarak da katılmaktadır. Parfümeride kokuların kalıcı hale getirilmesinde de likenler yaygın olarak kullanılmaktadır. Fransa ve Yugoslavya'da yılda tonlarca toplanan Evernia prunastri ve Pseudevernia furfuracea' den makyaj pudrası yapımında yararlanılmaktadır. Anadolu nun kırsal bölgelerinde çocukların kabuksu liken türlerini ıslatarak ellerine kına yaktıkları bilinmektedir. Bu rengin kalıcı olmadığı, halk arasında yalancı kına olarak adlandırıldığı tespit edilmiştir. Bryoria likenini bazı sincap, kuş ve maymun türleri yuva olarak kullanmaktadır. Aynı liken türü Alaska' da dağ keçilerine yem olarak verilmektedir. Siyah kuyruklu geyik ise ağaçlardan 3 metreye kadar uzayabilen cadı saçı likenleriyle beslenmektedir. 1.6 Ülkemizdeki Durum Çeşitli kaynaklara göre değişmekle birlikte dünyadaki liken türü sayısı yaklaşık kadardır. Türkiye de bugüne kadar bulunan liken türlerinin tamamı, Ascomycota sınıfına aittir. Büyük bir hızla yenileri eklenmekle birlikte, halen ülkemizde yayılış gösterdiği tespit edilen yaklaşık 1000 liken türü bulunmakta, gelecekte yapılacak daha yaygın çalışmalarla bu sayının iki katına çıkması umulmaktadır. Acarospora, Aspicilia, Caloplaca, Candelariella, Cladonia, Evernia, Melanelia, Neofuscelia, Parmelia, Peltigera, Physcia, Physconia, Ramalina, Rinodina, Rhizocarpon, Xanthoparmelia, Xanthoria gibi büyük cinsler ülkemizde de çok sayıda türle ve yaygın olarak temsil edilmektedir. 18

19 1.7 Liken Sistematiği Likenlerdeki sistematik çalışmalar, diğer bitki gruplarında da olduğu gibi klasik olarak daha çok morfolojik karakterlere dayalı tanımlamaya dayanmaktadır. Likenler morfolojik olarak 4 gruba ayrılırlar; - Foliose (Yapraksı) Likenler: Tallus küçük veya büyük loblardan ibarettir. Büyüdükleri ortamlarına rizoid şeklinde hifler gönderirler. Toprak istekleri çoktur. Çıplak kayaların üzerinde görülmezler. Şekil 1.5' de Foliose likenlerinin morfolojik yapısı görülmektedir. Şekil 1.6' da Lobaria pulmonaria ve Şekil 1.7' de Parmelia caperata örnek olarak gösterilmektedir. Şekil 1.5 Foliose likenlerinin morfolojik yapısı 19

20 Şekil 1.6 Lobaria pulmonaria Şekil 1.7 Parmelia caperata - Fruticose (Çalımsı-Dalsı) Likenler: Tallus ya diktir veya bir ağaçtan sarkar. Oldukça büyük likenlerdir. Tallus genellikle dallıdır. Fructicose likenlerinin morfolojik yapısı Şekil 1.8' de görülmektedir. Şekil 1.9' da Cladonia rangiformis ve Şekil 1.10' da Usnea subfloridana dalsı likenlere örnek olarak gösterilmektedir. Şekil 1.8 Fructicose likenlerinin morfolojik yapısı 20

21 Şekil 1.9 Cladonia rangiformis Şekil 1.10 Usnea subfloridana - Crustose (Kabuksu) Likenler: Morfolojileri incelendiğinde talluslarının yassı olduğu görülmektedir (Şekil 1.11). Büyüdükleri ortamlarına hiflerini sokarlar. Bazen kayaların yüzeylerini eritip derinliklerine girerler. Bunlara endolitik liken denir. Lecanora, Graphis cinsleri bu liken çeşidinde yer almaktadır (Şekil 1.12 Lecanora muralis, Şekil 1.13 Graphis scripta). Şekil 1.11 Crustose likenlerin morfolojik yapısı Şekil 1.12 Lecanora muralis Şekil 1.13 Graphis scripta 21

22 Squamulose Likenler : Bu likenler talluslarında squamules formunda substrattan ayrılmaktadırlar. Bunlar crustose likenleriyle üst korteks bulundurmasıyla benzerlik göstermelerine karşın alt kısımları ise farklılık göstermektedir (Şekil 1.14). Bu gruba dahil olan Neophyllis melacarpa Şekil 1.15' de görülmektedir. Şekil 1.14 Squamulose likenlerinin morfolojik yapısı. Şekil 1.15 Neophyllis melacarpa 1.8 Likenlerin Üremeleri Likenlerin çoğalması eşeysiz ve eşeyli şekillerde olabilir. Eşeysiz çoğalma sored adını alan ve mantar hifleri ile çevrili birkaç alg hücresinden oluşmuş tallus parçacıkları ile gerçekleşmektedir (Şekil 1.16). Soredler tallusun korteksinin parçalanması ile gerçekleşmektedir. Soredler tallusun korteksinin parçalanması ile serbest hale geçerek 22

23 toz gibi çevreye dağılırlar. Bu parçacıklar gittikleri yerde yeni bireyleri meydana getirirler (Güner 1986). Şekil 1.16 Sored ile eşeysiz üreme Eşeyli çoğalma, likenlerde bireylerden yalnız mantarlarda olur. Alg bu birliktelikte vejatatif olarak çoğalır. Mantarların meydana getirdiği fruktifikasyonlar serbest yaşayan mantarınkinden biraz farklıdır. Likenlerin yapısında çoğunlukla Askuslu mantarlar bulunduğundan oluşan fruktifikasyonlar mantarın cinsine göre değişiklik gösterir. Şekil 1.17'de askus içinde sporlar görülmektedir. Fruktifikasyonlar ya çanak şeklinde açık Apotesiyum veya Peritesiyum halinde tepesi açık veya kapalı testi şeklinde olabilir. Himeniyum tabakaları ask ve parafizden oluşmuştur. Asklarda askosporlar meydana gelir (Şekil 1.18). Olgunlaşıp atılan askosporlar çimlenip uygun alg hücrelerine rastlayarak yeni likeni oluşturmak üzere gelişirler. Şekil 1.17 Askus içinde sporlar Şekil 1.18 Askosporlar 23

24 1.9 Ramalina Kingdom (Alem) : Fungi Fungi Division (Şube) : Ascomycota Class (Sınıf) : Ascomycetes Order (Takım) : Lecanorales Family (Aile) : Ramalinaceae Genus (Cins) : Ramalina Ach. Species (Tür) : Ramalina fastigiata, Ramalina capitata, Ramalina polymorph. Bu cins bant şeklinde lobları olan bir yerleşme noktasından yükselen dallı fruticose likendir. Nadir bir türü olan R. thrausta silindirik lobları ve ince yapısıyla diğerlerinden ayrılmaktadır. Tüm türleri usnik asit içerir. Yeşilimsi bir rengi vardır ve her iki yüzü de aynı renktedir. Pek çoğu besleyici ve termofildir. Bu cins geniş alana yayılmıştır. Türlerinin çoğu sıcak, tropikal alanlardadır. Renk dallanmaları görülebilmektedir. Sisli, çorak yerlerde sarımtrak-yeşil tonlarında görülmektedir. Meksika ve Şili de bu türlere rastlanır. R. polymorpha, termofil değildir. Kuş alanlarında gübreler üzerinde ve dağlık bölgelerde gelişirler. R. subferinacea, yaygın olarak sahil boyunca kayaların üzerinde yaygın bir şekilde bulunur. R. farinacea, dikdörtgen şekilli, ağaç kabuklarında daha yoğun granular bir yapı gösterir. Bu türün diğer örnekleri, ağaç kabuklarınca zengin Güney İskandinavya da geniş yayılış alanına sahiptir. R. fastigiata, tallus dik oldukça sert yapıda ve sık dalsıdır. Grimsi-yeşil renktedir. Dallar karışık şekilde geliştiğinden çalımsı bir görünüş alır. Bu çalışma; ülkemizde yayılış gösteren Ramalina liken cinsinden Ramalina polymorpha, Ramalina fastigiata ve Ramalina capitata türlerine ait örneklerin rdna (ITS) bölgelerinin PCR yardımıyla çoğaltılıp, incelenen türler arasındaki benzerlik ve farklılıkların ortaya çıkartılması amaçlanarak dizi analizi uygulanmıştır. 24

25 Literatürde likenlerden saf DNA izolasyonu bazı zorluklar sergilemektedir. Grube et al. (1995) ve Crespo et al. (1997) yayınladıkları makalelerde bu zorlukların nedenleri olarak, polisakkarid ve fenolik bileşikler gibi inhibitörlerin bulunması ayrıca iki biyont un ayrılmasındaki güçlükleri ifade etmişlerdir Buna karşın bu zorlukların PCR da selektif primerlerin kullanılmasıyla bir ölçüye kadar aşılabildiği (Crespo et al. 1997) gibi DNA nın saf bir şekilde izole edilmesi ile ilgili değişik yöntemlerde farklı araştırmacılar tarafından bildirilmiştir (Armaleo and Clerc 1991, Lee et al. 1998, Armaleo and Clerc, Cubero et. al. 1999). Likenlerle gerçekleştirilen moleküler düzeydeki çalışmalar genelde ribozomal DNA (rdna) ITS (Internal transcribed spacer) bölgelerini içeren çalışmalar olarak karşımıza çıkmaktadır. ITS bölgelerinin incelenmesi son yıllarda uygulanan bir yöntemdir. Bu bölgeler hızla evrimleşen bölgeler olduğu için bir cinsini, türün ve hatta populasyonların incelenmesinde kullanılabilmektedir (White et al. 1990). Dyer and Murtagh (2001) Doğu Antartika' da, Vestfold tepelerinde bulunan Buellia frigida ve Xantharia elegans ile yaptıkları çalışmadaki genetik varyaslarının oldukça düşük olduğunu kaydetmelerine karşın, değişik bölgelerden toplanan X. elegans ın tür içinde dahi oldukça yüksek genetik varyasyon gösterdiğini ITS bölgelerinin incelenmesi ile ortaya koymuşlardır. Murtagh et al. (2002) nın değişik coğrafik lokalitelerden ve iklim rejimlerinden toplanan X. elegans örnekleri ile yaptıkları çalışmada ITS bölgelerinin incelenmesi ile oldukça yüksek genetik varyasyonun varlığını ortaya koymuştur. rdna, ITS bölgeleri incelenerek genetik farklılık ve benzerlikleri tanımlanan daha bir çok liken türleri literatürde bulunmaktadır. Högberg et al. (2002) Letharia vulpina türü kıtalar arası popülasyonlarını çalışmışlardır. Grube and Arup (2001), Physciaceae 25

26 familyasına ait değişik cinsleri yine ITS verilerine göre değerlendirilmiştir. Rios et al. (2002) ise, Rimularia insularis e ait ITS verilerini çalışmalarında kullanmışlardır. Crespo et al de yaptıkları bir çalışmada günümüzde PCR uygulaması ile taze veya herbaryum materyalinin bile çok az miktarları ile araştırmaları yapmanın mümkün olduğunu saptamışlardır. Ivanova et al da gerçekleştirdikleri bir araştırmada Umbilicariaceae familyasının filogenetik analizi rdna nın ITS 1 ve ITS 2 primerleri ile dizi analizini yapmış ve türler arasındaki farklılıkları ortaya çıkarmışlardır. Martin et al de Diploschiestes genusuna ait türlerin moleküler filogenisini ITS bölgesinin dizi analizini yaparak incelemişlerdir. Bruns et al da ve Taylor and Swann 1994 de yaptıkları bir çalışmada her zaman taze materyale ulaşılamayacağından herbaryum koleksiyonları moleküler çalışmalar için önemli ölçüde materyal temin edebileceğini göstermişlerdir. Son birkaç yılda, herbaryumda biriktirilmiş mantarlarda bozulmamış DNA izole edildiği belirlenmiştir. Multiclavula mucida nın 30 yıllık eski türlerinin DNA sından PCR ürünlerini çok miktarda elde etmek mümkündür (Gen Bankası acc no.23542; Gargas et al. 1995). Cansaran et al. (2006) Rhizoplaca liken cinsinin ITS bölgesini dizi analizini gerçekleştirerek filogenetik ilişkileri konusunda inceleme yapmışlardır. Filogenetik ağacın oluşturduğu dallanmalar ile genetik yakınlık hakkında bilgi edinilmiştir. 26

27 2. KURAMSAL TEMELLER Likenlerle ilgili sistematik çalışmalar, klasik olarak morfolojik karakterlere dayalı olarak yapılmaktadır. Ayrıca kemotaksonomik yöntemler de kullanılmaktadır. Bu sistematik çalışmalar, liken ve bitki sistematiğinde taksonomik tanımlamayı tam karşılayamadığından taksonomik çalışmalar için moleküler yöntemlerinin olumlu katkılar sağlayacak olduğu sonucuna varılmıştır. Moleküler yöntemlerin uygulanmasında moleküler belirteçler ortaya çıkmıştır. Son yıllarda bu amaçla moleküler taksonomik yöntemler de kullanılmasına rağmen konu ülkemiz için yenidir. Teşhis anahtarları bitkilerin anatomik, morfolojik, bazen de kimyasal özellikleri kullanarak çalışırlar. Ancak organizmaların kesin olarak belirlenebilmesi için morfolojik ve anatomik özellikler yeterli olmaz. Farklı habitatlarda bulunan organizmalar birbirlerinden farklı değişimler gösterebildiğinden, aynı türe ait organizmalar bile farklı morfolojik ve anatomik özellik gösterirler. Bu yüzden genotip fenotipten daha stabildir. Morfolojide görülen farklılıklar, genetik çeşitliliği bir kısmını oluşturduğu gibi genetik çeşitliliğin büyük bir kısmı da morfolojide görülmemektedir. Genotip-çevre etkileşimi ve bir karakterin birden fazla lokus tarafından belirlenmesi gibi etmenler yüzünden morfolojiden elde edilen bilgiler, genetik farklılıkları belirlemede etkili olamazlar. Bu yüzden genotiplemede, moleküler belirteçler ve moleküler teknoloji etkili olmaktadır. 2.1 Moleküler Belirteçler (Markerlar) Moleküler belirteç, kalıtımı takip edebilen bir gen veya belirlenebilir bir DNA parçasıdır. Genomun belirli bir bölgesini ifade ettiği için belirteç denmiştir. Moleküler belirteçler, canlı populasyondaki çeşitlilik veya o populasyon içindeki canlı genotipleri arasındaki ilişkilerin belirlenmesinde %100' e yakın güvenilirlikle göz önüne alınır. 27

28 1. Hibridizasyona Dayalı Belirteçler Restriksiyon Parça Uzunluk Polimorfizmi (RFLP) 2. Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) Dayalı Belirteçler Rasgele Çoğaltılmış Polimorfik DNA (RAPD) Çoğaltılmış Parça Uzunluk Polimorfizmi (AFLP) Basit Dizi Tekrarları (SSR) Basit Dizi Tekrarları Arası (ISSR) Belirlenmiş ve çoğaltılmış polimorfik diziler (SCAR) Kesilmiş Çoğaltılmış Polimorfik Diziler (CAPS) 3. ESTs : DNA Belirteçleri Moleküler belirteçlerin çevre faktörlerinden etkilenmemesi önemli bir avantajdır. Bunun yanında genetik değişiklikleri daha fazla yansıtırlar. Çekirdek, kloroplast, mitokondri ve ribozom gibi farklı organeller ayrı ayrı çalışılabilir. Gen ürünleri değil DNA kullanıldığı için, bu belirteçler seçilen dokuya ya da yaşam evresine göre değişiklik göstermezler. Her bir ebeveynden gelen farklı karakterler tespit edilebildiğinden canlının genetik orjini tespit edilebilir. Sonsuz sayıda moleküler belirteç elde edilebilir Hibridizasyona dayalı belirteçler RFLP : Restriksiyon parçası uzunluk polimorfizmi (Restriction fragment lenght polymorphizm) En önemli bileşeni restriksiyon enzimleridir. İlk defa Hamilton Smith (1970) tarafından keşfedilmiştir. Restriksiyon enzimleri (RE), DNA dizisinde belli bir nükleotid sırasını tanıyıp kesim yapar. Kesilen farklı uzunluklardaki DNA elektroforezi yapılarak büyüklüklerine göre ayrılır. Southern Blotlama tekniği yapılarak DNA' lar membranda radyoaktif problarla hibritleştirilir. Otoradyografi ile hibritler incelenir. 28

29 Karşılaştırmadaki DNA' lar uzunluklarındaki farklılık polimorfizm göstergesidir. RFLP, kantitatif özelliklerde sorumlu olan gen bölgelerinin haritalanması ve sıralanmasında yeni bir yaklaşım sağlamaktadır. Kullanılan problar önemlidir. Rasgele genomik veya cdna kütüphanelerinden oluşturulan homolog ve heterolog problar kullanılır. (Striem et. al., 1990) Radyoaktif madde kullanılması, çok pahalı ve yoğun iş gücü gerektiren bir teknik olması bu yöntemin dezavantajlarıdır PCR' a dayalı belirteçler RAPD: Rasgele Çoğaltılmış Polimorfik DNA (Randomly amplified polymorphic DNA) Bu metot, dizisi bilinmeyen DNA parçalarının çoğaltılmasını kapsar. Reaksiyonun ürünleri, oligonükleotidlerin dizisine, uzunluğuna ve reaksiyon şartlarına bağlıdır. RAPD yönteminin en büyük üstünlüğü çok sayıda marker sağlamasıdır. Bir primer kullanılır. Rastgele primerler (oligonükleotitler) kalıp DNA üzerinde tamamlayıcı olan, birbirine yakın iki bölgeye bağlanarak bu aradaki bölgenin çoğaltılmasını sağlar. Bu teknikte bir primer kullanılarak diğer PCR tekniklerinden ayrılır. Bu şekilde çoğaltılan DNA dizileri için, agaroz jel üzerinde elektroforez uygulanır ve bazı dizilerin çoğaltıldığı, bazılarının ise çoğaltılamadığı gözlenir. Bu gözlem var olan polimorfizmin göstergesidir (Welsh and McClelland 1990). RAPD belirteçleri ile çok yüksek düzeyde polimorfik bant elde edilmektedir. Radyoaktivite gerektirmemesi, çok az miktarda DNA gerektirmesi gibi özelliklerinden dolayı gen haritalarının çıkarılmasında oldukça sık kullanılmaktadır (Paran and Michelmore 1993, Hemmat et al. 1994, Malyshev and Kartel 1997). 29

30 AFLP : Çoğaltılmış parça uzunluk polimorfizmi ( Amplified fragment lenght polymorphism) PCR ile RFLP tekniğinin kombinasyonu olup, kullanılan primerler hem dizi-spesifik hem de rastgeledir. RPLP nin tekrarlanabilirliği hem de PCR kolaylığı bir araya gelmiştir. Üç aşamada gerçekleşir. I.Genomik DNA nın restriksiyon endonükleaz enzimleriyle kesilmesi ve bunu takiben kesilen uçlara adaptörlerin ligasyonu. II.Restriksiyon parçalarının PCR ile çoğaltılması. III.Poliakrilamid jelde çoğaltılmış parçaların analizi. Bu tekniğin amacı enzimler tarafından kesilen DNA fragmentinin bir bölümünün klonlanması ve belirlenmesidir. Bu tekniğin önemli bir avantajı, kullanılan primer çiftinin 3' ucundaki seçici bazlar değiştirilerek veya değişik kombinasyonlar kullanılarak her defasında yeni fragmentler klonlanır. Jel üzerinde elektroforez uygulanır. Böylece polimorfizm elde edilir. Kantitatif lokusların saptanmasına olanak sağlar. Ancak yüksek moleküler ağırlıklı ve saf DNA' ya ihtiyaç olması tekniğin dezavantajıdır (Gülşen ve Mutlu 2005) SSR : Basit dizi tekrarları (Simple sequence repeats) Ökaryotik genomlarda bulunan rastgele ardışık tekrarlanan, işlevi bilinmeyen ancak düzenleyici görevleri olduğu düşünülen nükleotit gruplarına mikrosatellit denir. (AT)n, (GT)n, (ATT)n ve (GACA)n gibi. Burada 'n' ardışık tekrar sayısıdır. İçerdikleri nükleotid sayısına göre mikrosatellit veya minisatallit olarak isimlendirilmektedirler. 30

31 Tekrarlanan bir dizi klonlanır ve bu tekrarlanan diziyi çevreleyen nükleotidler belirlenir bazlık tekrarlara çeşitli sayıda takip eden tekrarlar (Variable Number Tandem Repeats: VNTR) denir. Basit dizi tekrarları her bir lokusta çok sayıda allel bulunur. Dizi analizi gerektirir, ancak bir çok türün Gen Bankalarında türlerin belirlenen dizi tespitleri gün geçtikçe artmaktadır. SSR lokusu özellikle tek bir lokusu temsil edecek şekilde düzenlendiği için analitik olarak basittir. Genom boyunca homojen olarak dağılmıştır. Bu belirteç, az miktarda DNA' ya gereksinim duyar. Her SSR lokusu bir çift primer ile tanımlanır. Bu primerler tür içi ve tür dışı kullanılabilirler. Böylece türlerin bireysel olarak genotiplerini belirlemeye olanak sağlamaktadır (Powell et al. 1996) Bu nedenle çeşit tanımlamasında önemli bir yer tutmaktadır. Oldukça polimorfik olduklarından bitkilerde oldukça yüksek oranda bilgi verirler. Bilinen primer dizilerine sahip olduklarından diğer belirteçlere göre daha kullanışlıdır. Ancak bu teknik, oldukça fazla iş gücü gerektiren, uzmanlık isteyen pahalı bir tekniktir. SSR lokusuna bağlanan primerlerin PCR yardımıyla farklı uzunlukta parça çoğaltılması esasına dayanmaktadır ve ard arda tekrarlanan zincir elemanlarının sayısındaki değişiklikler sonucunda oluşan SSR lar bireyler arasındaki farklılıkları belirler (Weising et al. 1995). SSR ları çevreleyen korunmuş DNA dizileri primer olarak kullanılarak PCR tekniği sayesinde bir lokustaki farklı alleller tespit edilebilir ISSR : Basit dizi tekrarları arası ( Inter-simple sequence repeats) Bu teknik, birbirine ters yönlü ve yakın olan mikrosatallit bölgelerin ( bç) amplifikasyonunu dayanır. Primerler 5' veya 3' ucunda rastgele genellikle 1-4 bazdan 31

32 oluşan seçici baz dizilimlerine sahiptirler. Ancak seçici baz içermeyen primerler de kullanılabilmektedir. Primerler SSR' lar arasında kalan bölgeyi amplifiye ederler. Bu tekniğin avantajları arasında az miktarda DNA' ya ihtiyaç duyulması, uygulaması kolay, yüksek tekrarlanabilirlik, ön bilgi gerektirmeyerek maliyeti düşük olmasını sıralayabilmekteyiz. Dezavantajları ise primerlerin ayrı ayrı bağlanma sıcaklıklarının belirlenmesi ve benzer büyüklükteki bantların aynı olmama durumudur (Gülşen ve Mutlu 2005) SCAR : Belirlenmiş ve çoğaltılmış polimorfik diziler (Sequence characterized regions) Bir polimorfik RFLP veya RAPD klonlanır ve dizi analizi yapılır. Bu spesifik fragmentlere göre 2-24 nükleotitlik PCR primeri sentezlenir. PCR' da çoğaltılmış spesifik primerleri bir kesim enzimleri ile kesilir. Sonuçta DNA' daki büyüklük değişimi tespit edilir (Akkuş 2006). Her bir lokusda çok sayıda allel bulunması, RFLP' den daha kolay ve hızlı şekilde tespit edilmesi ve RAPD' e göre üretilebilirliğini fazla olması avantaj sağlamasına karşın zaman alıcı ve çok işçilik gerektirmesi yönünden de dezavantaj taşımaktadır CAPS : Kesilip çoğaltılmış polimorfik diziler (Cleaved amplified polimorphic sequence) Restriksiyon enzimleriyle kesilen PCR ürünlerinin elektroforezde büyüklüklerine göre ayrılmasıyla fragmentlerin belirlenmesini amaçlayan bir tekniktir. cdna veya genomik 32

33 DNA klonlarından klonlanan ve DNA zincirleri belirlenen RAPD, ISSR bantlarından elde edilir. Az miktarda kalıp DNA gerekmesine karşın primer için DNA bilgisi gerektiğinden yaygın kullanımı yoktur ESTs : DNA belirteçleri (Expressed sequence tags) EST genellikle baz çiftlik kısa dizilerdir. Bunlar yardımıyla bilinmeyen bölgelerin yada genlerin dizileri belirlenebilmektedir. Böylelikle maliyetin düşük olmasını sağlanmaktadır. EST' ler sadece fonksiyonu bilinen proteinlerin dizi bilgilerini ifade eder. Bu veriler kullanılarak da model olmayan bir organizmanın kısmi genomu oluşturulabilir yani bu kısımlarla genom bilgisinin genel durumu yorumlanabilir. 2.2 ITS : İnternal Ara Bölgeler (Internal Transcribed Spacer) ve rdna Bir öncü transkript üzerinde yer alan bu ara bölgeler, öncü ribozomal alt ünitelerinin arasında uzanmaktadır. Yapısal RNA öncü molekülün ribozomu işlediği zaman ortadan kalkmaktadır. Bu sekanslar ribozomal DNA (rdna)' da bulunan dizilerdir. Ökaryotik organizmalarda iki adet ITS bulunur (Şekil 2.1). ITS1; 18S ve 5,8S arasında, ITS2 ise 5,8S ve 28S arasında yer alır. Ribozomal genler ve bu ara bölgeler, binlerce kopyadan meydana gelmektedir. ITS bölgesi taksonomi ve moleküler filogenetikte geniş kullanım alanına sahiptir. ITS bölgesi mantarların DNA dizisinde geniş yer tutmaktadır. Coğrafik olarak değişebilen türlerde ve tür düzeyinde yapılan moleküler sistematik çalışmalarda çok kullanışlıdır. Çünkü onun diğer gen bölgelerindeki varyasyonlarından daha yüksek derecede varyasyonu vardır. rdna nın bireysel rdna tekrarları ITS ve IGS bölgelerinin her ikisinde de gözlem yapabilmek için olanak sağlamaktadır. Ayrıca 33

34 standart ITS 1 ve ITS4 primerleri, bazı taksonların tanımlanmasında spesifik primerler fungal sekansların seçici amplifikasyonlarına olanak sağlar (Gardes and Bruns 1993). Şekil 2.1 ITS bölgeleri, Oklar, primer bağlanma bölgelerini göstermektedir. rdna şifrelenmiş ribozomal RNA sekansıdır. Transkribe edilen veya transkribe edilmeyen ara bölgeleri içerir. Fungal Ribozomal RNA genlerinin nükleotit dizilimi, filogenetik ilişkileri taksonomik seviyelerde geniş oranlı olarak analiz etmesini sağlamaktadır. 16S rrna dizileri nispeten daha yavaş evrimleşmektedir ve bu nedenle birbirlerine uzak akraba olan organizmaların çalışmasında uygundur. Buna karşın mitokondriyal rrna genleri daha hızlı evrimleşir ve ordo veya aile (familya) seviyesinde bilgi almamızı sağlarlar. Transkripsiyonu yapılan internal ara bölgeler (ITS) ve intergenik ara bölgeler en hızlı evrimleşen bölgelerdir ve türler arasında tür içinde veya populasyonlar arasındaki farklılıkları bile ortaya çıkarırlar. Ribozomal RNA genlerinin izolasyonu ve klonlanan genlerinin direk dizi analizi ile pek çok rrna dizisine ait bilgiler edinilmiştir (Medlin et al. 1988). rrna dizilerinin direk dizi analizi ile de dizilim hakkında bilgi edinmek mümkündür (Lane et al.1985). Ancak bu metotlar çok miktarda RNA eldesi gerekmektedir ve hata payı yüksektir. 34

35 PCR ve bunu takiben yapılan direk dizi analizi pek çok avantaj sunmaktadır: Metot total DNA gerektiği için daha kolaydır. Sadece küçük miktarlarda (0,1-10 ng) DNA yeterli olmaktadır. Her iki zincirde dizi analizi yapılabilmektedir. Otomatik dizi analizi cihazları ile dizi analizinin yapılabilmesi mümkündür. 2.3 DNA Dizi Analizi Prokaryotik organizmaların (bakteri), faj, virus ve plasmidlerin DNA' larında bulunan nukleotid dizilerinin belirlenmesinde başlıca iki klasik yöntem önderlik etmiştir. Bunlardan biri, Sanger (1975 a,b) tarafından geliştirilen ve dideoksinukleotid olarak adlandırılan tekniktir (enzimatik metot). Bu metotla, Sanger, küçük DNA fajlarından olan øx174 fajının 5386 baz çiftinden oluşan genomunun nukleotid sıralarını saptamıştır. Baz sıralarını saptamada diğer bir metod da Maxam and Gilbert'e (1977) aittir (kimyasal metod). Bu araştırıcılar da SV40 virusunun baz sekanslarını belirlemişlerdir (5226 bç). Sanger yöntemi, kimyasal yönteme göre daha işlevsel ve uygulaması kolay bir yöntem olduğundan günümüzde daha çok tercih edilmektedir. Bununla birlikte otomatik dizi analizi cihazları da bu yöntemi esas alarak çalışmaktadır Sanger yöntemi (Enzimatik metot) Bu yöntem 3' hidroksil gruplarının olmaması nedeniyle normal deoksinükleotitlerden ayrılan didedoksinükleottlerin varlığında DNA dizisini saptamayı temel almaktadır. Spesifik zincir terminatörleri olan 4 tür 2,-3-dideoksinukleotidlerin (ddatp, ddgtp, ddctp, ddttp) kontrollü miktarlarda ve sürelerde kullanılması ile gerçekleşmektedir. Dideoksi nükleotid fosfatlar (ddntps) büyüyen DNA zincirine katıldığında sentezi 35

36 durdurmaktadırlar. Çünkü bir sonraki nükleotit ile bağlanmak için gerekli olan 3' hidroksil grubundan yoksundurlar. Bunlar yandaki moleküllerle fosfodiester bağları kuramamaktadırlar. Sanger yöntemi ile DNA dizi analizi Şekil 2.2' de gösterilmektedir. Bu yöntemde, test ortamında, 4 tür ddntp, DNA polimeraz I (klenow fragmenti), 4 tür dntp (datp, dgtp, dctp, dttp: bu nukleotidler polimerizasyon için gereklidirler) yanı sıra, ayrıca, baz sırası tayini yapılacak olan kısa tek iplikçik DNA segmenti (kalıp dizi) ve bunun 3'- ucundaki DNA bazlarına tamamlayıcı olan ve 32P ile 5'-uçlarından işaretlenmiş çok kısa (4 bazlık) primer DNA segmentleri de bulundurulur. Bu primer DNA fragmentleri, polimeraz I enziminin sentezi için basamak oluştururlar. Baz sırası saptanacak olan DNA, spesifik restriksiyon enzimlerinden biri ile (Örn., EcoRI gibi) kesilerek değişik boylarda DNA segmentleri elde edilir. Bu segmentler ısı (veya 0.5 N NaOH) ile denatüre edilerek tek iplikcikli hale getirilirler. Denatüre edilen segmentler 4 eşit kısma ayrılarak tüplere dağıtılır. Kısa DNA primerleri (5'-uçlarından 32 P ile işaretlenmiş) test ortamına ilave edilir. Bu primerler, baz sırası tayini yapılacak olan DNA segmentlerinin 3'-uçlarındaki 4 bazın tamamlayıcısı olduklarından bunlarla çok çabuk birleşirler. Tüplerin her birine, primerlerin yanı sıra, yeterli miktarda ve polimerizasyonda kullanılacak olan 4 tür (normal) deoksinukleotid trifosfat, polimeraz I enzimi ile her tüpe ayrı tür ddntp konur. Primer DNA segmentleri, tayini yapılacak DNA segmentinin 3'-ucundaki 4 nukleotide bağlanınca, polimeraz I enzimi, ortamdaki deoksinukleotid trifosfatları (DNA segmentini kalıp olarak kullanarak) primerlerin 3' -OH ucuna yerleştirerek zincirin büyümesini sağlar. Ancak, sıraya ortamdaki spesifik dideoksinukleotid trifosfatların girmesi halinde sentez durur ve sonlanır. 36

37 1. tüpte: Bu tüpe ddgtp konulduğunda: Tüpte polimerizasyon sırasında, baz sırası belirlenecek olan hedef DNA segmentinde sitozinin (C) sırada bulunduğu durumda, polimeraz enzimi bunun karşısına guanini (G) getirerek primerin 3'-OH ucuna ilave etmesi gerekecektir. Ortamda, normal guanosin trifosfatlar (dgtp) yanı sıra, dideoksinukleotid guanosin trifosfatlar (ddgtp) da bulunmaktadır. Eğer, polimeraz enzimi ddgtp'ı, normal dgtp yerine, sıraya koyarsa, sentez bu aşamadan sonra daha ileri gidemez ve sonlanır. 2. tüpte: Bu tüpe ddatp konulmuş olsun: Bu durumda, polimerizasyon sırasında, enzim, DNA segmentinde Timinin (T) sırada olduğu durumda, primerin 3'-OH ucuna Adenini (A) ilave etmesi gerekir. Eğer enzim, ddatp'ı primerin ucuna katarsa, buradan itibaren sentez durur. 3. tüpte: Bu tüpe ddctp konulduğunda, sentez sırasında DNA'daki adenin karşısında sıraya girerek sentezi durdurur. 4. tüpte: Bu tüpe de ddttp konulduğundan, sentez sırasında DNA' daki adenin karşısında bu ddttp gireceğinden sentez sona erecek ve değişik boylarda segmentler oluşacaktır. 37

38 Şekil 2.2 Sanger yöntemi ile DNA dizi analizi Bundan sonra, 4 tüp ayrı ayrı agaroz jel elektroforezine tabi tutularak segmentler boylarına göre, bir seperasyona tabii tutulurlar. Sonra bunlar otoradyografi ile belirgin siyah bantlar haline getirilir (ve aynen Maxam-Gilbert yönteminde olduğu gibi) karşılaştırılmalı olarak baz sıraları saptanmaya çalışılır. Günümüzde DNA baz sıralarının saptanması, geliştirilen yeni cihazlar yardımıyla otomatik olarak kolay, doğru ve kısa bir süre içinde (bir günde binlerce baz) yapılabilen otomatik DNA dizi analizi analizi cihazları kullanılmaktadır. Bu teknikte etiketleme, radyoaktif işaretleme yerine daha çok floresan boyanabilen oligonükleotit primerlerle 38

39 yapılmaktadır. Dört reaksiyonun her biri için farklı renk yayan floresan boya kullanılır ve aynı jel üzerinde elektroforezi yapılır (Şekil 2.3). Bir ayırmada yaklaşık bin bazı okuyabilecek özellikteki bu cihazlar floresanın saptanmasını sağlamaktadır. Şekil 2.3 DNA dizi analizi 39

40 3. MATERYAL VE YÖNTEM 3.1 Liken Materyali Türkiye den toplanmış olan Ramalina cinsine ait 3 tür çalışmamızda kullanılmıştır (Çizelge 3.1). Bu türler Ramalina polymorpha (Şekil 3.1), Ramalina fastigiata (Şekil 3.2), Ramalina capitata (Şekil 3.3) olarak belirlenmiştir. Çizelge 3.1 Ramalina örneklerinin lokaliteleri Tarih Tür Adı GPS Enlem Boylam Lokalite Rakım (m) Ramalina fastigiata N40 59 ' Karabük-Yenice- E32 15 ' Hacısu Mevkii Ramalina polymorpha N44 94' E37 61' Ramalina capitata N40 45 E8 20 Trabzon-Uzungöl- Soğanlı Giresun Dereli Kulakkaya Şekil 3.1 Ramalina polymorpha 40

41 Şekil 3.2 Ramalina capitata Şekil 3.3 Ramalina fastigiata 41

42 3.2 Yöntem DNA izolasyonu DNA izolasyonu için, Aras and Cansaran (2006) tarafından belirlenmiş mini prep yöntemi gerçekleştirilmiştir. Likenler için özel olarak gerçekleştirilmiş bir metot olması nedeni ile bu bu geliştirilen metot çalışmalarımızda olumlu sonuç vermiştir. Bu yöntemin safhaları şöyledir; Örnekten alınan 0.1g tallus sıvı azot içerisinde ezilir. 1,5 ml' lik ependorf tüplerine konulur. Örneklere 1 ml DNA ekstraksiyon tamponu {50mM Tris (ph 8.0), 50mM EDTA (ph 8), 10ml LiCl (4M), 1g CTAB, %2 PVPP )}ve 10 µl merkaptoetanol eklenir. 65 C olan su banyosunda arada karışması sağlanarak 15 dk. bekletilir. Sonra da oda sıcaklığına alınarak soğuması beklenir. 0.5ml Kloroform/ iso-amilalkol (24:1v/v) eklenir ve çok iyi karıştırılır. Örnekler 14000rpm' de 2dk santrifüj işlemi yapılır. Süpernatan (yaklaşık 0.8ml) yeni bir ependorfa alınır. Üzerine bir hacim isopropanol eklenerek yavaşça karıştırılır. Örnekler buz üzerinde 15 dk bekletilir rpm'de 2 dk santrifüj işlemi uygulanır. Süpernatan atılarak ependorfta kalan DNA % 70' lik etanolle yıkanır. Etanolun tamamen uzaklaşması beklenir. Pellet halindeki DNA 30-60µl TE (10mM Tris-HCl ph 8.0, 1mM EDTA ph 8.0) içerisinde çözülür. 10 mg/ml RNaz eklenerek 37 C' de 30dk bekletilir. Elde edilen DNA miktar tayinleri ve saflık dereceleri spektrofotometrik (Analytik Jena) ölçümler ile (260nm/ 280nm) belirlenir. 260nm dalga boyunda 1 OD' nin 50µg/ml DNA 42

43 miktarının absorbans değeri olduğu göz önünde bulundurularak hesaplama yapılır. Son hacimde 5mg/ml olacak şekilde etidyum bromür boyası eklenmiş %1' lik agaroz jeline elektroforetik ayırım için örnekler yüklenir. 100wattta 30dk yürütüldükten sonra UV ışığı altında DNA bantlarının varlığı belirlenir PCR analizleri İzole edilen DNA' da rdna ITS bölgesinin çoğaltılması uygun PCR şartlarında ilgili bölgeyi içine alan primer ile gerçekleştirilmiştir. Değişik liken türlerinde rdna, ITS bölgeleri ile ilgili olarak yapılan çalışmalar literatürde bulunmaktadır (Dyer and Murtagh 2001, Rios et al. 2002, Murtagh et al. 2002). ITS bölgeleri için uygulanan PCR amplifikasyon koşulları; 50 µl reaksiyon içerisinde: 5µl ~200 ng DNA, 5 µl 10x reaksiyon tamponu, 5 µl 25mM MgCl 2 5µl 25µΜ dntp' ler 4µl 10µΜ ITS1F 4µl 10µΜ ITS4 0.5 U Taq DNA polimeraz Toplam hacmi 50µl' ye tamamlayacak şekilde 21,5µl PCR suyu eklenerek PCR (Progene-Techne) reaksiyonu gerçekleştirilir. PCR döngü şartları: 95 o C 2 dk. ön denatürasyon yapılmıştır. Sonra sırasıyla 94 o C 30sn, 55 o C 1dk., 72 o C 1dk. 45sn' lik program 35 döngü olarak uygulanmıştır. Final uzama ise 72 o C 8 dk. olarak gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmada, primer çifti olarak ITS1-F 43